Made available in DSpace on 2016-03-15T14:19:06Z (GMT). No. of bitstreams: 2 romulo_bezerra_ioc_dout_2012.pdf: 7162611 bytes, checksum: 3d02f06c712f13335b047fc33620dd3c (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2016-02-23 / O P2X7 é um receptor purinérgico que está envolvido em importantes funções fisiológicas e metabólicas, mas também tem participação em diversas patologias, principalmente aquelas de caráter inflamatório. Apesar de sua relevância, ainda não se têm disponíveis antagonistas específicos que possam ser utilizados na clínica para o tratamento de doenças relacionadas à ativação deste receptor. Muitos fármacos comercializados nos dias de hoje apresentam estruturas químicas relacionadas a um produto natural extraído de alguma espécie botânica de uso consagrado na medicina popular. Baseia-se nisso a relevância do estudo de produtos naturais para obtenção de uma atividade específica sobre alvos celulares. Logo, esse trabalho teve como interesse o estudo de extratos vegetais e fúngicos obtidos de espécies dos diferentes biomas, cedidos pelo LQPN do Centro de Pesquisas René Rachou \2013 Fiocruz-MG, visando á identificação de antagonistas para o receptor P2X7. Nosso primeiro passo foi à padronização de uma metodologia que permitiu a triagem de cerca de 60 extratos ao mesmo tempo, através da utilização de um espectrofotômetro de placas. Depois de padronizada, promovemos a aplicação dessa metodologia na triagem de 1800 extratos, dos quais apenas três extratos (8067,8549 e 8568) apresentaram atividade antagonista na faixa de corte pré-estabelecida [100 \03BCg/mL], com perfis de inibição de 65 %, 62 % e 61 % respectivamente, sobre o P2X7R. Destes extratos foram determinados os IC´s50 tanto em células de linhagem murina (2,1 \03BCg/mL; 2.6 \03BCg/mL e 3.8 \03BCg/mL) quanto em células de linhagem humana (0.69, 0.92 e 1.5 \03BCg/mL), sendo possível verificar maior atividade quando testados em células de linhagem humana Posteriormente avaliamos a ação destes sobre funções fisiológicas relacionadas à ativação do P2X7R, nessa etapa, observamos o efeito inibitório destes extratos sobre a liberação de IL-1beta, ROS e NO, onde os três compostos foram capazes de inibir estas funções numa faixa entre 50 % a 60 %. Para obtermos uma caracterização do efeito farmacológico destes extratos sobre o receptor P2X7, realizamos experimentos de eletrofisiologia, caracterizando assim uma ação inibitória dose-dependente destes, sendo que nos respectivos IC´s50 os perfis de inibição da corrente foram de: 76 %, 47 % e 75 %. Também avaliamos a citotoxicidade in vitro utilizando as células de ambas às linhagens e verificamos que não apresentaram significativa toxicidade quando tratadas por 24 h. em doses até quatro vezes maiores que o IC50, visto que os resultados foram semelhantes ao controle não tratado. Depois de avaliarmos a atividade antagonista destes extratos in vitro, partimos para os experimentos in vivo utilizando os modelos de úlcera induzida por etanol e de dor neuropática e inflamatória, pois existem trabalhos previamente descritos na literatura que correlacionam a atividade do P2X7R com a evolução dessas patologias. No ensaio de dor neuropática, apenas dois extratos mostraram atividade analgésica (8067 e 8549) inibindo o estímulo de dor em 68 % e 66 %, porém no contexto da dor inflamatória os três extratos mostraram efeito analgésico, inibindo o estímulo em: 8067 = 48%, 8549 = 50% e 8568 = 44 % Os resultados obtidos do experimento de úlcera induzida por etanol demonstraram o efeito inibitório sobre a formação de úlceras desses extratos em: 88 %, 84 % e 51 %, inclusive foram mais efetivos que o BBG (antagonista reversível deste receptor) e que o medicamento utilizado na clínica (Lansoprazol), os quais inibiram a formação de úlceras em 43 % e 46% respectivamente. Nosso conjunto de resultados apontam extratos com significativa atividade antagonista sobre o P2X7R, com potencial para o desenvolvimento de novos fármacos com grande interesse para a indústria farmacêutica, além de contribuir para o conhecimento acerca de propriedades medicinais presentes na biodiversidade / The purinergic receptor P2X7 is involved in important physiological and metabolic functions, but it also participates in pathology, especially when inflammatory in character. Despite the importance of P2X7, it has no specifi c antagonists yet available for use in clinical treatment of diseases related to the receptor's activation. Today, many drugs on the market have chemical structures related to natural products obtained from botanical species with traditional use in indigen ous medicine, forming the basis for studying natural products to obtain specific activity on cellular targets. This work focused primarily on the study of plant and fungal species extracts obtained from different biomes provided by LQPN of the Research Cen ter René Rachou - Fiocruz - MG, aiming to identify antagonists for the P2X7 receptor. The first step was to standardize a method that allowed the screening of approximately 60 extracts at the same time through the use of a plate spectrophotometer. Once stand ardized, the application of this methodology was promoted in the screening of 1800 extracts. Of these, only three extracts (8067, 8549 and 8568) showed antagonistic activity in the pre - established cut range [100 mg/mL], with inhibition profiles of 65%, 62% , and 61% respectively, on the P2X7R. Th e IC's50 of them were determinate in murine (2.1, 2.6, and 3.8 mg/mL) and human (0.69, 0.92, and 1.5 mg/mL) cell lines. Which an increased activity was possible to verify when they were tested in human cells. Consequ ent evaluation of action on physiological functions related to the activation of P2X7R revealed an inhibitory effect of these extracts on the release of IL - 1beta, NO, and ROS. The three tested compounds were able to inhibit these functions in a range betwe en 50% and 60%. To obtain a pharmacological characterization of these extracts on the P2X7 receptor, electrophysiological experiments were conducted, which characterized the dose - dependent inhibitory effects, exhibiting inhibitory current profiles of 76%, 47%, and 75%, respectively. In vitro cytotoxicity was also evaluated, using both cell strains, showing no significant toxicity after 24 hours of treatment at doses of up to four times that of the IC50; the results were similar to the untreated control. Aft er evaluating the antagonistic activity of these extracts in vitro, experiments using the in vivo models of ethanol - induced ulcers and inflammatory and neuropathic pain were performed. Previous studies correlate the activity of the P2X7R with the evolution of these pathologies. In the neuropathic pain protocol experiment, only two extracts showed analgesic activity (8067 and 8549) by inhibiting the pain stimulation by 68% and 66%, but in the context of inflammatory pain, the three tested extracts showed ana lgesic effects by inhibiting the stimulus by the following percentages: 8067 = 48 %, 8549 = 50%, and 8568 = 44%. The results of the ethanol - induced ulcer demonstrated an inhibitory effect on the ulcer’s development of 88%, 84%, and 51% by these extracts, a nd found that the extracts were more effective than BBG (reversible antagonist of this receptor) and the medicine used clinically (Lansoprazole), which inhibited the formation of ulcers by 43% and 46%, respect ively. The data set links to extracts with significant antagonist activity on the P2X7R, and potential to the development xix of new medicines of great interest to the pharmaceutical industry and important contributions to the knowledge of medicinal properties present in biodiversity

Made available in DSpace on 2016-05-02T13:03:27Z (GMT). No. of bitstreams: 2 natiele_ferreira_ioc_mest_2015.pdf: 10259450 bytes, checksum: c4b782d98c9d1451e1f3f98eb0cae9dd (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2015 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Os receptores purinérgicos são proteínas expressas na membrana plasmática de diversos tipos celulares e são ativadas por purinas e pirimidinas extracelulares. Eles são classificados em receptores P1 e P2, de acordo com o tipo de ligante fisiológico, entretanto, os P2R são ainda subdivididos nas classes: P2XR, que abrange os subtipos ionotrópicos e P2YR, que agrupa os subtipos acoplados à proteína G. Dentre os P2YR, os subtipos P2Y2 e P2Y4 vem sendo amplamente estudados em virtude de suas funções sobre diversos sistemas biológicos. Uma vez ativados pelo UTP, estes receptores promovem a ativação e inibição de canais iônicos, controlam o fluxo de íons através da membrana, induzem um aumento de cálcio intracelular, além de estimular a proliferação celular. Em vista disso, muitos grupos de pesquisa já vem estudando o P2Y2 e o P2Y4 como alvos terapêuticos para o tratamento de diversas doenças, tais como fibrose cística, doença do olho seco, doença de Alzheimer, entre outras. Entretanto, a escassez de moléculas com propriedade antagonista seletiva sobre estes receptores dificulta o avanço da caracterização de novos papéis funcionais associados a eles, e neste contexto, os produtos naturais podem atuar como uma importante fonte para a descoberta de compostos que apresentem a característica almejada Por isso, o objetivo deste trabalho foi padronizar uma metodologia de mensuração de cálcio intracelular induzido pelo UTP em células da linhagem de macrófagos murinos J774.G8 e realizar a triagem de extratos oriundos de produtos naturais a fim de identificar compostos com atividade antagonista sobre o P2Y2R e o P2Y4R. Para isso, foi padronizado um protocolo de carregamento celular com o indicador de cálcio Fluo-4AM com posterior leitura dos sinais de cálcio no FlexStation III em células J774.G8. A partir desta padronização foi realizada a caracterização dos subtipos de receptores P2 expressos nestas células que possuem vias de sinalização que aumentam o cálcio intracelular, além da triagem de 78 extratos de origem natural para averiguar a sua atividade antagonista sobre receptores P2YR ativados por UTP. Nesta triagem, identificamos 7 extratos com atividade antagonista sobre o aumento de cálcio induzido pelo UTP e que não demonstraram citotoxicidade após o tratamento de 15 e 60 minutos. Com isso, acreditamos que essa metodologia seja capaz de identificar novos antagonistas para estes receptores, o que irá contribuir significativamente para o campo de Farmacologia de Receptores Purinérgicos / The purinergic receptors are proteins expressed in plasma membrane of many cell types that are activated by extracellular purines and pyrimidines. They are classified in P1 and P2 receptors, according to physiological ligand. However, the P2R are further subdivided in two classes: P2X for ionotropic subtypes and P2Y for G-protein coupled ones. Among P2YR, the P2Y2 and P2Y4 subtypes has been widely studied due to their functions in many biological systems. Once activated by UTP, these receptors promote the activation and inhibition of ion channels, control the flow of ions through the membrane, induce an increase of intracellular calcium and stimulate the cell proliferation. In view of this, many research groups have been studying the P2Y2 and P2Y4 as therapeutic targets for the treatment of several diseases like Cystic Fibrosis, Dry Eye Disease, Alzheimer, among others. However, the lack of molecules with selective antagonist property on these receptors difficults the advancement of characterization of new functional roles associated with them, and in this context, natural products may act as an important source for the discovery of compounds that present this desired feature. Therefore, the aim of this study was to standardize a methodology for measurement of intracellular calcium mobilization induced by UTP in a murine macrophage cell line J774.G8 and perform the screening of extracts derived from natural products in order to identify compounds with antagonist activity on the P2Y2R and P2Y4R. For this, it was standardized a protocol of cell labeling with calcium indicator Fluo-4AM in J774.G8 cells with subsequent detection of calcium signals in FlexStation III. With this standardization, it was characterized the P2 receptors subtypes expressed in this cell line that have signaling pathways of increase of intracellular calcium and the screening of 78 extracts from natural origin to verify its antagonist activity on P2YR receptors activated by UTP. In this screening, we identified 7 extracts with antagonistic activity on the increase of calcium induced by UTP and they did not demonstrate cytotoxicity after treatment 15 to 60 minutes. Thus, we believe that this method is able to identify new antagonists to these receptors, which will significantly contribute to the Purinergic Receptors Pharmacology field.