JUNQUEIRA, Ana Flávia Torquato de Araújo. Estudo do efeito do inibidor da enzima adenosina desaminase, EHNA, sobre a enterite induzida pela toxina a do Clostridium difficile em alça ileal isolada de camundongos. Fortaleza, 2008. 141 f. Dissertação (Mestrado em Farmacologia) - Universidade Federal do Ceará. Faculdade de Medicina, Fortaleza, 2008. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2012-03-05T14:24:00Z No. of bitstreams: 1 2008_dis_aftajunqueira.pdf: 2171395 bytes, checksum: b512db3b70b3edd53f62ca6b7d42c213 (MD5) / Approved for entry into archive by Eliene Nascimento(elienegvn@hotmail.com) on 2012-03-07T11:36:39Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2008_dis_aftajunqueira.pdf: 2171395 bytes, checksum: b512db3b70b3edd53f62ca6b7d42c213 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-03-07T11:36:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2008_dis_aftajunqueira.pdf: 2171395 bytes, checksum: b512db3b70b3edd53f62ca6b7d42c213 (MD5) Previous issue date: 2008 / The main factor of virulence in Clostridium difficile is toxin A (TxA), which can induce inflammation and acute tissue injury in the bowels of animals and humans affected by this organism. The high concentration of adenosine generated upon injury produces a number of antiinflammatory effects limited by rapid degradation by adenosine deaminase. The objective of this study was to determine the effect of EHNA (erythro-9-(2-hydroxy-3-nonyl)-adenine) inhibition of adenosine deaminase upon TxA-induced ileal loop enteritis in mice. EHNA (90 μmol/kg) or PBS was injected i.p. 30 minutes prior to TxA (10-100 μg) or PBS instillation into the ligated ileal loop. The animals were euthanized 3 hours after enteritis induction and the ileal loops were retrieved for analysis. The weight/length ratio and the secretion volume/length ratio were calculated and tissue samples were submitted to histopathological study, myeloperoxidase assay (MPO), measurement of TNF-α, IL-1β and IL-10 levels with ELISA, immunohistochemical tests for TNF-α, IL-1β, inducible NOS and PTX3, and PCR assay for TNF-α, IL-1β and PTX3. The instillation of TxA (10-100 μg) into the ileal loop significantly increased (p<0.05) the weight/length ratio and the secretion volume/length ratio with consistent results above 50 μg. TxA induced a significant amount (p<0.05) of histological damage, edema and inflammatory cell infiltration and increased the production of TNF-α, IL-1β, iNOS and PTX3. All changes were significantly reverted by treatment with EHNA (p<0.05). Moreover, IL-10 levels remained unchanged in animals treated with TxA, but increased in animals receiving EHNA. In conclusion, in mice with TxA-induced enteritis EHNA produced considerable antiinflammatory effects, reducing tissue injury, neutrophil migration, the expression and levels of proinflammatory cytokines (TNF-α and IL-1β) and producing an increase in IL-10 levels. In addition, TxA instillation increased PTX3 expression and the number of cells immunolabeled for iNOS in the ileal tissue, both of which were reverted by EHNA. / O Clostridium difficile tem como principal fator de virulência a toxina A (TxA), a qual provoca inflamação e destruição tecidual aguda em intestinos de animais experimentais e de pacientes com a doença induzida por esta bactéria. Em locais de injúria tecidual, adenosina é produzida em altas concentrações, onde exerce uma série de efeitos antiinflamatórios, limitados por sua rápida degradação pela enzima adenosina desaminase. O objetivo deste trabalho foi investigar o efeito da inibição da enzima adenosina desaminase pelo EHNA (eritro-9-(2-hidróxi-3-nonil)-adenina) sobre a enterite induzida pela TxA do C. difficile em alça ileal de camundongos. Para isto, injetamos EHNA (90 μmol/kg) ou PBS i.p. 30 minutos antes da administração de TxA (10 a 100 μg) ou PBS na alça ileal isolada. Os animais foram sacrificados 3 horas depois da indução da enterite e as alças foram retiradas para estudo. As razões peso/comprimento da alça e volume de secreção/comprimento da alça foram calculadas e amostras de tecido foram coletadas para histopatologia, dosagem de atividade de mieloperoxidase (MPO), dosagem de TNF-α, IL-1β e IL-10 por ELISA, imunohistoquímica para TNF-α, IL-1β, NOS induzível e PTX3, e PCR para TNF-α, IL-1β e PTX3. A injeção de TxA (10 a 100 μg) nas alças ileais aumentou significativamente (p<0,05) as razões peso/comprimento da alça e volume de secreção/comprimento da alça com resultados consistentes a partir de 50 μg. A TxA promoveu significativa (p<0,05) destruição tecidual, edema, infiltração de células inflamatórias, aumento das citocinas TNF-α e IL-1β, e elevação de iNOS e PTX3. Todos esses parâmetros foram significativamente revertidos com o uso do EHNA (p<0,05). Em adição, a TxA não alterou os níveis de IL-10 em relação ao controle, mas o pré-tratamento com EHNA promoveu uma elevação nos níveis desta citocina. Assim, concluímos que na enterite induzida pela TxA em camundongos o EHNA demonstrou um potente efeito antiinflamatório, reduzindo consideravelmente a lesão tecidual, a migração neutrofílica, a expressão e os níveis de citocinas próinflamatórias (TNF-α, IL-1β) e produzindo um aumento nos níveis de IL-10. Além disso, a administração de TxA induziu um aumento na expressão da proteína PTX3 e no número de células imunomarcadas para iNOS no tecido ileal, ambos revertidos pelo EHNA.

PIERDONÁ, Taiana Magalhães. Avaliação das atividades antiagregante plaquetária e anticoagulante em estudo de bioprospecção de Opercutina macrocarpa (L.) Urb. (Jalapa) em plasma humano : determinação do mecanismo de ação. 2011. 124 f. Dissertação (Mestrado em Farmacologia) - Universidade Federal do Ceará. Faculdade de Medicina, Fortaleza, 2011. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2013-03-08T12:01:26Z No. of bitstreams: 1 2011_dis_tmpierdoná.pdf: 2122526 bytes, checksum: f682e2203eb4dc5950da2fee4524dca5 (MD5) / Approved for entry into archive by Erika Fernandes(erikaleitefernandes@gmail.com) on 2013-03-12T14:08:36Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2011_dis_tmpierdoná.pdf: 2122526 bytes, checksum: f682e2203eb4dc5950da2fee4524dca5 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-03-12T14:08:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2011_dis_tmpierdoná.pdf: 2122526 bytes, checksum: f682e2203eb4dc5950da2fee4524dca5 (MD5) Previous issue date: 2011 / Operculina macrocarpa (L.) Urb ("Brazilian jalapa") (Convolvulaceae) is a common species of the Brazilian Northeast. It is popularly used because of its laxative and purgative properties. The tincture of Operculina macrocarpa tubers (major constituent) and Convolvulus scammonia composes the raw materials of Aguardente Alemã®, herbal medicine, referred to as antithrombotic in folk medicine. The objective of this study was to investigate the antiplatelet and anticoagulant potential for Operculina macrocarpa in human plasma, including the bioprospection study and determination of possible mechanism of action. The evaluation of antiplatelet activity of drugs (tincture and fractions of O. macrocarpa, tincture of C. scammonia and AAL) in human platelet-rich plasma (PRP) was measured by the turbidimetric method where the aggregation was induced by the addition of agonists (adenosine diphosphate (ADP), epinephrine (EPI), arachidonic acid (AA) collagen (COL) or thrombin (TROM). Unlike tincture of C. scammonia and AAL, both O. macrocarpa tincture (TOM/preciptade (P) and supernatant (S)) and one of the organic fractions obtained from O. macrocarpa (TOM/1-F4) showed antiplatelet activity in human plasma where TOM/1-F4 (100 µg/mL) presented comparable effect to AAS. Physicochemical characterization (HPLC and spectrophotometer) of TOM/PS (content of resins 1,38g%) and TOM/1-F4 allowed the identification of phenolic acids (chlorogenic, galic and caffeic) as well as the determination of total phenols of TOM (0,14g%). The antiplatelet effect of TOM/PS and TOM/1-F4 seems to result from many intracellular actions. However, TOM/PS in presence of AAS, L-ARG, ODQ, pentoxifilin (PTX) or ticlopidine (TIC) had its antiplatelet effect modified mainly because of TIC, suggesting an important role of purinergic receptors in TOM/PS. TOM/PS presented antioxidant activity determined by DPPH test. Furthermore, TOM/PS and TOM/1-F4 did not showed anticoagulant action in human plasma but TOM/PS increased the bleeding time in mice. It was observed a relative toxicity of TOM/PS in human neutrophil. Therefore, this study demonstrated, as never before, the antiplatelet potencial of tincture and the organic fraction of "jalapa" and that at least related to the presence of phenols, particulary phenolic acids, and resins in plant. / Operculina macrocarpa (L.) Urb. (“jalapa brasileira”) (Convolvulaceae) é uma espécie comum do Nordeste brasileiro, sendo popularmente utilizada pelas suas propriedades laxativa, purgativa e “depurativa”. A tintura do tubérculo de jalapa, matéria-prima majoritária, ao lado da tintura de Convolvulus scammonia (TCS) compõem o fitoterápico Aguardente Alemã® (AAL) ou Tintura de Jalapa Composta, indicada como antitrombótico na medicina popular. O objetivo do presente trabalho foi investigar o potencial antiagregante plaquetário e anticoagulante de O. macrocarpa em plasma humano, incluindo estudo de bioprospecção e determinação do possível mecanismo de ação. A avaliação da atividade antiagregante plaquetária das drogas testes (tintura e frações de O. macrocarpa, TCS e AAL) em plasma humano rico em plaquetas (PRP) foi mensurada por método turbidimétrico, sendo a agregação induzida por vários agonistas como difosfato de adenosina (ADP), epinefrina (EPI), ácido araquidônico (AA), colágeno (COL) ou trombina (TROM). Ao contrário da TCS e da AAL, tanto a tintura de O. macrocarpa (TOM/precipitado(P) e sobrenadante(S)) quanto uma das frações orgânicas obtidas da planta (TOM/1-F4) mostraram atividade antiagregante plaquetária, onde a TOM/1-F4 (100 µg/mL) apresentou efeito comparável ao ácido acetilsalicílico (AAS). Caracterização físico-química (CLAE e espectrofotometria) da TOM/PS (teor de resinas 1,38g%) e da TOM/1-F4 permitiu a identificação de ácidos fenólicos (clorogênico, gálico e caféico), bem como a determinação do teor de fenóis totais da TOM (0,14g%). O efeito antiagregante plaquetário da TOM/PS e da TOM/1F-4 parece resultar de várias ações intracelulares. Contudo, a TOM/PS na presença do AAS, L-ARG, ODQ, pentoxifilina (PTX) ou ticlopidina (TIC) teve seu efeito antiagregante plaquetário modificado principalmente pela TIC, sugerindo um papel importante dos receptores purinérgicos na bioatividade da TOM/PS. A TOM/PS apresentou atividade antioxidante determinada através do teste do DPPH. Além disso, a TOM/PS e a TOM/1F-4 não mostraram ação anticoagulante em plasma humano, mas a TOM/PS aumentou o tempo de sangramento em camundongos. Foi observada uma toxicidade relativa da TOM/PS em neutrófilo humano. Dessa forma, o presente estudo comprovou, de maneira inédita, o potencial antiagregante plaquetário da tintura e da fração orgânica de jalapa, que estão pelo menos em parte relacionados à presença de fenóis, particularmente ácidos fenólicos, e resinas na planta.

MARTINS, René Duarte. Efeitos renais e vasculares do extrato bruto da anêmona marinha Bunodosoma caissarum e sua fração fosfolipase A2 : estudo dos mediadores envolvidos. 2008. 242 f. Tese (Doutorado em Farmacologia) - Universidade Federal do Ceará. Faculdade de Medicina, Fortaleza, 2008. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2012-10-01T13:36:35Z No. of bitstreams: 1 2008_tese_rdmartins.pdf: 2488941 bytes, checksum: 48aedf1ec35acc89a4e97decf2688bd1 (MD5) / Approved for entry into archive by Eliene Nascimento(elienegvn@hotmail.com) on 2012-10-01T16:28:48Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2008_tese_rdmartins.pdf: 2488941 bytes, checksum: 48aedf1ec35acc89a4e97decf2688bd1 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-10-01T16:28:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2008_tese_rdmartins.pdf: 2488941 bytes, checksum: 48aedf1ec35acc89a4e97decf2688bd1 (MD5) Previous issue date: 2008 / Sea anemones contain a variety of biological active compounds including some potent toxins. For this reason, many investigators have focused their studies in these proteins, isolated from sea anemones, such as Bunodosoma caissarum. The aim of this work was to study the mechanism of functional alterations produced by the crude extract and the PLA2 fraction of B. caissarum in the isolated rat kidney and arteriolar mesenteric bed. Isolated kidneys from Wistar rats, weighing 250-300g, were perfused with Krebs-Henseileit solution containing 6% of bovine serum albumin for 120 min. B. caissarum crude extract (BcE) and PLA2 were added to the system 30 min after the beginning of each experiment (internal control) and Tezosentan (TZN) and Indomethacin (IND) were administered in the initial period of each experiment (T=0min). The mesenteric bed, kept warmed at 37°C, was perfused with Krebs solution at a constant flow, (4mL/min) but with a variable perfusion pressure, measured for 80 min. mRNA expression of TNF-α, IL-1β, rennin and adenosine receptors (A1, A2a, A2b and A3) was evaluated by PCR using 18S mRNA as reference gene. The data were analyzed by Student’s t-test (p<0.05). BcE altered kidney function increasing perfusion pressure (PP), renal vascular resistance (RVR), urinary flow (UF), glomerular filtration rate (GFR) and sodium, potassium and chloride excretion, especially with the intermediary concentração. Tezosentan inhibited these effects only partially. However, indomethacin presented a blockage more expressive that TZN. The PLA2 of B. caissarum showed a higher increase of PP at 60 minutes (Control= 104,17±3,72; PLA2(0,1) = 130,9±5,6*; PLA2(0,3) = 165,1±12,6*; PLA2(1,0) = 142,3±9,6*, *p<0,5) and increased RVR, UF, GFR, sodium, potassium and chloride excretion and urinary osmolarity, with descrease of Na+, K+ and Cl- distal transports.. The blockage of IND was more expressive on the smallest PLA2 concentração and TZN showed a modest effect, blocking more efficiently the intermediary concentração. Neither BcE, nor PLA2 altered the basal perfusion pressure of the isolated arteriolar mesenteric bed. PLA2 increased the gene expression of TNF-α (Control = 1,00 ± 0,00 vs. PLA2 = 1,116 ± 0,033*, com p<0,0001)and upnregulated the expression of adenosine receptors A2a (Control = 1,0 ± 0,01 vs. PLA2 = 1,238 ± 0,043*, com p<0,0001). These results suggest that BcE and PLA2 exert significative actions in the isolated perfusion kidney, without vascular effects in the arteriolar mesenteric bed. COX-2 and endothelin appear to be important mediators of the effects of BcE and PLA2. In addition, adenosine is also involved in the mechanism of action of B. caissarum. / Anêmonas marinhas contêm uma variedade de compostos biologicamente ativos incluindo potentes toxinas. Por esta razão, muitos investigadores têm centrado seus estudos nestas proteínas, isoladas de anêmonas marinhas, como Bunodosoma caissarum. O objetivo deste trabalho foi estudar o mecanismo das alterações funcionais produzidas pelo extrato bruto e da fração PLA2 de B. caissarum em rim isolado de rato e leito vascular mesentérico. Rins isolados de ratos Wistar, pesando 250-300g, foram perfundidos durante 120 min com solução de Krebs-Henseileit contendo 6% de albumina bovina. O extrato bruto de B. caissarum (BcE) e PLA2 foram adicionados ao sistema, em diferentes concentrações, 30 minutos após o início de cada experimento (controle interno) e Tezosentan (TZN) e Indometacina (IND) foram administrados no período inicial de cada experimento (T = 0 min). O leito vascular mesentérico, mantido aquecido a 37 ° C, foi perfundido com solução de Krebs em um fluxo constante (4mL/min) e a pressão medida por 80 min. A expressão de mRNA TNF-α, IL-1 β, renina e receptores de adenosina (A1, A2a, A2b e A3) foi avaliada por PCR utilizando como referência o mRNA do gene 18S. Os dados foram analisados por teste t de Student (p <0,05). BcE alterou a função renal elevando a pressão de perfusão (PP), a resistência vascular renal (RVR), fluxo urinário (UF), taxa de filtração glomerular (TFG) e excreção de sódio, de potássio e cloreto, especialmente com a concentração intermediária. Tezosentan inibiu estes efeitos apenas parcialmente. No entanto, indometacina apresentou um bloqueio mais expressivo que TZN. A PLA2 de B. caissarum elevou a pressão de perfusão (PP) já aos 60 minutos (controle = 104,17 ± 3,72; PLA2 (0,1) = 130,9 ± 5,6 *; PLA2 (0,3) = 165,1 ± 12,6 *; PLA2 (1,0) = 142,3 ± 9,6 *, *p <0,5), revelando também elevações de RVR , UF, TFG, excreção de eletrólitos e osmolaridade urinária, com diminuição dos transportes distais de Na+, K+ e Cl-. O bloqueio com IND foi mais expressivo sobre a menor concentração de PLA2, enquanto TZN mostrou um efeito discreto. BcE e PLA2 não alteraram a pressão de perfusão basal do leito vascular mesentérico. PLA2 aumentou a expressão relativa de TNFα (C = 1,00 ± 0,00 vs. PLA2 = 1,116 ± 0,033*, com p<0,0001) e do receptor de adenosina A2a (C = 1,0 ± 0,01 vs. PLA2 = 1,238 ± 0,043*, com p<0,0001).Estes resultados sugerem que BcE e PLA2 exercem ações significativas na perfusão de rim isolado, sem efeitos vasculares diretos no leito mesentérico. COX-2 e endotelina parecem ser importantes mediadores dos efeitos da BcE e PLA2. Além disso, adenosina também parece estar envolvida no mecanismo de ação da PLA2 de Bunodosoma caissarum.

FOSCHETTI, D. A. Toxinas A e B do Clostridium difficille induzem a expressão diferencial de receptor de Adenosina em células epiteliais intestinais: papel do receptor A2B. 2014. 160 f. Tese(Doutorado em Farmacologia) – Faculdade de Medicina, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2014. / Submitted by Erika Fernandes (erikaleitefernandes@gmail.com) on 2016-01-25T11:59:35Z No. of bitstreams: 1 2014_tese_dafoschetti.pdf: 5271291 bytes, checksum: 110e5955cf8edb636759d629ae0d7b60 (MD5) / Approved for entry into archive by Erika Fernandes(erikaleitefernandes@gmail.com) on 2016-01-25T11:59:46Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_tese_dafoschetti.pdf: 5271291 bytes, checksum: 110e5955cf8edb636759d629ae0d7b60 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-01-25T11:59:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_tese_dafoschetti.pdf: 5271291 bytes, checksum: 110e5955cf8edb636759d629ae0d7b60 (MD5) Previous issue date: 2014-12-01 / Clostridium difficile is recognized to be a nosocomial pathogen that causes intense intestinal inflammation, epithelial barrier disruption and diarrhea. Adenosine production is increased under inflammatory situations. The adenosine receptor A2B is the most expressed receptor in the human and mice intestine. We investigated the effect of short- and long-term exposure to TcdA and TcdB in HCT-8 cells and isolated cecum epithelial cells. HCT-8 cells were exposed to TcdA or TcdB (10 ng/ml) for 2, 6 and 24h. We used a murine cecal loop model and murine infection model to evaluate the effects of TcdA and C. difficile infection, respectively. We demonstrated that HCT-8 and isolated intestinal cecum epithelial cells naturally express high levels of A2BR receptors. TcdA or TcdB alters the cell morphology, viability and proliferation pattern and caused gene expression increase of all AR subtypes in HCT-8. In isolated cecum epithelial cells, TcdA significantly (p<0.05) increased volume/length, weight/length, histopathology scores, neutrophil infiltration, as measured by MPO content, and induced an altered gene expression increase of all AR subtypes. PSB603 (10 nM) treatment significantly (p<0.05) reduced TcdA-induced tissue damage. Our findings support the hypothesis that Clostridium difficile toxins affect adenosine receptor expression and this action may be related to their severe inflammatory effect. We concluded that adenosine receptors may play a crucial role in regulating the inflammatory system in intestinal epithelium during C. difficile infection. / O Clostridium difficile é reconhecido por ser uma bactéria nosocomial, levando a intensa inflamação intestinal, quebra da barreira epitelial e diarreia. A produção de adenosina está aumenta durante eventos inflamatórios. O receptor de adenosina A2B (A2BR) é o mais expresso no intestino de humanos e camundongos. Nós investigamos o efeito de exposição às TcdA e TcdB, a curto e longo prazo, em células HCT-8 e células epiteliais intestinais isoladas do ceco. Células HCT-8 foram expostas a TcdA ou TcdB (10 ng/ml) por 2, 6 e 24h. Foi usado o modelo de alça cecal e de infecção pelo bacilo em murinos para avaliar os efeitos da TcdA e da infecção pelo C. difficile, respectivamente. Foi demonstrado que HCT-8 e células epiteliais intestinais isoladas do ceco naturalmente expressam altos níveis do receptor A2BR. TcdA e TcdB alteraram a morfologia celular, viabilidade e proliferação e causaram aumento da expressão gênica de todos os subtipos de receptores de adenosina e das citocinas IL-6 e IL-8 em HCT-8. Em células epiteliais intestinais isoladas do ceco, a TcdA significativamente causou um aumento do peso e volume/comprimento da alça cecal, escores histológicos e infiltrado neutrofílico, medido por MPO, e também causou alterações da expressão gênicas dos receptores de adenosina, tanto no modelo de alça cecal quanto na infecção pelo bacilo. O tratamento com PSB603, um antagonista do receptor A2BR, foi capaz de reverter os efeitos causados pelas toxinas do C. difficile. Nossos dados suportam a hipótese que as toxinas do C. difficile alteram a expressão dos receptores de adenosina e isso pode estar relacionado com os severos efeitos inflamatórios. Nós concluimos que os receptores de adenosina tenham um papel importante na regulação da inflamação em células epiteliais intestinais na infecção pelo C. difficile.

Submitted by Maurílio Figueiredo (maurilioafigueiredo@yahoo.com.br) on 2013-03-13T19:56:47Z No. of bitstreams: 1 TESE_InfluênciaMetabolismoExtracelular.PDF: 1475554 bytes, checksum: 99839ae26ebfc2a908a5ac279c901e2b (MD5) / Approved for entry into archive by Neide Nativa (neide@sisbin.ufop.br) on 2013-03-15T15:59:45Z (GMT) No. of bitstreams: 1 TESE_InfluênciaMetabolismoExtracelular.PDF: 1475554 bytes, checksum: 99839ae26ebfc2a908a5ac279c901e2b (MD5) / Made available in DSpace on 2013-03-15T15:59:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 TESE_InfluênciaMetabolismoExtracelular.PDF: 1475554 bytes, checksum: 99839ae26ebfc2a908a5ac279c901e2b (MD5) Previous issue date: 2008 / Variações nos quadros clínicos da leishmaniose, observadas tanto na doença em humanos quanto em murinos, sugerem a existência de uma diferenciação, dependente da espécie, na capacidade de parasitos do gênero Leishmania causarem lesões no hospedeiro. A procura de fatores que diferenciam as espécies de Leishmania quanto à sua virulência se faz, então, necessária para o entendimento dos mecanismos pelos quais esses parasitos causam danos aos seus hospedeiros, possibilitando a descoberta de novas ferramentas de potencial terapêutico contra a leishmaniose. Componentes da via de metabolismo do ATP extracelular são candidatos potenciais para fatores de virulência desses parasitos, visto que tanto o ATP quanto a adenosina, produto da hidrólise de AMP, são capazes de influenciar a resposta imunológica do hospedeiro e, conseqüentemente, o estabelecimento do parasito. Essa hipótese é suportada pelo fato da Leishmania necessitar da utilização da via de salvação de purinas pela ação de enzimas, dentre elas as apirases, sobre o ATP extracelular, que possui propriedades imunoestimulantes, para gerar adenosina, produto da hidrólise do AMP pelas 5’-nucleotidases, cuja importância para o metabolismo do parasito e para a regulação da resposta imune está bem descrita na literatura. Para testar essa hipótese, nós estudamos três espécies de Leishmania com diferentes graus de virulência em camundongos C57BL/6: a mais virulenta L. amazonensis e as espécies L. braziliensis e L. major. Inicialmente, formas promastigotas metacíclicas e procíclicas desses parasitos foram testadas para sua capacidade de hidrolisar ATP, ADP ou AMP. As formas metacíclicas (infectantes) de L. amazonensis mostraram maior capacidade de hidrólise para os três nucleotídeos analisados, quando comparadas com as outras duas espécies menos virulentas. Além disso, sua capacidade de hidrólise de ATP foi maior que a das formas procíclicas da mesma espécie, sugerindo um controle de expressão de ATPases dependente de metaciclogênese. Posteriormente, foi verificado pelas técnicas de RTPCR, e “Western blotting” que, a despeito da ocorrência de expressão de mRNA para as isoformas solúvel e de membrana de apirases nas promastigotas metacíclicas das três espécies estudadas, somente extratos enriquecidos de membrana de L. amazonensis foram capazes de apresentar reação com anticorpo anti-apirase de T. cruzi. O inóculo de promastigotas metacíclicas desse parasito na presença de suramina, um inibidor de ecto ATPases, em camundongos C57BL/6, levou a uma diminuição no tamanho de lesão a partir da quarta semana de infecção e no parasitismo em 7 semanas de infecção. Por outro lado, a indução de maior atividade 5’-nucleotidásica dos parasitos ou a administração simultânea de adenosina ao inóculo levou a um aumento transiente no tamanho de lesão e a um maior parasitismo em 3 ou 4 semanas de infecção da mesma cepa de camundongos por promastigotas metacíclicas de L. braziliensis, resultado oposto ao obtido após o tratamento, no momento do inóculo, com o bloqueador de receptores A2B de adenosina, MRS 1754. Em conjunto, esses resultados sugerem que a redução dos níveis de ATP extracelular pela ação de enzimas expressas pelo parasito e/ou a elevação dos níveis de adenosina podem contribuir para o estabelecimento de parasitos do gênero Leishmania no hospedeiro vertebrado, indicando um possível alvo para futuras intervenções de caráter terapêutico contra as leishmanioses. ____________________________________________________________________________________________________ / ABSTRACT: The observed changes in clinical features of leishmaniasis in humans and mice suggest the existence of a specie-dependent differentiation in Leishmania ability to cause lesions on host. The search of factors that differentiate Leishmania species regarding their virulence is very important to the comprehension of the mechanisms underlying the grade of damage that these parasites may cause to the host, enabling the discovery of new tools with therapeutic potential against leishmaniasis. Components of extracellular ATP metabolism pathway are emerging candidates to determine the virulence of these parasites, since ATP and adenosine, a product of AMP hydrolysis, are able to influence the immunological response of the host and, in consequence, the parasite establishment. This hypothesis is supported by the fact that Leishmania parasites need to use the salvation pathway of purine nucleotides by the action of enzymes, amongst them the apyrases, over extracellular ATP, which display immunestimulatory features, to produce adenosine, a product of AMP hydrolysis by the action of 5’-nucleotidases, whose importance to the parasite metabolism and to the regulation of the immune response has been described in literature. In order to verify this hypothesis, we use three Leishmania species with different degrees of virulence in C57BL/6 mice: the more virulent L. amazonensis and its counterparts L. braziliensis and L. major species. Initially, metacyclic and procyclic promastigotes from these parasites were evaluated regarding their ability in hydrolyze ATP, ADP and AMP. L. amazonensis infective metacyclic forms showed higher hydrolytic ability to the three analyzed nucleotides, when compared to the other two less virulent species. Moreover, its ability to hydrolyze ATP was higher than that from procyclic forms deriving from the same specie, suggesting a metacyclogenesis-dependent control of ATPase expression. Later, using RT-PCR and Western blotting analysis, we observed that, in spite of the occurring expression of mRNA to soluble and membrane-bound apirase isoforms from metacyclic promastigotes in the three species, only enriched membrane extracts from L. amazonensis were capable to react with T. cruzi anti-apyrase antibody. The inoculum of metacyclic promastigotes of this parasite in the presence of suramin, an ecto-ATPase inhibitor, in C57BL/6 mice, lead to a decrease in lesion size 4 weeks of infection onward and in parasitism 7 weeks after infection. Otherwise, the induction of higher 5’-nucleotidasic activity of the parasites or the simultaneous administration of adenosine in the inoculum lead to a transient increasing in lesion size and increased tissue parasitism 3 or 4 weeks after the infection of the same strain of mice with L. braziliensis metacyclic promastigotes, opposite to the effects obtained after the treatment, at the moment of inoculum, with the A2B receptor antagonist MRS 1754. Together, these results suggest that the reduction in the levels of extracellular ATP by the action of enzymes expressed by the parasite and/or the increased levels of adenosine may contribute to the establishment of Leishmania parasites in the vertebrate host, indicating a possible target to future therapeutic interventions against leishmaniasis.

Tese (Doutorado em Ciências Biológicas) - Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Universidade Federal de Ouro Preto, Ouro Preto, 2016. / Submitted by Marise Leite (marise_mg@yahoo.com.br) on 2016-04-15T14:05:13Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) TESE_RecrutamentoReceptorAdenosina.pdf: 10895173 bytes, checksum: 063aa6f41640dc7c0ad7cf1bfd62b643 (MD5) / Approved for entry into archive by Gracilene Carvalho (gracilene@sisbin.ufop.br) on 2016-04-25T14:32:10Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) TESE_RecrutamentoReceptorAdenosina.pdf: 10895173 bytes, checksum: 063aa6f41640dc7c0ad7cf1bfd62b643 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-04-25T14:38:06Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) TESE_RecrutamentoReceptorAdenosina.pdf: 10895173 bytes, checksum: 063aa6f41640dc7c0ad7cf1bfd62b643 (MD5) Previous issue date: 2016 / A infecção por Leishmania pode resultar num amplo espectro de manifestações clínicas e a infecção por Leishmania amazonensis é associada a uma deficiência na resposta de linfócitos T específicos para o parasito. Células dendríticas direcionam a diferenciação de linfócitos Th1 que contribuem para o controle da infecção por Leishmania. Em um trabalho anterior, nós mostramos que a infecção por L. amazonensis, mas não por L. braziliensis ou L. major, prejudica a resposta de células dendríticas por um mecanismo dependente do receptor de adenosina A2B. Neste trabalho, nós avaliamos a expressão de receptores de adenosina e os eventos intracelulares ativados a partir do receptor A2B em células dendríticas infectadas, bem como o papel desses eventos na infecção de camundongos por L. amazonensis. Inicialmente, células dendríticas derivadas de células de medula óssea de camundongos C57BL/6J foram infectadas por promastigotas metacíclicas de L. amazonensis, L. braziliensis ou L. major. Imagens obtidas por microscopia de fluorescência mostraram que a infecção por promastigotas metacíclicas de L. amazonensis estimula a redistribuição do receptor A2B para a superfície de células dendríticas infectadas, sem alterar a quantidade total do receptor, avaliada por western blotting, nem a expressão dos receptores de adenosina A1, A2A e A3. A infecção por L. braziliensis, L. major ou promastigotas procíclicas de L. amazonensis não alteram a expressão do receptor A2B em células infectadas. Nossos resultados mostraram, ainda, que a infecção por L. amazonensis estimula a produção de AMPc e a fosforilação de ERK1/2 por mecanismos dependentes do receptor A2B. Além disso, L. amazonensis prejudica a expressão de CD40 e a produção de IL-12p70 por células dendríticas, efeitos independentes de IL-10 e revertidos pela inibição de adenilato ciclase, de PI3K e da fosforilação de ERK1/2. Por fim, camundongos infectados na orelha por L. amazonensis na presença de inibidores do receptor A2B ou das proteínas PI3K ou ERK1/2 desenvolvem lesões menores se comparados a animais controles, mas apenas o bloqueio do receptor A2B é capaz de diminuir o parasitismo tecidual. Concluindo, nós propomos um novo mecanismo utilizado por L. amazonensis (redistribuição do receptor A2B AMPc PI3K ERK1/2) para inibir a ativação de células dendríticas, que parece ser importante para a deficiência na resposta imune observada na infecção por essa espécie de parasito. ______________________________________________________________________________________ / ABSTRACT: Leishmania infection can result in a wide spectrum of clinical manifestations and L. amazonensis is associated with a lack of antigen-specific T-cell responses. Dendritic cells direct the differentiation of T-helper 1 lymphocytes that contribute to the control of Leishmania infection. In a previous work, we showed that infection by L. amazonensis, but not by L. braziliensis or L. major, impairs dendritic cells responses by activating adenosine A2B receptors. Here, we evaluated the expression of adenosine receptors and the intracellular events triggered by A2B receptor in infected cells. Furthermore, we evaluated the role of these intracellular events in L. amazonensis-infected mice. With this aim, bone marrow-derived dendritic cells from C57BL/6J mice were infected with metacyclic promastigotes of either L. amazonensis, L. braziliensis or L. major. Fluorescence microscopy revealed that L. amazonensis infection stimulates the redistribution of A2B receptor to the surface of infected dendritic cells, without altering total A2B receptor protein density, as gauged by Western blotting, nor the expression of A1, A2A or A3 adenosine receptors. We also report that L. amazonensis increases cAMP production and ERK1/2 phosphorylation in infected dendritic cells by a mechanism dependent on A2B receptor. Furthermore, L. amazonensis infection impairs CD40 expression and IL-12 production by dendritic cells, an IL-10-independent effect prevented by the inhibition of adenylate cyclase, PI3K or ERK1/2 phosphorylation. Finally, mice infected in ear with L. amazonensis in the presence of inhibitors of A2B receptor, PI3K or ERK1/2 develop smaller lesions if compared with control animals, but only A2B receptor blockade decreases tissue parasitism. In conclusion, we propose a new pathway used by L. amazonensis (A2BR redistribution cAMP PI3K ERK1/2) to suppress dendritic cells activation, which may contribute to the pronounced deficiency of immune response elicited against this parasite infection.

Resumo

A cafeína é a substância psicoativa mais consumida no mundo. Ela aumenta o estado de alerta, estabiliza o humor e também pode proporcionar melhora no desempenho cognitivo. Diversos estudos epidemiológicos e com roedores indicam uma relação inversa entre consumo de cafeína (um antagonista dos receptores de adenosina) e o comprometimento da memória associado ao envelhecimento e à Doença de Alzheimer. Considerando que o comprometimento da sinalização encefálica da insulina é um componente importante da fisiopatologia da Doença de Alzheimer, a estreptozotocina vem sendo utilizada, via intracerebroventricular, para produzir um modelo de Doença de Alzheimer com características neuroquímicas, fisiopatológicas e comportamentais semelhantes à Doença de Alzheimer em humanos. Dessa forma, está tese teve como objetivo avaliar as alterações dos receptores de adenosina e a imunoreatividade neuronal no hipocampo de ratos submetidos à administração intracerebroventricular de estreptozotocina, bem como um possível efeito protetor da cafeína sobre esses parâmetros e sobre a memória de reconhecimento. Como resultado, encontramos comprometimento da memória, modificação do imunoconteúdo e da expressão do receptor de adenosina A2A e perda neuronal no hipocampo no modelo animal de Doença de Alzheimer. O tratamento crônico com cafeína foi eficaz na prevenção do comprometimento da memória e das alterações neuronais observadas no hipocampo do modelo de Doença de Alzheimer. Essas observações fornecem suporte adicional para a possibilidade de que o consumo de cafeína poderia ser uma estratégia para prevenir o déficit mnemónico. No entanto, o efeito positivo da cafeína foi observado somente no modelo de Doença de Alzheimer. Nos animais controles, a cafeína não produziu nenhum efeito sobre a memória. / Caffeine is the most consumed psychoactive substance in the world, utilized to increase alertness, stabilize humor and enhance cognitive performance. Several epidemiological and animal studies indicate an inverse correlation between caffeine intake (an adenosine receptors antagonist) and memory impairment associated with ageing and Alzheimer’s disease. Considering that impaired brain insulin signaling is a main feature of Alzheimer’s disease, intracerebroventricular streptozotocin has been used as a model of Alzheimer’s disease with features resembling those of Alzheimer's disease patients. Therefore, the aim of this thesis was to evaluate the adenosine receptors immunocontent and neuronal immunoreactivity in the hippocampus of rats submitted to intracerebroventricular streptozotocin, as well as a possible protective effect of caffeine on these parameters and on recognition memory. The results showed memory impairment, modification of A2A adenosine receptor immunocontent and neuronal loss in the hippocampus of the animal model of Alzheimer’s disease induced by streptozotocin. Chronic caffeine treatment was effective in preventing the memory impairment and neuronal changes observed in Alzheimer’s disease rats. These assessments provide additional support for the hypothesis that caffeine consumption might be a valid strategy in preventing mnemonic deficit. Nonetheless, the positive effects of caffeine consumption were observed only among Alzheimer’s disease rats. Caffeine consumption had no effect over control animal’s performance.

A cafeína é a substância psicoativa mais consumida no mundo. Ela aumenta o estado de alerta, estabiliza o humor e também pode proporcionar melhora no desempenho cognitivo. Diversos estudos epidemiológicos e com roedores indicam uma relação inversa entre consumo de cafeína (um antagonista dos receptores de adenosina) e o comprometimento da memória associado ao envelhecimento e à Doença de Alzheimer. Considerando que o comprometimento da sinalização encefálica da insulina é um componente importante da fisiopatologia da Doença de Alzheimer, a estreptozotocina vem sendo utilizada, via intracerebroventricular, para produzir um modelo de Doença de Alzheimer com características neuroquímicas, fisiopatológicas e comportamentais semelhantes à Doença de Alzheimer em humanos. Dessa forma, está tese teve como objetivo avaliar as alterações dos receptores de adenosina e a imunoreatividade neuronal no hipocampo de ratos submetidos à administração intracerebroventricular de estreptozotocina, bem como um possível efeito protetor da cafeína sobre esses parâmetros e sobre a memória de reconhecimento. Como resultado, encontramos comprometimento da memória, modificação do imunoconteúdo e da expressão do receptor de adenosina A2A e perda neuronal no hipocampo no modelo animal de Doença de Alzheimer. O tratamento crônico com cafeína foi eficaz na prevenção do comprometimento da memória e das alterações neuronais observadas no hipocampo do modelo de Doença de Alzheimer. Essas observações fornecem suporte adicional para a possibilidade de que o consumo de cafeína poderia ser uma estratégia para prevenir o déficit mnemónico. No entanto, o efeito positivo da cafeína foi observado somente no modelo de Doença de Alzheimer. Nos animais controles, a cafeína não produziu nenhum efeito sobre a memória. / Caffeine is the most consumed psychoactive substance in the world, utilized to increase alertness, stabilize humor and enhance cognitive performance. Several epidemiological and animal studies indicate an inverse correlation between caffeine intake (an adenosine receptors antagonist) and memory impairment associated with ageing and Alzheimer’s disease. Considering that impaired brain insulin signaling is a main feature of Alzheimer’s disease, intracerebroventricular streptozotocin has been used as a model of Alzheimer’s disease with features resembling those of Alzheimer's disease patients. Therefore, the aim of this thesis was to evaluate the adenosine receptors immunocontent and neuronal immunoreactivity in the hippocampus of rats submitted to intracerebroventricular streptozotocin, as well as a possible protective effect of caffeine on these parameters and on recognition memory. The results showed memory impairment, modification of A2A adenosine receptor immunocontent and neuronal loss in the hippocampus of the animal model of Alzheimer’s disease induced by streptozotocin. Chronic caffeine treatment was effective in preventing the memory impairment and neuronal changes observed in Alzheimer’s disease rats. These assessments provide additional support for the hypothesis that caffeine consumption might be a valid strategy in preventing mnemonic deficit. Nonetheless, the positive effects of caffeine consumption were observed only among Alzheimer’s disease rats. Caffeine consumption had no effect over control animal’s performance.

A cafeína é a substância psicoativa mais consumida no mundo. Ela aumenta o estado de alerta, estabiliza o humor e também pode proporcionar melhora no desempenho cognitivo. Diversos estudos epidemiológicos e com roedores indicam uma relação inversa entre consumo de cafeína (um antagonista dos receptores de adenosina) e o comprometimento da memória associado ao envelhecimento e à Doença de Alzheimer. Considerando que o comprometimento da sinalização encefálica da insulina é um componente importante da fisiopatologia da Doença de Alzheimer, a estreptozotocina vem sendo utilizada, via intracerebroventricular, para produzir um modelo de Doença de Alzheimer com características neuroquímicas, fisiopatológicas e comportamentais semelhantes à Doença de Alzheimer em humanos. Dessa forma, está tese teve como objetivo avaliar as alterações dos receptores de adenosina e a imunoreatividade neuronal no hipocampo de ratos submetidos à administração intracerebroventricular de estreptozotocina, bem como um possível efeito protetor da cafeína sobre esses parâmetros e sobre a memória de reconhecimento. Como resultado, encontramos comprometimento da memória, modificação do imunoconteúdo e da expressão do receptor de adenosina A2A e perda neuronal no hipocampo no modelo animal de Doença de Alzheimer. O tratamento crônico com cafeína foi eficaz na prevenção do comprometimento da memória e das alterações neuronais observadas no hipocampo do modelo de Doença de Alzheimer. Essas observações fornecem suporte adicional para a possibilidade de que o consumo de cafeína poderia ser uma estratégia para prevenir o déficit mnemónico. No entanto, o efeito positivo da cafeína foi observado somente no modelo de Doença de Alzheimer. Nos animais controles, a cafeína não produziu nenhum efeito sobre a memória. / Caffeine is the most consumed psychoactive substance in the world, utilized to increase alertness, stabilize humor and enhance cognitive performance. Several epidemiological and animal studies indicate an inverse correlation between caffeine intake (an adenosine receptors antagonist) and memory impairment associated with ageing and Alzheimer’s disease. Considering that impaired brain insulin signaling is a main feature of Alzheimer’s disease, intracerebroventricular streptozotocin has been used as a model of Alzheimer’s disease with features resembling those of Alzheimer's disease patients. Therefore, the aim of this thesis was to evaluate the adenosine receptors immunocontent and neuronal immunoreactivity in the hippocampus of rats submitted to intracerebroventricular streptozotocin, as well as a possible protective effect of caffeine on these parameters and on recognition memory. The results showed memory impairment, modification of A2A adenosine receptor immunocontent and neuronal loss in the hippocampus of the animal model of Alzheimer’s disease induced by streptozotocin. Chronic caffeine treatment was effective in preventing the memory impairment and neuronal changes observed in Alzheimer’s disease rats. These assessments provide additional support for the hypothesis that caffeine consumption might be a valid strategy in preventing mnemonic deficit. Nonetheless, the positive effects of caffeine consumption were observed only among Alzheimer’s disease rats. Caffeine consumption had no effect over control animal’s performance.