Submitted by Maurílio Figueiredo (maurilioafigueiredo@yahoo.com.br) on 2013-03-13T19:56:47Z No. of bitstreams: 1 TESE_InfluênciaMetabolismoExtracelular.PDF: 1475554 bytes, checksum: 99839ae26ebfc2a908a5ac279c901e2b (MD5) / Approved for entry into archive by Neide Nativa (neide@sisbin.ufop.br) on 2013-03-15T15:59:45Z (GMT) No. of bitstreams: 1 TESE_InfluênciaMetabolismoExtracelular.PDF: 1475554 bytes, checksum: 99839ae26ebfc2a908a5ac279c901e2b (MD5) / Made available in DSpace on 2013-03-15T15:59:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 TESE_InfluênciaMetabolismoExtracelular.PDF: 1475554 bytes, checksum: 99839ae26ebfc2a908a5ac279c901e2b (MD5) Previous issue date: 2008 / Variações nos quadros clínicos da leishmaniose, observadas tanto na doença em humanos quanto em murinos, sugerem a existência de uma diferenciação, dependente da espécie, na capacidade de parasitos do gênero Leishmania causarem lesões no hospedeiro. A procura de fatores que diferenciam as espécies de Leishmania quanto à sua virulência se faz, então, necessária para o entendimento dos mecanismos pelos quais esses parasitos causam danos aos seus hospedeiros, possibilitando a descoberta de novas ferramentas de potencial terapêutico contra a leishmaniose. Componentes da via de metabolismo do ATP extracelular são candidatos potenciais para fatores de virulência desses parasitos, visto que tanto o ATP quanto a adenosina, produto da hidrólise de AMP, são capazes de influenciar a resposta imunológica do hospedeiro e, conseqüentemente, o estabelecimento do parasito. Essa hipótese é suportada pelo fato da Leishmania necessitar da utilização da via de salvação de purinas pela ação de enzimas, dentre elas as apirases, sobre o ATP extracelular, que possui propriedades imunoestimulantes, para gerar adenosina, produto da hidrólise do AMP pelas 5’-nucleotidases, cuja importância para o metabolismo do parasito e para a regulação da resposta imune está bem descrita na literatura. Para testar essa hipótese, nós estudamos três espécies de Leishmania com diferentes graus de virulência em camundongos C57BL/6: a mais virulenta L. amazonensis e as espécies L. braziliensis e L. major. Inicialmente, formas promastigotas metacíclicas e procíclicas desses parasitos foram testadas para sua capacidade de hidrolisar ATP, ADP ou AMP. As formas metacíclicas (infectantes) de L. amazonensis mostraram maior capacidade de hidrólise para os três nucleotídeos analisados, quando comparadas com as outras duas espécies menos virulentas. Além disso, sua capacidade de hidrólise de ATP foi maior que a das formas procíclicas da mesma espécie, sugerindo um controle de expressão de ATPases dependente de metaciclogênese. Posteriormente, foi verificado pelas técnicas de RTPCR, e “Western blotting” que, a despeito da ocorrência de expressão de mRNA para as isoformas solúvel e de membrana de apirases nas promastigotas metacíclicas das três espécies estudadas, somente extratos enriquecidos de membrana de L. amazonensis foram capazes de apresentar reação com anticorpo anti-apirase de T. cruzi. O inóculo de promastigotas metacíclicas desse parasito na presença de suramina, um inibidor de ecto ATPases, em camundongos C57BL/6, levou a uma diminuição no tamanho de lesão a partir da quarta semana de infecção e no parasitismo em 7 semanas de infecção. Por outro lado, a indução de maior atividade 5’-nucleotidásica dos parasitos ou a administração simultânea de adenosina ao inóculo levou a um aumento transiente no tamanho de lesão e a um maior parasitismo em 3 ou 4 semanas de infecção da mesma cepa de camundongos por promastigotas metacíclicas de L. braziliensis, resultado oposto ao obtido após o tratamento, no momento do inóculo, com o bloqueador de receptores A2B de adenosina, MRS 1754. Em conjunto, esses resultados sugerem que a redução dos níveis de ATP extracelular pela ação de enzimas expressas pelo parasito e/ou a elevação dos níveis de adenosina podem contribuir para o estabelecimento de parasitos do gênero Leishmania no hospedeiro vertebrado, indicando um possível alvo para futuras intervenções de caráter terapêutico contra as leishmanioses. ____________________________________________________________________________________________________ / ABSTRACT: The observed changes in clinical features of leishmaniasis in humans and mice suggest the existence of a specie-dependent differentiation in Leishmania ability to cause lesions on host. The search of factors that differentiate Leishmania species regarding their virulence is very important to the comprehension of the mechanisms underlying the grade of damage that these parasites may cause to the host, enabling the discovery of new tools with therapeutic potential against leishmaniasis. Components of extracellular ATP metabolism pathway are emerging candidates to determine the virulence of these parasites, since ATP and adenosine, a product of AMP hydrolysis, are able to influence the immunological response of the host and, in consequence, the parasite establishment. This hypothesis is supported by the fact that Leishmania parasites need to use the salvation pathway of purine nucleotides by the action of enzymes, amongst them the apyrases, over extracellular ATP, which display immunestimulatory features, to produce adenosine, a product of AMP hydrolysis by the action of 5’-nucleotidases, whose importance to the parasite metabolism and to the regulation of the immune response has been described in literature. In order to verify this hypothesis, we use three Leishmania species with different degrees of virulence in C57BL/6 mice: the more virulent L. amazonensis and its counterparts L. braziliensis and L. major species. Initially, metacyclic and procyclic promastigotes from these parasites were evaluated regarding their ability in hydrolyze ATP, ADP and AMP. L. amazonensis infective metacyclic forms showed higher hydrolytic ability to the three analyzed nucleotides, when compared to the other two less virulent species. Moreover, its ability to hydrolyze ATP was higher than that from procyclic forms deriving from the same specie, suggesting a metacyclogenesis-dependent control of ATPase expression. Later, using RT-PCR and Western blotting analysis, we observed that, in spite of the occurring expression of mRNA to soluble and membrane-bound apirase isoforms from metacyclic promastigotes in the three species, only enriched membrane extracts from L. amazonensis were capable to react with T. cruzi anti-apyrase antibody. The inoculum of metacyclic promastigotes of this parasite in the presence of suramin, an ecto-ATPase inhibitor, in C57BL/6 mice, lead to a decrease in lesion size 4 weeks of infection onward and in parasitism 7 weeks after infection. Otherwise, the induction of higher 5’-nucleotidasic activity of the parasites or the simultaneous administration of adenosine in the inoculum lead to a transient increasing in lesion size and increased tissue parasitism 3 or 4 weeks after the infection of the same strain of mice with L. braziliensis metacyclic promastigotes, opposite to the effects obtained after the treatment, at the moment of inoculum, with the A2B receptor antagonist MRS 1754. Together, these results suggest that the reduction in the levels of extracellular ATP by the action of enzymes expressed by the parasite and/or the increased levels of adenosine may contribute to the establishment of Leishmania parasites in the vertebrate host, indicating a possible target to future therapeutic interventions against leishmaniasis.

Este trabalho mostrou a purificação de uma apirase em extratos de tegumento de vermes adultos de S. mansoni com razão de hidrólise de ADP/ATP aproximadamente 2. Análise da amostra por MALDI-TOF evidenciou a presença de helicase e carboxilesterase, sendo que a atividade de hidrólise de ADP ainda não foi descrita para estas proteínas. Através de \"Western blot\" mostrou-se que a proteína purificada não tem epítopos reconhecíveis por anticorpo anti-apirase de batata, e que a imunoreatividade cruzada com apirase da família CD39 está presente na fração insolúvel que não foi utilizada no processo de purificação. Esta tese caracteriza também a utilização de \"primers\" consenso degenerados na construção de bibliotecas de cDNA com PCR de baixa estringência. A introdução do \"touch-down\" PCR aumentou o número médio de sequências não redundantes por biblioteca de 20 para 40. O \"touch-down\" associado ao uso de primers híbridos consenso-degenerados (40 pb) elevou a média de sequências não redundantes para 300. Este número significa uma diminuição de cerca de 10 vezes na quantidade de trabalho de clonagem e sequenciamento necessário para se gerar o mesmo montante de dados (Fietto et al., 2000, addendum patent application Nº196,716). A diminuição da concentração de sal na reação e abaixamento da velocidade de rampa entre os passos de anelamento e extensão gerou os melhores perfis de amplificação de cDNA. Bibliotecas feitas com primers híbridos mais curtos (25 pb) mostraram-se mais redundantes, refletindo uma maior especificidade por certas sequências alvo. Com estes primers, usando-se RNAm de tegumento, clonamos um fragmento parcial de cDNA altamente homólogo à CD39 de camundongo. Esta sequência serviu como base para o isolamento de grande parte do gene de Schistosoma (2,9 Kb) através de RACE-PCR (Rapid Amplification of cDNA Ends). / This work shows purification of an apyrase from the tegument membrane of S. mansoni adult worms that exhibited an ADP/ATP hydrolysis ratio near 2. MALDI-TOF analyses showed that helicase and carboxylesterase were present in the sample, however in the literature there is no ADPase activity described for either enzyme. Western blot analyses showed that the purified apyrase ha no epitopes common to members of the CD39 apyrase family. On the other hand, a CD39-like apyrase remained in the insoluble fraction that was not used in the purification procedures. This work studied the construction of cDNA libraries with Hybrid Consensus-degenerate Oligonucleotide Primers (40bp) and low stringency RT-PCR. Introduction of touch-down PCR in the standard ORESTES technique improved the number of non-redundant sequences per library twofold. Association of touch-down with hybrid consensus-degenerated oligonucleotide primers increased this number to 300 sequences per library. The modifications resulted in a 10-fold decrease in the amount of work required for libraries construction and high-throughput sequencing (Fietto et al., 2000; addendum to patent application #196,716 - Ludwig Institute for Cancer Research). The best amplification profiles were obtained in RT-PCR reactions with low salt and a slow temperature ramp. Libraries made with shorter hybrid primers (25bp) showed more redundant sequences, reflecting a higher specificity for few templates. These shorter primers were used in combination with tegument mRNA to clone a gene fragment homologous to CD39 of mouse. This sequence was used in RACE-PCR reactions (rapid amplification of cDNA ends) to clone a 2.9 Kb cDNA corresponding to most of the predicted coding sequence of the Schistosoma gene.

Este trabalho mostrou a purificação de uma apirase em extratos de tegumento de vermes adultos de S. mansoni com razão de hidrólise de ADP/ATP aproximadamente 2. Análise da amostra por MALDI-TOF evidenciou a presença de helicase e carboxilesterase, sendo que a atividade de hidrólise de ADP ainda não foi descrita para estas proteínas. Através de \"Western blot\" mostrou-se que a proteína purificada não tem epítopos reconhecíveis por anticorpo anti-apirase de batata, e que a imunoreatividade cruzada com apirase da família CD39 está presente na fração insolúvel que não foi utilizada no processo de purificação. Esta tese caracteriza também a utilização de \"primers\" consenso degenerados na construção de bibliotecas de cDNA com PCR de baixa estringência. A introdução do \"touch-down\" PCR aumentou o número médio de sequências não redundantes por biblioteca de 20 para 40. O \"touch-down\" associado ao uso de primers híbridos consenso-degenerados (40 pb) elevou a média de sequências não redundantes para 300. Este número significa uma diminuição de cerca de 10 vezes na quantidade de trabalho de clonagem e sequenciamento necessário para se gerar o mesmo montante de dados (Fietto et al., 2000, addendum patent application Nº196,716). A diminuição da concentração de sal na reação e abaixamento da velocidade de rampa entre os passos de anelamento e extensão gerou os melhores perfis de amplificação de cDNA. Bibliotecas feitas com primers híbridos mais curtos (25 pb) mostraram-se mais redundantes, refletindo uma maior especificidade por certas sequências alvo. Com estes primers, usando-se RNAm de tegumento, clonamos um fragmento parcial de cDNA altamente homólogo à CD39 de camundongo. Esta sequência serviu como base para o isolamento de grande parte do gene de Schistosoma (2,9 Kb) através de RACE-PCR (Rapid Amplification of cDNA Ends). / This work shows purification of an apyrase from the tegument membrane of S. mansoni adult worms that exhibited an ADP/ATP hydrolysis ratio near 2. MALDI-TOF analyses showed that helicase and carboxylesterase were present in the sample, however in the literature there is no ADPase activity described for either enzyme. Western blot analyses showed that the purified apyrase ha no epitopes common to members of the CD39 apyrase family. On the other hand, a CD39-like apyrase remained in the insoluble fraction that was not used in the purification procedures. This work studied the construction of cDNA libraries with Hybrid Consensus-degenerate Oligonucleotide Primers (40bp) and low stringency RT-PCR. Introduction of touch-down PCR in the standard ORESTES technique improved the number of non-redundant sequences per library twofold. Association of touch-down with hybrid consensus-degenerated oligonucleotide primers increased this number to 300 sequences per library. The modifications resulted in a 10-fold decrease in the amount of work required for libraries construction and high-throughput sequencing (Fietto et al., 2000; addendum to patent application #196,716 - Ludwig Institute for Cancer Research). The best amplification profiles were obtained in RT-PCR reactions with low salt and a slow temperature ramp. Libraries made with shorter hybrid primers (25bp) showed more redundant sequences, reflecting a higher specificity for few templates. These shorter primers were used in combination with tegument mRNA to clone a gene fragment homologous to CD39 of mouse. This sequence was used in RACE-PCR reactions (rapid amplification of cDNA ends) to clone a 2.9 Kb cDNA corresponding to most of the predicted coding sequence of the Schistosoma gene.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:51:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1544318 bytes, checksum: 458a87e82a4f75c2f8b02abcdb7d9ed9 (MD5) Previous issue date: 2009-08-21 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The yeast Kluyveromyces lactis has a potential applicability as a host in biotechnological production of heterologous recombinant proteins of biotechnological interest. In this context the objective of this work was to express the protein of Leishmania major GDPase for biotechnology applied to human and canine leishmaniasis. The GDPase of L. major belongs to the family of E-NTPDases or apirases, proteins involved in infectivity and virulence of parasites. For a system of expression and secretion of heterologous proteins in K. lactis, the technique of polymerase chain reaction (PCR) was used to amplify a sequence of 2073 bp covering the complete coding region of the GDPase "of L. major, which is inserted into the amplicon plasmid pKLAC1 sites in Sal I and Bgl II.The construction pKLAC1- GDPase was confirmed by PCR, linearized by the enzyme Ahd I and used for transformation of wild strain CBS 2359. The transformants were selected in YCB medium containing 5 mM acetamide induced in batch and in YPGal. Extract and supernatant of these cultures were analyzed by SDS-PAGE and Western blot using a polyclonal antiserum anti-GDPase of L. major. The analysis revealed a single protein of approximately 120 kDa in the wild strains and transformants of K. lactis. Perform a search in GenBank are two homologous genes in the genome of yeast: KlGDA1 and KlYND1que may explain the cross-reactivity. The results point to the failure to obtain transformants producing GDPase of L. major, probably due not to reconstitute the promoter PLAC4 that would direct the expression of the gene of GDPase. But that raises the chances of a wild strain to be tested as to induce the production of antibodies against species of the genus Leishmania and signal that the system contains flaws that compromise its use due to the dependence of reconstitution of the promoter PLAC4. / A levedura Kluyveromyces lactis apresenta potencial aplicabilidade biotecnológica como hospedeira na produção heteróloga de proteínas recombinantes de interesse biotecnológico. Neste contexto o objetivo deste trabalho foi expressar a proteína GDPase de Leishmania major em K. lactis para fins biotecnológicos aplicados às leishmanioses humana e canina. A GDPase de L. major pertence à família das E-NTPDases ou apirases, proteínas envolvidas na infectividade e virulência de parasitos. A técnica da Reação da Polimerase em Cadeia (PCR) foi utilizada para amplificar uma seqüência de 2073 pb referente a região codificante completa da GDPase de L. major, sendo este amplicon inserido no plasmídeo pKLAC1 nos sítios Sal I e Bgl II. A construção pKLAC1-GDPase foi confirmada por PCR, linearizada pela enzima Ahd I e utilizada para transformação da cepa selvagem de K. lactis CBS 2359. Os transformantes foram selecionados em meio YCB contendo 5 mM de acetamida e cultivados sob condições de indução em batelada em meio YPGal. Extrato e sobrenadante destas culturas foram analisados por SDS-PAGE e Western Blot utilizando um anti-soro policlonal anti-GDPase de L. major. As análises revelaram uma única proteína de cerca de 120 kDa nas cepas selvagem e transformantes de K. lactis. Pesquisa no Genbank revelou a presença de dois genes homólogos a GDPase no genoma da levedura: KlGDA1 e KlYND1que podem explicar a reatividade cruzada. Os resultados demonstram que os transformantes obtidos não produzem a GDPase de L. major, provavelmente devido a não reconstituição do promotor PLAC4 que dirigiria a expressão do gene da GDPase. Porém levanta as hipóteses de que a cepa selvagem possa ser testada quanto à indução da produção de anticorpos contra espécies do gênero Leishmania e de sinalizar que o sistema utilizado contém falhas que comprometem seu uso, devido à dependência de reconstituição do promotor PLAC4.

Plasmodium falciparum e Toxoplasma gondii são protozoários parasitas pertencentes ao filo Apicomplexa. Apirases são enzimas metabolizadoras de nucleotídeos extracelulares. Nesta tese mostramos pela primeira vez a presença de um membro desta família de enzimas em P. falciparum, o qual foi capaz de degradar ATP extracelular. Análises por RT-qPCR revelaram a expressão da apirase durante todo o ciclo intraeritrocítico. A adição de inibidores desta classe de enzimas foi capaz de prejudicar o desenvolvimento dos parasitas e a invasão de novas hemácias pelos merozoitos, sugerindo assim um papel da apirase nestes processos. A via de sinalização por Ca2+ é universal e vital para todas as células. Para melhor entender a fisiologia celular de P. falciparum construímos uma nova linhagem de parasitas transgênicos, PfGCaMP3, que nos tornam capazes de monitorar a dinâmica de Ca2+ sem o uso de protocolos invasivos de marcação. De modo semelhante utilizamos uma nova linhagem de T. gondii expressando de forma estável o indicador de Ca2+ GCaMP3 para estudar o papel deste íon na saída da célula. T. gondii possui o Ca2+ necessário para promover este processo, entretanto Ca2+ extracelular age como um fator intensificador neste passo essencial do ciclo lítico. / Plasmodium falciparum and Toxoplasma gondii are protozoan parasites that belong to phylum Apicomplexa. Apirases are metabolizing enzymes of extracellular nucleotides. In this work we show for the first time the presence of an apyrase in P. falciparum, which was able to degrade extracellular ATP. RTqPCR analysis revealed the expression of apyrase throughout the intraerythrocytic cycle. Addition of apyrase inhibitors was able to impair the development of the parasites and the invasion of new erythrocytes by merozoites, thus suggesting a role of apyrase in these processes. Calcium signaling is universal and vital to all cells. To better understand the cellular physiology of P. falciparum we construct a new strain of transgenic parasites, PfGCaMP3, which enable us to monitor the Ca2+ dynamics without using invasive protocols. Similarly we use a new strain of T. gondii that stably express the Ca2+ indicator GCaMP3 to study the role Ca2+ in parasite egress. T. gondii has the Ca2+ required to promote this process, however extracellular Ca2+ acts as an enhancer factor in this crucial step of the lytic cycle.

Submitted by isabela.moljf@hotmail.com (isabela.moljf@hotmail.com) on 2017-05-12T15:33:22Z No. of bitstreams: 1 thaisvieirasoares.pdf: 151024 bytes, checksum: dfb7ee8f9e6e385cff4e13ff23904a99 (MD5) / Approved for entry into archive by Adriana Oliveira (adriana.oliveira@ufjf.edu.br) on 2017-05-12T15:42:37Z (GMT) No. of bitstreams: 1 thaisvieirasoares.pdf: 151024 bytes, checksum: dfb7ee8f9e6e385cff4e13ff23904a99 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-05-12T15:42:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 thaisvieirasoares.pdf: 151024 bytes, checksum: dfb7ee8f9e6e385cff4e13ff23904a99 (MD5) Previous issue date: 2012-07-18 / FAPEMIG - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais / Um polipeptídio originado do domínio B conservado da apirase de batata (r78-117), homólogo ao domínio B da isoforma ATPDase 2 de Schistosoma mansoni (r156-195), foi obtido como um polipeptídio com cauda de hexahistidina (r-potDomínio B). Anticorpos policlonais anti-r-potDomínio B, quando imobilizados em Proteína A-Sepharose, imunoprecipitaram 67-91% das atividades ATPásica e ADPásica de preparação de vermes adultos. Por “Western blots”, o soro imune reconheceu bandas de 63 e 55 kDa na preparação do parasito e no complexo imunoprecipitado, confirmando a identidade da isoforma ATPDase 2. Adicionalmente, anticorpos policlonais anti-r-potDomínio B inibiram 38-58% das atividades ATPásica e ADPásica, sugerindo que o domínio B da ATPDase 2 de S.mansoni é um novo alvo para o desenho de inibidores. Amostras de soros de pacientes com esquistossomose foram testados em ELISA usando r-potDomínio B como antígeno. A soropositividade da subclasse IgG1 (27%, 8/30), IgG2 (27%, 8/30), IgG3 (50%, 15/30) ou IgG4 (17%, 5/30) sugeriu que o domínio B da ATPDase 2 está potencialmente envolvido na resposta imune do hospedeiro. A apirase de batata ou r-potDomínio B, emulsificado em adjuvantes Completo e Incompleto de Freund, foi inoculado em camundongos Suíços, aumentando a produção de anticorpos IgG, os quais foram também reativos com antígenos solúveis de ovos (SEA). Imunidade protetora induzida por cada biomolécula foi avaliada 60 dias após o desafio com cercárias. Nenhuma redução de vermes ou do número de ovos foi observada. Camundongos imunizados com apirase de batata desenvolveram altos níveis de anticorpos IgG1 reativos com as biomoléculas e SEA, enquanto anticorpos IgG2a foram produzidos em menor proporção, sugerindo uma tendência de resposta imune do tipo Th2. O r-potDomínio B foi capaz de induzir maior produção de anticorpos IgG2a reativos com as biomoléculas e SEA, uma resposta imune possivelmente associada ao tipo Th1. Análises histológicas de cortes de fígado corados por hematoxilina-eosina, obtidos de camundongos imunizados com apirase de batata, mas não com r-potDomínio B, mostraram uma redução significativa na área do granuloma, como evidenciado pela redução do número de células e substituição por fibras de colágeno. Estudos futuros destas biomoléculas poderão contribuir para um melhor entendimento da interação parasito e hospedeiro, e poderão ser exploradas como novas ferramentas de estudo da esquistossomose. / A polypeptide belonging to the conserved domain B (r78-117) from the potato apyrase, homologue to the domain B (r156-195) from the S. mansoni ATPDase 2 isoform, was obtained as a 6xHis tag polypeptide (r-potDomain B). Polyclonal anti-r-potDomain B antibodies, when immobilized on Protein A-Sepharose, immunoprecipitated 67-91% of the ATPase and ADPase activities from the adult worm preparation. By Western blots, the immune serum recognized band of 63 and 55 kDa in both parasite preparation and immunoprecipitated complex, confirming the ATPDase 2 identity. Additionally, polyclonal anti-r-potDomain B antibodies inhibited 38-58% of the ATPase and ADPase activities, suggesting that the domain B from the S.mansoni ATPDase 2 is a new target for inhibitor design. Serum samples from patients with schistosomiasis were tested in ELISA using r-potDomain B as coating antigen. The seropositivity of the subclass IgG1 (27%, 8/30), IgG2 (27%, 8/30), IgG3 (50%, 15/30) or IgG4 (17%, 5/30) suggested that the domain B from the ATPDase 2 is potentially involved in the host immune response. The potato apyrase or r-potDomain B, emulsified in Freund Complete and Incomplete adjuvants, was inoculated in Swiss mice, increasing the IgG antibodies production, which were also reactive with soluble egg antigens (SEA). Protective immunity induced by each biomolecule was evaluated 60 days after challenge infection. No worm burden or egg number reduction was observed. Mice immunized with potato apyrase developed high IgG1 antibody levels, reactive with either biomolecules or SEA, while IgG2a antibody levels were produced in lower proportion, suggesting a tendency of a Th2 type immune response. The r-potDomain B was able to induce higher IgG2a antibody production, an immune response possibly associated to the Th1 type. Histological analyses of haematoxylin-eosin-sections obtained from mice immunized with potato apyrase, but not with r-potDomain B, showed a significant reduction in liver granuloma area as evidenced by the cells number reduction and substitution by collagen fibbers. Further studies of these biomolecules could contribute to a better understanding of host-parasite interactions, and may to be explored as new tools in schistosomiasis research.

Submitted by isabela.moljf@hotmail.com (isabela.moljf@hotmail.com) on 2018-08-06T18:07:50Z No. of bitstreams: 0 / Approved for entry into archive by Adriana Oliveira (adriana.oliveira@ufjf.edu.br) on 2018-08-06T18:12:47Z (GMT) No. of bitstreams: 0 / Made available in DSpace on 2018-08-06T18:12:47Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-03-30 / FAPEMIG - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais / Por análises in silico, um domínio B conservado e antigênico foi previamente identificado em nucleosídeo trifosfato difosfohidrolases (NTPDases) de plantas e parasitos. O r-potDomB, um recombinante derivado do domínio B (r78-117) da apirase de batata, foi obtido por expressão heteróloga, e a sua reatividade com anticorpos policlonaisanti-apirase de batata confirmaram a existência de epitopos indutores de resposta imune humoral em mamíferos. A clonagem do gene da NTPDase1 de Leishmania amazonensis (LamNTPDase1; NCBI: AFJ22627.1) e as análises in silico reforçaram a hipótese de conservação do domínio B de NTPDases. O r-potDomB, os peptídeos sintéticos LbB1LJ e LbB2LJ derivados do domínio B de NTPDase1 de Leishmania, e os anticorpos produzidos contra estas biomoléculas, foram usados como ferramentas moleculares para estudos específicos da NTPDase1 de L. amazonensis e da leishmaniose. Por “Western blots”, a NTPDase1 foi identificada como bandas de 48 e 63 kDa em frações de membrana, microssomal e flagelo de promastigotas. Por análise imunocitoquímicaultraestrutural, os anticorpos localizaram a NTPDase1 na superfície de membrana plasmática, núcleo, mitocôndria e cinetoplasto, bolsa flagelar e flagelo, confirmando sua ampla distribuição neste parasito. Análises in silico sugeriram as possíveis modificações pós-traducionais da NTPDase1, incluindo a sua conjugação com proteína SUMO. Os polipeptídeos de 48 e 63 kDa e um co-migrante de 12 kDa foram isolados de promastigotas por eletroforese em gel não-desnaturante. Por “Western blots” e espectrometria de massas, a identidade da NTPDase1 foi confirmada nospolipeptídeos de 48 e 63 kDa. Por espectrometria de massas, o polipeptídeo de 12 kDa foi identificado como pertencente à família de proteínas SUMO e, também, adicionado aopolipeptídeo de 63 kDa. Os polipeptídeos de 63 kDa e 12 kDa, mas não o de 48 kDa, foram reconhecidos em “Western blots” pelo soro imune anti- SUMO1, sugerindo a ligação entre NTPDase1 e SUMO, uma modificação descrita pela primeira vez entre os membros da família das NTPDases. Camundongos BALB/c foram infectados com promastigotas, e os anticorpos destes animais reconheceram a NTPDase1 pura, mas não SUMO, confirmando sua antigenicidade. Durante a progressão da doença, alta reatividade entre r-potDomB, LbB1LJ ou LbB2LJ e anticorpos IgG2a dos camundongos infectados foi observada aos 40 dias pós-infecção, revelando a antigenicidade do domínio B e a sua habilidade de induzir a produção deste subtipo nos estágios iniciais da doença. A reatividade de IgG1 foi significativamente maior aos 90-120 dias pós-infecção, coincidindo com o estágio mais ativo da doença, sugerindo participação do domínio em eventos imunoregulatórios. O r-potDomB induziu reação de hipersensibilidade tardia em camundongos Suíços, uma resposta imune celular, com elevação concomitante dos níveis de IgG2a e IFN-y. O r-potDomB, na ausência de adjuvante, usado na préimunização de camungondos Suíços infectados com amastigotas, estimulou a produção de IgG2a e IFN-y, e promoveu proteção parcial contra a progressão da leishmaniose como observado por medida de edema de patas e análises histopatológicas.Os resultados estimulam o aproveitamento biotecnológico do rpotDomB, ou derivados desta biomolécula, em formulações e em protocolos experimentais de imunoterapia e/ou vacinação contra leishmanioses. / By in silico analysis, an antigenic conserved B domain was previously identified within nucleoside triphosphate diphosphohydrolases (NTPDases) of plants and parasites. The r-potDomB, a recombinant belonging to the conserved B domain (r78- 117) from the potato apyrase, was obtained by heterologous expression, and its reactivity with polyclonal anti-potato apyrase antibodies confirmed the existence of epitopes which induce humoral immune response in mammalian. The cloning of the gene from the Leishmania amazonensisNTPDase 1 (LamNTPDase1; NCBI AFJ22627.1) and in silico analysis reinforced the hypothesis of B-domain conservation within NTPDases. The r-potDomB, synthetic peptides LbB1LJ and LbB2LJ derived from the B-domain from LeishmaniaNTPDase 1, and the antibodies raised against these biomolecules, were used as molecular tools for specific studies of the L. amazonensisNTPDase 1 and leishmaniasis. By Western blots, theNTPDase 1 was identified as bands of 48 and 63 kDa in membrane, microsomal and flagellar fractions of promastigotes. By ultrastructural immunocytochemical, the antibodies localized the NTPDase 1 at the surface of plasma membrane, nucleus, mitochondria and kinetoplast, at flagellar pocket and flagellum, confirming its widespread distribution in this parasite. In silico analysis suggested possible post-translational modifications of the NTPDase 1, including its conjugation with SUMO protein. The polypeptides of 48 and 63 kDa and one co-migrant of 12 kDa were isolated of promastigotes by non-denaturing gel electrophoresis. By Western blots and mass spectrometry, the identity of NTPDase1 in the polypeptides of 48 e 63 kDa was confirmed. By mass spectrometry, the polypeptide of 12 kDa was identified belonging to the SUMO protein family and, also, added to the polypeptide of 63 kDa. The polypeptides of 63 and 12 kDa, but not 48 kDa, were recognized in Western blots by immune serum anti-SUMO1, suggesting binding between NTPDase 1 and SUMO, a modification described for the first time among members of the NTPDase family. BALB/c mice were infected with promastigotes, and the antibodies from these animals recognized the pure NTPDase, but not SUMO, confirming its antigenicity. During disease progression, high reactivity between r-potDomB, LbB1LJ or LbB2LJ and IgG2a antibodies of the promastigote-infected mice was observed at 40 days post-infection, revealing both the B-domain antigenicity and its ability for induce the production of this subtype in early disease stages. The IgG1 reactivity was significantly higher at 90-120 days post-infection, coinciding with the most active stage of the disease, suggesting participation of the domain in immuneregulatory events. The r-potDomB induced delayed type-hypersensitivity reaction in Swiss mice, a cellular immune response, with a concomitant increase in the levels of IgG2a and IFN-y. The r-potDomB, in the absence of adjuvant, used in pre-immunization of amastigotes-infected Swiss mice, stimulated the production of IgG2a and IFN-y, and promoted partial protection against leishmaniasis progression, as observed by measuring of footpad swelling and histopathological analysis. The results stimulate biotechnological use of the r-potDomB, or derivatives of this biomolecule, in formulations and experimental protocols of immunotherapy and/or vaccination against leishmaniasis.

Plasmodium falciparum e Toxoplasma gondii são protozoários parasitas pertencentes ao filo Apicomplexa. Apirases são enzimas metabolizadoras de nucleotídeos extracelulares. Nesta tese mostramos pela primeira vez a presença de um membro desta família de enzimas em P. falciparum, o qual foi capaz de degradar ATP extracelular. Análises por RT-qPCR revelaram a expressão da apirase durante todo o ciclo intraeritrocítico. A adição de inibidores desta classe de enzimas foi capaz de prejudicar o desenvolvimento dos parasitas e a invasão de novas hemácias pelos merozoitos, sugerindo assim um papel da apirase nestes processos. A via de sinalização por Ca2+ é universal e vital para todas as células. Para melhor entender a fisiologia celular de P. falciparum construímos uma nova linhagem de parasitas transgênicos, PfGCaMP3, que nos tornam capazes de monitorar a dinâmica de Ca2+ sem o uso de protocolos invasivos de marcação. De modo semelhante utilizamos uma nova linhagem de T. gondii expressando de forma estável o indicador de Ca2+ GCaMP3 para estudar o papel deste íon na saída da célula. T. gondii possui o Ca2+ necessário para promover este processo, entretanto Ca2+ extracelular age como um fator intensificador neste passo essencial do ciclo lítico. / Plasmodium falciparum and Toxoplasma gondii are protozoan parasites that belong to phylum Apicomplexa. Apirases are metabolizing enzymes of extracellular nucleotides. In this work we show for the first time the presence of an apyrase in P. falciparum, which was able to degrade extracellular ATP. RTqPCR analysis revealed the expression of apyrase throughout the intraerythrocytic cycle. Addition of apyrase inhibitors was able to impair the development of the parasites and the invasion of new erythrocytes by merozoites, thus suggesting a role of apyrase in these processes. Calcium signaling is universal and vital to all cells. To better understand the cellular physiology of P. falciparum we construct a new strain of transgenic parasites, PfGCaMP3, which enable us to monitor the Ca2+ dynamics without using invasive protocols. Similarly we use a new strain of T. gondii that stably express the Ca2+ indicator GCaMP3 to study the role Ca2+ in parasite egress. T. gondii has the Ca2+ required to promote this process, however extracellular Ca2+ acts as an enhancer factor in this crucial step of the lytic cycle.

Submitted by isabela.moljf@hotmail.com (isabela.moljf@hotmail.com) on 2017-08-17T12:32:21Z No. of bitstreams: 1 micheliaantoniadonascimentogusmao.pdf: 2641235 bytes, checksum: 154c338e19fb47129f176bdceb0cf92e (MD5) / Rejected by Adriana Oliveira (adriana.oliveira@ufjf.edu.br), reason: on 2017-08-24T11:26:04Z (GMT) / Submitted by isabela.moljf@hotmail.com (isabela.moljf@hotmail.com) on 2017-08-24T15:14:14Z No. of bitstreams: 0 / Approved for entry into archive by Adriana Oliveira (adriana.oliveira@ufjf.edu.br) on 2017-08-30T14:21:34Z (GMT) No. of bitstreams: 0 / Made available in DSpace on 2017-08-30T14:21:34Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2017-02-17 / A esquistossomose é uma doença tropical negligenciada que acomete milhões de pessoas no mundo. A falta de vacina para essa doença helmíntica impulsiona a busca por moléculas antigênicas oriundas dos parasitos do gênero Schistosoma. Dentre as moléculas consideradas como promissoras, se encontra a ATP difosfohidrolase de Schistosoma mansoni. O parasito possui duas isoformas de desta enzima que são denominadas SmATPDases e são expressas em todos as fases do ciclo de vida deste helminto. A apirase de batata é uma proteína vegetal pertencente à mesma família de enzimas do parasito, compartilha epitopos com as isoformas de SmATPDases. Dessa forma, o objetivo deste trabalho foi realizar a caracterização imunológica da apirase de batata em modelo de infecção murina experimental com base nessa homologia protéica. A proteína vegetal foi inoculada em camundongos C57BL/6 que posteriormente foram infectados com cercárias de S. mansoni. A proteína vegetal induziu níveis significativos de anticorpos IgG e IgG1 após a imunização, os quais se mantiveram elevados na análise 60 dias após a infecção. A cultura de esplenócitos dos animais imunizados respondeu ao estímulo com a proteína vegetal, induzindo a produção de níveis significativos de IFN-γ, IL-10 e IL-5, mas não de IL-13. O processo de imunização não conferiu proteção, sendo incapaz de promover a redução da carga parasitária. O efeito imunomodulador da imunização foi observado através de uma redução da área afetada pela reação granulomatosa hepática nos animais imunizados. Em relação à ligação de anticorpos IgE, a apirase de batata mostrou reatividade significativa com estes anticorpos presentes em amostras do plasma de pacientes com esquistossomose. Em ensaios de Western blotting, os anticorpos IgE foram capazes de reconhecer três proteínas presentes no homogeneizado de vermes adultos do helminto, com 91, 63 e 55 kDa. Foi possível inferir que todas as bandas reveladas correspondem a isoformas de SmAPTDases com distintos processamentos pós-tradução, tais como glicosilação e proteólise. Comprovando esta reatividade, foi possível verificar que a imunização dos animais (C57BL/6) com a proteína vegetal foi capaz de induzir a produção significativa de anticorpos IgE detectáveis em técnicas de ELISA e Western blotting. Como a apirase de batata possui identidade com a NTPDase 1 (CD39) de mamíferos sugerimos que os pacientes possuam anticorpos naturais contra NTPDases envolvidos na manutenção da homeostase do organismo. O conjunto de dados obtidos mostra que a apirase de batata possui um perfil imunoregulatório na esquistossomose, podendo contribuir para a redução da morbidade, induzindo a produção de anticorpos IgE, tidos como protetores na esquistossomose. / Schistosomiasis is a neglected tropical disease that affects millions of people around the world. The lack of vaccine for this helminth disease prompts a search for antigenic molecules from the parasites of the genus Schistosoma. Among the molecules considered promising are an ATP diphosphohydrolase from Schistosoma mansoni. The parasite has two enzyme isoforms which are termed SmATPDases and are expressed in all as life cycle phases of this helminth. The potato apyrase is a plant protein belonging to the same family of parasite enzymes, shared epitopes with SmATPDase isoforms. Thus, the objective of this work was to perform an immunological characterization of potato apyrase in a model of experimental murine infection based on this protein homology. Plant protein was inoculated into C57BL / 6 mice that were infected with S. mansoni cercariae. Plant protein induced significant levels of IgG and IgG1 antibodies after immunization, which remained high for analysis 60 days after infection. The solenocytes culture of the immunized animals responded to the stimulus with a plant protein, inducing a significant production of IFN-γ, IL-10 and IL-5, but not IL-13. The immunization process did not provide protection, being unable to promote a reduction of the parasitic load. The immunomodulatory effect of immunization was observed through a reduction of the area affected by the hepatic granulomatous reaction in the immunized animals. Concerning the binding of IgE antibodies, potato apyrase showed significant reactivity with these antibodies present in plasma samples from patients with schistosomiasis. In Western blotting assays, IgE antibodies were able to recognize three non-homogenized languages of adult helminth worms at 91, 63 and 55 kDa. It was possible to infer that all the bands revealed correspond to SmAPTDase isoforms with various post-translational processing, such as glycosylation and proteolysis. (C57BL / 6) with a plant protein capable of inducing a significant production of IgE antibodies detected in ELISA and Western blotting techniques. As potato apyrase has an identity with a mammalian NTPDase 1 (CD39), we suggest that patients have an antibody against the NTPDases involved in maintaining the body's homeostasis. The obtained data show that the potato harvest has an immunoregulatory profile in schistosomiasis, and may contribute to the reduction of morbidity, inducing a production of IgE antibodies, considered as protectors in schistosomiasis.

Submitted by Renata Lopes (renatasil82@gmail.com) on 2016-05-11T13:29:19Z No. of bitstreams: 1 micheliaantoniadonascimentogusmao.pdf: 2029497 bytes, checksum: 4ab5e6f5d64e0b6010c2ea583d1ed036 (MD5) / Approved for entry into archive by Adriana Oliveira (adriana.oliveira@ufjf.edu.br) on 2016-06-20T18:43:57Z (GMT) No. of bitstreams: 1 micheliaantoniadonascimentogusmao.pdf: 2029497 bytes, checksum: 4ab5e6f5d64e0b6010c2ea583d1ed036 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-20T18:43:57Z (GMT). No. of bitstreams: 1 micheliaantoniadonascimentogusmao.pdf: 2029497 bytes, checksum: 4ab5e6f5d64e0b6010c2ea583d1ed036 (MD5) Previous issue date: 2013-03-06 / FAPEMIG - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais / A esquistossomose é uma doença que acomete cerca de 200 milhões de pessoas no mundo causando grande morbidade. Devido à falta de vacina para essa doença, muitos antígenos são pesquisados. Um domínio antigênico B (r156-195) da ATPDase 2 de Schistosoma mansoni foi previamente descrito, e dois peptídeos sintéticos (SmB1LJ, r155-176; SmB2LJ, r175-194) derivados deste domínio foram obtidos com o objetivo de avaliar a imunogenicidade dessa proteía. O inóculo de cada peptídeo em camundongos BALB/c induziu atividade imunoestimulatória significativa, elevando os níveis de anticorpos IgG1 e IgG2, como detectado por ELISA. Os anticorpos policlonais anti-SmB1LJ e anti-SmB2LJ, quando imobilizados em Proteína A-Sepharose, imunoprecipitaram aproximadamente 42-96% da atividade ADPásica da preparação de verme adulto. Por “Western blots” do complexo imunoprecipitado, três bandas de 76, 63 e 55 kDa foram identificadas pelos dois soros imunes, confirmando a identidade da ATPDase 2, e sugerindo que esta proteína está sujeita a vários processamentos pós-tradução, tais como glicosilação e proteólise, resultando finalmente em uma proteína secretada de 55 kDa. Adicionalmente, anticorpos policlonais anti-SmB2LJ inibiram 62% e 37% das atividades ATPásica e ADPásica, respectivamente, enquanto anticorpos policlonais anti-SmB1LJ inibiram ADPase (92%), mas não atividade ATPásica, sugerindo que o domínio B da ATPDase 2 do S. mansoni está envolvido na regulação catalítica da enzima, sendo um novo alvo para o desenho de inibidores. Imunomarcação com anticorpos policlonais anti-SmB2LJ de cortes de fígado de camundongo infectado revelaram reações positivas na superfície externa do miracídio no ovo de S. mansoni. Fluorescência intensa foi detectada na região entre o miracídio e o lado interno da casca do ovo, localizada no envelope de von Lichtenberg, a qual é uma região de produção de componentes imunogênicos. Fluorescência foi também detectada no lado de fora da casca do ovo, aprisionada pelos microespinhos de superfície, confirmando que esta proteína, como no verme adulto, é também secretada de ovos de S. mansoni. Nenhuma reatividade foi observada nos tecidos granulomatosos circundantes. Amostras de plasmas de camundongos Swiss infectados com S. mansoni foram testadas por ELISA usando SmB1LJ or SmB2LJ como antígeno. Reatividade significativamente maior de anticorpos IgG, IgG1 ou IgG2a foi detectada com SmB1LJ, enquanto somente anticorpo IgG1 foi altamente reativo com SmB2LJ. A reatividade de amostras de plasma (diluídas 1:200) de camundongos Swiss previamente inoculados com apirase de batata ou r-potDomínio B, um polipeptídio com cauda de hexahistidina derivado do domínio B (r78-117) da apirase de batata, e homólogo ao domínio B da ATPDase 2, foi também testada por ELISA usando os peptídeos como antígenos. Anticorpos policlonais IgG e IgG1 anti-apirase de batata reagiram significativamente com SmB1LJ, enquanto somente IgG1 reagiu com SmB2LJ. Anticorpos policlonais anti-r-potDomínio B não reagiram significativamente com SmB2LJ. Comparado aos controles, amostras de plasma (diluídas 1:200) destes animais pré-imunizados com apirase de batata ou r-potDomínio B e desafiados com S. mansoni não reagem significativamente com os peptídeos. Os resultados confirmaram que o domínio B da ATPDase 2 está potencialmente envolvido na resposta imune do hospedeiro, e os peptídeos SmB1LJ e SmB2LJ podem ser usados em estudos da esquistossomose. / Schistosomiasis is a disease that affects approximately 200 million people worldwide causing great morbidity. Due to lack of vaccine for this disease, many antigens are searched. An antigenic domain B (r156-195) from the Schistosoma mansoni ATPDase 2 isoform was previously described, and two synthetic peptides (SmB1LJ, r155-176; SmB2LJ, r175-194) belonging to this domain were obtained. Inoculation of each peptide in healthy BALB/c mice induced significant immunostimulatory activity, increasing the IgG1 and IgG2a antibody levels, as detected by ELISA. The polyclonal anti-SmB1LJ and anti-SmB2LJ antibodies, when immobilized on Protein A-Sepharose, immunoprecipitated approximately 42-96% of the ADPase activity from the adult worm preparation. By Western blots of immunoprecipitated complex, three bands of 76, 63 and 55 kDa were identified by the two immune sera, confirming the ATPDase 2 identity, and suggesting that this protein is subject to several posttranslational processing, such as glycosylation and proteolysis, resulting finally in a secreted protein of 55 kDa. Additionally, polyclonal anti-SmB2LJ antibodies inhibited 62% and 37% of the ATPase and ADPase activities, respectively, whereas polyclonal anti-SmB1LJ antibodies inhibited ADPase (92%), but not ATPase activity, suggesting that the domain B from the S. mansoni ATPDase 2 is involved in enzyme catalytic regulation, being a new target for inhibitor design. Immunolabelled cryostat sections of infected mouse liver by the anti-SmB2LJ polyclonal antibodies revealed positive reactions on the external surface from the miracidium in the S. mansoni egg. Intense fluorescence was detected in the region between the miracidium and the inner side of the egg-shell, located in von Lichtenberg’s envelope, which is a region of production of immunogenic components. Fluorescence was also detected in the outer side of the egg-shell and entrapped by the surface microspines, confirming that this protein, like in the adult worm, is also secreted from the S. mansoni eggs. No reactivity was observed in the surrounding granumomatous tissues, which are rich en inflammatory cells. Serum samples from S. mansoni-infected Swiss mice were tested by ELISA using SmB1LJ or SmB2LJ as coating antigen. Significantly higher IgG, IgG1 or IgG2a antibody reactivity was detected against SmB1LJ, whereas only IgG1 antibody was highly reactive against SmB2LJ. The reactivity of plasma samples (diluted 1:200) from Swiss mice previously inoculated with potato apyrase or r-potDomain B, a 6xHis tag polypeptide belonging to the domain B (r78-117) from the potato apyrase, homologue to the domain B from the ATPDase 2, was also tested by ELISA using the peptides as coating antigens. Polyclonal IgG and IgG1 anti-potato apyrase antibodies significantly reacted with SmB1LJ, whereas only IgG1 reacted with SmB2LJ. Polyclonal anti-r-potDomain B antibodies did not significantly react with SmB2LJ. Compared to controls, plasma samples (diluted 1:200) from these animals pre-immunized with potato apyrase or r-potDomain B and challenged with S. mansoni did not react significantly with peptides. The results confirmed that the domain B from the ATPDase 2 is potentially involved in the host immune response, and peptides SmB1LJ and SmB2LJ can be used in schistosomiasis studies.