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Produção e purificação do peptídeo hemopressina visando potencial farmacológico

Oliveira, Daiane Medeiros de 30 January 2018 (has links)
Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas, 2018. / Submitted by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2018-09-03T21:30:37Z No. of bitstreams: 1 2018_DaianeMedeirosdeOliveira.pdf: 914732 bytes, checksum: 64d5ce1469f44af98590065cea165019 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2018-09-06T21:41:53Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2018_DaianeMedeirosdeOliveira.pdf: 914732 bytes, checksum: 64d5ce1469f44af98590065cea165019 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-09-06T21:41:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2018_DaianeMedeirosdeOliveira.pdf: 914732 bytes, checksum: 64d5ce1469f44af98590065cea165019 (MD5) Previous issue date: 2018-08-03 / A hemopressina é um nonapeptídeo derivado da cadeia α-1 de hemoglobina de mamíferos que é conhecido pelos seus efeitos hipotensivo, analgésico e supressor do apetite. Este peptídeo age como um agonista inverso ou antagonista do receptor canabinoide CB1. Disfunções no sistema endocanabinoide, estão associadas com algumas patologias e morbidade, tais como obesidade, dor neuropática, depressão, inflamação, mal de Alzheimer e doença de Parkinson. O presente estudo teve por objetivo produzir a hemopressina nas formas sintética e recombinante, e purificar as moléculas produzidas, visando futura avaliação das suas propriedades biológicas. Para a obtenção do peptídeo recombinante, a sequência nucleotídica que codifica a hemopressina foi inserida no vetor de expressão pGEX-4T-1® (GE Healthcare) fusionada ao tag-GST e expressa em Escherichia coli BL21-CodonPlus. Várias condições de expressão foram testadas para determinar os melhores parâmetros de expressão. A síntese em fase sólida da hemopressina de formas humana e murina foi realizada utilizando a estratégia Fmoc/tButil. As sequências de resíduos de aminoácidos de ambas as formas da hemopressina foram confirmadas por espectrometria de massa MALDI no modo LIFTTM em um equipamento de Autoflex Speed (BrukerDaltonics, Bilerica, EUA). A purificação do peptídeo sintético foi realizada por cromatografia de fase reversa (Shimadzu LC-20AT) numa coluna C18 semi-preparativa (Jupiter 5 μm 300 Å). Análises por espectrometria de massa das hemopressinas humana e murina mostraram peptídeos sintéticos com massa molecular de 1.053,6 Da e 1.087,6 Da, respectivamente. A massa molecular da hemopressina recombinante de murino fusionada à GST foi de aproximadamente 31 kDa, obtida por meio de análise de SDSPAGE e confirmada por Western Blotting. O rendimento da expressão foi avaliado por densitometria, que constatou a produção de 147,8 mg/L da proteína recombinante. / Hemopressin is a nonapeptide derived from the α-1 chain of mammalian hemoglobin known for its hypotensive, analgesic and appetite suppressive effects. This peptide acts as a CB1 cannabinoid receptor inverse agonist or antagonist. Dysfunctions in the endocannabinoid system are associated with some pathologies and morbidity, such as obesity, neuropathic pain, depression, inflammation, Alzheimer and Parkinson diseases. This study was focused on the production and purification of synthetic and recombinant hemopressin, aiming future evaluation of their biological properties. To obtain the recombinant peptide, the nucleotide sequence encoding hemopressin was inserted into the expression vector pGEX-4T-1 (GE Healthcare) fused to the tag-GST and expressed in Escherichia coli BL21-CodonPlus. Several expression conditions were tested to determine the best expression parameters. Solid-phase synthesis of human and murine hemopressin was performed using the Fmoc/t-butyl strategy. The amino acid sequences of both forms of hemopressin was confirmed by MALDI mass spectrometry in the LIFTTM mode at an Autoflex speed equipment (BrukerDaltonics, Bilerica, USA). Purification of the synthetic peptide was performed by reversed-phase chromatography (Shimadzu LC-20AT) on a C18 semi-preparative column (Jupiter 5 μm 300 Å). Mass spectrometric analysis of human and murine hemopressins showed synthetic peptides with a molecular mass of 1,053.6 Da and 1,087.6 Da, respectively. The molecular mass of murine recombinant hemopressin fused to GST was approximately 31 kDa, a value that was obtained by SDS-PAGE analysis and confirmed by Western Blotting. The expression yield was evaluated by densitometry, which showed an equivalent expression yield of 147,8 mg/L of the recombinant protein.
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Citotoxicidade dos peptídeos Aβ1-42 e Aβ25-35 em cultura organotípica de hipocampo de ratos

Frozza, Rudimar Luiz January 2008 (has links)
A Doença de Alzheimer (DA) é a mais comum desordem neurodegenerativa relacionada à idade. Os sintomas clínicos resultam da deterioração de determinadas regiões cognitivas, particularmente aquelas relacionadas à memória. Estima-se que 29 milhões de pessoas no mundo sofram de demência do tipo DA. A presença de emaranhados neurofibrilares (NFTs) intracelulares constituídos pela proteína tau hiperfosforilada e as placas extracelulares constituídas pela proteína beta-amilóide (Aβ) são características da DA. Existe uma ampla variedade de evidências genéticas, fisiológicas e bioquímicas que suportam a idéia que o peptídeo Aβ é ao menos uma das causas que originam a DA. Em diferentes modelos experimentais têm sido utilizados diversos peptídeos Aβ sintéticos para estudar os mecanismos de toxicidade envolvidos na DA. Entre os fragmentos do peptídeo Aβ utilizados, o peptídeo Aβ25-35 é considerado o mais curto fragmento tóxico exercendo efeitos neurotóxicos similares àqueles produzidos pelos peptídeos Aβ1-40 ou Aβ1-42, tais como danos no aprendizado e na memória, apoptose neuronal, disfunção colinérgica e estresse oxidativo. Este fragmento exibe significantes níveis de agregação molecular, mantendo a toxicidade observada pelo peptídeo Aβ1-42 e dessa forma representa a região biologicamente ativa do peptídeo encontrado em pacientes com DA. Assim, o peptídeo Aβ25-35 é rotineiramente usado para estabelecer modelos de DA, para estudar as propriedades neurotóxicas do peptídeo Aβ e para a triagem de fármacos neuroprotetores. Neste trabalho, nós procuramos estabelecer uma comparação entre os dois peptídeos Aβ comumente usados, Aβ1-42 e Aβ25-35 num modelo in vitro de toxicidade pelo peptídeo Aβ. Para esse propósito foram utilizadas culturas organotípicas de hipocampo de rato expostas a 25 μM do peptídeo Aβ1-42 ou a 25 μM do peptídeo Aβ25-35 durante 48h. A morte celular foi quantificada pela medida da captação do iodeto de propídeo (IP), um marcador de morte celular. Nós observamos que ambos os peptídeos Aβ apresentaram toxicidade similar, causando cerca de 39% de dano celular no hipocampo. Não houve diferença significativa na extensão da morte celular entre os peptídeos Aβ1-42 e Aβ25-35, indicando que ambos causaram um efeito tóxico similar. Além disso, nós avaliamos a ativação de caspase 3, uma proteína executora chave na apoptose, por Western blotting. A exposição a 25 μM dos peptídeos Aβ1-42 ou Aβ25-35 por 48h aumentou significativamente a quantidade de caspase 3 clivada quando comparado às fatias controles não expostas aos peptídeos. Além disso, não houve diferenças entre os níveis de caspase 3 clivada induzida pelos peptídeos Aβ1-42 e Aβ25-35. Nós também não observamos efeito de ambos os peptídeos na fosforilação das proteínas PTEN e Akt; porém, de modo contrário, a percentagem de fosforilação da proteína GSK-3β foi aumentada por ambos os peptídeos Aβ. Neste trabalho, nós também avaliamos o efeito do tratamento prévio das culturas com 25 μM de resveratrol. O tratamento das culturas por 72h com resveratrol antes da exposição ao peptídeo Aβ25-35 parece exercer efeito neuroprotetor. Embora mais estudos sejam necessários para entender os mecanismos da toxicidade do peptídeo Aβ, nossos resultados fornecem fortes evidências de que o peptídeo Aβ1-42 e o fragmento sintético Aβ25-35 induzem dano celular de maneira semelhante. / Alzheimer’s disease (AD) is the most commom age-related neurodegenerative disorder. The clinical symptoms result from deterioration of selective cognitive domains, particularly those related to memory. It is estimated that 29 million people worldwide suffer from dementia like AD. The presence of intracelular neurofibrilary tangles (NFTs) of the hyperphosphorylated protein tau and extracellular amyloid-beta (Aβ) protein into plaques are the hallmarks of AD. There is a plethora of genetic, physiological and biochemical evidences that supports the idea that Aβ is at least one of the originating causes of the AD. Several synthetic Aβ peptides have been used to study the mechanisms of toxicity involved in AD. Among the Aβ fragments studied so far, the Aβ25-35 peptide is considered the shorter toxic fragment exerting neurotoxic effects similar to those produced by Aβ1-40 or Aβ1-42 peptides, such as learning and memory impaired, neuronal apoptosis, cholinergic dysfunction, and oxidative stress. Therefore, this peptide exhibits significant levels of molecular aggregation, retaining the toxicity of the full-length peptide and representing the biologically active region of Aβ1-42 peptide. Thus Aβ25-35 peptide is communly used to establish the AD model for the study of the neurotoxic properties of Aβ peptide and drug screening. In this work, we sought to establish the comparison between two commonly used Aβ peptides Aβ1-42 and Aβ25-35 on an in vitro model of Aβ toxicity. For this purpose, we used organotypic slice cultures of rat hippocampus exposed to 25 μM of both Aβ peptides for 48h. Cell death was quantified by measuring propidium iodide (PI) uptake, a marker of necrotic dead cell. We observed that both Aβ peptides caused about 39% of cell damage in hippocampus. There were no significant cell death differences between Aβ1-42 and Aβ25-35 peptides, indicating that both caused the similar toxic effect. Moreover, we evaluated the caspase-3 activation, a key executor in apoptosis, by Western blotting. The exposure to 25 μM of Aβ1-42 or Aβ25-35 peptides for 48h significantly increased the amount of cleaved-caspase-3 when compared to control slice cultures not exposed to peptides. Besides, there were no statistical differences between cleaved-caspase-3 induced by Aβ1-42 and Aβ25-35 peptides. In addition, we did not observe any effect of both peptides on PTEN and Akt phosphorylation; otherwise the phosphorylation of GSK-3β was increased by both Aβ peptides. In this work, we also evaluated the effects of treatment with 25 μM of resveratrol on cell death induced by 25 μM of Aβ25-35 peptide. The treatment of cultures for 72h with resveratrol before the Aβ25-35 peptide exposure seems to exert neuroprotective effects. Although further studies are necessary for understanding the mechanisms underlying Aβ peptide toxicity, our results provide strong evidence that Aβ1-42 and the synthetic fragment Aβ25-35 peptides induce neuronal injury in a similar pattern.
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Identificação e caracterização de peptídeos opioides presentes na fração proteica dos grãos de Coffea arabica / Identification and characterization of opioid peptides in protein fraction of Coffea arabica grains

Vinecky, Felipe 27 March 2015 (has links)
Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Biologia, Departamento de Biologia Celular, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2015. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2015-05-27T19:02:30Z No. of bitstreams: 1 2015_FelipeVinecky.pdf: 2577475 bytes, checksum: e64357e63db9f4f796cbc1a81a469cf1 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2015-05-28T11:36:41Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015_FelipeVinecky.pdf: 2577475 bytes, checksum: e64357e63db9f4f796cbc1a81a469cf1 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-05-28T11:36:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015_FelipeVinecky.pdf: 2577475 bytes, checksum: e64357e63db9f4f796cbc1a81a469cf1 (MD5) / No que diz respeito à cafeicultura e ao processamento dos grãos de café, o conceito de qualidade do produto foi definido sob diferentes aspectos, como, por exemplo, qualidade de produção, níveis de torra, aroma. Acredita-se que muitos dos constituintes do grão influenciam diretamente nas características organolépticas apresentadas pela bebida. Entretanto, pouco se conhece a respeito de quais moléculas estariam desempenhando tais funções, principalmente, em relação a proteínas e peptídeos encontrados no endosperma da semente do café, uma vez que a maioria dos estudos relacionados focam moléculas não protéicas. Alguns peptídeos que são biologicamente ativos, ou seja, bioativos, estão encriptados em proteínas de origem animal e vegetal e podem ser encontrados com a realização de um screening de um banco de dados utilizando parâmetros pré-definidos. Uma das formas de obtenção de peptídeos bioativos é por meio da ingestão de alimentos que contenham proteínas precursoras e que sofram proteólise por enzimas digestivas. No presente trabalho, foi realizada uma avaliação da composição química de Coffea arabica que visou identificar os precursores de qualidade da bebida do café que estivessem associados a proteínas com possíveis sequências de peptídeos opioides como parte de suas estruturas primárias. Para isso foram realizadas análises in silico em bancos de dados internacionais e na base de dados do Genoma Café, buscando peptídeos que apresentassem a região N-terminal (YGG) similar a outros peptídeos opioides. Outra metodologia utilizada foi a digestão do extrato proteico de Coffea arabica var. Acauã com enzimas digestivas, seguido de fracionamento por HPLC e sequenciamento por Espectrometria de Massa. Os peptídeos encontrados estavam encriptados em uma família de proteínas chamada dehidrina. Esses peptídeos, identificados em ambos métodos, foram sintetizados utilizando-se a estratégia Fmoc/t-butila (9-fluorenilmetoxicarbonila) de síntese manual em suporte sólido e tiveram a atividade (opioide) avaliada em modelos in vivo que permitiram determinar suas funções. Os testes utilizados para avaliar a atividade opioide foram o da placa quente e o da retirada da cauda. Foi possível concluir que as metodologias utilizadas para desvendar os peptídeos encriptados mostrou-se ser eficiente, já que todos os peptídeos testados apresentaram atividade antinociceptiva em camundongos. / Regarding to coffee and processing of coffee beans, the product quality concept has been defined in many different ways, for example, production quality, roasting levels, flavor. It is believed that many of the grain constituents directly influence the organoleptic characteristics of the beverage. However, little is known about the molecules performing such functions, especially concerning peptides and proteins found in the endosperm of the coffee seed, since most studies related to this topic focuses on non-protein molecules. Some peptides which are biologically active, ie bioactive, are encrypted in animal or vegetal proteins and can be found by a database screening, using default parameters. One way to obtain bioactive peptides is through the ingestion of foods containing precursor proteins susceptible to proteolysis by digestive enzymes. In the present study, an evaluation of the chemical composition of Coffea arabica was conducted which aimed identifying the coffee beverage quality precursors associated with proteins containing putative sequences of opioid peptides as part of their primary structures. As part of the investigation, in silico analyzes were performed using the international databases and the Coffee Genome database by searching peptides with N-terminal region (YGG) similar to other opioid peptides. Another methodology used was the digestion of protein extract of Coffea arabica var. Acauã with digestive enzymes, followed by HPLC purification and sequencing by Mass Spectrometry. The detected peptides were encrypted in a family of proteins called dehydrin. Those peptides identified in both methods were synthesized by using Fmoc/t-Butyl strategy (9-fluorenilmetoxicarbonila) of manual synthesis on solid support, and their activity (opioid) was evaluated by in vivo models which allowed to determine their roles. The tests used to access the opioid activity were the hot plate and tail flick. It was concluded that the methodologies used to unlock the encrypted peptides have proved to be efficient since all of the tested peptides showed antinociceptive activity in mice.
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Citotoxicidade dos peptídeos Aβ1-42 e Aβ25-35 em cultura organotípica de hipocampo de ratos

Frozza, Rudimar Luiz January 2008 (has links)
A Doença de Alzheimer (DA) é a mais comum desordem neurodegenerativa relacionada à idade. Os sintomas clínicos resultam da deterioração de determinadas regiões cognitivas, particularmente aquelas relacionadas à memória. Estima-se que 29 milhões de pessoas no mundo sofram de demência do tipo DA. A presença de emaranhados neurofibrilares (NFTs) intracelulares constituídos pela proteína tau hiperfosforilada e as placas extracelulares constituídas pela proteína beta-amilóide (Aβ) são características da DA. Existe uma ampla variedade de evidências genéticas, fisiológicas e bioquímicas que suportam a idéia que o peptídeo Aβ é ao menos uma das causas que originam a DA. Em diferentes modelos experimentais têm sido utilizados diversos peptídeos Aβ sintéticos para estudar os mecanismos de toxicidade envolvidos na DA. Entre os fragmentos do peptídeo Aβ utilizados, o peptídeo Aβ25-35 é considerado o mais curto fragmento tóxico exercendo efeitos neurotóxicos similares àqueles produzidos pelos peptídeos Aβ1-40 ou Aβ1-42, tais como danos no aprendizado e na memória, apoptose neuronal, disfunção colinérgica e estresse oxidativo. Este fragmento exibe significantes níveis de agregação molecular, mantendo a toxicidade observada pelo peptídeo Aβ1-42 e dessa forma representa a região biologicamente ativa do peptídeo encontrado em pacientes com DA. Assim, o peptídeo Aβ25-35 é rotineiramente usado para estabelecer modelos de DA, para estudar as propriedades neurotóxicas do peptídeo Aβ e para a triagem de fármacos neuroprotetores. Neste trabalho, nós procuramos estabelecer uma comparação entre os dois peptídeos Aβ comumente usados, Aβ1-42 e Aβ25-35 num modelo in vitro de toxicidade pelo peptídeo Aβ. Para esse propósito foram utilizadas culturas organotípicas de hipocampo de rato expostas a 25 μM do peptídeo Aβ1-42 ou a 25 μM do peptídeo Aβ25-35 durante 48h. A morte celular foi quantificada pela medida da captação do iodeto de propídeo (IP), um marcador de morte celular. Nós observamos que ambos os peptídeos Aβ apresentaram toxicidade similar, causando cerca de 39% de dano celular no hipocampo. Não houve diferença significativa na extensão da morte celular entre os peptídeos Aβ1-42 e Aβ25-35, indicando que ambos causaram um efeito tóxico similar. Além disso, nós avaliamos a ativação de caspase 3, uma proteína executora chave na apoptose, por Western blotting. A exposição a 25 μM dos peptídeos Aβ1-42 ou Aβ25-35 por 48h aumentou significativamente a quantidade de caspase 3 clivada quando comparado às fatias controles não expostas aos peptídeos. Além disso, não houve diferenças entre os níveis de caspase 3 clivada induzida pelos peptídeos Aβ1-42 e Aβ25-35. Nós também não observamos efeito de ambos os peptídeos na fosforilação das proteínas PTEN e Akt; porém, de modo contrário, a percentagem de fosforilação da proteína GSK-3β foi aumentada por ambos os peptídeos Aβ. Neste trabalho, nós também avaliamos o efeito do tratamento prévio das culturas com 25 μM de resveratrol. O tratamento das culturas por 72h com resveratrol antes da exposição ao peptídeo Aβ25-35 parece exercer efeito neuroprotetor. Embora mais estudos sejam necessários para entender os mecanismos da toxicidade do peptídeo Aβ, nossos resultados fornecem fortes evidências de que o peptídeo Aβ1-42 e o fragmento sintético Aβ25-35 induzem dano celular de maneira semelhante. / Alzheimer’s disease (AD) is the most commom age-related neurodegenerative disorder. The clinical symptoms result from deterioration of selective cognitive domains, particularly those related to memory. It is estimated that 29 million people worldwide suffer from dementia like AD. The presence of intracelular neurofibrilary tangles (NFTs) of the hyperphosphorylated protein tau and extracellular amyloid-beta (Aβ) protein into plaques are the hallmarks of AD. There is a plethora of genetic, physiological and biochemical evidences that supports the idea that Aβ is at least one of the originating causes of the AD. Several synthetic Aβ peptides have been used to study the mechanisms of toxicity involved in AD. Among the Aβ fragments studied so far, the Aβ25-35 peptide is considered the shorter toxic fragment exerting neurotoxic effects similar to those produced by Aβ1-40 or Aβ1-42 peptides, such as learning and memory impaired, neuronal apoptosis, cholinergic dysfunction, and oxidative stress. Therefore, this peptide exhibits significant levels of molecular aggregation, retaining the toxicity of the full-length peptide and representing the biologically active region of Aβ1-42 peptide. Thus Aβ25-35 peptide is communly used to establish the AD model for the study of the neurotoxic properties of Aβ peptide and drug screening. In this work, we sought to establish the comparison between two commonly used Aβ peptides Aβ1-42 and Aβ25-35 on an in vitro model of Aβ toxicity. For this purpose, we used organotypic slice cultures of rat hippocampus exposed to 25 μM of both Aβ peptides for 48h. Cell death was quantified by measuring propidium iodide (PI) uptake, a marker of necrotic dead cell. We observed that both Aβ peptides caused about 39% of cell damage in hippocampus. There were no significant cell death differences between Aβ1-42 and Aβ25-35 peptides, indicating that both caused the similar toxic effect. Moreover, we evaluated the caspase-3 activation, a key executor in apoptosis, by Western blotting. The exposure to 25 μM of Aβ1-42 or Aβ25-35 peptides for 48h significantly increased the amount of cleaved-caspase-3 when compared to control slice cultures not exposed to peptides. Besides, there were no statistical differences between cleaved-caspase-3 induced by Aβ1-42 and Aβ25-35 peptides. In addition, we did not observe any effect of both peptides on PTEN and Akt phosphorylation; otherwise the phosphorylation of GSK-3β was increased by both Aβ peptides. In this work, we also evaluated the effects of treatment with 25 μM of resveratrol on cell death induced by 25 μM of Aβ25-35 peptide. The treatment of cultures for 72h with resveratrol before the Aβ25-35 peptide exposure seems to exert neuroprotective effects. Although further studies are necessary for understanding the mechanisms underlying Aβ peptide toxicity, our results provide strong evidence that Aβ1-42 and the synthetic fragment Aβ25-35 peptides induce neuronal injury in a similar pattern.
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Nova classe de inibidor de serinopeptidase presente na peçonha do escorpião Tityus obscurus

Mourão, Caroline Barbosa Farias 15 March 2016 (has links)
Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2016. / Submitted by Patrícia Nunes da Silva (patricia@bce.unb.br) on 2017-05-20T13:22:39Z No. of bitstreams: 1 2016_CarolineBarbosaFariasMourao.pdf: 24960184 bytes, checksum: 00723dfae5e9671d15007e5c9e57c39b (MD5) / Approved for entry into archive by Patrícia Nunes da Silva (patricia@bce.unb.br) on 2017-05-20T13:22:55Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_CarolineBarbosaFariasMourao.pdf: 24960184 bytes, checksum: 00723dfae5e9671d15007e5c9e57c39b (MD5) / Made available in DSpace on 2017-05-20T13:22:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_CarolineBarbosaFariasMourao.pdf: 24960184 bytes, checksum: 00723dfae5e9671d15007e5c9e57c39b (MD5) Previous issue date: 2017-05-20 / O interesse na caracterização de novos inibidores de peptidases (PIs) tem aumentado nas últimas décadas devido a seu potencial uso na prevenção e tratamento de diversas doenças humanas. Muitos PIs já foram caracterizados de animais venenosos e peçonhentos, como anêmonas, serpentes, anuros e, mais recentemente, escorpiões e aranhas. Nesse estudo apresentamos uma nova classe de inibidor de serinopeptidase isolado da peçonha do escorpião Tityus obscurus (Buthidae), responsável por muitos casos de envenenamento na região Amazônica. Denominado ToPI1, ele foi purificado da peçonha bruta por RP-HPLC, e sua sequência foi determinada por MALDI-ISD e pela análise de seu precursor, obtido da biblioteca de cDNA da glândula de peçonha do T. obscurus. O ToPI1 compartilha menos de 45% de similaridade com outros peptídeos descritos em bancos de dados públicos. Ainda assim, todas eles são bloqueadores ou possíveis bloqueadores de canais de K+, não havendo similaridade com nenhum PI descrito até o momento. O peptídeo sintético oxidado (ToPI1s), obtido usando a estratégia Fmoc/t-butila, foi ativo contra tripsina em ensaios cromogênicos, mostrando-se do tipo tight-binding, e também por Ressonância Plasmônica de Superfície (SPR), em um biossensor Biacore 3000, onde apresentou afinidade picomolar por tripsina imobilizada. Os resultados indicaram que a formação do complexo ToPI1:tripsina é espontânea, endotérmica e favorecida por um aumento de entropia. Experimentos em SPR indicaram que o ToPI1s se liga ao sítio ativo da tripsina, semelhante aos inibidores canônicos. O ToPI1s não inibiu quimotripsina mesmo em concentrações elevadas. Também não reduziu a viabilidade de células tumorais HeLa (de câncer cervical humano) e B16F10 (de melanoma murino) nem de fibroblastos murinos não tumorais (NIH-3T3). Seu efeito foi mínimo ou nulo nas correntes de diferentes subtipos de canais de K+. O ToPI1s não causou alterações comportamentais e/ou fisiológicas visíveis em camundongos. A potente atividade inibidora de tripsina do ToPI1s em conjunto com esses resultados negativos o tornam um candidato atrativo para futuras aplicações terapêuticas. Análises por dicroísmo circular (190-260 nm) sugerem ausência de diferenças de estrutura secundária entre o ToPI1 nativo e o ToPI1s, com predominância de estruturas do tipo β (folhas-β e voltas-β) e desordenadas, e menor quantidade de α-hélice. O ToPI1s mostrou-se bastante estável, não desnaturando na faixa de pH 3,0-9,0 mesmo a 95°C. Dois análogos do ToPI1 foram sintetizados, os quais estão sob processo de proteção à propriedade intelectual. / The interest in the characterization of new peptidase inhibitors (PIs) has increased in recent decades due to their potential use in the prevention and treatment of several human diseases. Many PIs from poisonous and venomous animals such as sea anemones, snakes, anurans and, more recently, scorpions and spiders have been characterized. In the present study we present a new class of serinopeptidase inhibitor isolated from Tityus obscurus scorpion venom. This species (Buthidae) is responsible for many cases of envenomation in the Amazon region. Named ToPI1, it was purified from the crude venom by RP-HPLC and its sequence was determined by MALDI-ISD and by the analysis of its precursor, obtained from the cDNA library of T. obscurus venom gland. ToPI1 shares less than 45% sequence similarity with other peptides described in public databases. Still, they are all blockers or potential blockers of K+ channels, with no similarity to any PI described so far. The oxidized synthetic peptide (ToPI1s), obtained by using the Fmoc/t-butyl strategy, was active against trypsin in chromogenic assays, displaying tight-binding inhibition, and also by Surface Plasmon Resonance (SPR) in a Biacore 3000 biosensor, where it showed picomolar affinity to immobilized trypsin. The results indicated that the formation of the bimolecular complex ToPI1:trypsin is spontaneous, endothermic and favored by an entropy increase. SPR experiments indicated that ToPI1s binds to the active site of trypsin, similar to the canonical inhibitors. ToPI1s did not inhibit chymotrypsin even at high doses. In addition, it reduced neither the viability of the tumor cells HeLa (from human cervical cancer) and B16F10 (from murine melanoma) nor of non-tumor murine fibroblasts (NIH-3T3). It showed minimal or null effect on the currents of different subtypes of K+ channels. The ToPI1s did not cause any visible behavioral and/or physiological changes in mice. The potent trypsin inhibitory activity of ToPI1s together with these negative results make it an attractive candidate for future therapeutic purposes. Analysis by circular dichroism (190-260 nm) suggests the absence of differences in secondary structures between ToPI1s and the native ToPI1, with predominance of β-type structures (β-sheets and β-turns) and randon coil, and a smaller amount of α-helix. The ToPI1s proved to be very stable, non-denaturing at the range of pH 3.0 to 9.0 even at 95 °C. Two ToPI1 analogues were synthesized, which are under process of intellectual property protection.
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Identificação e efeitos antinociceptivos de um mastoparano isolado da peçonha da vespa social Parachartergus fraternus

Gonçalves, Jacqueline Coimbra 22 February 2013 (has links)
Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde, 2013. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2013-07-01T16:13:12Z No. of bitstreams: 1 2013_JacquelineCoimbraGoncalves.pdf: 2488679 bytes, checksum: b569380a85fd0875d28536d9c2282e8f (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2013-07-02T11:08:18Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_JacquelineCoimbraGoncalves.pdf: 2488679 bytes, checksum: b569380a85fd0875d28536d9c2282e8f (MD5) / Made available in DSpace on 2013-07-02T11:08:18Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_JacquelineCoimbraGoncalves.pdf: 2488679 bytes, checksum: b569380a85fd0875d28536d9c2282e8f (MD5) / A dor foi definida pela Associação Internacional para o Estudo da Dor (IASP) como “uma experiência sensorial e emocional desagradável, associada a um dano real ou potencial, ou descrita em termos desse dano potencial” e tem sido elencada como um grave problema de saúde pública. A terapia analgésica atual baseia-se no manejo sequencial de analgésicos, o qual tem como último recurso o uso de opióides como a morfina que é extremamente eficaz, porém produzem efeitos colaterais sistêmicos, além de desenvolverem dependência e tolerância. Atualmente, a busca por novos fármacos com alvos alternativos tem sido necessária a fim de minimizar os efeitos colaterais ou aumentar a eficácia do tratamento para a dor. As vespas, artrópodes da ordem Hymenoptera, possuem em suas peçonhas uma quantidade enorme de toxinas bioativas que podem atuar como antimicrobianas, anticonvulsivantes, ansiolíticas e antinociceptivas. O mastoparano é uma classe de peptídeos muito abundante na peçonha de vespas que tem demonstrado um enorme potencial para novas drogas antimicrobianas e excelentes ferramentas para o estudo de proteínas G. O objetivo deste trabalho foi descrever a atividade antinociceptiva de um mastoparano isolado da peçonha da vespa social Parachartergus fraternus, uma atividade inédita para esse grupo. Para tanto, a peçonha foi filtrada e cromatografada para a separação dos seus compostos. As frações selecionadas foram testadas, aquela que apresentou atividade antinociceptiva (PfTx 10) foi encaminhada a espectrometria de massa (MALDI- TOF/TOF) para caracterização de sua massa molecular e sequenciamento. Após as análises, descobriu-se que se tratava de um mastoparano de massa 1566,99 Da de sequência idêntica ao peptídeo AGELAIA – MP I. O peptídeo foi então sintetizado e posteriormente, testado em três doses distintas – 3.2, 4.8 e 6.4 mM. A maior dose apresentou efeito antinociceptivo máximo por até quatro horas, sendo observado decréscimo do índice de antinocicepção após 24 horas, e três dias após o efeito ainda se apresentava maior que o da salina. Os resultados obtidos revelam o grande potencial no estudo de novos compostos isolados da peçonha de vespas com atividade no Sistema Nervoso Central. Além disso, diversos compostos descritos ainda tem funções farmacológicas desconhecidas, que podem porporcionar o desenvolvimento de ferramentas para o estudo do funcionamento cerebral normal ou patológico. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Pain is defined by the International Association for the Study of Pain (IASP) as "an unpleasant sensory and emotional experience associated with actual or potential damage, or described in terms of such damage potential" and has been classified as a serious health problem public. Nowadays the analgesic therapy is based on the sequential handling of pain killers, which has as a last resort opioids like morphine which is very effective but produces systemic side effects, in addition to develop dependence and tolerance. Therefore, the search for new drugs with alternative targets becomes necessary in order to minimize side effects or enhance efficacy of treatment. Wasps, arthropods of the order Hymenoptera, have a great amount of bioactive toxins in their venom that can act as antimicrobial, anticonvulsant, anxiolytic and antinociceptive. The mastoparan is an abundant class of peptides in the venom of wasps which has shown potential for new antimicrobial drugs and excellent tools for the study of protein G. The goal of the present study is to describe the antinociceptive activity of a mastoparan isolated from the venom of the social wasp Parachartergus fraternus, a novel activity for this class of peptides. For this purpose, the venom was filtered and chromatographed to separate the compounds. The selected fractions were tested, one that showed antinociceptive activity (PfTx 10) was referred to mass spectrometry (MALDI-TOF/TOF) to characterize its molecular weight and sequencing. After analysis, it was identified as a mastoparano with mass of 1566.99 Da and peptidic sequence identical to Agelaia - MP I. The peptide was subsequently synthesized and then tested in three different concentrations - 3.2, 4.8 and 6.4 mM. The largest dose reported maximum antinociceptive effect for up to four hours and also reduced the rate of antinociception after 24 hours and three days after i.c.v. injection the effect is still showed greater than that of saline. The results revealed the great potential of the study of compounds isolated from the venom of wasps with activity in the central nervous system. In addition, various compounds described still have unknown pharmacological functions that can provide the development of tools for the study of normal or pathological brain function.
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Caracterização química e atividade biológica de peptídeos presentes na peçonha do escorpião brasileiro Opisthacanthus cayaporum

Camargos, Thalita Soares 29 July 2009 (has links)
Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde, 2009. / Submitted by Jaqueline Ferreira de Souza (jaquefs.braz@gmail.com) on 2010-04-14T12:41:31Z No. of bitstreams: 1 2009_ThalitaSoaresCamargos.pdf: 1644939 bytes, checksum: 40726ff9747a05ab68d269a426d4dd64 (MD5) / Approved for entry into archive by Lucila Saraiva(lucilasaraiva1@gmail.com) on 2010-05-19T06:10:49Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2009_ThalitaSoaresCamargos.pdf: 1644939 bytes, checksum: 40726ff9747a05ab68d269a426d4dd64 (MD5) / Made available in DSpace on 2010-05-19T06:10:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2009_ThalitaSoaresCamargos.pdf: 1644939 bytes, checksum: 40726ff9747a05ab68d269a426d4dd64 (MD5) Previous issue date: 2009-07-29 / A peçonha de escorpiões é conhecida por ser uma complexa mistura de moléculas capazes de exercer as mais diversas funções. As mais estudadas são as que atuam em canais iônicos, especialmente nos canais seletivos aos íons Na+ e K+, os responsáveis pela transmissão da informação nervosa. Além dessas moléculas, existe uma família de peptídeos sem pontes dissulfeto, chamados de NDBP (Non Dissulfide Brigded Peptides), que podem agir como formadores de poros em membranas, como antimicrobianos e citolíticos, e/ou potencializadores de bradicinina. O presente trabalho demonstra a riqueza de moléculas presentes na peçonha do escorpião brasileiro Opisthacanthus cayaporum. A caracterização de uma molécula bloqueadora de canal para K+, membro da família das κ-KTx, sistematicamente chamada de κ-KTx2.5, mostrou que esta molécula forma α-hélices em ambiente hidrofílico e é capaz de bloquear canais de K+ dos subtipos hKV1.1 e 1.4. As sequências parciais de uma molécula da família das Escorpinas e de um NDBP também são descritas no presente trabalho. __________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Scorpions venom is a rich source of molecules with variable functions. The most studied are those that act on ion channels, particularly those selective for Na + and K +, which are responsible for the cell excitability. Besides these compounds, a family of peptides without disulfide bridges, called NDBP (Non Dissulfide Brigded Peptides), which act as pores formers in membranes, holding antimicrobial and cytolytic activities, and as bradykinin potentiators. This study demonstrates the richness of molecules present in the venom of Brazilian scorpion Opisthacanthus cayaporum. The characterization of a K +-channel blocker, for member of the family of κ-KTx, and systematically called here as κ-KTx2.5, showed that this molecule form α-helix in an hydrophilic environment, and is able to blockhKV1.1 and 1.4 K+-channel subtypes. The partial sequence of a molecule belonging to the Escorpine family and a NDBP are also described in the work.
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Prospecção de peptídeos antimicrobianos da secreção cutânea de anfíbios do gênero Phyllomedusa

Mandel, Saulo Martins de Sá January 2008 (has links)
Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Animal, 2008. / Submitted by Suelen Silva dos Santos (suelenunb@yahoo.com.br) on 2009-09-23T18:03:16Z No. of bitstreams: 1 2008_SauloMartinsdeSaMandel.pdf: 2852948 bytes, checksum: b1488ceb58020d0f431c0320e5561497 (MD5) / Approved for entry into archive by Tania Milca Carvalho Malheiros(tania@bce.unb.br) on 2009-09-25T14:07:09Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2008_SauloMartinsdeSaMandel.pdf: 2852948 bytes, checksum: b1488ceb58020d0f431c0320e5561497 (MD5) / Made available in DSpace on 2009-09-25T14:07:10Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2008_SauloMartinsdeSaMandel.pdf: 2852948 bytes, checksum: b1488ceb58020d0f431c0320e5561497 (MD5) Previous issue date: 2008 / A secreção cutânea de anfíbios é uma rica fonte de diversas moléculas bioativas. Um importante grupo de tais moléculas são os peptídeos antimicrobianos. Anuros da subfamília Phyllomedusinae (Hylidae-Amphibia) expressam diversos componentes pertencentes a este grupo. O presente estudo descreve a purificação e determinação da estrutura primária de vários análogos pertencentes às famílias de peptídeos antimicrobianos encontradas em anfíbios do gênero Phyllomedusa. O extrato total dos anfíbios Phyllomedusa burmeisteri, Phyllomedusa rohdei e Phyllomedusa tomopterna mostrou-se uma complexa mistura de peptídeos. Dentre estes, 40 moléculas pertencentes (homologia) a quatro famílias de peptídeos antimicrobianos (dermaseptinas, filoseptinas, hiposinas e dermatoxinas) foram identificados e caracterizados quanto à sua estrutura primária. Os peptídeos foram purificados por meio de um sistema RP-HPLC, seqüenciados e analisados por meio de espectrometria de massa MALDI TOF/TOF e ESI Q-TOF. Degradação de Edman foi utilizada para confirmação da estrutura primária de três peptídeos (Filoseptina 08, DStomo01 e DD L). Adicionalmente, um análogo de hiposina, denominado hiposina 6, foi identificado. PS 08 e hiposina 6 foram sintetizados e testados contra uma bactéria patogênica de plantas (Xanthomonas citrii) e contra bactérias patogênicas de humanos (Escherichia coli, Staphylococcus aureus e Pseudomonas aeruginosa). Como comparação, duas dermaseptinas identificadas em Phyllomedusa tarsius, DRT 12 e DRT 15, foram purificadas e testadas contra Xanthomonas citrii e contra os patógenos humanos, respectivamente. O presente trabalho contribui para o aumento do conhecimento da biodiversidade relativa a esse grupo de moléculas, adicionando um relevante número de novos análogos à miríade de peptídeos antimicrobianos já conhecidos na subfamília Phyllomedusinae. _________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Amphibian skin secretion is considered a rich source of bioactive molecules. One important group of such molecules is the antimicrobial peptides group. Frogs from the Phyllomedusinae subfamily (Hylidae-Amphibia) possess several components of this group. The present work describes the purification and primary structure determination of several analogs which belong to antimicrobial peptides families found in amphibians of the genus Phyllomedusa (Hylidae-Amphibia). The crude extract obtained from the amphibians Phyllomedusa burmeisteri, Phyllomedusa rohdei and Phyllomedusa tomopterna was demonstrated to be a complex mixture of peptides. Among them, 40 molecules belonging to four families of antimicrobial peptides (dermaseptins, phylloseptins, hyposins and dermatoxins) were identified and their primary structures were obtained. The peptides were purified in a RP-HPLC system and sequenced and analyzed by MALDI TOF/TOF and ESI Q-TOF mass spectrometry. Three peptides had their primary structure confirmed by Edman degradation (Phylloseptin 08, DStomo01 and DD L). A hyposin analog, named hyposin 6, was also identified. PS 08 and hyposin 6 were synthesized and tested against a plant pathogen (Xanthomonas citrii) and against human pathogens (Escherichia coli, Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa). As a comparison, DRT 12 and DRT 15, two dermaseptins previously identified in Phyllomedusa tarsius secretion, were purified in a RP-HPLC system and tested against Xanthomonas citrii and the human pathogens, respectively
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Avaliação biológica da secreção cutânea da rã Leptodactylus ocellatus : peptídeos citolíticos e proteases

Nascimento, Anna Christina Carvalho Coutinho do 12 1900 (has links)
Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2007. / Submitted by wesley oliveira leite (leite.wesley@yahoo.com.br) on 2009-10-02T13:33:19Z No. of bitstreams: 1 Tese_Anna Carvalho Coutinho do Nascimento.pdf: 3780007 bytes, checksum: 9fe01e3c2b8920c32479ebf9a44ffc2e (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2009-10-02T15:47:05Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Tese_Anna Carvalho Coutinho do Nascimento.pdf: 3780007 bytes, checksum: 9fe01e3c2b8920c32479ebf9a44ffc2e (MD5) / Made available in DSpace on 2009-10-02T15:47:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese_Anna Carvalho Coutinho do Nascimento.pdf: 3780007 bytes, checksum: 9fe01e3c2b8920c32479ebf9a44ffc2e (MD5) Previous issue date: 2007-12 / Cerca de 94% dos peptídeos de secreção cutânea de anfíbios anuros caracterizados até o momento foram isolados de espécies das famílias Bombinatoridae, Hylidae e Ranidae, enquanto os repertórios peptídicos dos anfíbios das outras mais de 40 famílias são, ainda, pouco conhecidos. A família Leptodactylidae, à qual pertence a rã sul-americana Leptodactylus ocellatus, é uma das pouco estudadas no que diz respeito a peptídeos de secreção cutânea, de modo que apenas oito peptídeos de leptodactilídeos haviam sido descritos até então. O presente trabalho resultou na caracterização de dois novos peptídeos da secreção cutânea de L. ocellatus: ocellatins 4 e 5, que possuem, respectivamente, 21 e 17 resíduos de aminoácidos e apresentam atividades antibacteriana e hemolítica. Verificou-se, ainda, a ocorrência de outros componentes hemolíticos na secreção de L. ocellatus, o que indica uma possível necessidade de proteção contra ectoparasitas. Foi, também, realizado um estudo preliminar da relação entre estrutura e atividade dos peptídeos, o qual consistiu na síntese de análogos de ocellatin 4, modificados por substituição, deleção ou inserção de resíduos de aminoácidos, e na avaliação das atividades hemolítica, antibacteriana e antifúngica desses análogos. Finalmente, verificou-se a ocorrência de proteases ativas na secreção de L. ocellatus, por meio de ensaios que utilizaram caseína, gelatina e substratos fluorogênicos para evidenciar a atividade proteolítica. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT / About 94% of all amphibian skin secretion peptides characterized to date have been isolated from species belonging to the families Bombinatoridae, Hylidae and Ranidae, while little is known about the peptide repertoires of frogs from the other more than 40 families. The Leptodactylidae family, which includes the South American frog Leptodactylus ocellatus, is one that has been subjected to few studies of skin secretion peptides, hence only eight leptodactylid peptides had been so far described. The present work has led to the characterization of ocellatins 4 and 5, two new peptides from the skin secretion of L. ocellatus, with 17 and 21 amino acid residues and showing hemolytic and antibacterial activities. The presence of other hemolytic compounds in the secretion of L. ocellatus has been observed and may indicate the need of molecular defense against external parasites. Preliminary studies of the relationship between structure and activity of peptides have been conducted as well, by means of comparing the hemolytic, antibacterial and antifungal activities of synthetic analogs of ocellatin 4 in which the sequence had been altered by substitution, deletion or insertion of amino acid residues. Lastly, we confirmed the occurrence of active proteases in the secretion of L. ocellatus by performing assays that used casein, gelatin or fluorogenic substrates to evidence proteolytic activity.
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Caracterização de um peptideo anticoccidiano obtido a partir de bibliotecas de phage display

Silva Junior, Arnaldo da 02 August 2018 (has links)
Orientador : Adilson Leite / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-02T09:23:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 SilvaJunior_Arnaldoda_D.pdf: 6277270 bytes, checksum: 2d414067434cd31aec9b917ad0ab2e1a (MD5) Previous issue date: 2002 / Doutorado

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