Submitted by isabela.moljf@hotmail.com (isabela.moljf@hotmail.com) on 2018-08-06T18:07:50Z No. of bitstreams: 0 / Approved for entry into archive by Adriana Oliveira (adriana.oliveira@ufjf.edu.br) on 2018-08-06T18:12:47Z (GMT) No. of bitstreams: 0 / Made available in DSpace on 2018-08-06T18:12:47Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-03-30 / FAPEMIG - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais / Por análises in silico, um domínio B conservado e antigênico foi previamente identificado em nucleosídeo trifosfato difosfohidrolases (NTPDases) de plantas e parasitos. O r-potDomB, um recombinante derivado do domínio B (r78-117) da apirase de batata, foi obtido por expressão heteróloga, e a sua reatividade com anticorpos policlonaisanti-apirase de batata confirmaram a existência de epitopos indutores de resposta imune humoral em mamíferos. A clonagem do gene da NTPDase1 de Leishmania amazonensis (LamNTPDase1; NCBI: AFJ22627.1) e as análises in silico reforçaram a hipótese de conservação do domínio B de NTPDases. O r-potDomB, os peptídeos sintéticos LbB1LJ e LbB2LJ derivados do domínio B de NTPDase1 de Leishmania, e os anticorpos produzidos contra estas biomoléculas, foram usados como ferramentas moleculares para estudos específicos da NTPDase1 de L. amazonensis e da leishmaniose. Por “Western blots”, a NTPDase1 foi identificada como bandas de 48 e 63 kDa em frações de membrana, microssomal e flagelo de promastigotas. Por análise imunocitoquímicaultraestrutural, os anticorpos localizaram a NTPDase1 na superfície de membrana plasmática, núcleo, mitocôndria e cinetoplasto, bolsa flagelar e flagelo, confirmando sua ampla distribuição neste parasito. Análises in silico sugeriram as possíveis modificações pós-traducionais da NTPDase1, incluindo a sua conjugação com proteína SUMO. Os polipeptídeos de 48 e 63 kDa e um co-migrante de 12 kDa foram isolados de promastigotas por eletroforese em gel não-desnaturante. Por “Western blots” e espectrometria de massas, a identidade da NTPDase1 foi confirmada nospolipeptídeos de 48 e 63 kDa. Por espectrometria de massas, o polipeptídeo de 12 kDa foi identificado como pertencente à família de proteínas SUMO e, também, adicionado aopolipeptídeo de 63 kDa. Os polipeptídeos de 63 kDa e 12 kDa, mas não o de 48 kDa, foram reconhecidos em “Western blots” pelo soro imune anti- SUMO1, sugerindo a ligação entre NTPDase1 e SUMO, uma modificação descrita pela primeira vez entre os membros da família das NTPDases. Camundongos BALB/c foram infectados com promastigotas, e os anticorpos destes animais reconheceram a NTPDase1 pura, mas não SUMO, confirmando sua antigenicidade. Durante a progressão da doença, alta reatividade entre r-potDomB, LbB1LJ ou LbB2LJ e anticorpos IgG2a dos camundongos infectados foi observada aos 40 dias pós-infecção, revelando a antigenicidade do domínio B e a sua habilidade de induzir a produção deste subtipo nos estágios iniciais da doença. A reatividade de IgG1 foi significativamente maior aos 90-120 dias pós-infecção, coincidindo com o estágio mais ativo da doença, sugerindo participação do domínio em eventos imunoregulatórios. O r-potDomB induziu reação de hipersensibilidade tardia em camundongos Suíços, uma resposta imune celular, com elevação concomitante dos níveis de IgG2a e IFN-y. O r-potDomB, na ausência de adjuvante, usado na préimunização de camungondos Suíços infectados com amastigotas, estimulou a produção de IgG2a e IFN-y, e promoveu proteção parcial contra a progressão da leishmaniose como observado por medida de edema de patas e análises histopatológicas.Os resultados estimulam o aproveitamento biotecnológico do rpotDomB, ou derivados desta biomolécula, em formulações e em protocolos experimentais de imunoterapia e/ou vacinação contra leishmanioses. / By in silico analysis, an antigenic conserved B domain was previously identified within nucleoside triphosphate diphosphohydrolases (NTPDases) of plants and parasites. The r-potDomB, a recombinant belonging to the conserved B domain (r78- 117) from the potato apyrase, was obtained by heterologous expression, and its reactivity with polyclonal anti-potato apyrase antibodies confirmed the existence of epitopes which induce humoral immune response in mammalian. The cloning of the gene from the Leishmania amazonensisNTPDase 1 (LamNTPDase1; NCBI AFJ22627.1) and in silico analysis reinforced the hypothesis of B-domain conservation within NTPDases. The r-potDomB, synthetic peptides LbB1LJ and LbB2LJ derived from the B-domain from LeishmaniaNTPDase 1, and the antibodies raised against these biomolecules, were used as molecular tools for specific studies of the L. amazonensisNTPDase 1 and leishmaniasis. By Western blots, theNTPDase 1 was identified as bands of 48 and 63 kDa in membrane, microsomal and flagellar fractions of promastigotes. By ultrastructural immunocytochemical, the antibodies localized the NTPDase 1 at the surface of plasma membrane, nucleus, mitochondria and kinetoplast, at flagellar pocket and flagellum, confirming its widespread distribution in this parasite. In silico analysis suggested possible post-translational modifications of the NTPDase 1, including its conjugation with SUMO protein. The polypeptides of 48 and 63 kDa and one co-migrant of 12 kDa were isolated of promastigotes by non-denaturing gel electrophoresis. By Western blots and mass spectrometry, the identity of NTPDase1 in the polypeptides of 48 e 63 kDa was confirmed. By mass spectrometry, the polypeptide of 12 kDa was identified belonging to the SUMO protein family and, also, added to the polypeptide of 63 kDa. The polypeptides of 63 and 12 kDa, but not 48 kDa, were recognized in Western blots by immune serum anti-SUMO1, suggesting binding between NTPDase 1 and SUMO, a modification described for the first time among members of the NTPDase family. BALB/c mice were infected with promastigotes, and the antibodies from these animals recognized the pure NTPDase, but not SUMO, confirming its antigenicity. During disease progression, high reactivity between r-potDomB, LbB1LJ or LbB2LJ and IgG2a antibodies of the promastigote-infected mice was observed at 40 days post-infection, revealing both the B-domain antigenicity and its ability for induce the production of this subtype in early disease stages. The IgG1 reactivity was significantly higher at 90-120 days post-infection, coinciding with the most active stage of the disease, suggesting participation of the domain in immuneregulatory events. The r-potDomB induced delayed type-hypersensitivity reaction in Swiss mice, a cellular immune response, with a concomitant increase in the levels of IgG2a and IFN-y. The r-potDomB, in the absence of adjuvant, used in pre-immunization of amastigotes-infected Swiss mice, stimulated the production of IgG2a and IFN-y, and promoted partial protection against leishmaniasis progression, as observed by measuring of footpad swelling and histopathological analysis. The results stimulate biotechnological use of the r-potDomB, or derivatives of this biomolecule, in formulations and experimental protocols of immunotherapy and/or vaccination against leishmaniasis.

Submitted by isabela.moljf@hotmail.com (isabela.moljf@hotmail.com) on 2017-08-31T15:40:53Z No. of bitstreams: 0 / Approved for entry into archive by Adriana Oliveira (adriana.oliveira@ufjf.edu.br) on 2017-09-01T11:35:40Z (GMT) No. of bitstreams: 0 / Made available in DSpace on 2017-09-01T11:35:40Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Por alinhamento das sequências de aminoácidos da apirase de S. tuberosum e isoformas de outras espécies de plantas, alta identidade (46% a 94%) e similaridade (64% a 96%) foram identificadas entre elas, incluindo espécies diferentes de Fabaceae, e estreita relação estrutural foi encontrada entre os domínios B destas proteínas. Anticorpos policlonais anti-apirase de batata S. tuberosum inibiram 65-80% da atividade catalítica desta proteína. Soros imunes policlonais produzidos contra os peptídeos sintéticos homólogos potB1LJ, LbB1LJ e SmB1LJ ou potB2LJ, LbB2LJ e SmB2LJ, derivados de domínios B de isoformas de NTPDases, inibiram significativamente (32-44%) a atividade da apirase de batata. Estes anticorpos podem ser ferramentas moleculares auxiliares para o estudo das isoformas de apirase. A atividade apirásica de tecidos de folha (NL) ou caule (NS) normais e de galha globosa (GG) de Calliandra brevipes BENTH (Fabaceae: Mimosoidae) foi testada em meio de reação pH 7,5 e na presença de C12E9, e a hidrólise de ADP, UDP ou GDP por GG foi 1,8 a 2,4 vezes maiores que tecidos não galhados. Anticorpos policlonais anti-apirase de batata inibiram significativamente (70-90%) a hidrólise de ATP, ADP, GDP ou UDP por NS. Em GG, similarmente, a atividade ATPásica, GDPásica, ADPásica ou UDPásica foi significativamente inibida (40-66%). Para o isolamento e identificação de apirase de tecidos normais e galha globosa de Calliandra brevipes, amostra de tecido de NS ou NL não galhado, ou de GG previamente homogeneizada em Triton X-100 mais deoxicolato de sódio foi fracionada em gel não desnaturante contendo os mesmos detergentes. Usando ADP como o substrato, a atividade catalítica da enzima permitiu o aparecimento de uma única banda de precipitado de fosfato de cálcio mostrando idêntica mobilidade eletroforética nas amostras NS, NL e GG, sendo mais intensa nesta última, sugerindo que a apirase é superexpressa neste tecido. Nesta banda de maior mobilidade, distintos polipeptídeos de 52 a 75 kDa foram reconhecidos pela imunoreatividade cruzada de anticorpos anti-apirase de batata, sugerindo a existência de formas ativas da mesma proteína com diferentes cargas líquidas, possivelmente como um resultado de diferentes níveis de glicosilação. Além disso, uma banda de aproximadamente 52 kDa, de menor mobilidade e atividade, foi também identificada em todos os tecidos, possivelmente a apirase em sua forma completamente deglicosilada. Usando técnicas histoquímicas e microscopia óptica, cortes micrométricos corados por lugol ou azul de astra-safranina evidenciaram a câmara pulpal amplamente circundada por tecido nutritivo contendo amido em sua porção distal, e parênquima cortical delimitado por anéis esclerenquimáticos lignificados. Por técnicas histoquímicas, a atividade ADPásica ou ATPásica foi encontrada como um depósito eletrodenso granular de fosfato de chumbo distribuído na superfície externa, e nos tecidos nutritivos da galha globosa. Por técnicas imunohistoquímicas, usando Microscópio Confocal de Varredura a Laser e anticorpos anti-apirase de batata e anti-peptídeos sintéticos, a apirase de galha globosa foi encontrada nos mesmos sítios. Hipóteses funcionais para esta proteína estão sob investigação. Além disso, o tempo de germinação de semente de C. brevipes foi determinado, e no quinto dia após a instalação do teste, a primeira folha foi aberta, identificando tecidos de crescimento rápido apropriados para a investigação da regulação da hidrólise de ATP por apirase na proliferação celular. / By alignment of amino acid sequences of the S. tuberosum apyrase and isoforms from other plant species, high identity (46 to 94%) and similarity (64 to 96%) were identified between them, including distinct species of Fabaceae, and closer structural relationship was found between the domains B from these proteins. Polyclonal antibodies anti- S. tuberosum potato apyrase inhibited 65-80% of the catalytic activity of this protein. In addition, polyclonal immune sera produced against homologue synthetic peptides potB1LJ, LbB1LJ and SmB1LJ or potB2LJ, LbB2LJ and SmB2LJ, derivatives from B domains of NTPDases isoforms, significantly inhibited (32 to 44%) potato apyrase activity. These antibodies could be useful molecular tools for studies of the apyrase isoforms. The apyrase activity from the non-galled stem (NS), non-galled leaf (NL), or globose gall (GG) tissue from Calliandra brevipes BENTH (Fabaceae: Mimosoidae) was tested in reaction medium pH 7.4 and in the presence of C12E9, the ADP, UDP or GDP hydrolysis by GG was 1.8 to 2.4 fold higher than non-galled tissues. Polyclonal antibodies anti-potato apyrase significantly inhibited (70 to 90%) the ATP, ADP, GDP or UDP hydrolysis by NS. In GG, similarly, the ATPase, GDPase, ADPase or UDPase activity was also significantly inhibited (40-66%). For isolation and identification of apyrase from normal tissues and globose gall from the Calliandra brevipes, sample of NS, NL or GG tissue was previously homogenised in Triton X-100 plus sodium deoxycholate, and fractionated in non-denaturing gel containing the same detergents. Using ADP as the substrate, the enzyme catalytic activity gave rise to the appearance of a single calcium phosphate precipitate band displaying identical electrophoretic mobilities in NS, NL, and GG samples, being more intense in this last one suggesting that apyrase is over-expressed in this tissue. In this band of higher mobility, a number of distinct polypeptides ranging from 52 to 75 kDa were recognized by cross-immunoreactivity with polyclonal anti-potato apyrase antibodies, suggesting the existence of active forms of the same protein with different net charges, possibly as a result of distinct glycosylation levels. In addition, an immunoreactive band of approximately 52 kDa, of lower mobility and activity, was also identified in all tissues, possibly apyrase in completely deglycosylated form. By histochemical techniques and light microscopy, micrometric sections stained with lugol or Astra Blue-Saphranine evidenced the chamber pulpal widely surrounded by nutritive tissue containing starch in its distal portion, and cortical parenchime delimited by rings sclereides lignified. By histochemical techniques, the ADPase or ATPase activity was found as a granular dense lead phosphate deposit distributed at the external surface, and inside of the nutritive cells of the globose gall. By immunohistochemical techniques, using confocal laser scanning microscopy and antibodies anti-potato apyrase and anti-synthetic peptides, the gall globose apyrase was found at same sites. In addition, the time of laboratory germination of C. brevipes seed was determined, and on the fifth day after test installation, the first leaf opened, identifying rapid growing tissues suitable for further investigations on the participation of both apyrase and regulation of ATP hydrolysis in cell proliferation.

Submitted by Geandra Rodrigues (geandrar@gmail.com) on 2018-04-04T18:08:27Z No. of bitstreams: 1 anacarolinaribeirogomesmaia.pdf: 687971 bytes, checksum: 19edf64a9349768df07f14662c3d6df6 (MD5) / Approved for entry into archive by Adriana Oliveira (adriana.oliveira@ufjf.edu.br) on 2018-04-05T11:27:48Z (GMT) No. of bitstreams: 1 anacarolinaribeirogomesmaia.pdf: 687971 bytes, checksum: 19edf64a9349768df07f14662c3d6df6 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-04-05T11:27:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 anacarolinaribeirogomesmaia.pdf: 687971 bytes, checksum: 19edf64a9349768df07f14662c3d6df6 (MD5) Previous issue date: 2015-05-04 / PROQUALI (UFJF) / A NTPDase 1 (50 kDa) de promastigotas de Leishmania infantum foi purificada por eletroforese em gel não-desnaturante. A identidade desta proteína ou de seu domínio B conservado (r83-122) foi confirmada por “Western blots” utilizando soros imunes produzidos contra a apirase de batata (SA), r-potDomínioB (SB), um polipeptídeo recombinante derivado do domínio B desta proteína vegetal, e LbB1LJ (SC; r82-103) e LbB2LJ (SD; r102-121), peptídeos sintéticos derivados do domínio B da NTPDase 1 de L. braziliensis. Sua antigenicidade foi evidenciada em “Western blots” pela reatividade com soros de cães com leishmaniose visceral. Os soros imunes SC ou SD inibiram sua atividade (87-99%) em preparação de promastigotas, sugerindo um efeito direto sobre o domínio B. Por ELISA, 45-50% de 38 cães infectados foram soropositivos para LbB1LJ e LbB2LJ confirmando a antigenicidade deste domínio. / The NTPDase 1 (50 kDa) of Leishmania infantum promastigotes was purified by nondenaturing gel electrophoresis. The identity of this protein or of its conserved domain B (r83-122) was confirmed by Western blots using immune sera raised against potato apyrase (SA); r-potDomainB (SB), a recombinant polypeptide derived from the B domain of this vegetable protein, and LbB1LJ (SC; r82-103) and LbB2LJ (SD; r102-121), synthetic peptides derived from the B domain of the L. braziliensis NTPDase 1. Its antigenicity was evidenced in Western blots by the reactivity with serum samples from dogs with visceral leishmaniasis. The immune sera SC and SD inhibited its activity (87- 99%) in promastigotes preparation, suggesting a direct effect on the B domain. By ELISA, 45-50% of 38 infected dogs were seropositive for LbB1LJ and LbB2LJ confirming the antigenicity of this domain.