Tese (Doutorado em Ciências Biológicas) - Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Universidade Federal de Ouro Preto, Ouro Preto, 2016. / Submitted by Marise Leite (marise_mg@yahoo.com.br) on 2016-04-15T14:05:13Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) TESE_RecrutamentoReceptorAdenosina.pdf: 10895173 bytes, checksum: 063aa6f41640dc7c0ad7cf1bfd62b643 (MD5) / Approved for entry into archive by Gracilene Carvalho (gracilene@sisbin.ufop.br) on 2016-04-25T14:32:10Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) TESE_RecrutamentoReceptorAdenosina.pdf: 10895173 bytes, checksum: 063aa6f41640dc7c0ad7cf1bfd62b643 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-04-25T14:38:06Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) TESE_RecrutamentoReceptorAdenosina.pdf: 10895173 bytes, checksum: 063aa6f41640dc7c0ad7cf1bfd62b643 (MD5) Previous issue date: 2016 / A infecção por Leishmania pode resultar num amplo espectro de manifestações clínicas e a infecção por Leishmania amazonensis é associada a uma deficiência na resposta de linfócitos T específicos para o parasito. Células dendríticas direcionam a diferenciação de linfócitos Th1 que contribuem para o controle da infecção por Leishmania. Em um trabalho anterior, nós mostramos que a infecção por L. amazonensis, mas não por L. braziliensis ou L. major, prejudica a resposta de células dendríticas por um mecanismo dependente do receptor de adenosina A2B. Neste trabalho, nós avaliamos a expressão de receptores de adenosina e os eventos intracelulares ativados a partir do receptor A2B em células dendríticas infectadas, bem como o papel desses eventos na infecção de camundongos por L. amazonensis. Inicialmente, células dendríticas derivadas de células de medula óssea de camundongos C57BL/6J foram infectadas por promastigotas metacíclicas de L. amazonensis, L. braziliensis ou L. major. Imagens obtidas por microscopia de fluorescência mostraram que a infecção por promastigotas metacíclicas de L. amazonensis estimula a redistribuição do receptor A2B para a superfície de células dendríticas infectadas, sem alterar a quantidade total do receptor, avaliada por western blotting, nem a expressão dos receptores de adenosina A1, A2A e A3. A infecção por L. braziliensis, L. major ou promastigotas procíclicas de L. amazonensis não alteram a expressão do receptor A2B em células infectadas. Nossos resultados mostraram, ainda, que a infecção por L. amazonensis estimula a produção de AMPc e a fosforilação de ERK1/2 por mecanismos dependentes do receptor A2B. Além disso, L. amazonensis prejudica a expressão de CD40 e a produção de IL-12p70 por células dendríticas, efeitos independentes de IL-10 e revertidos pela inibição de adenilato ciclase, de PI3K e da fosforilação de ERK1/2. Por fim, camundongos infectados na orelha por L. amazonensis na presença de inibidores do receptor A2B ou das proteínas PI3K ou ERK1/2 desenvolvem lesões menores se comparados a animais controles, mas apenas o bloqueio do receptor A2B é capaz de diminuir o parasitismo tecidual. Concluindo, nós propomos um novo mecanismo utilizado por L. amazonensis (redistribuição do receptor A2B AMPc PI3K ERK1/2) para inibir a ativação de células dendríticas, que parece ser importante para a deficiência na resposta imune observada na infecção por essa espécie de parasito. ______________________________________________________________________________________ / ABSTRACT: Leishmania infection can result in a wide spectrum of clinical manifestations and L. amazonensis is associated with a lack of antigen-specific T-cell responses. Dendritic cells direct the differentiation of T-helper 1 lymphocytes that contribute to the control of Leishmania infection. In a previous work, we showed that infection by L. amazonensis, but not by L. braziliensis or L. major, impairs dendritic cells responses by activating adenosine A2B receptors. Here, we evaluated the expression of adenosine receptors and the intracellular events triggered by A2B receptor in infected cells. Furthermore, we evaluated the role of these intracellular events in L. amazonensis-infected mice. With this aim, bone marrow-derived dendritic cells from C57BL/6J mice were infected with metacyclic promastigotes of either L. amazonensis, L. braziliensis or L. major. Fluorescence microscopy revealed that L. amazonensis infection stimulates the redistribution of A2B receptor to the surface of infected dendritic cells, without altering total A2B receptor protein density, as gauged by Western blotting, nor the expression of A1, A2A or A3 adenosine receptors. We also report that L. amazonensis increases cAMP production and ERK1/2 phosphorylation in infected dendritic cells by a mechanism dependent on A2B receptor. Furthermore, L. amazonensis infection impairs CD40 expression and IL-12 production by dendritic cells, an IL-10-independent effect prevented by the inhibition of adenylate cyclase, PI3K or ERK1/2 phosphorylation. Finally, mice infected in ear with L. amazonensis in the presence of inhibitors of A2B receptor, PI3K or ERK1/2 develop smaller lesions if compared with control animals, but only A2B receptor blockade decreases tissue parasitism. In conclusion, we propose a new pathway used by L. amazonensis (A2BR redistribution cAMP PI3K ERK1/2) to suppress dendritic cells activation, which may contribute to the pronounced deficiency of immune response elicited against this parasite infection.

Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós Graduação, Universidade Federal de Ouro Preto. / Submitted by Maurílio Figueiredo (maurilioafigueiredo@yahoo.com.br) on 2014-10-10T20:16:09Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 22190 bytes, checksum: 19e8a2b57ef43c09f4d7071d2153c97d (MD5) TESE_AdenosineProductionCD39.pdf: 1471044 bytes, checksum: 2af62f7d8c073380843cd9a8ae7ce6be (MD5) / Approved for entry into archive by Gracilene Carvalho (gracilene@sisbin.ufop.br) on 2014-11-07T12:09:27Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 22190 bytes, checksum: 19e8a2b57ef43c09f4d7071d2153c97d (MD5) TESE_AdenosineProductionCD39.pdf: 1471044 bytes, checksum: 2af62f7d8c073380843cd9a8ae7ce6be (MD5) / Made available in DSpace on 2014-11-07T12:09:27Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 22190 bytes, checksum: 19e8a2b57ef43c09f4d7071d2153c97d (MD5) TESE_AdenosineProductionCD39.pdf: 1471044 bytes, checksum: 2af62f7d8c073380843cd9a8ae7ce6be (MD5) Previous issue date: 2014 / Item withdrawn by Gracilene Carvalho (gracilene@sisbin.ufop.br) on 2014-12-05T12:14:11Z Item was in collections: PPCBIOL - Doutorado (Teses) (ID: 17) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 22190 bytes, checksum: 19e8a2b57ef43c09f4d7071d2153c97d (MD5) TESE_AdenosineProductionCD39.pdf: 1471044 bytes, checksum: 2af62f7d8c073380843cd9a8ae7ce6be (MD5) / Item reinstated by Gracilene Carvalho (gracilene@sisbin.ufop.br) on 2015-12-15T16:43:13Z Item was in collections: PPCBIOL - Doutorado (Teses) (ID: 17) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 22190 bytes, checksum: 19e8a2b57ef43c09f4d7071d2153c97d (MD5) TESE_AdenosineProductionCD39.pdf: 1471044 bytes, checksum: 2af62f7d8c073380843cd9a8ae7ce6be (MD5) / A leishmaniose cutânea (CL), causada por L. amazonensis, é caracterizada por uma intensa imuno- supressão e multiplicação descontrolada do parasito em modelos experimentais e é geralmente grave em humanos, variando desde a forma cutânea até a cutâneo-difusa. Não existem mecanismos precisos conhecidos sobre como L. amazonensis modula a resposta imunológica para que os macrófagos (MФ) infectados com L. amazonensis se tornem refratários à ativação por células T efetoras. Aqui, nós investigamos o possível mecanismo regulador que Leishmania provavelmente pode induzir em MФ residentes durante a interação precoce, de modo a impedir ativação das células. Neste estudo, analisou-se a expressão de CD39 e CD73, por citometria de fluxo, em MФ peritoneais murinos infectados com promastigotas metacíclicas de L. amazonensis e também a porcentagem dessas células que expressam a CD39 e CD73 foi avaliada. Nossos resultados mostraram que em 72hrs inativos os MФ tiveram baixa expressão de CD73. Curiosamente, no entanto, ao contrário de MФ tratados com LPS os infectados com L. amazonensis expressaram altos níveis de CD73. Esta informação foi posteriormente validada pelos resultados de estudos no contexto ex-vivo que mostrou igualmente que MФ infectados são predominantemente CD73+. Quando as atividades enzimáticas de CD39 e CD73 foram bloqueadas, tal como pelo uso de DIDS e MAD αβ, tanto a infecção quanto o número de amastigotas diminuiu significativamente após 48 horas de incubação. Da mesma forma, a inibição dos receptores de adenosina A2a e A2b de ZM241385 e MRS1754 também apresentou os mesmos efeitos sobre a sobrevivência do parasito e infectividade. Em estudo posterior, em busca de um possível papel da HIF- 1α na infecção por Leishmania, investigamos os efeitos da FM19G11, inibidor do HIF- 1α, na expressão de CD39 e CD73, bem como na infecção parasitária . Observou-se que, apesar de HIF - 1α poder influenciar na sobrevivência do parasito, os seus efeitos sobre a expressão de CD39 e CD73 não eram visíveis. Também foi avaliada, por PCR em tempo real, a expressão de receptores de adenosina em populações infectadas, nas quais não se observou nenhuma mudança significativa na expressão após 24 horas de infecção. Além disso, também foi avaliada a produção de citocinas, tais como TNF- α e IL-10 a partir da produção de NO nos grupos tratados. Surpreendentemente, não houve variação nos níveis destes mediadores, sugerindo a existência de outros mecanismos independentes da mediação por citocina para produção de Óxido Nítrico, tais como a produção de ROS ou efeitos leishmanacidas independentes do triptofano. Concluindo, nossos dados mostram que a infecção por L. amazonensis regula a expressão CD73 durante 24 horas de infecção e sua sobrevivência depende de atividades enzimáticas, bem como de receptores A2a e A2b. __________________________________________________________________________________________ / ABSTRACT:Cutaneous leishmaniasis (CL) caused by L. amazonensis is characterized by intense immune-suppression and uncontrolled parasite multiplication in experimental models and is usually severe in humans ranging from cutaneous to diffuse cutaneous leishmaniasis. There are no precise mechanisms known how L. amazonensis modulates immune response so that macrophages (MФ) infected with L. amazonensis are refractory to activation by effector T cells. Here, we investigated the possible regulatory mechanism that Leishmania can likely induce in host MФ during early interaction so as to prevent their host cells from activation. In this study, we analyzed the expression of CD39 and CD73, by flow cytometry, in murine peritoneal MФ infected with metacyclic promastigotes of L. amazonensis and percentage of those cells expressing CD39 and CD73 was evaluated. Our results showed that 72hrs rested MФ down regulated CD73 expression. Interestingly, however, unlike LPS treated MФ, L. amazonensis infected MФ up regulated CD73 expression. This data was further validated by the findings from in ex-vivo studies which equally support that infected MФ are predominantly CD73 positive. When CD39 and CD73 enzymatic activities were blocked such as by the use of DIDS and αβ MAD, both infection and amastigote number decreased significantly within 48hrs of incubation. Similarly, inhibition of adenosine receptors A2a and A2b by ZM241385 and MRS1754 also had the same effects on the parasite survival and infection. In another study, in search of a possible role of HIF-1α in Leishmania infection, we investigated the effects of FM19G11, inhibitor of HIF-1α, on expression of CD39 and CD73 as well as parasitic infection. We observed that although HIF-1α can influence in the parasite survival, their effects on CD39 and CD73 expression were not visible. We also evaluated the expression of adenosine receptors in infected population by real time PCR in which we observed no significant change in the expression after 24hrs of infection. Moreover, we also evaluated cytokine production such as TNF-alpha, IL-10 and NO production from the treated groups. Surprisingly, there was no alternation in the levels of these mediators suggesting other mechanisms, independent of cytokine mediated nitric oxide production such as ROS production or tryptophan independent oxygen anti-leishmanacidal effects, involved in it. In conclusion, our data show that L. amazonensis infected up regulates CD73 expression during 24hrs of infection and its survival is dependent on enzyme activities as well as A2a and A2b receptors.