Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós Graduação, Universidade Federal de Ouro Preto. / Submitted by Maurílio Figueiredo (maurilioafigueiredo@yahoo.com.br) on 2014-10-10T20:16:09Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 22190 bytes, checksum: 19e8a2b57ef43c09f4d7071d2153c97d (MD5) TESE_AdenosineProductionCD39.pdf: 1471044 bytes, checksum: 2af62f7d8c073380843cd9a8ae7ce6be (MD5) / Approved for entry into archive by Gracilene Carvalho (gracilene@sisbin.ufop.br) on 2014-11-07T12:09:27Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 22190 bytes, checksum: 19e8a2b57ef43c09f4d7071d2153c97d (MD5) TESE_AdenosineProductionCD39.pdf: 1471044 bytes, checksum: 2af62f7d8c073380843cd9a8ae7ce6be (MD5) / Made available in DSpace on 2014-11-07T12:09:27Z (GMT). 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Não existem mecanismos precisos conhecidos sobre como L. amazonensis modula a resposta imunológica para que os macrófagos (MФ) infectados com L. amazonensis se tornem refratários à ativação por células T efetoras. Aqui, nós investigamos o possível mecanismo regulador que Leishmania provavelmente pode induzir em MФ residentes durante a interação precoce, de modo a impedir ativação das células. Neste estudo, analisou-se a expressão de CD39 e CD73, por citometria de fluxo, em MФ peritoneais murinos infectados com promastigotas metacíclicas de L. amazonensis e também a porcentagem dessas células que expressam a CD39 e CD73 foi avaliada. Nossos resultados mostraram que em 72hrs inativos os MФ tiveram baixa expressão de CD73. Curiosamente, no entanto, ao contrário de MФ tratados com LPS os infectados com L. amazonensis expressaram altos níveis de CD73. Esta informação foi posteriormente validada pelos resultados de estudos no contexto ex-vivo que mostrou igualmente que MФ infectados são predominantemente CD73+. Quando as atividades enzimáticas de CD39 e CD73 foram bloqueadas, tal como pelo uso de DIDS e MAD αβ, tanto a infecção quanto o número de amastigotas diminuiu significativamente após 48 horas de incubação. Da mesma forma, a inibição dos receptores de adenosina A2a e A2b de ZM241385 e MRS1754 também apresentou os mesmos efeitos sobre a sobrevivência do parasito e infectividade. Em estudo posterior, em busca de um possível papel da HIF- 1α na infecção por Leishmania, investigamos os efeitos da FM19G11, inibidor do HIF- 1α, na expressão de CD39 e CD73, bem como na infecção parasitária . Observou-se que, apesar de HIF - 1α poder influenciar na sobrevivência do parasito, os seus efeitos sobre a expressão de CD39 e CD73 não eram visíveis. Também foi avaliada, por PCR em tempo real, a expressão de receptores de adenosina em populações infectadas, nas quais não se observou nenhuma mudança significativa na expressão após 24 horas de infecção. Além disso, também foi avaliada a produção de citocinas, tais como TNF- α e IL-10 a partir da produção de NO nos grupos tratados. Surpreendentemente, não houve variação nos níveis destes mediadores, sugerindo a existência de outros mecanismos independentes da mediação por citocina para produção de Óxido Nítrico, tais como a produção de ROS ou efeitos leishmanacidas independentes do triptofano. Concluindo, nossos dados mostram que a infecção por L. amazonensis regula a expressão CD73 durante 24 horas de infecção e sua sobrevivência depende de atividades enzimáticas, bem como de receptores A2a e A2b. __________________________________________________________________________________________ / ABSTRACT:Cutaneous leishmaniasis (CL) caused by L. amazonensis is characterized by intense immune-suppression and uncontrolled parasite multiplication in experimental models and is usually severe in humans ranging from cutaneous to diffuse cutaneous leishmaniasis. There are no precise mechanisms known how L. amazonensis modulates immune response so that macrophages (MФ) infected with L. amazonensis are refractory to activation by effector T cells. Here, we investigated the possible regulatory mechanism that Leishmania can likely induce in host MФ during early interaction so as to prevent their host cells from activation. In this study, we analyzed the expression of CD39 and CD73, by flow cytometry, in murine peritoneal MФ infected with metacyclic promastigotes of L. amazonensis and percentage of those cells expressing CD39 and CD73 was evaluated. Our results showed that 72hrs rested MФ down regulated CD73 expression. Interestingly, however, unlike LPS treated MФ, L. amazonensis infected MФ up regulated CD73 expression. This data was further validated by the findings from in ex-vivo studies which equally support that infected MФ are predominantly CD73 positive. When CD39 and CD73 enzymatic activities were blocked such as by the use of DIDS and αβ MAD, both infection and amastigote number decreased significantly within 48hrs of incubation. Similarly, inhibition of adenosine receptors A2a and A2b by ZM241385 and MRS1754 also had the same effects on the parasite survival and infection. In another study, in search of a possible role of HIF-1α in Leishmania infection, we investigated the effects of FM19G11, inhibitor of HIF-1α, on expression of CD39 and CD73 as well as parasitic infection. We observed that although HIF-1α can influence in the parasite survival, their effects on CD39 and CD73 expression were not visible. We also evaluated the expression of adenosine receptors in infected population by real time PCR in which we observed no significant change in the expression after 24hrs of infection. Moreover, we also evaluated cytokine production such as TNF-alpha, IL-10 and NO production from the treated groups. Surprisingly, there was no alternation in the levels of these mediators suggesting other mechanisms, independent of cytokine mediated nitric oxide production such as ROS production or tryptophan independent oxygen anti-leishmanacidal effects, involved in it. In conclusion, our data show that L. amazonensis infected up regulates CD73 expression during 24hrs of infection and its survival is dependent on enzyme activities as well as A2a and A2b receptors.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Farmacologia / Made available in DSpace on 2013-03-04T20:00:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 309418.pdf: 6770047 bytes, checksum: 2ae869b302507576ff090a4c7db27639 (MD5)

Os ritmos circadianos estão presentes em um grande número de organismos, proporcionando uma organização temporal de processos fisiológicos e comportamentais a fim de promover uma efetiva adaptação do organismo às mudanças ambientais. O ATP e seus produtos de degradação, o ADP, o AMP e a adenosina podem atuar como mensageiros extracelulares em uma série de processos biológicos, e estão envolvidos em uma variedade de condições patológicas, incluindo isquemia, doenças neurodegenerativas e cardiovasculares, depressão e câncer. O ATP extracelular, bem como os demais nucleotídeos de adenina, podem ser hidrolisados pela ação das enzimas nucleotidases incluindo as NTPDases e a 5'- nucleotidase, que são consideradas as principais reguladoras da sinalização purinérgica no sangue. O presente trabalho avaliou a possível existência de um padrão temporal nas atividades das enzimas responsáveis pela metabolização destes nucleotídeos, e se estas enzimas poderiam estar sendo moduladas pela melatonina, corticosterona ou norepinefrina, que claramente apresentam robustos padrões circadianos. A hidrólise dos nucleotídeos ATP e ADP foram significativamente maiores durante o ciclo escuro quando comparada com o ciclo claro. Além disso, nós demonstramos que as atividades ATPásica e ADPásica são sensíveis a uma concentração fisiológica de norepinefrina em experimentos in vitro e in vivo em soro de ratos. Este estudo sugere a existência de um padrão temporal na hidrólise do ATP e do ADP, que pode ser fisiologicamente importante para o funcionamento normal do organismo. Além disso, a norepinefrina pode modular estas atividades enzimáticas, provocando uma diminuição das concentrações de ATP e ADP circulantes. / Circadian rhythms are present in a large number of organisms, representing an important mechanism for preparing the organism to environmental changes. ATP and its breakdown products, ADP, AMP and adenosine can act as extracellular messengers in a range of biological processes through the binding to purinergic receptors, and are involved in a variety of pathological conditions including ischaemia, neurodegenerative, depression, cardiovascular and cancer diseases. Extracellular adenine nucleotides are metabolized to adenosine by a number of enzymes including NTPDases and 5’-nucleotidase that are considered to be the major regulators of purinergic signaling in blood. This study evaluated the possible existence of a temporal pattern of enzymatic activities responsible for metabolism of these nucleotides, and its possible modulation by melatonin, corticosterone or norepinephrine, which clearly show robust circadian patterns. The hydrolysis of ATP and ADP nucleotides were significantly higher during the dark cycle when compared with light cycle. Furthermore, we demonstrated that ATPase and ADPase activities are sensitive to a physiological concentration of norepinephrine in in vitro and in vivo experiments in rat blood serum. This study suggests the existence of a temporal pattern of ATP and ADP hydrolysis, which may be physiologically important for normal functioning of the body. Moreover, the norepinephrine may modulate these enzymatic activities, causing a decrease in the circulating levels of ATP and ADP.

O zebrafish é um modelo experimental consolidado em diversas áreas, tais como genética e neurociências. Estudos têm demonstrado que muitos genes deste peixe são evolutivamente conservados e similares aos de mamíferos, incluindo a espécie humana. Com relação ao sistema purinérgico, já foi demonstrado que o zebrafish apresenta diferentes membros da família das NTPDases (nucleosídeo trifosfato difosfoidrolases) e uma ecto-5’-nucleotidase, capazes de clivar o ATP até adenosina, que atua através de purinoreceptores P1. A adenosina deaminase (ADA) é responsável pela clivagem da adenosina à inosina. Dois membros da família da ADA, conhecidos como ADA1 e ADA2, foram descritos e evidências recentes demonstraram a existência de um outro grupo similar de proteína, denominado ADAL (adenosina deaminase “like”). Portanto, no primeiro capítulo desta Dissertação, foram identificados distintos genes relacionados à ADA (ADA1, ADAL e dois genes ortólogos da ADA2) através de uma análise filogenética. Primers específicos para cada membro da ADA foram desenhados, experimentos otimizados de RT-PCR foram conduzidos e a quantidade relativa de transcritos determinada em diversos tecidos. Os resultados demonstraram que os genes da ADA1, ADAL, ADA2-1 e ADA2-2 podem ser diferentemente expressos nos tecidos de zebrafish. Além disso, a estratégia adotada também permitiu a identificação de uma isoforma truncada de ADA2-1 de splicing alternativo (ADA2-1/T), a qual foi expressa em diferentes intensidades nos tecidos analisados. Considerando que distintos membros da adenosina deaminase foram identificados, o segundo capítulo teve por objetivo caracterizar a atividade de desaminação de adenosina em frações solúvel e de membrana do cérebro de zebrafish. A atividade enzimática foi determinada pelo ensaio colorimétrico da amônia liberada. Foi verificado que em ambas as frações celulares estudadas a atividade de desaminação da adenosina foi linear quando utilizada uma concentração final de substrato de 1,5 mM. A curva de proteína, após incubação a 37ºC por 75 min (pH 7,0) e 120 min (pH 5,0) para as frações solúvel e de membrana, respectivamente, foi linear quando utilizada uma quantidade de proteína na faixa de 5–20 μg. A adição de 5 mM de Zn2+ promoveu uma queda significativa na desaminação de adenosina em membranas, a qual foi prevenida com 5 mM de EDTA. Utilizando adenosina como substrato, o KM aparente para ambas as frações celulares foi de aproximadamente 0,2 mM, enquanto que o Vmax foi de 12,3 + 0,73 e 17,5 + 0,51 (média + EP) nmol NH3.min-1.mg-1 de proteína para as frações solúvel e de membrana, respectivamente. Os resultados também demonstraram uma preferência para a desaminação de nucleosídeos da adenina em relação aos da guanina. Além disso, a incubação com 0,1 mM de EHNA (hidrocloreto de eritro-9-(2-hidróxi-3-nonil) adenina), um inibidor clássico da ADA1, promoveu uma inibição significativa da atividade enzimática em ambas as frações celulares. Estes achados sugerem que a existência de diferentes genes associados à ADA, bem como seus distintos padrões de expressão podem contribuir para a atividade de desaminação de adenosina em zebrafish. / Zebrafish (Danio rerio) is a consolidated experimental model in several areas, such as genetics and neuroscience. Studies have shown that many genes of this fish are evolutionary conserved and that share similarities to mammals genes, including humans. In relation to the purinergic system, it was demonstrated that zebrafish presents distinct members of the NTPDase (nucleoside triphosphate diphosphohydrolase) family and an ecto- 5'-nucleotidase, able to cleave ATP to adenosine, which acts via P1 purinoreceptors. Adenosine deaminase (ADA) is responsible for cleaving the adenosine to inosine. Two members of ADA family, known as ADA1 and ADA2, were described and recent evidence demonstrated the existence of another similar protein group named ADAL (adenosine deaminase “like”). Therefore, in the first chapter of this Dissertation, distinct ADA-related genes were identified (ADA1, ADAL e two ADA2 orthologous genes) by a phylogenetic analysis. Specific primers for each ADA members were designed, optimized semi-quantitative RT-PCR experiments were conducted and the relative amount of transcripts was determined in several tissues. The results demonstrated that ADA1, ADAL, ADA2-1 e ADA2-2 genes may be expressed differently in zebrafish tissues. In addition, the strategy adopted also allowed the identification of a truncated alternative splice isoform of ADA2-1, which was expressed in the analyzed tissues with different intensities. Considering that distinct adenosine deaminase members were identified, the objective of the second chapter was to characterize the adenosine deaminase activity in soluble and membrane fractions of zebrafish brain. The enzyme activity was measured by the colorimetric assay from the ammonia released. It was verified that in both cellular fractions, the adenosine deaminase activity was linear when it was used a final substrate concentration of 1.5 mM. The protein curve was linear using an amount of 5–20 μg of protein in the incubation at 37ºC for 75 min (pH 7.0) and 120 min (pH 5.0) for soluble and membrane fractions, respectively. The addition of 5 mM Zn2+ promoted a significant decrease on adenosine deamination in membranes, which was prevented by 5 mM EDTA. Using adenosine as substrate, the apparent KM for both cellular fractions was around of 0.2 mM, whereas the calculated Vmax were 12.3 + 0.73 and 17.5 + 0.51 (mean + SEM) nmol NH3.min-1.mg-1 of protein for the soluble and membrane fractions, respectively. The results also demonstrated a preference for the deamination of adenine nucleosides in relation to guanine derivates. In addition, the incubation with 0.1 mM EHNA (erythro-9-(2- hydroxy-3-nonyl)-adenine, a classical inhibitor of ADA1, promoted a significant inhibition on the enzyme activity in both cellular fractions. These findings suggest that the existence of different ADA-related genes and their distinct expression patterns may contribute for the adenosine deamination activity in zebrafish.

O transplante renal representa atualmente a melhor opção terapêutica e de reabilitação para o paciente com insuficiência renal crônica terminal. As rejeições são as principais causas de perda dos rins transplantados e, entre essas, as rejeições agudas são as que apresentam maior relevância clínica. Desta maneira, a monitorização do transplante renal com vistas ao diagnóstico precoce da rejeição e seu rápido tratamento é de grande relevância no manejo adequado desses pacientes. Como a rejeição celular aguda é mediada predominantemente por linfócitos T e, visto que, a enzima adenosina deaminase (ADA) é encontrada principalmente, a nível de sangue periférico, em linfócitos, objetivou-se com esse estudo, verificar a possível associação entre atividade sérica da ADA e a rejeição aguda do enxerto renal. Buscou-se, também, determinar a sua utilidade como método diagnóstico de rejeição celular aguda. Foram acompanhados até 1 mês de internação 35 pacientes transplantados renais. Dosagens da atividade de ADA sérica foram feitas cinco vezes por semana e sempre que houvesse suspeita clínica de rejeição aguda. O diagnóstico de rejeição aguda foi estabelecido por 2 nefrologistas, aos quais foram omitidos os resultados dos níveis séricos ADA. Estes médicos tinham todas informações clínicas e laboratoriais, incluindo valores séricos de creatinina e ciclosporina, cintilografias, ecografias, citologia aspirativa, punção biópsia renal quando esta era realizada e resposta aos diferentes tratamentos imunossupressores usados. A análise estatística foi feita utilizando-se testes de Mann-Whitney e Qui-quadrado. O nível p menor do que 0,05 foi considerado como significativo. A mediana dos episódios de rejeição celular aguda ficou entre o sexto e sétimo dia pós-transplante, havendo diferença estatisticamente significativa nos valores de ADA no sexto dia de seguimento entre os pacientes com rejeição (60.16), em relação aos que não tiveram rejeição celular aguda (24,55) (p=0,021 MW). Para se avaliar a eficácia da atividade sérica de ADA com método diagnóstico de rejeição aguda, empregou-se pontos de corte de valores de ADA>35,>40,>45, >50 e > que 30% dos valores do período pré-rejeição. Houve associação estatisticamente significativa entre ADA>30% e rejeição celular aguda (p=0.035 MW). Verificou-se, também, aumento significativos da atividade sérica de ADA em pacientes anti-HCV positivos e com necrose tubular aguda, sem interferência sobre os resultados dos episódios de rejeição celular aguda. Usando esses pontos de corte como parâmetros de diagnóstico para rejeição aguda observou-se: sensibilidade = 55,5%, especificidade = 82,3%, valor preditivo positivo = 76,9%, valor preditivo negativo = 63,6% e acurácia = 69,0%. Conclui-se que há um aumento significativo da atividade sérica da ADA durante os episódios de rejeição aguda de enxertos renais humanos, encontrando-se associação significativa entre o aumento de 30% dos valores de ADA pré-rejeição e o diagnóstico de rejeição celular aguda.

Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós Graduação em Ciências da Saúde, da Universidade do Extremo Sul Catarinense – UNESC, para obtenção do título de Mestre em Ciências da Saúde. / Estudos prévios mostram que a administração crônica de cafeína na adolescência promove sensibilização cruzada com a administração aguda de metilfenidato na vida adulta. Esta sensibilização é caracterizada pelo aumento gradual e progressivo da atividade locomotora em ratos, induzida através da administração repetida de uma substância psicoestimulante. A cafeína é um antagonista não-seletivo dos receptores de adenosina do tipo A1 e, principalmente, A2A. Ambos os receptores modulam o sistema dopaminérgico, local onde o metilfenidato atua produzindo seus efeitos estimulantes como um agonista indireto. O objetivo do estudo foi avaliar o comportamento locomotor de ratos adultos e a participação de componentes celulares adenosinérgicos no cérebro dos animais após o tratamento de indução de sensibilização cruzada entre cafeína e metilfenidato. Ratos Wistar machos (21 dias), foram tratados com solução de cafeína (0,3 g/L) na garrafa de água (livre acesso) durante quatro semanas, após passarem por um período de suspensão da substância (washout) de 14 dias ingerindo água, no 15° dia os animais foram desafiados com metilfenidato intraperitoneal (1 mg/kg and 10mg/kg, i.p.) ou solução salina. Após 05 minutos do desafio com metilfenidato, foram administrados o inibidor da 5’-nucleotidase e antagonitas dos receptores de adenosina. 2 horas depois, os animais foram submetidos a avaliação comportamental no teste do campo aberto. 48 horas após a administração do metilfenidato os animais foram mortos e o hipocampo e estriado foram dissecados para posterior análise da atividade de ecto-nucleotidases, pela hidrólise de ATP, ADP e AMP (1 mM). A avaliação da atividade locomotora através da análise das explorações horizontais dos animais mostrou que metilfenidato não induziu alteração locomotora nas doses administradas. Porém, quando os animais foram tratados cronicamente com cafeína na adolescência e receberam uma dose aguda com metilfenidato (10 mg/kg) na vida adulta apresentaram hiperlocomoção, indicando a sensibilização cruzada. Nenhum inibidor ou antagonistas adenosinérgicos (AOPCP , CPT e ZM241385) foi capaz de alterar o efeito hiperlocomotor observado nos ratos tratados com metilfenidato 10 mg/kg que foram tratados cronicamente com cafeína na adolescência. Em relação a hidrólise de nucleotídeos, no estriado não houve diferença entre nenhum dos grupos em estudo, nem para hidrólise do ATP (atividade das NTPDases) nem para hidrólise de AMP (atividade da ecto-5´-nucleotidase). No hipocampo houve diminuição da hidrólise de ATP nos animais que ingeriram cafeína e foram tratados com metilfenidato 1 mg/kg, e a hidrólise do AMP diminuiu nos animais que ingeriram cafeína cronicamente e foram tratados com metilfenidato 1mg/kg e 10 mg/kg. Os resultados indicam que o uso crônico de cafeína, no presente estudo, pode ter gerado a adaptação do sistema adenosinérgico diminuindo a hidrólise de AMP e induzindo consequentemente, a redução da adenosina, na presença de um desafio estimulador desse sistema como o metilfenidato. Além disso, como previamente descrito na literatura, a cafeína apresentou efeitos de sensibilização cruzada com o metilfenidato. Porém, adicionais estudos são necessários para avaliar esta interação.

Dissertação apresentada ao curso de Pós-Graduação em Ciências da Saúde da Universidade do Extremo Sul Catarinense - UNESC, como requisito à obtenção do título de Mestre em Ciências da Saúde. / A estimulação eletroconvulsiva (ECS) aplicada experimentalmente em animais é largamente utilizada como um modelo de estudo para a terapia eletroconvulsiva. O uso de um pré-tratamento com os anticonvulsivos aumenta o limiar de convulsão induzido por choque ECS em modelo animal, demonstrando que o efeito do ECS pode ser modulado. Porém, as modificações que este modelo de convulsão causa entre os vários sistemas de neurotransmissores não são conhecidas. Há uma ampla evidência do envolvimento do neurotransmissor glutamato em crises epilépticas. A adenosina, importante neuromodulador do sistema nervoso central, exerce principalmente efeitos inibitórios através dos receptores A1, resultando em efeitos sedativos, anticonvulsivos e neuroprotetores, através de mecanismos de inibição da excitabilidade glutamatérgica. Ou seja, a adenosina é um importante modulador da atividade glutamatérgica, inibindo a liberação pré-sináptica e ação póssináptica do glutamato. No presente trabalho foi avaliado o efeito do choque sub-eletroconvulsivo (sub-ECS) aplicado em diferentes tempos antes do ECS no comportamento convulsivo e na locomoção de camundongos. Também foi investigada a possível participação dos receptores adenosinérgicos e glutamatérgicos do tipo NMDA no efeito do sub-ECS a partir da administração dos antagonistas, cafeína e MK- 801, respectivamente. Os camundongos CF-1 machos albinos (60 dias, 30-40 g) receberam choques sub-convulsivos e/ou convulsivos em diferentes intervalos de tempo, de acordo com os grupos: controle (sham), sub-ECS, ECS, sub-ECS + ECS 30 min, 4h, 8h, 24h, 48h ou 72h. Os animais foram pré-tratados com injeções intraperitoniais de solução salina (NaCl 0,9g%), 30 mg de cafeína/kg ou 0,25 mg/kg de MK-801 de animal 30min antes da aplicação do sub-ECS. O comportamento convulsivo (extensão tônica de 180° das patas traseiras) e a atividade locomotora dos camundongos foram avaliados. A aplicação do sub-ECS com 4h a 48h de intervalo entre a aplicação do ECS reduziu em de 72,7% a 90,9% o número de animais com convulsões após o ECS, efeito esse bloqueado por cafeína quando os intervalos entre sub-ECS e ECS foram maiores que 8h. O MK-801, ao contrário, só não bloqueou o efeito protetor do sub-ECS no intervalo de 30min entre o ECS. A associação dos choques sub-ECS e ECS induziu hipolocomoção nos animais quando eles foram avaliados 2h após o ECS. A cafeína não foi capaz de alterar esse efeito comportamental, mas o MK-801 bloqueou a hipolocomoção da induzida pela aplicação dos choques nos intervalos de 30min, 24h e 48h. O presente estudo demonstra o efeito protetor do sub-ECS contra convulsões induzidas pelo ECS, com possível participação do sistema de neurotransmissão glutamatérgica e de modulação adenosinérgica.

Orientador: Fabio Erminio Mingatto / Banca: Flavia Thomaz Verechia Pereira / Banca: Tiago Rodrigues / Resumo: Abamectina é uma lactona macrocíclica pertencente à família das avermectinas, utilizada mundialmente como agente antiparasitário em animais de criação e estimação, além do emprego agrícola como princípio ativo dos inseticidas e nematicidas. Mitocôndrias são responsáveis pela conversão da energia liberada pelo transporte de elétrons e armazenamento como energia de ligação na molécula de ATP, um componente metabólico essencial. Interferências em sua síntese ou utilização caracterizam mecanismos pelos quais os xenobióticos podem expressar toxicidade aguda ou crônica. Neste trabalho, os efeitos da abamectina na bioenergética de mitocôndrias isoladas de fígado de rato foram avaliados. Nas concentrações utilizadas (5 a 25 µM), abamectina causou inibição da cadeia respiratória, sem afetar a atividade das enzimas NADH desidrogenase, succinato desidrogenase e o potencial de membrana, comportando-se de maneira semelhante à oligomicina e ao atractilosídeo. A principal atuação da abamectina foi reduzir o potencial mitocondrial de fosforilação oxidativa, diminuindo os níveis de ATP provavelmente como resultado de sua ação direta sobre a FoF1-ATPase, uma vez que inibiu a atividade desta enzima, e/ou sobre o translocador de ADP/ATP. A inibição mais acentuada da atividade fosfohidrolase em mitocôndrias intactas desacopladas do que em mitocôndrias rompidas juntamente com a inibição da despolarização do potencial de membrana induzida pelo ADP sugerem que a abamectina atuou inibindo mais especificamente o translocador de ADP/ATP do que a FoF1-ATPase / Abstract: Abamectin is a macrocyclic lactone belonging to the avermectin family, used worldwide as antiparasitic agent in farm animals and pets, and agricultural employment as the active ingredient of insecticides and nematicides. Mitochondria are responsible for converting the energy released by electron transport and storage as the binding energy molecule ATP, an essential metabolic component. Interference in its synthesis or utilization characterize mechanisms by which xenobiotics can express acute or chronic toxicity. In this study, the effects of abamectin in the bioenergetics of mitochondria isolated from rat liver were evaluated. At the concentrations used (5-25 mM), abamectin caused inhibition of the respiratory chain without affecting the activity of enzymes NADH dehydrogenase, succinate dehydrogenase and the membrane potential, behaving similarly to oligomycin and Atractyloside. The main activity of abamectin was to reduce the potential of mitochondrial oxidative phosphorylation, decreasing ATP levels probably as a result of its direct action on the Fo-F1 ATPase, since it inhibited the activity of this enzyme, and/or the ADP/ATP translocator. The more pronounced inhibition of the fosfohydrolase activity in intact uncoupled mitochondria than in disrupted mitochondria, in addition to the inhibition of the ADP-stimulated depolarization of mitochondrial membrane potential suggest that abamectin acted more specifically by inhibiting the ADP/ATP translocator than the FoF1-ATPase / Mestre

Made available in DSpace on 2013-10-11T13:35:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000451454-Texto+Completo-0.pdf: 6697842 bytes, checksum: 890c954db41088b36538c3133a7c2606 (MD5) Previous issue date: 2013 / Epilepsy, characterized by the occurrence of spontaneous and recurrent seizures, is one of the main chronic neurological diseases, affecting around 1% of the world's population. Adenosine is an endogenous modulator of neuronal excitability and has anticonvulsant properties. Thus, the modulation of adenosinergic signalling pathway may presents important effects on epilepsy. In this study we characterize different aspects of the adenosinergic signaling in a model of seizures induced by pentylenetetrazole (PTZ) in zebrafish. In this study we also analyzed the effect of different modulators of adenosinergic signaling on controlling the development of seizures. Our results showed that the activation of type A1 adenosine receptors has an important role in controlling seizures in zebrafish. Furthermore, we observed that ecto-5´-nucleotidase and ADA enzymes, in addition to nucleoside transporters, are directly involved in controlling extracellular adenosine levels and, consequently, in controlling the development of seizures in this teleost. In addition, we clarified the occurrence of controversial data related to the mTOR signaling pathway in oxidative stress. Previous studies have suggested the activation of this pathway in oxidative stress based on the misinterpretation of the phosphorylation of RSK and MSK proteins through the antibody anti-phospho-Thr389-S6K, in addition to protein S6 phosphorylation, regulated by the MAPK signaling pathway in this case. Therefore, these findings might contribute for a better understanding about the signaling pathways involved in the mechanisms of seizure control and represents na alternative for the development of antiepileptic drugs, increasing the therapeutic options in epilepsia. Our results may also contribute to future studies on the characterization and modulation of TOR signaling pathway in zebrafish. / A epilepsia, caracterizada pela ocorrência de crises convulsivas espontâneas e recorrentes, é umas das principais doenças neurológicas crônicas, afetando em torno de 1% da população mundial. A adenosina é um modulador endógeno da excitabilidade neuronal e apresenta propriedades anticonvulsivantes. Sendo assim, a modulação da via de sinalização adenosinérgica pode apresentar um efeito importante na epilepsia. Neste estudo, nós caracterizamos diferentes aspectos da sinalização adenosinérgica em modelo de crise convulsiva induzida por pentilenotetrazol (PTZ) em peixe-zebra. Nossos resultados demonstram um aumento nas atividades da adenosina desaminase (ADA), responsável pela desaminação de adenosina em inosina, logo após uma crise convulsiva. Além disso, foi observado que os fármacos antiepilépticos gabapentina, fenitoína e ácido valpróico preveniram o efeito estimulatório promovido pelo PTZ sobre as atividades da adenosina desaminase. Neste estudo, também analisamos o efeito de diferentes moduladores da sinalização adenosinérgica no controle do desenvolvimento de convulsões induzidas por PTZ. Nossos resultados demonstraram que a ativação de receptores de adenosina do tipo A1 tem importante participação no controle de crises convulsivas em peixe-zebra. Além disso, observamos que as enzimas ecto-5´-nucleotidase e ADA, além dos transportadores de nucleosídeos estão diretamente envolvidos no controle dos níveis extracelulares de adenosina e, consequentemente, no controle do desenvolvimento de crises convulsivas neste teleósteo. Além disso, esclarecemos a ocorrência de dados controversos relacionados à via de sinalização mTOR em estresse oxidativo. Estudos sugeriram a ativação desta via em estresse oxidativo baseados na interpretação equivocada da fosforilação das proteínas RSK e MSK pelo anticorpo anti-fosfo-Thr389-S6K, além da fosforilação da proteína S6, regulada neste caso pela via de sinalização MAPK. Este estudo pode contribuir para um maior entendimento das vias de sinalização envolvidas nos mecanismos de controle de crises convulsivas e representar uma alternativa para o desenvolvimento de fármacos antiepilépticos, aumentando as opções terapêuticas em epilepsia. Nossos resultados também podem contribuir para futuros estudos referentes à caracterização e modulação da via de sinalização TOR em peixe-zebra.

Os transtornos de ansiedade estão entre os mais prevalentes de todos os transtornos mentais no mundo. Estão associados a sofrimento subjetivo e prejuízo na qualidade de vida dos pacientes. Porém os mecanismos fisiopatológicos da ansiedade ainda necessitam de muita investigação. Recentemente, nosso grupo demonstrou que a administração sistêmica de GMP é capaz de induzir um efeito típico ansiolítico em ratos, contudo, o mecanismo de ação deste efeito ainda não foi esclarecido. Assim, no presente estudo buscamos investigar os mecanismos envolvidos no efeito ansiolítico do GMP, além de avaliar o potencial efeito ansiolítico da guanosina (GUO), e explorar o envolvimento do sistema adenosinérgico e glutamatérgico nos efeitos observados. Nossos resultados evidenciam que o GMP é capaz de promover efeito típico ansiolítico quando a administração é central, aumentar os níveis de GUO e adenosina (ADO) no liquor quando sua administração é intraperitoneal (i.p.). Ainda, observamos que a administração i.p. de GUO possui efeito típico ansiolítico, aumentando apenas os níveis de ADO no liquor. Com isso, demonstramos que a administração de GUO foi capaz de diminuir os níveis de glutamato no liquor, sem alterar a captação de glutamato em regiões do cérebro relacionadas com a ansiedade. Por fim, mostramos que o pré-tratamento com cafeína foi capaz de abolir o efeito ansiolítico da GUO e parcialmente bloquear a diminuição dos níveis de glutamato no liquor. Como conclusão, este estudo fornece novas evidências sobre o mecanismo de ação do GMP e da GUO, e mostra que o efeito ansiolítico pode estar relacionado com a modulação do sistema adenosinérgico e glutamatérgico. / Anxiety disorders represent the most common worldwide psychiatric diseases but nowadays there is no satisfactory strategy to their treatment without severe adverse effects. Recently, we demonstrated that a systemic administration of GMP induces anxiolytic-like effect in rats but its mechanism of action remains unclear. In the present study we aimed to investigate the mechanisms insights into how GMP induces anxiolytic-like effects and further explored the anxiolytic potential of guanosine (GUO) and the involvement of the adenosinergic and glutamatergic system on those effects. Our results showed that GMP induces anxiolytic-like behaviors centrally and increases cerebrospinal fluid (CSF) CSF GUO and adenosine (ADO) levels 60 min after a systemic administration. Furthermore, systemic administration of GUO produced anxiolytic-like behaviors but enhance only CSF ADO level 60 min after administration. In addition, GUO treatment decreased CSF glutamate level but did not change glutamate uptake in brain regions related to anxiety. Moreover, the pre administration of CAF abolished GUO anxiolytic-like effects and partially blocked GUO effects on CSF glutamate level. In summary, the present work presents the anxyolitic effects of GMP and GUO and provides new evidence that these effects seem to be related to the modulation of adenosinergic and glutamatergic systems.