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"Transcript finishing initiative" : contribuição do laboratório IL2 /

Ferrasi, Adriana Camargo. January 2003 (has links)
Orientador: Maria Inês de Moura Campos Pardini / Banca: Maurício Bacci Junior / Banca: Magaly Machado Sales / Resumo: O principal objetivo na análise de um genoma é a identificação gênica. Várias ferramentas computacionais estão disponíveis para este propósito e são baseadas em similaridade (BLAST e BLAT) ou em predição de genes (Genscan e Fgenes). Entretanto, estes programas estão se mostrando ineficientes para detectar e caracterizar todos os genes presentes no genoma humano. A importância das informações de cDNAs tem sido reconhecida desde o início do Projeto Genoma Humano, entretanto, o seqüenciamento em larga escala de cDNAs completos ainda requer técnicas avançadas tais como a produção de bibliotecas de cDNAs enriquecidas por transcritos grandes e raros. O seqüenciamento parcial de etiquetas de seqüências expressas (ESTs) foi desenvolvido como uma técnica alternativa para gerar, em larga escala, vários tipos de cDNAs. Atualmente, a maioria das informações de cDNAs no GenBank são representadas por ESTs convencionais 3þ e 5þ e ORESTES (provenientes das porções centrais dos transcritos). Baseados nos bancos de dados gerados pelo alinhamento de todas essas seqüências com as seqüências genômicas humanas disponíveis foi proposta a estratégia "transcript finishing" para a caracterização e validação de novos genes humanos, como parte do consórcio entre FAPESP e Instituto Ludwig de Pesquisa sobre o Câncer. O projeto "Transcript Finishing Initiative" está sendo realizado por uma rede de 31 diferentes grupos de pesquisa do Estado de São Paulo. Foram selecionados pela coordenação do projeto, 602 transcritos e destes 300 (50%) foram validados. Destes transcritos, 20 foram atribuídos ao laboratório validador IL2, e destes, 11 (55%) foram validados. Utilizando ferramentas de bioinformática, o laboratório IL2 realizou uma anotação preliminar dos consensos de seus transcritos validados (disponibilizados pela coordenação do projeto)... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo). / Abstract: A fundamental task in analyzing genome is gene identification. This is relatively straightforward for compact genome but much more challenging for complex genomes. Some computational tools are available for this purpose, but they are bases on similarity (BLAST) or prediction analysis (Genscan and Fgenes). However, these programs are inefficient to detect and characterize all genes present in the genome. The importance of cDNA information has been recognized since the beginning of the Human Genome Project, however cost-effective and hightroughput sequencing of full-length cDNA still requires technical advances such as the production of cDNA libraries enriched for large and rare transcripts. Partial sequencing of expressed sequences (EST) has been developed as an alternative approach for the generation, in large-scale, of several kinds of cDNAs. Currently, the vast majority of cDNA data in the GenBank is represented both by conventional 5þand 3þexpressed sequence tags (ESTs) and by ORESTES (open reading frame ESTs), which is derived from central portions of the transcripts. Based on a database generated through alignment of all of these sequences to the available human genomic sequences, have been proposed the transcript finishing strategy for characterization and validation of new human genes, as part of the FAPESP-LICR Transcript Finishing Initiative. The strategy utilizes the ORESTES scaffold EST sequence to build primers for reverse transcription (RT) - PCR reactions in order to bridge gaps, thereby confirming the membership of ESTs to a common transcript and providing information on the intervening sequence (validation strategy). The FAPESP-LICR Transcript Finishing Initiative is being pursed by a network of 31 different research groups from the State of São Paulo (The Transcript Finishing Consortium) coordinated by 2 different laboratories... (Complete abstract click electronic address below). / Mestre
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Transcript finishing initiative: contribuição do laboratório IL2

Ferrasi, Adriana Camargo [UNESP] 25 February 2003 (has links) (PDF)
Made available in DSpace on 2014-06-11T19:23:00Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2003-02-25Bitstream added on 2014-06-13T20:49:45Z : No. of bitstreams: 1 ferrasi_ac_me_rcla.pdf: 2629180 bytes, checksum: c178eeb179f2c77ab45bfcddeb648f51 (MD5) / O principal objetivo na análise de um genoma é a identificação gênica. Várias ferramentas computacionais estão disponíveis para este propósito e são baseadas em similaridade (BLAST e BLAT) ou em predição de genes (Genscan e Fgenes). Entretanto, estes programas estão se mostrando ineficientes para detectar e caracterizar todos os genes presentes no genoma humano. A importância das informações de cDNAs tem sido reconhecida desde o início do Projeto Genoma Humano, entretanto, o seqüenciamento em larga escala de cDNAs completos ainda requer técnicas avançadas tais como a produção de bibliotecas de cDNAs enriquecidas por transcritos grandes e raros. O seqüenciamento parcial de etiquetas de seqüências expressas (ESTs) foi desenvolvido como uma técnica alternativa para gerar, em larga escala, vários tipos de cDNAs. Atualmente, a maioria das informações de cDNAs no GenBank são representadas por ESTs convencionais 3þ e 5þ e ORESTES (provenientes das porções centrais dos transcritos). Baseados nos bancos de dados gerados pelo alinhamento de todas essas seqüências com as seqüências genômicas humanas disponíveis foi proposta a estratégia transcript finishing para a caracterização e validação de novos genes humanos, como parte do consórcio entre FAPESP e Instituto Ludwig de Pesquisa sobre o Câncer. O projeto Transcript Finishing Initiative está sendo realizado por uma rede de 31 diferentes grupos de pesquisa do Estado de São Paulo. Foram selecionados pela coordenação do projeto, 602 transcritos e destes 300 (50%) foram validados. Destes transcritos, 20 foram atribuídos ao laboratório validador IL2, e destes, 11 (55%) foram validados. Utilizando ferramentas de bioinformática, o laboratório IL2 realizou uma anotação preliminar dos consensos de seus transcritos validados (disponibilizados pela coordenação do projeto)... . / A fundamental task in analyzing genome is gene identification. This is relatively straightforward for compact genome but much more challenging for complex genomes. Some computational tools are available for this purpose, but they are bases on similarity (BLAST) or prediction analysis (Genscan and Fgenes). However, these programs are inefficient to detect and characterize all genes present in the genome. The importance of cDNA information has been recognized since the beginning of the Human Genome Project, however cost-effective and hightroughput sequencing of full-length cDNA still requires technical advances such as the production of cDNA libraries enriched for large and rare transcripts. Partial sequencing of expressed sequences (EST) has been developed as an alternative approach for the generation, in large-scale, of several kinds of cDNAs. Currently, the vast majority of cDNA data in the GenBank is represented both by conventional 5þand 3þexpressed sequence tags (ESTs) and by ORESTES (open reading frame ESTs), which is derived from central portions of the transcripts. Based on a database generated through alignment of all of these sequences to the available human genomic sequences, have been proposed the transcript finishing strategy for characterization and validation of new human genes, as part of the FAPESP-LICR Transcript Finishing Initiative. The strategy utilizes the ORESTES scaffold EST sequence to build primers for reverse transcription (RT) - PCR reactions in order to bridge gaps, thereby confirming the membership of ESTs to a common transcript and providing information on the intervening sequence (validation strategy). The FAPESP-LICR Transcript Finishing Initiative is being pursed by a network of 31 different research groups from the State of São Paulo (The Transcript Finishing Consortium) coordinated by 2 different laboratories... (Complete abstract click electronic address below).
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Estudo dos efeitos da aplicação de aminoacidos excitatorios sobre os potenciais evocados corticais induzidos por estimulação tactil no rato

Souza, Washington Portela de January 1991 (has links)
Dissertação (mestrado) - Escola Paulista de Medicina. Departamento de Fisiologia / Made available in DSpace on 2016-01-08T17:01:00Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 1991
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Estudo dos efeitos da aplicação de aminoacidos excitatorios sobre os potenciais evocados corticais induzidos por estimulação tactil no rato

Souza, Washington Portela de January 1991 (has links)
Dissertação (mestrado) - Escola Paulista de Medicina. Departamento de Fisiologia / Made available in DSpace on 2012-10-16T04:08:50Z (GMT). No. of bitstreams: 0
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FUNCTIONAL PROTEOMICS OF CIRRHOSIS AND HEPATOCELLULAR CARCINOMA / ProteÃmica Funcional da Cirrose e do Carcinoma Hepatocelular

Aline Maria Araujo Martins 26 March 2012 (has links)
Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / Introduction. Cancer is the most common given name to a series of molecular and physiological events which result in genetic instability and biochemical imbalance in cells. Among the seven events that drives cell cancer, the role of chronic inflammation and tumor microenvironment in cancer development were highlighted in this work . To experimentally evaluate some of these events was chosen as an experimental model, cirrhosis resulting from chronic hepatitis (viral and alcoholic) as a progressor of hepatocellular carcinoma (HCC), the most common liver cancer. Goals. To identify and correlate proteins/enzymes involved in chronic inflammatory process of cirrhosis and HCC establishment in cancer progress. Patients and Methods. The profile of soluble proteins in inflammatory tissue and in HCC were analyzed using Functional Proteomics techniques of , such as 2D DIGE, coupled to mass spectrometry. The interaction within the identified proteins signaling pathways was performed by using MetaCore software. Results. In this study, where identified proteins that never been described in the literature, using differential gel electrophoresis within the different biological scenarios analyzed here, such as macrophage metalloelastase - MMP12; Collagenase 3 - MMP13; endoplasmina - HSP90B1; heat shock protein HSP 90β - HSP90AB1; Protein S100 A6; Disintegrin and metalloproteinase with a thrombospondin motifs 9 - ADAMTS9, those playing an important role in carcinogenesis. Discussion Relevant observations due to signaling pathways within the proposed biological scenario were analysed, as well as specific pathways in each etiology. Conclusion. Proteins/enzymes involved in cirrhosis and chronic inflammatory progression and the development of HCC were identified and related by their functionality. The interaction between identified proteins within each biological scenario was evaluated from the perspective of its signaling pathways, and differences between those pathways were demonstrated. Tumor microenvironment plays and undergoes significant influence on the variation of gene expression. / IntroduÃÃo. O cÃncer à o nome mais comum dado a uma sÃrie de eventos moleculares e fisiolÃgicos que resultam na instabilidade genÃtica e no desequilÃbrio bioquÃmico nas cÃlulas. Dentro os sete eventos celulares que regem o cÃncer destaca-se neste trabalho o papel da inflamaÃÃo crÃnica e do microambiente tumoral no desenvolvimento dos tumores. Para avaliar experimentalmente alguns destes eventos foi escolhido como modelo experimental, a cirrose resultante da hepatite crÃnica (viral e alcoÃlica) como progressora da neoplasia mais comum no fÃgado, o carcinoma hepatocelular. Objetivo. Identificar e inter-relacionar as proteÃnas/enzimas envolvidas no processo inflamatÃrio crÃnico da cirrose e o estabelecimento dos processos neoplÃsicos no carcinoma hepatocelular. Pacientes e MÃtodos. Utilizando de tÃcnicas de ProteÃmica diferencial, 2D DIGE acoplada à espectrometria de massa, foram analisadas, entre vÃrios cenÃrios biolÃgicos, o perfil das proteÃnas solÃveis em tecidos inflamatÃrios e no prÃprio carcinoma hepatocelular. Uma abordagem por meio da interaÃÃo das proteÃnas anotadas em vias de sinalizaÃÃo foi realizada por meio do programa MetacoreÂ. Resultados. Neste estudo, proteÃnas que nÃo haviam sido separadas e purificadas por meio de eletroforese em gel diferencial foram anotadas, como MacrÃfago metaloelastase - MMP12; Colagenase 3 â MMP13; endoplasmina - HSP90B1; ProteÃna S100 A6; Desintegrina e metaloproteinase com repetiÃÃo de trombospondina 9 - ADAMTS9, estas desempenhando importante papel na carcinogÃneses. DiscussÃo Relevantes observaÃÃes das vias de sinalizaÃÃo que regem cada cenÃrio biolÃgico proposto, foram realizadas e vias especÃficas em cada etiologia foram analisadas. ConclusÃo. As proteÃnas/enzimas envolvidas no processo inflamatÃrio crÃnico da cirrose e o surgimento/progressÃo do carcinoma hepatocelular foram identificadas e caracterizadas quanto à sua funcionalidade e a interaÃÃo das mesmas, com outras proteÃnas diferenciais anotadas em cada cenÃrio biolÃgico foi avaliada dentro da perspectiva de suas vias de sinalizaÃÃo correspondentes. O microambiente tumoral exerce e sofre importante influÃncia na variaÃÃo da expressÃo gÃnica.
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ExpressÃo de genes relacionados Ãs vias de reparo de danos em fita dupla no DNA em pacientes com sÃndrome mielodisplÃsica / Expression of genes related to damage repair pathways in double-stranded DNA in patients with myelodysplastic syndrome

Howard Lopes Ribeiro JÃnior 09 June 2016 (has links)
nÃo hà / The myelodysplastic syndrome (MDS) is a group of clonal hematopoietic stem cell disorders characterized by cytopenia (s) peripheral (s), dysplasia of one or more myeloid cell lineages and increased risk of acute myeloid leukemia development. MDS is considered a disease of elderly people, since approximately 80% of patients are over 60 years of diagnosis. The causes of MDS are known only in 15% of cases. With respect to environmental factors such as MDS triggers may be included the use of prior chemotherapy, especially alkylating agents and purine analogs, radiation therapy and smoking. The pathogenesis of MDS involves DNA damage in hematopoietic stem cells affected probably by double-stranded damage (DSB) in the DNA and the case of joints by non-homologous ends (NHEJ) and homologous recombination main repair mechanisms necessary to ensure stability genomics of stem cells. This cohort study aimed to assess the level of expression of mRNA of the genes active in the repair mechanism of double-stranded DNA damage (BRCA1, BRCA2 and RAD51, operating in HR mechanism, the XRCC5, XRCC6 and LIG4 related mechanism for NHEJ and, finally, the ATM) linking the molecular findings with their polymorphic variants (rs4793191, rs9567623, rs1801320, rs3835, rs2267437, rs1805388 and rs228593, respectively) and with clinical and socio-demographic of patients of Myelodysplastic Syndromes. This genotyping analysis was based on qPCR methodology, including bone marrow samples from 83 patients with MDS and 10 bone marrow samples from healthy elderly volunteers. The MDS patients were diagnosed according to the criteria proposed by the World Health Organization and stratified according to the criteria established by prognÃsitoc Score Index International Prognostic revised. In this study we observed that: 1. the ATM, BRCA1, BRCA2 and RAD51 genes were significantly associated with cellularity variable bone marrow of patients with MDS; 2. the XRCC5 gene introduced is associated with the presence of ringed sideroblasts on the analysis of the bone marrow of patients with MDS; 3. The BRCA2, RAD51 and LIG4 genes correspond to potential markers of poor prognosis and progression in clonal cases of MDS de novo of high level, being associated with decreased survival and a high chance of progression to AML; 4. the XRCC6 gene is a negative prognostic factor for patients at low risk, it is evident that the decrease in expression of this gene is able to identify an unfavorable subgroup within the low-risk patients who have higher dependence transfusion and increased genomic instability and finally, 5 the results of analysis of influence of functional polymorphisms in MDS emphasize the importance of polymorphism rs228593, rs2267437 and rs1805388 in differentiating the expression levels of ATM, XRCC6 and LIG4 genes, respectively, compared to patients with clinical variables MDS representing novel targets for the study of the pathogenesis of this disease. We demonstrate that the DSBs repair related genes are also related to the pathogenesis of MDS. These results support the importance of the expression levels of ATM, BRCA1, BRCA2, RAD51, XRCC5, XRCC6 and LIG4 genes, as well as the frequency of the respective polymorphisms (rs228593, rs4793191, rs9567623, rs1801320, rs3835, rs2267437 and rs1805388) in the maintenance genomic stability of hematopoietic stem cells promoting a better understanding of the etiology, diagnosis and prognostic stratification and the process of clinical development of Myelodysplastic Syndromes. / SÃndrome MielodisplÃsica (SMD) à um grupo de doenÃas clonais das cÃlulas progenitoras hematopoiÃticas, caracterizadas por citopenia(s) perifÃrica(s), displasia de uma ou mais linhagens celulares mielÃides e aumento do risco de desenvolvimento de leucemia mielÃide aguda. A SMD à considerada uma doenÃa de pessoas idosas, pois aproximadamente 80% dos pacientes possuem mais de 60 anos ao diagnÃstico. As causas da SMD sÃo conhecidas em apenas 15% dos casos. Em relaÃÃo aos fatores ambientais como desencadeadores da SMD, podem ser incluÃdos o uso de quimioterapia prÃvia, especialmente de agentes alquilantes e anÃlogos da purina, radioterapia e tabagismo. A patogÃnese da SMD envolve danos no DNA nas cÃlulas tronco hematopoÃticas acometido provavelmente pelos danos de fita dupla (DSB) no DNA tendo o processo de junÃÃes por extremidades nÃo-homÃlogas (JENH) e recombinaÃÃo homÃloga como principais mecanismos de reparo necessÃrios para garantir a estabilidade genÃmica das cÃlulas-tronco. Este estudo de coorte propÃs avaliar o nÃvel de expressÃo do mRNA dos genes atuantes no mecanismo de reparo em danos de fita dupla no DNA (BRCA1, BRCA2 e RAD51, atuantes no mecanismo de RecombinaÃÃo HomÃloga; o XRCC5, XRCC6 e LIG4 relacionados ao mecanismo de JunÃÃes por Extremidades nÃo-HomÃlogas e, por fim, o ATM) associando os achados moleculares com suas variantes polimÃrficas (rs4793191, rs9567623, rs1801320, rs3835, rs2267437, rs1805388 e rs228593, respectivamente) e com variÃveis clÃnicas e sÃcio-demogrÃficas de pacientes portadores de SÃndrome MielodisplÃsica. Esta anÃlise de genotipagem baseou-se na metodologia de qPCR, entre amostras de medula Ãssea de 83 pacientes com SMD e 10 amostras de medula Ãssea de idosos voluntÃrios sadios. Os pacientes com SMD foram diagnosticados de acordo com os critÃrios propostos pela OrganizaÃÃo Mundial de SaÃde e estratificados de acordo com os critÃrios prognÃsitoc estabelecidos pelo Ãndice de Score PrognÃstico Internacional revisado. Com este estudo foi possÃvel identificar que: 1. os genes ATM, BRCA1, BRCA2 e RAD51 foram associados significativamente com a variÃvel de celularidade da medula Ãssea dos pacientes com SMD; 2. o gene XRCC5 apresentou-se associado com a presenÃa de sideroblastos em anel quanto à anÃlise da medula Ãssea dos pacientes com SMD; 3. os genes BRCA2, RAD51 e LIG4 correspondem a possÃveis marcadores de pior prognÃstico e de progressÃo clonal em casos de SMD de novo de alto grau, estando associados a uma diminuiÃÃo da sobrevida e a uma elevada chance de evoluÃÃo para LMA; 4. o gene XRCC6 à um fator de prognÃstico desfavorÃvel para os pacientes de baixo risco, sendo evidente que a diminuiÃÃo da expressÃo deste gene à capaz de identificar um subgrupo desfavorÃvel dentro dos pacientes de baixo risco que apresentariam maior dependÃncia transfusional e maior instabilidade genÃmica e, por fim, 5. os resultados das anÃlises de influÃncia dos polimorfismos funcionais na SMD realÃam a importÃncia dos polimorfismos rs228593, rs2267437 e rs1805388 na diferenciaÃÃo dos nÃveis de expressÃo dos genes ATM, XRCC6 e LIG4, respectivamente, frente Ãs variÃveis clÃnicas de pacientes com SMD, representando novos alvos para o estudo da patogÃnese desta doenÃa. Demonstramos que os genes relacionados à reparaÃÃo das DSBs sÃo tambÃm relacionados a patogÃnese da SMD. Estes resultados suportam a importÃncia dos nÃveis de expressÃo dos genes ATM, BRCA1, BRCA2, RAD51, XRCC5, XRCC6 e LIG4, como tambÃm da frequÃncia dos seus respectivos polimorfismos (rs228593, rs4793191, rs9567623, rs1801320, rs3835, rs2267437 e rs1805388) na manutenÃÃo da estabilidade genÃmica das cÃlulas tronco hematopoiÃticas promovendo um melhor entendimento da etiologia, estratificaÃÃo diagnÃstica e prognÃstica e do processo de evoluÃÃo clÃnica da
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Clonación del CDNA y expresión del Gen de una proteina de la cromatina de embrión de guisante.

Castillo Aliaga, Josefa 19 December 2001 (has links)
No description available.
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Influência dos testes de triagem para detecção de sangue nos exames imunológicos e de genética forense

Almeida, Juliana Piva de January 2009 (has links)
Made available in DSpace on 2013-08-07T18:41:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000418143-Texto+Completo-0.pdf: 285814 bytes, checksum: 88313ad8173e10bd8abedb6c2a800e24 (MD5) Previous issue date: 2009 / Bloodstains are one of the major physical evidence to elucidate a crime. Diluted blood invisible to the naked eye can be detected using special reagents called presumptive tests. The effects of presumptive tests with luminol, Luminol 16®, Bluestar® Forensic and benzidine on the inhibition of human antiglobulin test, human hemoglobin immunochromatographic test and genotyping were evaluated in this study. All bloodstains were prepared by apllication of 2 μL drop of venous blood to squares of white cloth (100% cotton) and allowed to dry for 48 hours. Samples were then submitted to presumptive tests and dried for 48 hours before the inhibition of human antiglobulin and human hemoglobin immunochromatographic tests were evaluated. DNA was extractec by the organic method and quantified by Quantifiler® Human DNA Quantification (Applied Biosystems) at 48 hours, 7 days, 30 days or 120 days after reagents application. Samples treated with both luminol solutions or Bluestar® Forensic gave positive results at immunologic tests, indicating noninterference with human blood confirmatiry tests. Twenty samples treated with benzidine were negative for the inhibition of human antiglobulin test. Of the 20 bloodstains submitted to immunochromatographic test, 18 resulted negative, evidencing a deletery effect of benzidine over human blood confimatory tests. Real time PCR showed that 48 hours after benzidine solution application, DNA of samples was degraded. After 120 days of treatment, all treated samples had degraded DNA compared to the untreated material, to different extents. / Manchas de sangue são vestígios de grande importância para a elucidação de um crime. Sangue diluído, invisível a olho nu, ou em superfícies escuras, pode ser detectado utilizando reagentes especiais, através dos chamados "testes presuntivos". Os efeitos dos testes preliminares para sangue utilizando luminol, Luminol 16®, Bluestar® Forensic e benzidina sobre os métodos de inibição da antiglobulina humana, imunocromatográfico para hemoglobina humana e sobre o exame de DNA foram avaliados nesse trabalho. As manchas de sangue foram produzidas através da aplicação de 2 μL de sangue venoso em fragmentos de tecido branco (100% algodão). As amostras foram submetidas aos exames presuntivos e deixadas para secar por 48 horas antes da realização dos testes de inibição da antiglobulina humana e imunocromatográfico para hemoglobina humana. O DNA foi extraído pelo método orgânico e quantificado com Quantifiler® Human DNA Quantification (Applied Biosystems) em 48 horas, 7 dias, 30 dias ou 120 dias após a aplicação dos reagentes. As amostras tratadas com ambas as preparações de luminol ou com Bluestar® Forensic obtiveram resultado positivo nos exames imunológicos, mostrando que não influenciam nos testes confirmatórios para sangue humano. As 20 amostras tratadas com benzidina tiveram resultado negativo no teste de inibição da antiglobulina humana. Das 20 amostras submetidas ao teste imunocromatográfico, 18 obtiveram resultado negativo, evidenciando o efeito deletério da benzidina sobre os testes confirmatórios para sangue humano. Através de PCR em tempo real foi possível observar que, 48 horas após contato com a solução de benzidina, as amostras tiveram o DNA degradado. Todos os reagentes testados causaram degradação do DNA, em diferentes extensões, após 120 dias de sua aplicação.
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Amplificação, clonagem, superexpressão e purificação da enzima citidina deaminase (Cdd, E.C.3.5.4.5) de Mycobacterium tuberculosis

Quitian, Zilpa Adriana Sánchez January 2009 (has links)
Made available in DSpace on 2013-08-07T18:41:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000410668-Texto+Completo-0.pdf: 610134 bytes, checksum: 96d58c78aa5915846ec6c97a8caffdcb (MD5) Previous issue date: 2009 / The Tuberculosis (TB) is considered a threat to global public health; according to the World Health Organization, nearly two million people die annually due to this disease. One of the most importat features of this pathogen is its ability to persist in host tissues for a long period in a state of latency, also known as persistence. The importance of the state of latency to the bacillus survival has been an attractive factor towards the development of works to characterize in greater detail this phase of infection by M. tuberculosis. An understanding of the mode of action and the role of pyrimidine salvage pathway enzymes in M. tuberculosis could reveal new targets for the rational design of potent and selective anti-TB agents capable of, hopefully, preventing progression and reactivation of the disease. Cytidine deaminase (CDA; EC 3. 5. 4. 5), an evolutionarily conserved enzyme of the pyrimidine salvage pathway, catalyzes the hydrolytic deamination of cytidine and 2’-deoxycytidine to form uridine and 2’-deoxyuridine, respectively. The probable CDA gene (cdd, Rv3315c) from M. tuberculosis H37Rv was cloned, sequenced, and expressed in Escherichia coli BL21(DE3) cells. The purification protocol of recombinant M. tuberculosis CDA (MtCDA) yielded 35 mg of homogeneous protein from 10 g of cells. Mass spectrometry, N-terminal amino acid sequencing, and gel filtration chromatography confirmed the predicted molecular mass, identity, and oligomeric state of MtCDA, which was estimated to be 52. 99 kDa. These results and the ones for multiple sequence alignment suggest that MtCDA is a homotetramer in solution. Steady-state kinetic measurements yielded the following parameters: KM and kcat values of, respectively, 1004 μM and 4. 8 s-1 for cytidine, and 1059 μM and 3. 5 s-1 for 2'-deoxycytidine. The pH dependence of kcat and kcat/KM for cytidine indicates that the protonation of a single ionizable group with pKa value of 4. 3 abolishes activity, and protonation of a group with pKa value of 4. 7 reduces substrate binding. Crystals of CDA were obtained using the hanging-drop vapour-diffusion method. The demonstration that the Rv3315c locus encodes a protein having CDA activity in M. tuberculosis is the first step to understand the role of this gene product and should help the design of anti-TB agents and vaccines. / A tuberculose (TB) é considerada uma ameaça à saúde pública mundial; segundo a Organização Mundial da Saúde, cerca de dois milhões de pessoas morrem anualmente em conseqüência desta doença. Uma das características mais importantes do patógeno causador da TB é a sua capacidade de persistir nos tecidos do hospedeiro por um longo período em um estado de latência, também conhecido como persistência. A importância do estado de latência à sobrevivência do bacilo tem sido um atrativo fator para o desenvolvimento de trabalhos que caracterizem com maior profundidade esta fase da infecção por M. tuberculosis. O entendimento do modo de ação e o papel das enzimas da rota de salvamento de pirimidinas em M. tuberculosis poderia revelar novos alvos para o desenho racional de agentes anti-TB potentes e seletivos capazes de, se possível, prevenir a progressão e a reativação da doença. A citidina deaminase (CDA, EC 3. 5. 4. 5), uma enzima evolutivamente conservada da rota de salvamento das pirimidinas, catalisa a deaminacao hidrolítica de citidina e 2’-desoxicitidina para formar uridina e 2’-desoxiuridina, respectivamente. O provável gene da CDA (cdd, Rv3315c) de M. tuberculosis foi clonado, seqüenciado e expresso em células de Escherichia coli BL21(DE3). O protocolo de purificação da CDA recombinante de M. tuberculosis (MtCDA) produziu 35 mg de proteína homogênea a partir de 10 g de células. A análise de espectrometria de massas, seqüenciamento N-terminal e cromatografia por gel filtração confirmaram a massa molecular prevista, a identidade e o estado oligomérico de MtCDA, que foi estimada em 52,99 kDA. Estes resultados e os de alinhamento múltiplo de seqüências sugere que MtCDA é um homotetrâmero em solução. Medidas de cinética em estado estacionário da CDA geraram os seguintes parâmetros: valores de KM e kcat de, respectivamente, 1004 μM e 4,8 s-1 para citidina, e 1059 μM e 3,5 s-1 para 2'- desoxicitidina. A dependência dos valores de kcat e kcat/KM em função do pH para citidina indicam que a protonação de um único grupo ionizável com valor de pKa de 4,3 elimina a atividade, e a protonação de um grupo com pKa de 4,7 reduz a ligação ao substrato. Foram obtidos cristais de CDA utilizando o método de difusão de vapor em gota pendente. A demonstração de que o locus Rv3315c codifica uma proteína com atividade CDA em M. tuberculosis é o primeiro passo para entender o papel do produto deste gene e deverá ajudar no desenho de agentes anti-TB e vacinas.
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Clonagem, superexpressão, purificação e caracterização da proteína recombinante humana fator estimulador de colônias de granulócitos

Vanz, Ana Letícia de Souza January 2008 (has links)
Made available in DSpace on 2013-08-07T18:41:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000399966-Texto+Completo-0.pdf: 2182806 bytes, checksum: b7ae0dc782e83e28c95813d364f5ef3b (MD5) Previous issue date: 2008 / The granulocyte colony stimulating factor (G-CSF) is a hematopoietic cytokine that acts on cells of the neutrophil lineage causing proliferation and differentiation of committed precursor and activation of mature neutrophils. The hG-CSF is an 18. 8 kDa protein consisting of 174 amino acid polypeptide chain with two intra-molecular disulphide bonds and one free cysteine at residue 17. This biopharmaceutical has been widely used with success in oncology patients who receive high-dose chemotherapy. It is also used as treatment and prophylactically to improve the immune system in patients with HIV, pneumonia, diabetic foot infections, leukemia and febrile neutropenia. Based on this large clinical application, the recombinant hG-CSF has been produced in genetically engineered Escherichia coli and was approved for use in chemotherapyinduced neutropenia by the U. S Food and Drug Administration in 1991. Filgrastim (generic name of G-CSF) lost its patent protection in 2006 becoming a target of Brazilian pharmaceutical industries. Currently, Brazil is totally dependent of the importation of this biopharmaceutical. Therefore, the aim of this work is to develop a methodology for subsequent production of a national Filgrastim. In this work the granulocyte colonystimulating factor gene was assembled by PCR, Its amplicon was cloned into pET23a(+) expression vector using NdeI and BamHI, restriction enzymes. The overexpression was tested in different strains of E. coli cells and the best condition for expression of the protein was in the BL21(DE3) strain. In order to solubilize the inclusion bodies and purify the protein, many protocols have been tested. Finally, it was described an efficient protocol of isolation of inclusion bodies through a multi-step washing procedure and purification method of the recombinant protein from inclusion bodies using only a cationic exchange column. The immunoassay and N-terminal sequencing confirmed the identity of rhG-CSF. Characterization of homogeneous rhG-CSF using SEC-HPLC and RP-HPLC has shown similarity to the international standard. The biological activity assay, in vivo, has shown an equivalent biological effect to those obtained with the standard reference rhG-CSF. The protein rhG-CSF was produced through simple, cost effective and economically feasible process of rhG-CSF, which has extreme importance to the industrial process and healthcare community. / O fator estimulador de colônias de granulócitos (G-CSF) é uma citocina hematopoiética que age sobre a linhagem de neutrófilos promovendo proliferação e diferenciação de seus precursores e ativação dos neutrófilos maduros. O G-CSF é uma proteína com 18,8 kDa, constituída por 174 aminoácidos possuindo duas pontes dissulfeto intra-moleculares e uma cisteína livre no resíduo 17. Este biofármaco tem sido empregado com sucesso em pacientes com câncer que recebem altas doses de quimioterapia. Além disso, também tem sido usado como tratamento ou profilaticamente a fim de reforçar o sistema imune em pacientes com HIV, pneumonia, pacientes diabéticos com infecções nos pés, leucemia e neutropenia febril. Em função desta ampla aplicação clínica, hG-CSF recombinante tem sido produzido por engenharia genética em Escherichia coli e foi aprovado para uso em neutropenia provocada por quimioterapia pelo FDA em 1991. Filgrastima (nome genérico do G-CSF) teve sua patente expirada em 2006, tornando-se alvo das indústrias farmacêuticas. Atualmente, o Brasil é totalmente dependente da importação deste biofármaco. Logo, o objetivo deste estudo é desenvolver uma metodologia para a posterior produção de uma Filgrastima nacional. Neste trabalho, o gene para hG-CSF foi construído por PCR, clonado no vetor de expressão pET23a(+), usando as enzimas de restrição NdeI e BamHI. Os testes de superexpressão foram realizados em diferentes cepas de E. coli, mostrando a melhor condição de expressão na fração insolúvel na cepa BL21(DE3). Na tentativa de solubilizar os corpos de inclusão e purificar a proteína, inúmeros protocolos foram testados. Por fim, foi descrito um eficiente protocolo de isolamento e solubilização dos corpos de inclusão por um processo de múltiplos passos de lavagem e um método de purificação usando somente uma coluna cromatográfica de troca catiônica. A identidade da proteína foi confirmada por seqüenciamento N-terminal e Western blotting. A caracterização do rhG-CSF homogêneo, através de SEC-HPLC e RP-HPLC, mostrou resultados similares aos do padrão internacional. O teste de atividade biológica, in vivo, demonstrou que o rhG-CSF produzido tem potencial equivalente ao padrão internacional utilizado. A proteína foi produzida por um processo simples e econômico, sendo de extrema importância em um processo industrial, podendo trazer benefícios para a saúde da população.

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