Orientador: Regina Maria Barreto Cicarelli / Coorientador: Ángel Carracedo Alvarez / Banca: Greiciane Gaburro Paneto / Banca: Rogério Nogueira de Oliveira / Banca: Celso Teixeira Mendes Júnior / Banca: Raquel Mantuanelli Scarel Caminaga / Resumo: Os marcadores polimórficos short tandem repeats do cromossomo X (X.STR) são de utilização recente na prática forense, sendo aplicados, principalmente, com a finalidade de complementar os dados obtidos com marcadores genéticos autossômicos. Tendo em vista a necessidade de ampliação dos dados da população brasileira em relação aos X.STRs, este projeto teve o objetivo de determinar as frequências alélicas e os parâmetros estatísticos de interesse forense para 10 X.STRs na população de São Paulo.SP, Rio de Janeiro.RJ, Belo Horizonte.BH e Vitória.ES (Sudeste do Brasil). Posteriormente, os X.STRs foram genotipados em casos deficientes de relação biológica e, com o objetivo de compilar os dados genéticos populacionais brasileiros publicados para X.STRs, este projeto desenvolveu o Banco Genético Brasileiro do Cromossomo X (BGBX). Para isso, foram analisados 1001 indivíduos não relacionados e residentes nas cidades descritas acima e 3 casos deficientes de relação biológica. Os marcadores X.STRs foram amplificados em sistema decaplex e submetidos à eletroforese em analisador genético ABI377 e ABI3500. Os programas GeneScan e GeneMapper ID.X foram utilizados para a determinação alélica e, a planilha Excel e o programa Arlequin, para a determinação das frequências alélicas, parâmetros estatísticos e análise de distância genética entre diferentes populações. Em relação aos X.STRs analisados, os marcadores DXS6809 e GATA172D05 foram os mais discriminativos, enquanto os marcadores DXS8378, DXS7133 e DXS7423 apresentaram os menores poder de discriminação. Diferenças significativas de frequências alélicas foram obtidas dentre as populações brasileiras e entre estas e demais populações estrangeiras, sendo que uma maior distância genética foi obtida em relação à população africana de Uganda... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The short tandem repeat polymorphic markers of X chromosome (X.STR) are of recent use in forensic practice, been applied mainly in order to complement the data obtained with autosomal genetic markers. Given the needs of expansion of the Brazilian population data in relation to X.STRs, this project aimed to determine the allele frequencies and the statistical parameters of forensic interest to 10 X.STRs in the population from São Paulo.SP, Rio de Janeiro.RJ, Belo Horizonte.BH e Vitória.ES (Southeast of Brazil). Subsequently, the X.STRs were genotyped in deficient kinship cases and, with the aim of compiling the Brazilian genetic population data published for X.STRs, this project developed the Brazilian Genetic Database of Chromosome X (BGBX). For this, we have analyzed 1001 unrelated individuals, residents in the cities previously described, and three deficient kinship cases. The X.STR markers were amplified in decaplex system and submitted to electrophoresis on ABI377 and ABI3500 genetic analyzers. GeneScan and GeneMapper ID.X softwares were used to determine the allele and, Excel spreadsheet and Arlequin software, for the determination of allele frequencies, statistical parameters and genetic distance analysis between different populations. Regarding the X.STRs analyzed, markers DXS6809 and GATA172D05 were the most discriminative, while the markers DXS8378, DXS7133 and DXS7423 showed the lowest discrimination power. Significant differences in allele frequencies were obtained within Brazilian populations and between these and other foreign populations, and a greater genetic distance was... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Made available in DSpace on 2014-10-18T02:01:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000462081-Texto+Completo-0.pdf: 1430487 bytes, checksum: 4c2af366716f369356b61bcee2b250d0 (MD5) Previous issue date: 2014 / Brazil is a large country, were each region shows a particular pattern of admixture population. To evaluate the agreement between different forensic anthropology tools to determine ancestry and sex in a region of this country, we perform morphological and genetic analysis in a sample of 25 crania from cemeteries and Universities from Porto Alegre metropolitan region, south of Brazil. Those analysis consists in cranioscopy evaluation of 8 cranial traits, 16 craniometric measurements, and allele amplification of 13 autosomal short tandem repeats (STRs) loci of the CODIS system (TPOX, D3S1358, FGA, D5S818, CSF1PO, D7S820, D8S1179, TH01, vWA, D13S317, D16S539, D18S51, D21S11) plus other two loci (D2S1338, D19S433) and amelogenin, using the Identifiler® Plus Kit loci Amelogenin and The NGM™ Kit loci. Genetics and morphological data were then compared to ancestral populations' database of cranial measurements, Howells and Hanihara database, and STR allele frequencies from individuals of African, Amerindian and European origin. Our results showed cranioscopy and craniometry based on Hanihara database were the most accurate morphological tools to determine sex, and probably ancestry as well. This can be explained by the fact that Howells database is not composed of populations who effectively colonized Brazil, and a more resembled craniometric database could turn Brazilian forensic identification analysis more precise and accurate. / Porto Alegre é a maior cidade do Rio Grande do Sul, sul do Brasil. Sua população é composta principalmente por descendentes de portugueses, com a contribuição de outras populações europeias, africanos e indígenas. Neste estudo, para a estimativa da ancestralidade e sexo, foram utilizadas as metodologias de cranioscopia (8 caracteres), craniometria (16 medidas/índices) e a análise de marcadores genéticos STR em uma amostra de 25 crânios provenientes da região metropolitana de Porto Alegre, sul do Brasil. A análise craniométrica da ancestralidade foi realizada por meio de análise discriminante utilizando a distância de Mahalanobis, com o software FORDISC 3. 0 baseado no banco craniométrico de Howells, e com o software Statistica 12 utilizando o banco craniométrico de Hanihara. Foram utilizados os 13 (STRs) loci do sistema CODIS (CSF1PO, D3S1358, D5S818, D7S820, D8S1179, D13S317, D16S539, D18S51, D21S11, FGA, TH01, TPOX, vWA) acrescido de mais dois loci STR (D2S1338, D19S433) e Amelogenina, utilizando os kits AmpFlSTR Identifiler® Plus Kit e AmpFlSTR NGM™ da Applied Biosystems®.A comparação dos resultados entre os dados craniométricos e de marcadores STR demonstra que as duas metodologias apresentam resultados pouco concordantes. Em se tratando da comparação da craniometria usando dois bancos de dados distintos, o banco de Hanihara se mostrou mais preciso na determinação do sexo e, possivelmente, da ancestralidade, se comparado ao banco de Howells. Isso pode se dever ao fato de que o banco Hanihara é composto de indivíduos de populações europeias, africanas e indígenas originais similares as que efetivamente colonizaram o Brasil. Os resultados obtidos indicam a necessidade de um banco de dados craniométrico contendo populações ancestrais brasileiras, o que seria importante para aumentar a eficiência das identificações em Antropologia Forense no Brasil.

Made available in DSpace on 2014-11-12T01:01:09Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000462290-Texto+Completo-0.pdf: 2133615 bytes, checksum: 5c5628b9cc5fd71ee1dcc7d68f182c36 (MD5) Previous issue date: 2014 / Tuberculosis (TB) is an infectious disease caused mainly by Mycobacterium tuberculosis. The increasing number of infected patients among immune compromised populations and emergence of drug-resistant strains has created urgent need of new strategies to treat TB. Understanding relevant pathways (as the purine salvage) will reveal details of M. tuberculosis that might be used to develop new strategies to combat this pathogen. Hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase (HGPRT) is an enzyme from the purine phosphoribosyltransferase (PRTase) family and catalyzes the conversion of hypoxanthine or guanine and 5-phosphoribosyl-α-1-pyrophosphate (PRPP) to inosine 5’-monophosphate (IMP) or guanosine 5’-monophosphate (GMP), and pyrophosphate (PPi). Here we describe the mode of action of M. tuberculosis HGPRT (MtHGPRT) through kinetic and thermodynamical analysis. Experiments were also performed to determine the oligomeric state in solution, pH, temperature and solvent isotope effects. These data allows us to compare MtHGPRT to homologues from other species and look for similarities and differences in its mechanism and constants. We hope the experiments presented here will contribute to the understanding of this pathogen purine salvage pathway. / A Tuberculose (TB) é uma doença infecciosa causada principalmente por Mycobacterium tuberculosis. O aumento de pacientes infectados entre a população imunocomprometida e a emergência de cepas resistentes a drogas criam uma necessidade de novas estratégias para tartar a TB. Entender como funcionam as vias metabólicas relevantes, como a via de salvamento de purinas, poderá revelar detalhes do M. tuberculosis que poderão ser úteis para o desenvolvimento de novas estratégias de combate a este patógeno. A hipoxantina-guanina fosforribosiltransferase (HGPRT) é uma enzima da familia das purina fosforribosiltransferases (PRTase) e catalisa a conversão de hipoxantina ou guanina e 5-fosforribosilpirofosfato-α-1-pirofosfato (PRPP) em inosina 5’-monofosfato (IMP) ou guanosina 5’-monofosfato (GMP) respectivamente, com a liberação de pirofosfato inorgânico (PPi). Aqui nós descrevemos o modo de ação da HGPRT de M. tuberculosis (MtHGPRT) através de análises cinéticas e termodinâmicas. Também foram realizados experimentos para determinar o estado oligomérico da enzima em solução e os efeitos de pH, temperatura e efeitos isotópicos do solvente. Esses dados nos permitem comparar a MtHGPRT com homólogos de outras espécies e procurar por similaridades e diferenças nos seu mecanismo e constantes. Nós esperamos que os experimentos apresentados aqui contribuam para o entendimento da via de salvamento de purinas desse patógeno.

Orientador: João Ruggiero Neto / Banca: Marcelo Andres Fossey / Banca: Tereza Pereira de Souza / Resumo: Estudos de visualização de GUVs por microscopias de fluorescência e contraste de fase, realizados com três mastoparanos (MP-1, N-MP-1 e MPX), evidenciam que alguns destes peptídeos induzem a formação de regiões densas na superfície das GUVS que foram atribuídas a agregacão ou segregação lipídica. Evidências experimentais anteriores mostraram que estes peptídeos apresentam atividade interfacial e suas cargas líquidas +2, +3 e +4 conferem atividade lítica preferencial em vesículas aniônicas, bem como atividade antimicrobiana contra bactérias Gram negativas e Gram positivas. A formação de domínios poderia ser um mecanismo lítico alternativo para a atividade interfacial. Segregação lipídica induzida por estes peptídeos foi então avaliada por calorimetria diferencial de varredura (DSC), observando-se o impacto destes peptídeos nas propriedades termotrópicas de misturas de lipídios que são miméticas de bactérias Gram negativas. As misturas binárias utilizadas foram POPE:DOPG (3:1) e DPPE:DPPG (4:1 e 1:4). A transição de fase gel-líquida cristalina da mistura POPE:DOPG em 20mM PIPES (140mM NaCl + 1mM EDTA, pH=7,4) foi centrada em 14 oC com um "ombro"em, apro-ximadamente, 16 oC indicando miscibilidade incompleta destes lipídios. Na razão molar de lipídio por peptídeo (L/P)=400, os três peptídeos estudados induziram aumento na temperatura de fusão (Tm) de suspensão de vesículas multilamelares. Destes peptídeos MP-1, com carga +2, mostrou a maior variação de Tm. As mudanças em Tm foram observadas ser dependente da relação L/P, sendo maior deslocamento de Tm em L/P=15. O aumento da temperatura de transição de fase indica interação preferencial destes... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: GUVs visualization studies by fluorescence and phase contrast microscopies, carried out with three mastoparan peptides (MP-1, N-MP-1 and MPX) provided evidences that some of these peptides induce dense regions in the GUV's surfaces that were attributed to aggregation or lipid segregation. Previous experimental evidences showed that these peptides display inter-facial activity and their net charges +2, +3 and +4 confer preferential lytic activity in anionic vesicles as well as antimicrobial activity against Gram negative and Gram positive bacteria. The domain formation could be an alternative lytic mechanism for the interfacial activity. Lipid segregation induced by these peptides was then evaluated by differential scanning calorime-try (DSC), by observing the impact of these peptides on the thermotropic properties of lipid mixtures which are mimetics of the Gram negative bacteria. The binary mixtures used were POPE:DOPG (3:1) and DPPE:DPPG (4:1 and 1:4). The gel to liquid crystalline phase transi-tion of the mixture POPE:DOPG in 20 mM PIPES (140 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH7.4) was centered in 14 oC with a shoulder in approximately 16 oC indicating incomplete miscibility. At lipid to peptide molar ratio (L/P)=400 the three peptides studied induced increase of the melting temperature Tm of multilamelar vesicle suspensions. From these peptides MP-1, with charge +2, showed the largest variation of Tm. The changes in Tm were observed to be dependent on the L/P ratio, displacing to larger temperature for L/P =15 ratio. The increase in the of the phase transition temperature indicate preferential interaction of these peptides with the anionic com-ponent of the mixture leading to the formation of domains enriched with the other component (POPE) which, in pure state, has the largest Tm. Other three peptides... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Made available in DSpace on 2013-08-07T18:41:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000418143-Texto+Completo-0.pdf: 285814 bytes, checksum: 88313ad8173e10bd8abedb6c2a800e24 (MD5) Previous issue date: 2009 / Bloodstains are one of the major physical evidence to elucidate a crime. Diluted blood invisible to the naked eye can be detected using special reagents called presumptive tests. The effects of presumptive tests with luminol, Luminol 16®, Bluestar® Forensic and benzidine on the inhibition of human antiglobulin test, human hemoglobin immunochromatographic test and genotyping were evaluated in this study. All bloodstains were prepared by apllication of 2 μL drop of venous blood to squares of white cloth (100% cotton) and allowed to dry for 48 hours. Samples were then submitted to presumptive tests and dried for 48 hours before the inhibition of human antiglobulin and human hemoglobin immunochromatographic tests were evaluated. DNA was extractec by the organic method and quantified by Quantifiler® Human DNA Quantification (Applied Biosystems) at 48 hours, 7 days, 30 days or 120 days after reagents application. Samples treated with both luminol solutions or Bluestar® Forensic gave positive results at immunologic tests, indicating noninterference with human blood confirmatiry tests. Twenty samples treated with benzidine were negative for the inhibition of human antiglobulin test. Of the 20 bloodstains submitted to immunochromatographic test, 18 resulted negative, evidencing a deletery effect of benzidine over human blood confimatory tests. Real time PCR showed that 48 hours after benzidine solution application, DNA of samples was degraded. After 120 days of treatment, all treated samples had degraded DNA compared to the untreated material, to different extents. / Manchas de sangue são vestígios de grande importância para a elucidação de um crime. Sangue diluído, invisível a olho nu, ou em superfícies escuras, pode ser detectado utilizando reagentes especiais, através dos chamados "testes presuntivos". Os efeitos dos testes preliminares para sangue utilizando luminol, Luminol 16®, Bluestar® Forensic e benzidina sobre os métodos de inibição da antiglobulina humana, imunocromatográfico para hemoglobina humana e sobre o exame de DNA foram avaliados nesse trabalho. As manchas de sangue foram produzidas através da aplicação de 2 μL de sangue venoso em fragmentos de tecido branco (100% algodão). As amostras foram submetidas aos exames presuntivos e deixadas para secar por 48 horas antes da realização dos testes de inibição da antiglobulina humana e imunocromatográfico para hemoglobina humana. O DNA foi extraído pelo método orgânico e quantificado com Quantifiler® Human DNA Quantification (Applied Biosystems) em 48 horas, 7 dias, 30 dias ou 120 dias após a aplicação dos reagentes. As amostras tratadas com ambas as preparações de luminol ou com Bluestar® Forensic obtiveram resultado positivo nos exames imunológicos, mostrando que não influenciam nos testes confirmatórios para sangue humano. As 20 amostras tratadas com benzidina tiveram resultado negativo no teste de inibição da antiglobulina humana. Das 20 amostras submetidas ao teste imunocromatográfico, 18 obtiveram resultado negativo, evidenciando o efeito deletério da benzidina sobre os testes confirmatórios para sangue humano. Através de PCR em tempo real foi possível observar que, 48 horas após contato com a solução de benzidina, as amostras tiveram o DNA degradado. Todos os reagentes testados causaram degradação do DNA, em diferentes extensões, após 120 dias de sua aplicação.

Made available in DSpace on 2013-08-07T18:41:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000410668-Texto+Completo-0.pdf: 610134 bytes, checksum: 96d58c78aa5915846ec6c97a8caffdcb (MD5) Previous issue date: 2009 / The Tuberculosis (TB) is considered a threat to global public health; according to the World Health Organization, nearly two million people die annually due to this disease. One of the most importat features of this pathogen is its ability to persist in host tissues for a long period in a state of latency, also known as persistence. The importance of the state of latency to the bacillus survival has been an attractive factor towards the development of works to characterize in greater detail this phase of infection by M. tuberculosis. An understanding of the mode of action and the role of pyrimidine salvage pathway enzymes in M. tuberculosis could reveal new targets for the rational design of potent and selective anti-TB agents capable of, hopefully, preventing progression and reactivation of the disease. Cytidine deaminase (CDA; EC 3. 5. 4. 5), an evolutionarily conserved enzyme of the pyrimidine salvage pathway, catalyzes the hydrolytic deamination of cytidine and 2’-deoxycytidine to form uridine and 2’-deoxyuridine, respectively. The probable CDA gene (cdd, Rv3315c) from M. tuberculosis H37Rv was cloned, sequenced, and expressed in Escherichia coli BL21(DE3) cells. The purification protocol of recombinant M. tuberculosis CDA (MtCDA) yielded 35 mg of homogeneous protein from 10 g of cells. Mass spectrometry, N-terminal amino acid sequencing, and gel filtration chromatography confirmed the predicted molecular mass, identity, and oligomeric state of MtCDA, which was estimated to be 52. 99 kDa. These results and the ones for multiple sequence alignment suggest that MtCDA is a homotetramer in solution. Steady-state kinetic measurements yielded the following parameters: KM and kcat values of, respectively, 1004 μM and 4. 8 s-1 for cytidine, and 1059 μM and 3. 5 s-1 for 2'-deoxycytidine. The pH dependence of kcat and kcat/KM for cytidine indicates that the protonation of a single ionizable group with pKa value of 4. 3 abolishes activity, and protonation of a group with pKa value of 4. 7 reduces substrate binding. Crystals of CDA were obtained using the hanging-drop vapour-diffusion method. The demonstration that the Rv3315c locus encodes a protein having CDA activity in M. tuberculosis is the first step to understand the role of this gene product and should help the design of anti-TB agents and vaccines. / A tuberculose (TB) é considerada uma ameaça à saúde pública mundial; segundo a Organização Mundial da Saúde, cerca de dois milhões de pessoas morrem anualmente em conseqüência desta doença. Uma das características mais importantes do patógeno causador da TB é a sua capacidade de persistir nos tecidos do hospedeiro por um longo período em um estado de latência, também conhecido como persistência. A importância do estado de latência à sobrevivência do bacilo tem sido um atrativo fator para o desenvolvimento de trabalhos que caracterizem com maior profundidade esta fase da infecção por M. tuberculosis. O entendimento do modo de ação e o papel das enzimas da rota de salvamento de pirimidinas em M. tuberculosis poderia revelar novos alvos para o desenho racional de agentes anti-TB potentes e seletivos capazes de, se possível, prevenir a progressão e a reativação da doença. A citidina deaminase (CDA, EC 3. 5. 4. 5), uma enzima evolutivamente conservada da rota de salvamento das pirimidinas, catalisa a deaminacao hidrolítica de citidina e 2’-desoxicitidina para formar uridina e 2’-desoxiuridina, respectivamente. O provável gene da CDA (cdd, Rv3315c) de M. tuberculosis foi clonado, seqüenciado e expresso em células de Escherichia coli BL21(DE3). O protocolo de purificação da CDA recombinante de M. tuberculosis (MtCDA) produziu 35 mg de proteína homogênea a partir de 10 g de células. A análise de espectrometria de massas, seqüenciamento N-terminal e cromatografia por gel filtração confirmaram a massa molecular prevista, a identidade e o estado oligomérico de MtCDA, que foi estimada em 52,99 kDA. Estes resultados e os de alinhamento múltiplo de seqüências sugere que MtCDA é um homotetrâmero em solução. Medidas de cinética em estado estacionário da CDA geraram os seguintes parâmetros: valores de KM e kcat de, respectivamente, 1004 μM e 4,8 s-1 para citidina, e 1059 μM e 3,5 s-1 para 2'- desoxicitidina. A dependência dos valores de kcat e kcat/KM em função do pH para citidina indicam que a protonação de um único grupo ionizável com valor de pKa de 4,3 elimina a atividade, e a protonação de um grupo com pKa de 4,7 reduz a ligação ao substrato. Foram obtidos cristais de CDA utilizando o método de difusão de vapor em gota pendente. A demonstração de que o locus Rv3315c codifica uma proteína com atividade CDA em M. tuberculosis é o primeiro passo para entender o papel do produto deste gene e deverá ajudar no desenho de agentes anti-TB e vacinas.

Made available in DSpace on 2013-08-07T18:41:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000399966-Texto+Completo-0.pdf: 2182806 bytes, checksum: b7ae0dc782e83e28c95813d364f5ef3b (MD5) Previous issue date: 2008 / The granulocyte colony stimulating factor (G-CSF) is a hematopoietic cytokine that acts on cells of the neutrophil lineage causing proliferation and differentiation of committed precursor and activation of mature neutrophils. The hG-CSF is an 18. 8 kDa protein consisting of 174 amino acid polypeptide chain with two intra-molecular disulphide bonds and one free cysteine at residue 17. This biopharmaceutical has been widely used with success in oncology patients who receive high-dose chemotherapy. It is also used as treatment and prophylactically to improve the immune system in patients with HIV, pneumonia, diabetic foot infections, leukemia and febrile neutropenia. Based on this large clinical application, the recombinant hG-CSF has been produced in genetically engineered Escherichia coli and was approved for use in chemotherapyinduced neutropenia by the U. S Food and Drug Administration in 1991. Filgrastim (generic name of G-CSF) lost its patent protection in 2006 becoming a target of Brazilian pharmaceutical industries. Currently, Brazil is totally dependent of the importation of this biopharmaceutical. Therefore, the aim of this work is to develop a methodology for subsequent production of a national Filgrastim. In this work the granulocyte colonystimulating factor gene was assembled by PCR, Its amplicon was cloned into pET23a(+) expression vector using NdeI and BamHI, restriction enzymes. The overexpression was tested in different strains of E. coli cells and the best condition for expression of the protein was in the BL21(DE3) strain. In order to solubilize the inclusion bodies and purify the protein, many protocols have been tested. Finally, it was described an efficient protocol of isolation of inclusion bodies through a multi-step washing procedure and purification method of the recombinant protein from inclusion bodies using only a cationic exchange column. The immunoassay and N-terminal sequencing confirmed the identity of rhG-CSF. Characterization of homogeneous rhG-CSF using SEC-HPLC and RP-HPLC has shown similarity to the international standard. The biological activity assay, in vivo, has shown an equivalent biological effect to those obtained with the standard reference rhG-CSF. The protein rhG-CSF was produced through simple, cost effective and economically feasible process of rhG-CSF, which has extreme importance to the industrial process and healthcare community. / O fator estimulador de colônias de granulócitos (G-CSF) é uma citocina hematopoiética que age sobre a linhagem de neutrófilos promovendo proliferação e diferenciação de seus precursores e ativação dos neutrófilos maduros. O G-CSF é uma proteína com 18,8 kDa, constituída por 174 aminoácidos possuindo duas pontes dissulfeto intra-moleculares e uma cisteína livre no resíduo 17. Este biofármaco tem sido empregado com sucesso em pacientes com câncer que recebem altas doses de quimioterapia. Além disso, também tem sido usado como tratamento ou profilaticamente a fim de reforçar o sistema imune em pacientes com HIV, pneumonia, pacientes diabéticos com infecções nos pés, leucemia e neutropenia febril. Em função desta ampla aplicação clínica, hG-CSF recombinante tem sido produzido por engenharia genética em Escherichia coli e foi aprovado para uso em neutropenia provocada por quimioterapia pelo FDA em 1991. Filgrastima (nome genérico do G-CSF) teve sua patente expirada em 2006, tornando-se alvo das indústrias farmacêuticas. Atualmente, o Brasil é totalmente dependente da importação deste biofármaco. Logo, o objetivo deste estudo é desenvolver uma metodologia para a posterior produção de uma Filgrastima nacional. Neste trabalho, o gene para hG-CSF foi construído por PCR, clonado no vetor de expressão pET23a(+), usando as enzimas de restrição NdeI e BamHI. Os testes de superexpressão foram realizados em diferentes cepas de E. coli, mostrando a melhor condição de expressão na fração insolúvel na cepa BL21(DE3). Na tentativa de solubilizar os corpos de inclusão e purificar a proteína, inúmeros protocolos foram testados. Por fim, foi descrito um eficiente protocolo de isolamento e solubilização dos corpos de inclusão por um processo de múltiplos passos de lavagem e um método de purificação usando somente uma coluna cromatográfica de troca catiônica. A identidade da proteína foi confirmada por seqüenciamento N-terminal e Western blotting. A caracterização do rhG-CSF homogêneo, através de SEC-HPLC e RP-HPLC, mostrou resultados similares aos do padrão internacional. O teste de atividade biológica, in vivo, demonstrou que o rhG-CSF produzido tem potencial equivalente ao padrão internacional utilizado. A proteína foi produzida por um processo simples e econômico, sendo de extrema importância em um processo industrial, podendo trazer benefícios para a saúde da população.

Introdução: O diabetes mellitus tipo 1 (DM1) é uma doença autoimune crônica e progressiva caracterizada por descompensações metabólicas frequentemente acompanhadas por desidratação e cetoacidose. Os agentes virais parecem ter um papel importante no desencadeamento da destruição autoimune que leva ao desenvolvimento do DM1. Entre as cepas virais estudadas, a família dos enterovírus foi associada ao surgimento da doença em humanos. Um dos mediadores do dano viral é o RNA fita dupla (RNAfd) gerado durante a replicação e transcrição do RNA e DNA viral. O gene TLR3 codifica um receptor endoplasmático pertencente à família dos Pattern- Recognition Receptors (PRR), o qual reconhece o RNAfd, tendo um importante papel na resposta imune inata desencadeada por infecção viral. A ligação do RNAfd ao TLR3 desencadeia a liberação de citocinas proinflamatórias, como interferons, as quais exibem uma potente ação anti-viral; assim, protegendo as células não infectadas e induzindo apoptose naquelas já contaminadas. Dessa forma, esse estudo teve como objetivo investigar a associação entre polimorfismos no gene TLR3 e o DM1. Métodos: As frequências dos polimorfismos rs5743313, rs11721827, rs3775291, rs13126816 e rs7668666 no gene TLR3 foram analisadas em 476 pacientes com DM1 e em 507 indivíduos não-diabéticos saudáveis. Os haplótipos construídos a partir da combinação dos cinco polimorfismos estudados e suas frequências foram inferidos utilizando o programa Phase 2.1, o qual implementa o método estatístico bayesiano. Resultados: Todos os genótipos estão de acordo com o esperado pelo Equilíbrio de Hardy-Weinberg. Os polimorfismos rs3775291 e rs13126816 foram associados com risco para DM1 em diferentes modelos de herança, com a associação mais forte sendo observada para o modelo aditivo [OR= 2,3 (IC 95% 1,3-4,1) e OR= 2,1 (IC 95% I 1,4-3,2); respectivamente]. Os demais polimorfismos estudados não foram associados ao DM1. Interessantemente, a frequência de DM1 aumentou quanto maior o número de alelos mutados dos cinco polimorfismos estudados presente nos haplótipos (p-trend= 0,002). Além disso, em pacientes com DM1, os alelos mais raros dos polimorfismos rs5743313 e rs11721827 foram associados com menor idade de diagnóstico do DM1 e a um pior controle glicêmico. Conclusão: Os polimorfismos rs3775291 e rs13126816 no gene TLR3 estão associados com risco para o DM1 em indivíduos do Sul do Brasil, enquanto os polimorfismos rs5743313 e rs11721827 estão associados com idade de diagnóstico precoce e a um pior controle glicêmico. O número de alelos de risco nos haplótipos formados pelos cinco polimorfismos estudados no gene TLR3 parece influenciar o risco para DM1, sugerindo que esses polimorfismos interagem na suscetibilidade para a doença. / Introduction: Type 1 diabetes mellitus (T1DM) is a chronic, progressive autoimmune disease characterized by metabolic decompensation often leading to dehydration and ketoacidosis. Viral agents seem to have an important role in triggering the autoimmune destruction that leads to the development of T1DM. Among several viral strains investigate so far, the enterovirus family has been consistently associated with the onset of T1DM in humans. One of the mediators of viral damage is the double-stranded RNA (dsRNA) generated during replication and transcription of viral RNA and DNA. The Toll-like receptor 3 (TLR3) gene codes for an endoplasmic receptor of the patternrecognition receptors (PRRs) family that recognizes dsRNA, playing an important role in the innate immune response triggered by viral infection. Binding of dsRNA to the TLR3 triggers the release of proinflammatory cytokines, such as interferons, which exhibit potent antiviral action; thus, protecting uninfected cells and inducing apoptosis of infected ones. Therefore, this study aimed to investigate whether TLR3 polymorphisms were associated with T1DM. Methods: Frequencies of the TLR3 rs5743313, rs11721827, rs3775291, rs13126816 and rs7668666 polymorphisms were analyzed in 476 T1DM patients and in 507 healthy subjects. Haplotypes constructed from the combination of these polymorphisms were inferred using Bayesian statistical method. Results: All genotypes are in agreement with those predicted by the Hardy-Weinberg equilibrium. The rs3775291 and rs13126816 polymorphisms were associated with T1DM in different inheritance models, with the strongest association being observed for the additive model [OR= 2.3 (95% CI 1.3-4.1) and OR= 2.1 (95% CI 1.4-3.2); respectively]. The other three polymorphisms were not significantly associated with T1DM. Interestingly, the prevalence of T1DM was higher as more risk alleles of the five polymorphisms were present (P trend = 0.002). Moreover, in T1DM patients, the minor alleles of the rs5743313 and rs117221827 polymorphisms were associated with an early age at diagnosis and worse glycemic control. Conclusion: The TLR3 rs3775291 and rs13126816 polymorphisms are associated with risk for T1DM in Southern Brazilian subjects, while the rs5743313 and rs11721827 polymorphisms are associated with age at T1DM diagnosis and worst glycemic control. The number of risk alleles of the five TLR3 polymorphisms in the haplotypes seems to influence the risk for T1DM, suggesting that these polymorphisms might interact in the susceptibility for the disease.

As mucopolissacaridoses (MPS) constituem um grupo de doenças lisossômicas caracterizadas pela deficiência de uma das enzimas responsáveis pela degradação das glicosaminoglicanos. A expressão neurológica da doença varia de acordo com cada deficiência enzimática, mas o retardo mental é característico da MPS III e de formas graves das MPS I, II e VII. Vários estudos com ressonância magnética (RM) demonstraram que atrofia cerebral, lesões na substância branca (SB) e hidrocefalia são freqüentemente observados em pacientes com MPS. Entretanto a correlação entre a RM, anormalidades bioquímicas e gravidade do quadro neurológico ainda não foi descrita na literatura. Além disso, a comparação dos achados de espectroscopia de prótons por RM (ERM) com a RM convencional é desconhecida. O objetivo deste trabalho foi analisar a aplicação da RM e da ERM na investigação de pacientes com MPS. Sessenta crianças com MPS tipos I, II, IV e VI foram avaliadas com RM e ERM. Os resultados foram comparados com tempo de doença, anormalidades bioquímicas e disfunção cognitiva. Os exames de RM foram realizados em equipamento de alto campo magnético (1.5 T). Pacientes com maior tempo de doença tiveram mais lesões na SB. A atrofia cerebral e o grau de dilatação ventricular não foram afetados pelo tempo de doença ou idade dos pacientes. Pacientes com MPS II e disfunção cognitiva apresentaram maior atrofia cerebral, hidrocefalia, lesões mais severas na substância branca e aumento da relação mioinositol/creatina na ERM. Estas informações podem ser úteis para o melhor entendimento da fisiopatogenia das MPS e do papel da RM na sua investigação. / The mucopolysaccharidosis are a group of lysosomal diseases characterized by enzymatic deficiency which leads incomplete degradation of glycosaminoglycans. Neurological expression varies according to each enzyme but mental compromise is characteristic of MPS III and the severe forms of MPS I, II and VII. Studies with magnetic resonance imaging (MRI) demonstrated that brain atrophy, white matter (WM) lesions and hydrocephalus are common in MPS patients. However, correlation among MRI, biochemical changes and severity of neurological deficit was not published so far. In addition, comparison between MR spectroscopy (MRS) and MRI is controversial. The purpose of this study was to analyze MRI and MRS findings in MPS patients. Sixty patients with MPS types I, II, IV and VI were evaluated with MRI and MRS. Results were compared with disease duration, biochemical changes and cognitive impairment. MRI exams were performed in high field MRI scanner (1.5 T). Patients with longer disease duration had more WM lesions. Brain atrophy and hydrocephalus were not affected by disease duration or patient´s age. Patients with MPS II and cognitive impairment had more brain atrophy, hydrocephalus, severe WM lesions and elevated myoinositol/creatine at MRS. These results can be useful to better understand the pathogenic process and to increase the applicability of MRI in the disease investigation.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Zoologia, 2014. / Submitted by Ana Cristina Barbosa da Silva (annabds@hotmail.com) on 2015-02-05T18:07:06Z No. of bitstreams: 1 2014_IsisCarolinaSoutodeOliveira.pdf: 2170234 bytes, checksum: 3e041531fdefa9851652d45970087c0a (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2015-03-06T19:40:31Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_IsisCarolinaSoutodeOliveira.pdf: 2170234 bytes, checksum: 3e041531fdefa9851652d45970087c0a (MD5) / Made available in DSpace on 2015-03-06T19:40:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_IsisCarolinaSoutodeOliveira.pdf: 2170234 bytes, checksum: 3e041531fdefa9851652d45970087c0a (MD5) / O gênero Brevipalpus Donnadieu destaca-se como um dos mais importantes na família Tenuipalpidae. Esses ácaros fitófagos podem causar danos a seus hospedeiros, sejam diretos, pela alimentação em folhas, ramos e frutos, sejam indiretos, devido à transmissão de vírus. A taxonomia dos ácaros Brevipalpus, especialmente das espécies de importância econômica, tem representado um desafio para os acarologistas; numerosas sinonímias têm sido estabelecidas e a ocorrência de espécies crípticas tem sido confirmada. A acurada identificação desses ácaros é fundamental para compreensão do papel de cada espécie na transmissão dos fitovírus, para a determinação dos hospedeiros de cada espécie, e para a definição de medidas de prevenção e controle. Estudos morfológicos com a utilização de diferentes técnicas de microscopia têm possibilitado um imenso avanço na taxonomia do grupo. Em uma abordagem integrativa, além dos estudos morfológicos é fundamental dispor de ferramentas adicionais para a construção de uma sistemática consistente dos grupos de organismos. Até o momento apenas um fragmento, da região Citocromo Oxidase I (COI) do DNA mitocondrial foi explorado na sistemática de Brevipalpus. A utilização de um maior número de marcadores moleculares, independentes, é importante para a consistência dos estudos. O presente trabalho teve como objetivos contribuir para o avanço da sistemática molecular de ácaros Brevipalpus, através da avaliação e otimização de protocolos de extração e amplificação de DNA; comparação de filogenias obtidas a partir de sequências de quatro regiões do genoma, incluindo marcadores mitocondriais - dois fragmentos da região COI -, e nucleares - regiões “Internal Transcriber Spacer II” (ITS2) e subunidade D1-D3 do gene 28S; apresentação de faixas de distâncias genéticas intra e interespecíficas; e avaliação de caracteres morfológicos em um contexto filogenético. Foram obtidas 25 amostras de Brevipalpus, de cinco países - Argentina, Brasil, Chile, Espanha, e Israel -, de 22 plantas hospedeiras. Foram avaliados dois protocolos de extração de DNA em relação ao rendimento da concentração de DNA, de sua qualidade e eficiência para amplificação, sendo um parcialmente destrutivo e um não destrutivo. Apesar do rendimento da concentração de DNA dos dois protocolos ser similar, observou-se maior eficiência de amplificação com o DNA obtido através do método parcialmente destrutivo. Para cada um dos quatro pares de primers foram testadas Reações de Polimerase em Cadeia (PCR) com variações nas concentrações de componentes da reação (MgCl2, BSA, DNTP e primers), assim como nas condições das reações (temperaturas de amplificação, número e tempo dos ciclos). As reações de PCR foram alteradas para possibilitar a amplificação do DNA com apenas 2μL de DNA molde, permitindo a amplificação dos quatro marcadores com DNA de um único espécime. Para as análises filogenéticas, além das sequências obtidas durante o desenvolvimento desse estudo, foram incluídas, nos datasets das análises filogenéticas, sequências de Brevipalpus recuperadas do GenBank. O fragmento da região COI amplificado com os primers DNR e DNF foi de 373 pares de base (pb) e o alinhamento final foi composto por 190 sequências de Brevipalpus (92 obtidas nesse estudo, 98 recuperadas do GenBank), as quais foram classificadas em 89 haplótipos, agrupados em 18 linhagens. O fragmento da região COI amplificado com os primers LCO e HCO foi de 650pb e o alinhamento final foi composto por 64 sequências (todas obtidas nesse estudo), as quais foram classificadas em 31 haplótipos, agrupados em 12 linhagens. O fragmento da região ITS2 foi de 500pb e o alinhamento final foi composto por 109 sequências (108 obtidas nesse estudo, uma recuperada do GenBank), as quais foram classificadas em 43 genótipos, agrupados em 14 linhagens. O fragmento da região D1-D3 foi de 900pb e o alinhamento final foi composto por 74 sequências (todas obtidas nesse estudo), as quais foram classificadas em 28 genótipos, agrupados em 11 linhagens. De forma geral, as topologias das árvores filogenéticas obtidas a partir de sequências das quatro regiões do genoma foram congruentes. Apesar de não ter sido possível obter sequências dos quatro fragmentos para todos os espécimes foi possível fazer a correspondência entre os clados das diferentes árvores a partir das infomações sobre as amostras e/ou espécimes sequenciados. Entretanto, entre as árvores dos diferentes marcadores, foram observadas algumas incongruências na divisão de linhagens dentro dos grupos phoenicis e obovatus. A principal diferença na topologia das ávores filogenéticas, foi a posição do clado do grupo cuneatus. O status taxonômico de algumas populações, que provavelmente consituem novos táxons para a ciência, foi aclarado. Os resultados das análises filogenéticas indicaram a necessidade da condução de estudos mais detalhados para esclarecer a posição taxonômica de linhagens próximas a B. yothersi, B. incognitus e B. phoenicis tipo 1, para as quais não houve consenso entre as filogenias das diferentes regiões. O valor filogenético de alguns dos caracteres morfológicos que têm sido utilizados para a taxonomia de Brevipalpus foi discutido com a finalidade de subsidiar a revisão da classificação de grupos. As informações geradas representam um ponto de partida para a construção de uma classificação taxonômica consistente para os ácaros Brevipalpus, baseada nas relações filogenéticas entre os táxons. ___________________________________________________________________________________ ABSTRACT / The genus Brevipalpus is one of the most important in the Tenuipalpidae family. These phytophagous mites can cause damage to their host plants either directly, by feeding on leaves, stems and fruits or indirectly, by transmitting plant virus. Brevipalpus mite taxonomy, particularly of economically important species, represents a challenge for acarologists; numerous synonyms have been established and the occurrence of cryptic species has been confirmed. The accurate identification of these mites is essential to understand the role of each species in the transmission of plant viruses, for listing host plants of each species, and for defining prevention and control strategies. Morphological studies applying different microscopy techniques have enabled a considerable advance in the taxonomy of the group. In an integrative approach, besides the morphological studies is essential to have additional tools for building a consistent systematics for groups of organisms. So far, only one fragment of the Cytochrome Oxidase I (COI) region, of the mitochondrial DNA had been explored in Brevipalpus systematics. Employing a higher number of independent molecular markers is important to give consistency for the studies. The present study aimed to contribute for the advance of Brevipalpus mite molecular systematics by evaluating and optimizing DNA extraction and amplification protocols; comparing phylogenies obtained from sequences of four different genome regions, including mitochondrial– two fragments of the COI region -, and nuclear markers – regions Internal Transcriber Spacer II (ITS2) and the subunit D1-D3 of the gene 28S; presenting intra and interspecific genetic distances; and evaluating the morphological traits in a phylogenetic context. For the study 25 samples of Brevipalpus were obtained, from five countries – Argentina, Brazil, Chile, Spain and Israel, from 22 host plants. Two protocols of DNA extraction were evaluated considering DNA concentration, quality and efficiency for amplification, being one partially destructive and the other one non destructive. Although the DNA concentration for both protocols has been similar, the partially destructive method was more efficient for DNA amplification. For each of the four pairs of primers Polymerase Chain Reactions (PCR) were tested with variations on the components of reaction (MgCl2, BSA, DNTP and primers) as well as in the reactions conditions (amplification temperatures, number and duration of cycles). Reactions were adjusted to make possible DNA amplification from 2μL of DNA, thus allowing amplification of the four markers from DNA of one specimen. For the phylogenetic analyses, in addition to the sequences obtained in this study, Brevipalpus sequences retrieved from Genbank were included in the datasets. The length of the amplified fragment of the COI region using primers DNF & DNR was 373 base pairs (bp) and the final alignment included 190 sequences (92 obtained in this study, 98 retrieved from Genbank), which were classified in 89 haplotypes, clustered in 18 lineages. The length of the amplified fragment of the COI region using primers LCO & HCO was 650bp and the final alignment included 64 sequences (all obtained in this study), which were classified in 31 haplotypes, clustered in 12 lineages. The length of the amplified fragment of the ITS2 region was 500bp and the final alignment included 109 sequences (108 obtained in this study, one retrieved from Genbank), which were classified in 43 genotypes, clustered in 14 lineages. The length of the amplified fragment of the subunit D1-D3 of the gene 28S was 900bp and the final alignment included 74 sequences (all obtained in this study), which were classified in 28 genotypes, clustered in 11 lineages. In general topologies of phylogenetic trees obtained from sequences of the four genome regions were congruent. Although it wasn’t possible to obtain sequences of the four fragments for all the specimens, it was possible to match clades trees from information of the sequenced samples and/or specimens. However, incongruences in the division of lineages within groups phoenicis and obovatus were observed between trees built from different markers. The main difference between the phylogenetic trees topologies, was the position of the cuneatus group. Taxonomic status of some populations, which probably constitute new taxa, was clarified. Results of phylogenetic analyses showed the need to conduct further studies to clarify the taxonomic position of lineages close to B. yothersi, B. incognitus and B. phoenicis tipo 1, to which were observed incongruencies between phylogenies. The phylogenetic value of some morphological characters used for Brevipalpus taxonomy was discussed to support the revision of groups classification. Information provided represents a starting point for the development of a consistent taxonomic classification of the Brevipalpus mites, based on the phylogenetic relations between groups and taxa.