Dissertação (Mestrado)—Universidade de Brasília, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2012. / Submitted by Jaqueline Ferreira de Souza (jaquefs.braz@gmail.com) on 2012-06-15T12:35:31Z No. of bitstreams: 1 2012_SandrieleAiresdeOliveira.pdf: 2326927 bytes, checksum: 9d7022636d4e3822635264488ecb0119 (MD5) / Approved for entry into archive by Jaqueline Ferreira de Souza(jaquefs.braz@gmail.com) on 2012-06-15T12:35:45Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_SandrieleAiresdeOliveira.pdf: 2326927 bytes, checksum: 9d7022636d4e3822635264488ecb0119 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-06-15T12:35:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_SandrieleAiresdeOliveira.pdf: 2326927 bytes, checksum: 9d7022636d4e3822635264488ecb0119 (MD5) / A incidência e mortalidade por câncer têm aumentado em todo mundo e representam um problema de saúde pública. Os tratamentos mais comuns são muitas vezes invasivos e inespecíficos. Quimioterápicos mais potentes e específicos têm sido estudados para elaboração de novos tratamento contra vários tipos de câncer. O inibidor de tripsina e quimotripsina BTCI, extraído a partir de sementes de feijão-de-corda Vigna unguiculata, foi caracterizado como um potente agente anticancerígeno devido à sua capacidade de diminuir a proliferação e viabilidade das células de câncer da mama. No presente trabalho, nanopartículas de quitosana contendo BTCI foram escolhidas para serem sintetizadas devido ao potencial anticarcinogênico do inibidor e às propriedades biomédicas de quitosana, que é atóxica e biodegradável. Além disso, peptídeos derivados de BTCI foram sintetizados e purificados a fim de estudar a atividade inibitória contra proteinases e a capacidade destes peptídeos de se translocarem através da membrana celular na ausência de receptores. Os peptídeos derivados apresentaram atividade inibitória contra tripsina e quimotripsina, e foram capazes de desestabilizar a bicamada de lipossomas POPC, utilizados neste trabalho como modelos de membrana. O diâmetro da nanopartícula contendo quitosana e BTCI variou entre 25 e 200 nm, em relação a diferentes pHs e concentrações de BTCI. A eficiência de encapsulamento do BTCI foi superior a 50%, apresentando liberação prolongada em condições fisiológicas. Análises de espectroscopia de fluorescência e dicroísmo circular sugeriram que a molécula de BTCI interage com a superfície externa das nanopartículas, apresentando algumas modificações estruturais, mas mantendo ainda a atividade inibitória contra proteinases. Estes resultados mostraram que os sistemas de nanopartículas de quitosana contendo BTCI são estáveis e ativos, podendo ser testados em ensaios in vitro com células de câncer da mama, visando investigar a atividade antitumoral destes sistemas contendo BTCI associado a polímeros de quitosana. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT / The incidence and mortality caused by cancer have increased and represent a public health problem. The common treatments are often invasive and nonspecific. More potent and specific chemotherapeutic agents have been studied for the alternative treatment of several types of cancer. The black-eyed pea trypsin/chymotrypsin inhibitor (BTCI), a Bowman-Birk inhibitor isolated from Vigna unguiculata seeds, was characterized as a potent anticarcinogenic agent due its ability to significantly decrease the proliferation and viability of breast cancer cells. In the present work, chitosan nanoparticles encapsulating BTCI were chose to be synthesized due the anticarcinogenic potential of inhibitor and the nontoxic and biodegradable properties of chitosan. In addition, peptides derived from BTCI were synthesized and purified in order to study their activity against serine proteinases and the ability to translocate through the cell membrane models. The peptides presented inhibitory activity against trypsin and chymotrypsin and were able to destabilize POPC phospholipids from membrane model. The diameter of chitosan-BTCI nanoparticles ranged from 25 and 200 nm in different pH and concentrations of BTCI. The encapsulation efficiency of the BTCI into chitosan particles was > 50% and the liberation of the inhibitor in physiological condition was prolonged. Analysis of fluorescence spectroscopy and circular dichroism suggested that BTCI interacts with the external surface of nanoparticles. Although the BTCI presents structural changes in this condition its inhibitory activity against proteinases was preserved. Altogether, these results showed that Chitosan-BTCI nanoparticles are active and stable and should be tested in vitro assays with breast cancer cells aiming investigation of the BTCI anticarcinogenic action in this system.

Dissertação (mestrado)-Universidade Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Molecular, 2012. / Submitted by Gabriela Botelho (gabrielabotelho@bce.unb.br) on 2012-07-11T14:22:35Z No. of bitstreams: 1 2012_JulianaRibeiroRocha.pdf: 1320639 bytes, checksum: d8a0c917dabc31eb56d6427c44f07a2d (MD5) / Rejected by Jaqueline Ferreira de Souza(jaquefs.braz@gmail.com), reason: Documento não está bloqueado on 2012-07-13T10:36:42Z (GMT) / Submitted by Gabriela Botelho (gabrielabotelho@bce.unb.br) on 2012-07-13T11:54:18Z No. of bitstreams: 1 2012_JulianaRibeiroRocha.pdf: 1241121 bytes, checksum: 4e480e573263804ce2f125d7ac2c2c26 (MD5) / Approved for entry into archive by Jaqueline Ferreira de Souza(jaquefs.braz@gmail.com) on 2012-07-26T13:52:33Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_JulianaRibeiroRocha.pdf: 1241121 bytes, checksum: 4e480e573263804ce2f125d7ac2c2c26 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-07-26T13:52:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_JulianaRibeiroRocha.pdf: 1241121 bytes, checksum: 4e480e573263804ce2f125d7ac2c2c26 (MD5) / O estudo do enovelamento de proteínas e a predição de suas estruturas nativas são de grande importância para a ciência. Uma das abordagens possíveis para tal predição tem base nos enterramentos atômicos, entendidos como a distância do átomo até o centro geométrico da proteína normalizada pelo raio de giro da proteína. Esses enterramentos podem ser discretizados em camadas concêntricas e equiprováveis e já foi mostrado que a informação sobre estas camadas é su_ciente para levar a proteína ao seu estado nativo (Pereira de Araújo et al., Proteins 70:971-983, 2008; Pereira de Araújo e Onuchic, PNAS 106:19001-19004, 2009), mas não se sabe como esta informação está codi_cada na sequência. O objetivo do presente trabalho é medir a transinformação, quantidade de informação compartilhada por duas ou mais variáveis aleatórias discretas, entre sequência e enterramentos atômicos a partir de quatro diferentes alfabetos de sequência e de diversos números de níveis de enterramento atômico visando entender as relações entre essas variáveis e, assim, fornecer um máximo teórico para a e_ciência dos algoritmos de predi- ção de enterramentos atômicos. Os resultados deste trabalho mostram que a sequência de aminoácidos possui densidade de entropia entre 0; 9969 _ 0; 0002 bit e 4; 176 _ 0; 004 bit, dependendo do número de símbolos do alfabeto considerado (dois, três, cinco ou vinte símbolos), e excesso de entropia sempre próximo a zero. Portanto, infere-se que não existe correlação local entre os elementos da sequência. Por outro lado, os enterramentos atômicos apresentam densidade de entropia variando de 0; 617_0; 002 bit a 2; 16_0; 04 bit para C_ e de 0; 735_0; 002 bit a 2; 54_0; 01 bit para C_, de acordo com a quantidade de níveis de enterramento considerados (de dois a dez níveis), e excesso de entropia compreendido entre 0; 53 _ 0; 01 bit e 1; 4 _ 0; 1 bit para C_ e entre 0; 48 _ 0; 02 bit e 0; 93 _ 0; 04 bit para C_. Estes resultados evidenciam que os enterramentos atômicos são correlacionados localmente entre si. Foi encontrada uma relação entre enterramento atômico e estrutura secundária, na qual as _-hélices são distribuídas por todo o espaço ocupado pela proteína, as folhas-_ tendem aos níveis mais internos e segmentos sem estrutura secundária regular tendem a ocupar os níveis mais externos. A densidade de entropia da sequência é maior que a dos enterramentos atômicos se considerados alfabetos de mesmo tamanho, ou seja, aquela é potencialmente capaz de armazenar a informação necessária para a determinação deste. Entretanto, a transinformação entre sequência e enterramento (calculada para C_ e para C_) não é maior que 20% da dúvida do mesmo. Essa porcentagem é aparentemente pequena, mas é possível que mesmo esta quantidade de informação seja su_ciente para a predição dos enterramentos nativos, uma vez que a dúvida em relação ao enterramento de um átomo deve diminuir quando o de seu vizinho é conhecido, o que também foi mostrado neste trabalho. A combinação dos resultados deste provê um máximo teórico para os algoritmos de predição e permite saber se eles estão próximos deste máximo. _________________________________________________________________________ ABSTRACT / Protein folding understanding and protein terciary structure prediction are two main areas in science nowadays. One approach to terciary structure prediction has its basis in atomic burials, understood as the distance from a speci_c atom to the molecular geometrical center divided by protein's radius of giration. Atomic burials can be discretized in concentric and equiprobable burial layers, and it has been shown that information about these layers cary an amount of information enough to lead protein to its native structure (Pereira de Araújo et al., Proteins 70:971-983, 2008; Pereira de Araújo and Onuchic, PNAS 106:19001-19004, 2009), althougth it is not elucidated how this information is held to the sequence. The intend of this work is to measure mutual information, de_ned as the amount of information shared between two or more discrete random variables, between sequence and atomic burials considering di_erent combinations of sequence alphabets and number of burial layers, with the aim of understanding the relations between them and, therefore, contribute protein terciary structure prediction algorithms. The obtained results show that aminoacids sequence has entropy density ranging from 0; 9969_0; 0002 bit to 4; 176_0; 004 bit, according to the number of symbols of the considered alphabet (two, three, _ve or twenty symbols), and excess entropy approximately equal to zero. Taken together, these results demonstrate that sequence elements are not locally correlated. On the other hand, C_ and C_ atomic burials have shown entropy density from 0; 617_0; 002 bit up to 2; 16_0; 04 bit, and from 0; 735_0; 002 bit up to 2; 54_0; 01 bit, respectively, according to the number of burial levels considered (from two to ten levels). Its excess entropy vary from 0; 53_0; 01 bit to 1; 4_0; 1 bit and from 0; 48_0; 02 bit to 0; 93_0; 04 bit, taking C_ and C_ respectively. These results point that atomic burials elements have local correlation. In addition, a relation between atomic burials and secondary structure was evidenced, taken that Loops tend to external levels, _-sheets tend to internal levels and _-helices are homogeneously distributed through the protein radius. Sequence entropy density is major than atomic burials entropy density, i.e. sequence is theoretically capable of holding the amount of information necessary to determine atomic burials. However, mutual information between sequence and burials (calculated considering C_ and C_) is not greater than 20% of burial uncertainty. This percentage is apparently small, but is it possible that even this few information is enough to a correct prediction of atomic burials once that the entropy with respect to one atom shall decrease once its neigbour's position is known, which has also been shown here. The results obtained here provide a theoretical maximum that can be achieved by prediction algorithms, and therefore permit measure their e_ciency.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, Laboratório de Biologia Molecular, 2012. / Submitted by Elna Araújo (elna@bce.unb.br) on 2012-07-11T20:25:23Z No. of bitstreams: 1 2012_OsmardeSouzaOliveiraNeto.pdf: 1853403 bytes, checksum: 49c9f10ee2f9927bf8118d1cb04907e5 (MD5) / Approved for entry into archive by Jaqueline Ferreira de Souza(jaquefs.braz@gmail.com) on 2012-07-30T12:10:45Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_OsmardeSouzaOliveiraNeto.pdf: 1853403 bytes, checksum: 49c9f10ee2f9927bf8118d1cb04907e5 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-07-30T12:10:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_OsmardeSouzaOliveiraNeto.pdf: 1853403 bytes, checksum: 49c9f10ee2f9927bf8118d1cb04907e5 (MD5) / Quase todos os vetores de expressão de Pichia pastoris utilizam a sequência da região pré-pró do fator-α de Saccharomyces cerevisiae como sinal de secreção, o qual pode ser processado incorretamente em condições de hiperexpressão. Utilizar um sinal de secreção nativo de P. pastoris pode contornar este problema, mantendo a estrutura correta da proteína heteróloga. Utilizando o software Signal P. 3.0, os peptídeos sinais de 13 proteínas nativas do secretoma e a região “pré-pró” do fator α putativo de P. pastoris foram identificados e em seguida suas sequências foram amplificadas via PCR. Essas sequências foram clonadas no vetor pPIC9, integradas e expressas nessa levedura, junto com o gene repórter α-amilase de Bacillus subtillis. O fator α de S. cerevisiae presente nesse vetor foi removido, permitindo que apenas as sequências testadas neste trabalho influenciassem a secreção da enzima heteróloga. Após análise dos halos de hidrólise em placa e ensaios enzimáticos utilizando sobrenadante de cultura, observou-se que pelo menos quatro sinais de secreção testados possuíam níveis de secreção semelhantes ao fator α de S. cerevisiae. O sequenciamento do N-terminal da α-amilase será feito por espectrometria de massa, após purificação da enzima em coluna de níquel, e permitirá a análise da eficiência de processamento dos peptídeos sinais testados. Este último teste permitirá a escolha de um novo sinal de secreção nativo de P. pastoris, introduzindo novas opções para expressão heteróloga nesta levedura, além das disponíveis comercialmente pela empresa Invitrogen (EUA). _________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Almost all Pichia pastoris expression vectors uses Saccharomyces cerevisiae α-factor secretion signal, which can be improperly processed in conditions of hiperexpression. Using a native P. pastoris secretion signal should overcome this problem, maintaining the right structure of the heterologous protein. Using Signal P. 3.0 software, 13 secretion signals of native secretome proteins and the putative α factor of P. pastoris were identified and then their sequences were amplified via PCR. These sequences were cloned in pPIC9 vector, integrated and expressed in this yeast, along with a Bacillus subtillis α-amylase gene as a reporter. The S. cerevisiae α factor present in this vector was removed, allowing that only the sequences tested in this work had influence on the secretion of the heterologous enzyme. After analyses of hydrolysis halos on plates and enzymatic assays using culture supernatants, it was observed that at least four secretion signals tested had similar secretion levels of the S. cerevisiae α factor. Sequencing of the N-terminus of α-amylase will be carried out by mass spectrometry, after purification of the enzyme in a nickel based column, and will allow analysis of processing efficiency of the signal peptides tested. The latter test will enable the selection of a new native P. pastoris secretion signal, introducing new options for heterologous expression in this yeast, aside the ones commercially available by Invitrogen Company (USA).

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular. / Submitted by Alaíde Gonçalves dos Santos (alaide@unb.br) on 2012-09-20T14:42:51Z No. of bitstreams: 1 2012_ThiagoMachadoMellodeSousa.pdf: 9146808 bytes, checksum: 6df4980d0f83f0be7d1a74e005ab3541 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2012-09-28T12:56:46Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_ThiagoMachadoMellodeSousa.pdf: 9146808 bytes, checksum: 6df4980d0f83f0be7d1a74e005ab3541 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-09-28T12:56:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_ThiagoMachadoMellodeSousa.pdf: 9146808 bytes, checksum: 6df4980d0f83f0be7d1a74e005ab3541 (MD5) / O pH ambiental é um sinal importante para fisiologia de fungos, intervindo na regulação da transcrição de vários genes. Em fungos filamentosos e leveduras, PacC é um importante fator transcricional que regula a expressão de genes tanto em pH ácido como alcalino. A produção de enzimas envolvidas na bioconversão de biomassa vegetal é regulada principalmente no nível da transcrição. No entanto, o envolvimento da via de regulação por pH na expressão de enzimas lignocelulolíticos não tem sido extensivamente estudado. Nosso grupo havia demonstrado anteriormente que o deuteromiceto termofílico Humicola grisea var. thermoidea é um potente produtor de celulases, apresentando um considerável potencial biotecnológico para bioconversão de resíduos agrícolas. Nossos resultados sustentam a existência de uma via de regulação por pH para as glicosil hidrolases em H. grisea. Neste trabalho, foram realizadas análises quantitativas por RT-PCR em tempo real para vários transcritos de H. grisea. O perfil transcricional de oito genes codificadores de enzimas lignocelulolíticas (cbh1.1, cbh1.2, egl1, egl2, egl3, egl4, bgl4 e xyn1) e de dois fatores de transcrição (pacC e creA) foi avaliado na presença de glicose ou de bagaço de cana-de-açúcar em condições de pH ácido e alcalino. A análise por qRT-PCR revelou uma indução forte e precoce de quase todos os genes de enzimas lignocelulolíticas, de uma maneira sinérgica quando o fungo foi cultivado com a fonte de carbono complexa e em condições alcalinas (pH 8,0). A única exceção foi egl4, que foi induzido por pH ácido. Um padrão oposto para a expressão dos dois fatores transcricionais foi observado. Enquanto pacC foi induzido em condições alcalinas e fortemente reprimido na presença de glicose, creA foi induzido por glicose e reprimido em condições alcalinas. Os dados de perfil de transcrição, combinados com a análise da ligação in vitro de PacC e CreA aos promotores dos genes analisados, apóiam a repressão por carbono, mediada por CreA, e a via de regulação por pH, mediada por PacC em H. grisea. Além disso, ensaios de mobilidade eletroforética (EMSAs) com o promotor de pacC mostraram que, in vitro, PacC e CreA competem pelo mesmo sítio de ligação. Tomados em conjunto, estes dados corroboram as hipóteses de que PacC possa ser o mediador da regulação influenciada pelo pH e de que a repressão por glicose, possivelmente atribuída a CreA, é capaz de sobrepujar a ação indutória do pH alcalino. Temos ainda evidências de que CreA também esteja envolvido na repressão de PacC, estabelecendo uma interação entre os dois sistemas regulatórios. O foco do segundo capítulo desse trabalho foi a produção e caracterização de Xyr1 (regulador de xilanases 1), que é o principal fator transcricional que atua na regulação da expressão dos genes codificadores de xilanases em Trichoderma reesei. Os resultados apresentados mostraram a bem sucedida produção heteróloga da versão completa da proteína Xyr1, algo até então inédito entre reguladores de xilanases em fungos filamentosos. Nossas análises empregando técnicas de interação DNA-proteína e géis nativos indicaram que Xyr1 pode naturalmente formar homodímeros em solução. Contudo, a dimerização não é fundamental para a interação com o DNA, o que implica em uma dinâmica complexa de ligação ao promotor do gene xyn1. São possíveis as formas de monômero, dímero e interação com ambos os motivos do sítio palindrômico. A capacidade de dimerização do fator fortalece a proposição de modulação adicional da atividade de Xyr1 por meio de possíveis interações proteína-proteína com outros fatores transcricionais, sendo candidatas as proteínas Ace1 e Ace2. O papel de modificações pós-traducionais tem sido apontado como crucial na regulação mediada por Xyr1. Mostramos que a fosforilação possivelmente está envolvida na regulação da atividade de Xyr1, sendo necessária para a interação DNA-proteína in vitro, mas sem afetar a formação de dímeros. Apresentamos ainda indícios de modulação alostérica de Xyr1 que depende tanto da interação com o DNA quanto, possivelmente, com carboidratos, o que torna mais complexo este modelo de regulação. _______________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Environmental pH is an important signal in fungal physiology, acting at transcriptional regulation of several genes. In filamentous fungi and yeasts, the PacC zinc-finger transcription factor regulates gene expression in response to changes of external pH. The production of enzymes involved in plant cell wall breakdown is regulated mainly at the transcriptional level. Nonetheless, the involvement of the pH-related regulatory pathway in the lignocellulolytic enzymes expression has not been extensively studied. We have demonstrated that the thermophilic deuteromycete Humicola grisea var. thermoidea is a potent cellulases producer, presenting a considerable potential for agricultural wastes bioconversion processes. Previous results of our group support the existence of a pH regulatory pathway in H. grisea var. thermoidea. In this work, we have performed a time course transcription analysis of several H. grisea genes by quantitative real time RT-PCR. Eight enzyme genes (cbh1.1, cbh1.2, egl1, egl2, egl3, egl4, bgl4 and xyn1), and two transcription factors genes (pacC and creA) were analyzed in the presence of simple (glucose) or complex (sugarcane bagasse) carbon source, in acid and alkaline medium conditions. The qRT-PCR analyses revealed an early and strong induction of almost all glycoside hydrolase genes transcription, in a synergistic way, when the mycelia were grown in the presence of the complex carbon source, under alkaline conditions (pH 8.0). The only exception was egl4, which was acid-induced. An opposite pattern was observed for the expression of the two transcription factors. While pacC was induced in alkaline conditions and strongly repressed in presence of glucose, creA was induced by glucose and repressed in alkaline conditions. The transcriptional profile data combined with the analysis of the in vitro binding of PacC and CreA transcription factors to the promoters support the CreA-mediated carbon repression and the PacC-related pH regulation of H. grisea cellulase and xylanase encoding genes. Moreover, electrophoretic mobility shift assays (EMSAs) employing the upstream regulatory sequences of pacC showed that an in vitro interaction occurs between the proteins PacC and CreA on the pacC upstream regulatory sequence, with both factors competing for the same binding site. Taken together, this data corroborate our previous evidences, supporting the existence of a pH transcriptional regulatory pathway in H. grisea, mediated by PacC. Moreover, PacC is probably transcriptionally auto-regulated and may be subject to the carbon repression mechanism mediated by CreA. The second chapter of this work describes the production and characterization of Xyr1 (xylanase regulator 1), which is the main transcription factor that acts regulating the expression of xylanase encoding genes in Trichoderma reesei. The results showed the successful heterologous production of the full version of Xyr1, something never previously described for xylanases regulators in filamentous fungi. Our analyses employing techniques of DNA-protein xviii interactions and native gels indicated that Xyr1 can form homodimers in solution. Nevertheless, dimerization is not essential for the interaction with DNA, suggesting a complex binding dynamics to the xyn1 promoter region (as monomer, dimer and interacting with both palindromic binding sites). The dimerization capacity of Xyr1f strengthens the proposition of an additional modulation for this factor activity, probably by protein-protein interactions with other transcription factors, such as Ace1 and Ace2. A crucial role for post-translational modifications was proposed for gene regulation mediated by Xyr1. We initially showed that phosphorylation has a possible role in the regulation of Xyr1 activity, being necessary for the DNA-protein interactions in vitro, but not affecting the dimer formation. Additionally, we present evidence suggesting an allosteric modulation of Xyr1, dependent on interactions, both with DNA and carbohydrates, which adds an additional degree of complexity to this regulatory model.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2006. / Submitted by Jaqueline Ferreira de Souza (jaquefs.braz@gmail.com) on 2013-04-16T13:45:06Z No. of bitstreams: 1 2006_LanusecaixetaZanotta.pdf: 2759687 bytes, checksum: 6648f9b9b9e241bf7e823934a4640935 (MD5) / Approved for entry into archive by Jaqueline Ferreira de Souza(jaquefs.braz@gmail.com) on 2013-04-16T13:45:51Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2006_LanusecaixetaZanotta.pdf: 2759687 bytes, checksum: 6648f9b9b9e241bf7e823934a4640935 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-04-16T13:45:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2006_LanusecaixetaZanotta.pdf: 2759687 bytes, checksum: 6648f9b9b9e241bf7e823934a4640935 (MD5) / Em algumas regioes do mundo, inclusive no Brasil, o numero de acidentes com escorpioes e bastante significativo. Devido a necessidade, entao, de se produzir antidotos ou anti-soros eficazes para combater os prejuizos causados a saude humana em decorrencia desses acidentes, estudos envolvendo a caracterizacao quimica e farmacologica da peconha desses animais foram intensificados. A peconha dos escorpioes e composta por varios tipos de moleculas, principalmente polipeptideos geralmente toxicos para um grande numero de organismos como mamiferos, insetos e crustaceos. Muito se tem estudado sobre as diferentes propriedades fisiologicas e farmacologicas dessas moleculas e atualmente ja sao conhecidas a atuacao em canais ionicos, atividade antimicrobiana, antimalaria, fosfolipasica e inseticida. Esse trabalho tem como objetivo principal o isolamento e a caracterizacao de peptideos biologicamente ativos presentes na peconha do escorpiao Tityus fasciolatus, especie endemica do cerrado. Os animais foram coletados na regiao do Distrito Federal e a peconha foi obtida por meio de estimulacao eletrica moderada proximo a glandula produtora de peconha do especime e, em seguida, liofilizada. A purificacao dos peptideos foi realizada em duas etapas: filtracao em gel (Superdex 75 HR 10/30) em tampao formiato de amonia e RP-HPLC (Vydac C18 218TP54) com a eluicao mediada pela aplicacao de um gradiente linear de acetonitrila. Os peptideos de interesse foram reduzidos e alquilados com 4-vinilpiridina e suas massas moleculares foram obtidas por meio de espectrometria de massa (MALDI-TOF MS). A estrutura primaria dos peptideos isolados foi obtida por meio da degradacao de Edman e tambem foram realizados ensaios biologicos a fim de se determinar a atividade de tais peptideos. Tres peptideos que apresentaram bom grau de pureza e abundancia tiveram suas estruturas primarias determinadas. O peptideo Tf14 possui massa molecular igual a 14 kDa e temos indicios de se tratar de um homodimero ligado por pontes dissulfeto; Tf3.5 e um provavel bloqueador de canais de potassio, uma vez que possui alta similaridade estrutural com peptideos dessa natureza e, finalmente, Tf2.7, um peptideo linear com 25 residuos de aminoacidos e massa molecular igual a 2,75 kDa. Ensaios biologicos revelaram tratar-se de um peptideo com atividade semelhante a bradicinina, alem de ser capaz de bloquear o fluxo de ions em canais de potassio voltagem-dependentes. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / In some regions of the world, including Brazil, the number of injuries caused by scorpions is rather relevant. In order to minimize the deleterious effects in human health caused by those injuries by means of counter poison or anti-serum, efforts were expanded to further investigate the biochemical and pharmacological properties of the poison of these animals. The scorpion venom are constituted by several and different kinds of molecules, mainly polypeptides, generally toxic for a large number of organisms like mammals, insects and crustaceans. Much is known about the physiological and pharmacological properties of these polypeptides, including their mode of action on ions channels, anti-malary, anti-microbial, phospholipasic and insecticidal activities. The main objective of this work is the purification and characterization of biologically active peptides present in the venom of the scorpion Tityus fasciolatus, an endemic species from cerrado region. The animals were collected in Distrito Federal, and the venom was obtained by gentle electric stimulation next to the producing glandule of the specimen. The peptides were purified in two steps: gel filtration (Superdex 75 HR 10/30) using ammonium formiate buffer, followed by RP-HPLC cromatography (Vydac C18 218TP54). The elution was performed by means of an acetonitrile gradient. The obtained peptides were reduced and alkylated using 4-vinylpyridine and their molecular masses were determined using mass spectrometry analysis (MALDI-TOF MS). The primary structures of these peptides were determined by Edman degradation and several assays were done in order to determine the biological activity of these peptides. Three highly pure and abundant peptides had their primary structures determined: Tf14, with a molecular mass of 14 kDa seems to be an homodimer holded by disulphide bridges; Tf3.5 should act blocking potassium channels since it shares high structural similarities to other scorpion peptides of this nature; and Tf2.7, a linear peptide of 25 amino acids residues with a molecular mass of 2.75 kDa. This peptide exhibits a bradykinin-like activity and is also able of blocking ion fluxes in voltage-dependent potassium channels.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Departamento de Biologia Celular, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2011. / Submitted by Tania Milca Carvalho Malheiros (tania@bce.unb.br) on 2013-04-24T13:15:00Z No. of bitstreams: 0 / Rejected by Jaqueline Ferreira de Souza(jaquefs.braz@gmail.com), reason: on 2013-04-24T13:18:59Z (GMT) / Submitted by Tania Milca Carvalho Malheiros (tania@bce.unb.br) on 2013-04-24T13:32:17Z No. of bitstreams: 1 2011_MarianaHallwass_Parcial.pdf: 1786257 bytes, checksum: 77d79c88b2c676722e4667d89e92ac9d (MD5) / Approved for entry into archive by Jaqueline Ferreira de Souza(jaquefs.braz@gmail.com) on 2013-04-24T13:40:11Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2011_MarianaHallwass_Parcial.pdf: 1786257 bytes, checksum: 77d79c88b2c676722e4667d89e92ac9d (MD5) / Made available in DSpace on 2013-04-24T13:40:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2011_MarianaHallwass_Parcial.pdf: 1786257 bytes, checksum: 77d79c88b2c676722e4667d89e92ac9d (MD5) / Espécies do gênero Tospovirus têm sido relatadas como agentes causais de doenças em diferentes culturas, no mundo, sendo transmitidos por diferentes espécies de tripes. O Tomato spotted wilt virus (TSWV) é a espécie-tipo do gênero Tospovirus e possui uma ampla gama de hospedeiros quando comparado com outros vírus do gênero. A partícula viral é envelopada e contém três segmentos de RNA designados S, M e L, que codificam duas proteínas não-estruturais (NSM e NSS) e três proteínas estruturais (L, N e o precursor das glicoproteínas GN e GC). A proteína NSM está envolvida no movimento do vírus célula-a-célula, enquanto que a NSS está envolvida na supressão de silenciamento gênico em plantas, demonstrado para o TSWV e para outro tospovírus, o Groundnut bud necrosis virus (GBNV) e também está relacionada com a expressão de sintomas nos tecidos foliares. Visando minimizar os danos causados por tospovírus, principalmente em cultivos de olerícolas, genes de resistência têm sido incorporados em variedades comerciais como o Tsw em pimentão e o Sw-5 em tomate. O entendimento dos processos de interação desses genes de resistência com genes virais constitui estratégia importante na durabilidade e estabilidade da resistência a esses patógenos. Este trabalho teve como objetivo geral estudar a interação entre tospovírus e plantas e foi dividido em três capítulos, sendo que no primeiro capítulo, foram determinadas as sequências completas de nucleotídeos do gene NSS de dois tospovírus relatados no Brasil, Groundnut ring spot virus (GRSV) e do Zucchini lethal chlorosis virus (ZLCV). As sequências foram comparadas com outras sequências NSS de tospovírus, disponíveis no banco de dados, permitindo a construção de árvores filogenéticas. Verificou-se que a NSs do GRSV e do ZLCV apresentou o mesmo tamanho, 1.404 nucleotídeos. A comparação das sequências de aminoácidos de GRSV com ZLCV mostrou uma identidade de 69,6%. Análises filogenéticas foram realizadas com base nas sequências NSS, depositadas no banco de dados, confirmando que as espécies estudadas pertencem ao grupo americano. O segundo capítulo foi dedicado ao estudo da interação entre TSWV e uma cultivar de pimenta resistente à infecção. No Brasil e no mundo, o estudo e o entendimento da morte celular programada (PCD) em células vegetais, induzida por infecções causada por fitopatógenos, ainda é incipiente. Resultados preliminares de ocorrência de PCD foram obtidos, utilizando o patossistema TSWV em Capsicum chinense PI 159236. Com o objetivo de estudar os domínios da proteína do nucleocapsídeo (N) de TSWV, responsável pela indução de reação de hipersensibilidade (RH) em genótipos de pimenta, foram construídas quimeras com troca de fragmentos genômicos do gene N de TSWV e Tomato chlorotic spot virus (TCSV) (responsável por causar infecção sistêmica em alguns genótipos de pimenta), usando como ferramenta o vetor de expressão transiente pGreenII 62-K. Agroinfiltrações com as construções e um controle negativo, que consistiu da bactéria mais o meio de indução, foram realizadas em plantas de C. chinense. Sintomas de necrose foram observados nas folhas com 10 a 12 dias após a infiltração. O sintoma de necrose ocorreu devido à incompatibilidade da interação agrobactéria GV3101/C. chinense, sendo necessário, em uma próxima etapa do trabalho, utilizar outra cepa de Agrobacterium mais adequada a este tipo de avaliação e que não induza, precocemente, o sintoma de necrose foliar. O terceiro capítulo consistiu do aprofundamento dos estudos da interação entre TSW V e um gene de resistência derivado do tomateiro. Interações entre plantas e vírus são complexas e envolvem vários tipos de respostas que podem ou não causar doenças no hospedeiro. A RH é um mecanismo utilizado pelas plantas para impedir a disseminação do patógeno para as células vizinhas. Para identificar o gene do TSWV isolado BR-01, responsável por desencadear uma resposta do tipo RH em plantas de Nicotiana benthamiana transgênica (expressando o gene de resistência derivada do tomateiro: Sw-5b), os genes das proteínas N, NSM e NSS foram clonados, individualmente, no vetor binário pGR107 (pPVX - Potato virus X ) e no vetor de expressão transiente pEAQ-HT Gateway, que também recebeu os genes GN e GC e o precursor da glicoproteína. Plantas de N. benthamiana (Sw-5b) foram agroinfiltradas com as construções obtidas em pGR107 e pEAQ-HT GW. Lesões necróticas do tipo RH foram observadas apenas nas plantas inoculadas com a construção pGR107 + NSM, diferindo dos sintomas causados pelas construções pGR107 + N e pGR107 + NSS. Entretanto, em inoculações realizadas com o vetor pEAQ, não foram observados sintomas do tipo RH nas agroinfiltrações realizadas com a construção pEAQ-HT GW + NSM. Verificou-se que a proteína NSM apresentou-se fragmentada em duas bandas quando detectada por Western blot, podendo ser esta a causa do não aparecimento da resposta do tipo RH com a inoculação dessa construção. Outra hipótese seria a necessidade de translocação da proteína NSM para a indução da RH, fato que poderia ser propiciado pelo vetor PVX, porém não ocorreria com o vetor de expressão pEAQ-HT GW. Visando a elucidação dessas hipóteses os trabalhos serão continuados. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / The species type Tomato spotted wilt virus (TSW V) of the genus Tospovirus, has a broad host range if compared with other viruses of the genus. The viral particle is enveloped and contains three ssRNA segments denoted S, M and L, encoding two non-structural proteins (NSM e NSS) and three structural proteins (L, N, and the glycoprotein precursor of GN and GC). The NSM protein is involved in the cell-to-cell movement, whereas NSS acts as silencing suppressor in the affectedplants. This role was demonstrated for both TSWV and Groundnut bud necrosis virus (GBNV). The NSS is also related to the symptoms expression in plants. Strategies to minimizing the damages caused by tospoviruses, mainly in horticultural crops have been implemented based on resistance genes as Tsw in sweet-pepper and Sw-5 in tomato. Understanding the interactions between resistance and viral genes are essential to generate stable and durable resistance to these pathogens. This work had the general aim to study the interaction of tospoviruses and plants and it was divided into three chapters. In the first chapter, the complete nucleotide sequence of NSS gene of two tospoviruses Groundnut ring spot virus (GRSV) and Zucchini lethal chlorosis virus (ZLCV) were determined. The NSs sequence of GRSV and ZLCV was both 1,404 nucleotides-long. Pairwise comparison showed that the NSs amino acid sequence of GRSV shared 69.6% identity with that of ZLCV. The sequences were compared with other NSS sequences of tospovírus available in the database. Phylogenetic analysis based on NSs sequences confirmed that these species cluster in the American clade. The second chapter was devoted to study the interaction between TSWV and a pepper cultivar resistant to the infection. The understanding of programmed cell death (PCD) in plants, induced by pathogens, is still incipient. Previous results about the PCD occurrence were obtained by using the pathosystem TSWV/ Capsicum chinense In order to study the nucleocapsid protein (N) domains of TSW V, responsible to cause a hypersensitive response (HR) in pepper genotypes, chimeras were constructed with genomic fragments of TSWV and Tomato chlorotic spot virus (TCSV) (responsible for causing systemic infection in some sweet pepper genotypes) was cloned into the pGreenII 62-K, a transient expression vector. Agroinfiltration was carried out in C. chinense plants with the pGreenII constructs and the negative control (just the Agrobacterium in the medium). Necrotic symptoms were observed 10 to 12 days after infiltration. The necrosis occurred dueto the interaction incompatibility between Agrobacterium GV 3101 and C. chinense plants. It was concluded that a different Agrobacterium strain that does not induce necrotic symptoms in the leaf must be used to enable this study, in a next step of this work. In the third chapter the interaction between TSW V and the resistance gene Sw-5 from tomato was studied. Interactions between plant and viruses are complex and involve several types of responses that may or may not cause disease to the host. The HR is a mechanism used by plants to prevent the spread of the pathogen to the neighboring cells. In order to identify the TSW V isolate BR-01 gene, responsible for triggering the HR in the transgenic Nicotiana benthamiana plants (Sw-5b), the N, NSM and NSSgenes were cloned individually in frame into the vector pGR107 (pPVX Potato virus X) and into the transient expression vector pEAQ-HT Gateway. The GN, GC and Glycoprotein precursor were cloned to into the pEAQ-HT GW vector. The constructs were agroinfiltrated in the transgenic N. benthamiana (Sw-5). HR-like necrotic lesions were seen only in leaves inoculated with the construct pGR107 + NSM, which differed significantly with symptoms caused by pGR107 + N and pGR107 + NSS. HR-like symptoms were not observed with pEAQ-HT GW + NSM. It was observed that the NSMprotein was not intact since two bands were detected by Western blot, suggesting that this could be the cause of the absence of the HR symptom in the inoculated plants. Another explanation would be the necessity of the NSM protein to move cell-to-cell to induce HR. This movement could be provided by the PVX vector, however does not occur when the pEAQ-HT GW was used. To elucidate these possible hypotheses, these studies will still be continued.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2013. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2013-04-26T12:47:13Z No. of bitstreams: 1 2013_SamuelCoelhoMandacaru.pdf: 2461734 bytes, checksum: 53e3bd695ac68b937ab8d244d5b05392 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2013-04-29T11:24:05Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_SamuelCoelhoMandacaru.pdf: 2461734 bytes, checksum: 53e3bd695ac68b937ab8d244d5b05392 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-04-29T11:24:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_SamuelCoelhoMandacaru.pdf: 2461734 bytes, checksum: 53e3bd695ac68b937ab8d244d5b05392 (MD5) / Uma característica do Trypanosoma cruzi são as mudanças morfológicas que ocorrem durante seu ciclo de vida. A amastigogênese é um importante processo no ciclo de vida do parasita onde as formas tripomastigotas infectivas se diferenciam em amastigotas replicativas. A duplicação celular é um processo complexo, onde vários eventos estão envolvidos, dentre eles, a correta segregação das cromátides irmãs após a replicação do DNA, função exercida por um complexo denominado coesina. Neste trabalho, foi proposta caracterização de complexos proteicos de T.cruzi assim como a identificação de proteínas de complexos nucleares, cuja expressão se altera durante a amastigogênese. Por meio da técnica Blue Native PAGE (BN-PAGE) foi possível realizar a separação de complexos proteicos de lisado total das formas epimastigotas de Trypanosoma cruzi. Os componentes individuais dos complexos puderam ser visualizados em segunda dimensão após o gel ter sido corado com nitrato de prata. Experimentos de detecção imunológica por western blotting demonstraram a ausência da subunidade SCC1 do complexo coesina em amastigotas gerados por diferenciação in vitro de formas tripomastigotas em cultura axênica em pH 5. Porém, a subunidade SCC1 pode ser detectada em extratos proteicos de formas amastigotas que foram reincubadas por 10 h em meio de cultura com pH ajustado para 7,5, sugerindo que essas formas são capazes de manter suas propriedades replicativas. Por espectrometria de massas do tipo LC-MS/MS, 1.339 proteínas de T. cruzi foram identificadas de amostras provenientes dos ensaios de amastigogênese. Destas, 560 proteínas foram anotadas em bancos de dados como proteínas reguladas, 65 possuíam localização nuclear e 66 foram preditas como pertencentes a complexos proteicos. Na classificação das proteínas identificadas os grupos que correspondem àqueles envolvidos em metabolismo de ácidos nucleicos aparecem como predominantes. Proteínas que se ligam a DNA (9,23%), proteínas de ligação a RNA (13,85%) e proteínas que se ligam a nucleotídeos (18,46%) correspondem juntas a 41,54% do total de proteínas nucleares reguladas, corroborando o fato de que intensa atividade de transcrição e processamento de DNA e RNA ocorre em todas as etapas de diferenciação, além de outros principais grupos como as peptidases (15,38%), proteínas estruturais (13,85%) e atividade de hidrolases (12,31%). Para proteínas reguladas e envolvidas com complexos proteicos durante a amastigogênese os maiores grupos estão envolvidos em processos de transporte (25,58%), processos metabólicos (19,77%), processos metabólicos de compostos contendo nucleotídeos (16,28%), geração de precursores metabólicos e de energia (8,14%). ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / A feature of Trypanosoma cruzi is the morphological changes that occur during their life cycle. The amastigogenesisis an important process in the life cycle of the parasite where the infective trypomastigotes differentiate into replicative amastigotes. A cell replication is a complex process, where several events are involved, among them the correct segregation of sister chromatids after DNA replication, function performed by a complex called cohesin. In this work we proposed the characterization of T. cruzi protein complexes and the identification of proteins from nuclear complexes, whose expression is altered during amastigogenesis. Through the technique of Blue Native PAGE (BN-PAGE) it was possible the separation of protein complexes from total lysate of T. cruzi epimastigotes. The individual components of the complexes could be visualized after the second dimensional gel after stainingwith silver nitrate. Immunological detection experiments by western blotting demonstrated the absence of SCC1 subunit of cohesin complex in amastigotes generated by in vitro differentiation of trypomastigotes in axenic culture at pH 5.0. However, the subunit SCC1 was detected in protein extracts of amastigotes that were reincubated for 10 hours in a culture medium adjusted at pH 7.5, suggesting that these forms are able to maintain their replicative properties. By LC-MS/MS mass spectrometry, 1,339 proteins ofT.cruzi were identified in samples from mastigogenesis. Of these, 560 proteins were annotated in databases as regulated proteins, 65 have presented nuclear localization and 66 were predicted as belonging to protein complexes. In the classification of proteins involved in nucleic acid metabolism, this group appears to be predominant. Proteins which bind to DNA (9.23%), RNA-binding proteins (13.85%) and proteins that bind nucleotides (18.46%) correspond together to 41.54% of the total regulated nuclear proteins, confirming that strong transcription activity and DNA and RNA processing occur in all stages of differentiation, and other major groups such as peptidases (15.38%), structural proteins (13.85%) and activity of hydrolases (12.31%). For regulated proteins and protein complexes involved in amastigogenesis the largest groups are involved in transport processes (25.58%), metabolic processes (19.77%), metabolic processes of compounds containing nucleotides (16.28%), generation of metabolic precursors and energy (8.14%).

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2008. / Submitted by Kathryn Cardim Araujo (kathryn.cardim@gmail.com) on 2009-09-29T13:57:27Z No. of bitstreams: 1 2008_CesarMarcosMarcello.pdf: 1454599 bytes, checksum: a756918626271ef79f64ecdf6eae900c (MD5) / Approved for entry into archive by Marília Freitas(marilia@bce.unb.br) on 2010-02-02T23:01:49Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2008_CesarMarcosMarcello.pdf: 1454599 bytes, checksum: a756918626271ef79f64ecdf6eae900c (MD5) / Made available in DSpace on 2010-02-02T23:01:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2008_CesarMarcosMarcello.pdf: 1454599 bytes, checksum: a756918626271ef79f64ecdf6eae900c (MD5) Previous issue date: 2008-08 / Espécies do gênero Trichoderma têm sido encontrados atacando uma grande variedade de fungos patogênicos e usados como agente de biocontrole. A maioria das preparações a base de Trichoderma, utilizadas comercialmente para controle biológico, são de Trichoderma atroviride ou Trichoderma harzianum. Entretanto, Trichoderma asperellum, uma espécie pouco estudada, é um efetivo agente de controle biológico contra alguns fungos patogênicos. A interação de T. asperellum com Rhizoctonia solani é característica de micoparasitismo, envolvendo crescimento em direção ao hospedeiro, produção de estruturas semelhantes à apressórios e enrolamento das hifas. A maioria dos fungos fitopatogênicos possui parede celular contendo quitina, organizada em camadas regularmente ordenadas e ß-1,3-glucanas arranjadas como um enchimento de maneira amorfa. Quitinases e ß-1,3-glucanases tem sido diretamente envolvidas nas interações de micoparasitismo entre espécies de Trichoderma e seus hospedeiros. Neste trabalho nós apresentamos a análise da expressão de exo-ß-1,3-glucanases produzidas por T. asperellum durante o crescimento em diferentes fontes de carbono. Também demonstramos que a expressão do gene tag83 ocorre quando o T. asperellum cresce sob simulação de antagonismo contra R. solani. Estudamos a regulação do gene codante da exo-ß-1,3-glucanase extracelular (tag83) produzida pelo micoparasita T. asperellum. Foi detectada atividade enzimática em todas as fontes de carbono avaliadas, com níveis elevados encontrados quando amido e parede celular de R. solani foram utilizados. Estes resultados são apoiados pela presença de uma forte banda com atividade enzimática em gel nãodesnaturante (PAGE). Experimentos utilizando RT-PCR demonstrou que a indução da exo-ß-1,3-glucanase em T. asperellum ocorrem em nível transcricional. Também utilizamos RT-PCR e PCR em tempo real para analisar a expressão do gene tag83 durante ensaio in vivo do T. asperellum contra R. solani. Demonstramos ainda que a expressão de tag83 está significativamente aumentada na presença de R. solani. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Species of the genus Trichoderma have been found to attack a wide range of plant-pathogenic fungi and have been used as biocontrol agents. The majority of Trichoderma preparations used commercially for biological control are Trichoderma atroviride or Trichoderma harzianum. However, Trichoderma asperellum, a less well studied species, is also an effective biological control agent against some phytopathogen fungi. The interaction of T. asperellum with Rhizoctonia solani is characteristically mycoparasitic, involving growth along the host hyphae, production of appressoria-like structures and coiling. Most phytopathogenic fungi have cell wall that contain chitin as a structural backbone arranged in regularly ordered layers and â-1,3-glucan as a filling material arranged in an amorphous manner. Chitinases and â-1,3-glucanases have been found to be directly involved in the mycoparasitism interaction between Trichoderma species and its hosts. In this study, we reported the analysis of expression of the exo-ß-1,3-glucanase encoding gene tag83 produced by T. asperellum during growth in different carbon sources. We also show that expression of tag83 gene occurs when T. asperellum grows under simulated antagonism against R. solani. The regulation of the gene encoding the extracellular exo-â-1,3-glucanase (tag83) produced by the mycoparasite Trichoderma asperellum was studied. Enzyme activity was detected in all carbon sources, but highest levels were found when starch and purified cell walls from Rhizoctonia solani were used. These results are supported by the appearance of one strong band with enzyme activity in non-denaturing PAGE. Experiments using RT-PCR showed that exo-ß-1,3-glucanase induction in T. asperellum occurred at the transcriptional level. We used RT-PCR and real-time PCR analysis to examine the expression of tag83 gene during in vivo assay of T. asperellum against R. solani. We showed that the expression of tag83 is significantly increased by the presence of R. solani.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2008. / Submitted by Diogo Trindade Fóis (diogo_fois@hotmail.com) on 2009-10-06T12:08:10Z No. of bitstreams: 1 2008_RobertoNascimentoSilva.pdf: 3733422 bytes, checksum: 1da0c1d7f54c836476db5e24188ceeb2 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2009-11-03T17:40:52Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2008_RobertoNascimentoSilva.pdf: 3733422 bytes, checksum: 1da0c1d7f54c836476db5e24188ceeb2 (MD5) / Made available in DSpace on 2009-11-03T17:40:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2008_RobertoNascimentoSilva.pdf: 3733422 bytes, checksum: 1da0c1d7f54c836476db5e24188ceeb2 (MD5) Previous issue date: 2008 / Trichoderma reesei (Hypocrea jecorina) é amplamente utilizado na indústria e seu potencial para o uso na agricultura como agente de controle biológico contra fungos fitopatogênicos começou a ser explorado recentemente. O gene gna3 que codifica para uma proteína G subgrupo III, ativadora de adenilato ciclase de T. reesei, foi clonado para o estudo do seu possível papel no controle da expressão de genes codificadores das celulases (cbh1 e cbh2) por celulose e soforose. Bem como, na produção de enzimas que degradam parede celular (EDPCs), durante o antagonismo contra Phytium ultimum. A linhagem mutante de T. reesei que possui uma cópia modificada de gna3 para expressão de uma versão da proteína GNA3 (gna3QL) que se mantém ativada exibiu elevado conteúdo intracelular de AMPc e uma diminuição na esporulação, mas sem afetar a taxa de crescimento vegetativo no escuro e um aumento de 20% dessa taxa em presença de luz. Consistente com o comportamento da linhagem selvagem, nenhuma transcrição de genes de celulase ocorre na ausência de indutor. Entretanto, o mutante mostra um aumento na transcrição de celulase em presença de celulose, mas somente em presença de luz. O nível de transcrição de celulase no escuro é similar o da linhagem parental TU-6. Por outro lado, quando soforose foi utilizada como indutor, transcritos de cbh1 e cbh2 tiveram nível mais alto de transcrição quando as culturas foram mantidas no escuro do que na presença de luz. A transcrição de gna3 é aumentada em presença de luz. Todavia, genes conhecidamente regulados por luz, blr1, blr2 e env1 são igualmente transcritos no mutante gna3QL como no tipo selvagem. Durante o antagonismo contra P. ultimum, o mutante gna3QL, como a linhagem parental TU-6 inibiram o crescimento de P. ultimum no teste de confronto. O mutante gna3QL cresceu mais rápido do que a linhagem parental TU-6 nos primeiros 3 dias, mas cresceu mais devagar que o T. harzianum (ALL42). A microscopia eletrônica de varredura mostrou que o mutante gna3QL promoveu maiores alterações morfológicas na parede celular de P. ultimum do que a linhagem parental TU-6. O mutante gna3QL apresentou uma melhor performance na produção de EDPCs como endoquitinase (0,36 U. mL-1), N-acetil-?-D-glicosaminidase (NAGase) (2,62 U. mL-1) , ?-1,3-glicanase (5 U. mL-1), lipase (2,94 U. mL-1) e fosfatase ácida (11,81 U. mL-1), após 72 horas de incubação em meio líquido contendo parede celular de P. ultimum como fonte de carbono. Entretanto, a linhagem parental TU-6 apresentou uma maior atividade de celulase (10,3 U. mL-1) do que o mutante gna3QL (6,64 U. mL-1) e nenhuma diferença significativa na atividade de protease entre as duas linhagens foi observada. Os resultados mostram que GNA3 está envolvida na regulação da expressão de genes de celulase (cbh1 e cbh2) por celulose e este processo é dependente de luz. Além disso, a produção de algumas EDPCs durante o micoparasitismo por T. reesei contra P. ultimum pode estar associada com a atividade de GNA3 e/ou com o aumento intracelular dos níveis de AMPc. __________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Trichoderma reesei (Hypocrea jecorina) is widely used in industry and its potential for use in agriculture as a biocontrol agent against phytopathogenic fungi has just begun to be explored. The adenylate cyclase activating subgroup III Gproteinencoding gene gna3 of T. reesei was cloned to study its possible role in the control of cellulose and sophorose to cellulase (cbh1 and cbh2) gene expression as well in production of cell wall-degrading enzymes (CWDEs) during antagonism against Pythium ultimum. A mutant strain of T. reesei bearing a modified copy of gna3 for expression of a kept activated version of GNA3 protein (gna3QL) exhibits elevated intracellular cAMP levels and decreased sporulation, but was unaffected in its growth rate in dark and an increase in this rate of about 20% in light. Consistent with the behavior of the wild-type strain, no cellulase transcription occurs in this mutant in the absence of an inducer. However, the mutant shows an increase in cellulase transcription in presence of cellulose, but only in the presence of light. Cellulase transcription level in the dark is similar to the parent strain. On the other hand, when sophorose was used as inducer, transcript levels of cbh1 and cbh2 were higher when cultures were kept in the dark than in presence of light. The transcription of gna3 is increased in the presence of light. Nevertheless the light regulatory genes blr1, blr2 and env1 are transcribed similarly in the gna3QL mutant as in the wild-type. During antagonism against P. ultimum, the mutant gna3QL, like the parental TU-6 strain, inhibited the growth of P. ultimum in dual culture assay. The mutant gna3QL grew faster than the parental TU-6 strain within the first 3 days but grew more slowly than the T. harzianum (ALL42). Scanning electron microscopy showed that the mutant gna3QL promoted more morphological alterations of P. ultimum cell wall after interaction than the parental TU- 6 strain. The mutant gna3QL showed a better performance in production of CWDEs such as endochitinase (0.36 U. mL-1), N-Acetyl- _ -D-glucosaminidase (NAGase) (2.62 U. mL-1), _-1,3-glucanase (5 U. mL-1), lipase (2.94 U. mL-1) and acid phosphatase (11.81 U. mL-1), after 72 hours of incubation in liquid medium containing P. ultimum cell wall as the carbon source. However, the parental TU-6 strain showed higher cellulase activity (10.3 U. mL-1) than the mutant gna3QL (6.64 U. mL-1) and no significant difference was observed in protease activity between the two strains. The results showed that GNA3 is involved in light-regulated cellulase gene expression (cbh1 and cbh2) on cellulose. Furthermore, the production of some CWDEs during mycoparasitism by T. reesei against P. ultimum can be associated with GNA3 activity and/or increase in intracellular cAMP levels.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, 2006. / Submitted by Natália Cristina Ramos dos Santos (nataliaguilera3@hotmail.com) on 2009-11-01T17:27:42Z No. of bitstreams: 1 2006_David Neves.pdf: 1665803 bytes, checksum: 120b8a159902f36958452567ba6c8f3a (MD5) / Approved for entry into archive by Luanna Maia(luanna@bce.unb.br) on 2009-11-10T12:59:00Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2006_David Neves.pdf: 1665803 bytes, checksum: 120b8a159902f36958452567ba6c8f3a (MD5) / Made available in DSpace on 2009-11-10T12:59:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2006_David Neves.pdf: 1665803 bytes, checksum: 120b8a159902f36958452567ba6c8f3a (MD5) Previous issue date: 2006 / Esta tese descreve a identificação do gene mtaf (metiltioadenosina fosforilase) de T. cruzi, o qual contém uma fase aberta de leitura de 921 pb, sendo que sua a seqüência traduzida exibe a assinatura da família 2 das purina nucleosídeo fosforilase/MTAP. A seqüência da TcMTAF é 59% e 58% idêntica às seqüências MTAF do Trypanosoma brucei and Leishmania major, respectivamente, mas apresentando apenas 35% de identidade com a seqüência da MTAF humana. Além disso, o gene está representado como cópia única por genoma haplóide do parasita. A TcMTAF recombinante migra como um monômero de 33 kDa em gel de “SDS-PAGE” sob condições redutoras, mas se associa em oligômeros na ausência de agentes redutores. A MTAF nativa é expressa pelas três formas de desenvolvimento do T. cruzi. Apesar da enzima ser ativa em uma ampla faixa de pH e temperatura, ela exibe atividade máxima à 50 °C e um pH ótimo na faixa neutra. Ao contrário da MTAF humana, que degrada apenas MTA, a TcMTAF catalisa a clivagem de MTA, adenosina, deoxiadenosina e guanosina. Devido ao fato da TcMTAF e da MTAF humana possuírem diferentes parâmetros cinéticos e especificidade a substratos, a TcMTAF pode ser explorada como um novo alvo para o desenvolvimento de quimioterapia tripanocída. A rTcMTAP foi submetida a caracterização fisicoquímica. A enzima foi submetida à desnaturação térmica, visualizada por dicroísmo circular, em uma ampla faixa de pH, contudo não se observou uma relação entre a estabilidade da proteína e as condições de ionização do meio. A enzima demonstrou uma considerável resistência à desnaturação térmica, desdobrando-se em temperaturas acima de 79 °C. O conteúdo de estruturas secundárias da enzima é significativamente composto por α-hélices. Contudo, mesmo após a desnaturação térmica, a percentagem das α-hélices exibe pouca variação, principalmente no pH 7.4 e 9.0. Desnaturação química, induzida por hidrocloreto de guanidina e uréia, foi monitorada tanto por dicroísmo circular como por espectroscopia de fluorescência. A enzima suportou concentrações de até 3.6 M de hidrocloreto de guanidina e até 8 M de uréia sem alterar sua estrutura terciária. Os parâmetros termodinâmicos calculados a partir dos experimentos de desnaturação química e térmica demonstraram estar em harmonia. Em pH 6.0 e na presença de CTAB a enzima demonstrou uma resistência ainda maior à desnaturação térmica.