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Caracterização dos mecanismos de resistência ao sistema complemento humano e microvesiculação em diferentes cepas de Trypanosoma cruzi

Wyllie, Melisa Patricia January 2017 (has links)
Orientador : Prof. Dr. Marcel Iván Ramírez Araya / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciencias Biológicas (Microbiologia, Parasitologia e Patologia Básica). Defesa: Curitiba, 31/01/2017 / Inclui referências : f. 78-87 / Resumo: O protozoário Trypanosoma cruzi, é o agente etiológico da doença de Chagas. Considerada como uma doença tropical negligenciada, esta doença acomete milhões de pessoas do mundo e atinge também mamíferos silvestres e domésticos. Para produzir uma infecção o parasito T. cruzi precisa evadir o sistema imune inato do hospedeiro. O sistema imune inato é a primeira linha de defesa contra patógenos; e o sistema complemento representa o principal mecanismo da defesa inata. O sistema complemento é formado por um conjunto de proteínas que são ativadas em cascata e, que culmina na formação de um poro na membrana do patógeno, provocando a sua lise. Todavia, muitos organismos patogênicos como o T. cruzi têm desenvolvido vários mecanismos para escapar o ataque do sistema complemento afin de progredir no seu ciclo de vida, e portanto estabelecer a infecção. Recentemente, foi descrito um novo mecanismo de evasão empregado por patógenos, que é a liberação de microvesículas. Microvesículas são estruturas bicamadas lipídicas complexas (0.1-1 ?m), oriundo da brotamento e fissão da membrana plasmática e que transportam várias moléculas derivadas das células de origem tais como proteínas e ácidos nucleicos. Nosso grupo de pesquisa recentemente descreveu alguns aspectos das características e papel das microvesículas nos mecanismos de evasão do sistema imune inata e durante os eventos de infecção, utilizando como modelo as microvesículas liberadas durante a interação de apenas uma cepa de T. cruzi com células hospedeiras. Desse modo, o presente trabalho teve como objetivo analisar microvesiculação em diferentes cepas de T. cruzi durante a interação com células hospedeiras e availar seu efeito. Apresentamos evidências de que a liberação de microvesículas é induzida durante a interação entre tripomastigotas metacíclicos de diferentes cepas de T. cruzi, G (TcI) e Y (TcII), e células sanguíneas (monócitos) e que existem diferenças na produção de microvesículas entre as diferentes cepas. Os nossos resultados também demostram o envolvimento das microvesículas isoladas nos mecanismos de resistência de T. cruzi à lise mediada pelo complemento e os mecanismos de invasão. A adição de microvesículas a 6,25% de soro humano normal aumentou a resistência dos parasitos da cepa Y à lise mediada por complemento de 50% para 80%; este fenômeno foi mais pronunciado em parasitos da cepa G, pois este aumento quase dobrou. Em termos do papel das microvesículas na infectividade de parasito, verificamos que as microvesículas induziram um aumento de invasão celular pelo parasito. Na presença de microvesículas, o número de parasitos da cepa Y invadindo células mamíferas aumentou por aproximadamente 50%, entretanto mais uma vez este fenômeno foi mais evidente para parasitos da cepa G, o número de parasitos que penetraram as células mamíferas duplicou. Curiosamente, foi observado que o papel das microvesículas na resistência à lise do complemento e na invasão é de classe específica, uma vez que as microvesículas de uma classe não tinha efeito sobre os parasitos de outra classe. Isto indica que as cepas têm mecanismos de inibição independentes e que os componentes de microvesículas poderiam ser diferentes. Finalmente foi comprovado que as microvesículas carreiam proteínas parasitárias envolvidas na interação parasitohospedeiro e que soro de pacientes chagásicos possuem anticorpos que reagem com componentes das microvesículas. Isto fornece evidências de que as microvesículas poderiam ser utilizadas por T. cruzi para transferir fatores de virulência a células hospedeiras e do potencial das mesmas como biomarcador para o diagnóstico da doença. Com esse trabalho foi possível demostrar novos aspectos da relevância de microvesículas durante a interação de diferentes cepas de T. cruzi com células hospedeiras. Palavras-chave: microvesículas. sistema complemento. invasão. / Abstract: The protozoan parasite Trypanosoma cruzi is the etiologic agent of Chagas disease. Considered a neglected tropical disease, this disease affects millions of people worldwide as well as wild and domestic mammals. In order to produce an infection, the T. cruzi parasite has to evade the host's innate immune system. The innate immune system is the first line of defense against pathogens; and the complement system represents the main mechanism of innate defense. The complement system is composed of a set of proteins that are activated in cascade, culminating in the formation of a pore in the membrane of the pathogen, resulting in its lysis. However, many pathogenic organisms such as T. cruzi have developed several mechanisms to escape the attack of the complement system, in order to progress in their life cycle, and thus establish an infection. Recently, a new evasion mechanism used by pathogens has been described, this is, the release of microvesicles. Microvesicles are complex lipid bilayer structures (0.1-1 ?m), originating from the outward blebbing and fission of plasma membrane, and which carries molecules derived from the parent cell such as proteins and nucleic acids. Our research group recently described some aspects of the characteristics and role of microvesicles as a mechanism of evasion of the innate immune system and during the infection process, using as model, the microvesicles released during the interaction of only one strain of T. cruzi with host cells. Accordingly, the objective of the present work was to analyse microvesiculation during interaction of different T. cruzi strains with host cells and to evaluate their effect. We present evidence that microvesicle release is induced during the interaction between metacyclic trypomastigotes from different T. cruzi strains, G (TcI) and Y (TcII), and blood cells (monocytes). Our results also demonstrate the involvement of microvesicles, isolated from T. cruzi and host cells interaction, in parasite resistance to complementmediated lysis and invasion mechanisms. Addition of microvesicles to 6,25% normal human serum increased parasite resistence to complement-mediated lysis from 50% to 80% in parasites of Y strain; this inhibition was more pronounced in G parasites since this increase was almost doubled. In terms of the role of microvesicles in parasite infectivity, we verified that the microvesicles induced an increase in cellular invasion by the parasite. In the presence of microvesicles, the number of parasites of the Y strain invading mammalian cells increased by approximately 50%, however once again this phenomenon was more evident for parasites of G strain, the number of parasites that penetrated the mammalian cells duplicated. Interestingly, it was observed that the role of microvesicles in resistance to complement lysis and invasion is class-specific, since microvesicles of one class had no effect on the parasites of the other class. This indicates that the strains have independent inhibition mechanisms and that the components of microvesicles could be different. Lastly, it was demonstrated that microvesicles carry parasite proteins involved in the parasite-host cell interaction and that sera from chagasic patients contain antibodies that react with microvesicular components. This provides evidence that microvesicles could be used by T. cruzi to transfer virulence factors to host cells and their potential application as a biomarker for the diagnosis of this disease. With this work, it was possible to demonstrate new aspects of the relevance of microvesicles released during the interaction of different T. cruzi strains with host cells. Key words: microvesicles. complement system. invasion.
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Identificação e caracterização de uma proteína com motivos ZINC FINGER de Trypanosoma cruzi

Oliveira, Alessandra Rejane Ericsson de January 2006 (has links)
Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2006. / Submitted by Larissa Ferreira dos Angelos (ferreirangelos@gmail.com) on 2009-11-14T12:47:05Z No. of bitstreams: 1 2006_Alessandra Rejane Ericsson de Oliveira.pdf: 1765643 bytes, checksum: 9a175047678704e91e49247033e86e47 (MD5) / Approved for entry into archive by Marília Freitas(marilia@bce.unb.br) on 2010-01-19T16:03:40Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2006_Alessandra Rejane Ericsson de Oliveira.pdf: 1765643 bytes, checksum: 9a175047678704e91e49247033e86e47 (MD5) / Made available in DSpace on 2010-01-19T16:03:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2006_Alessandra Rejane Ericsson de Oliveira.pdf: 1765643 bytes, checksum: 9a175047678704e91e49247033e86e47 (MD5) Previous issue date: 2006 / Proteínas zinc finger são compostas por domínios compactados contendo α- hélices e folhas β unidos e estabilizados por um ou dois átomos de zinco. Arranjos repetidos de zinc fingers são comumente utilizados para reconhecimento de ácidos nucléicos. Dentre outras atividades, eles estão envolvidos em replicação, transcrição e reparo de DNA. No nucleocapsídeo do vírus HIV tipo 1 foi identificada uma proteína contendo o motivo zinc finger CX2CX4HX4C, estando esta proteína envolvida em várias etapas do ciclo de vida viral, incluindo a propriedade de encapsidação do RNA viral. Em tripanosomatídeos, somente poucas proteínas contendo o motivo zinc finger já foram identificadas até o presente momento. Em um fragmento genômico de 17 kb da banda XX de T. cruzi, nós identificamos três genes in tandem codificando para proteínas zinc finger do tipo CX2CX2HX4C. Nós também demonstramos que genes similares estão presentes em T. brucei e L. major como três definidos grupos monofiléticos entre esses tripanosomatídeos. Em T. cruzi, TcZFP8 corresponde a um novo gene codificando para uma proteína com oito motivos zinc finger. O homólogo de TcZFP8 em T. brucei é aparentemente ausente, enquanto um candidato foi identificado em L. major. A clonagem molecular e a expressão heteróloga de TcZFP8 foi realizada para produção de anticorpos e procedimentos como imunocitolocalização, SELEX e EMSA. Análise por Western blotting revelou a presença dessa proteína nas três formas do parasita. Análises usando extratos protéicos nucleares e citoplasmáticos de T.cruzi mostraram que essa proteína está presente na porção nuclear. Esse resultado foi confirmado através de análise de microscopia por imunofluorescência indireta. Experimento de SELEX demonstrou quatro diferentes populações com uma região interna rica em C e/ou G, porém sem seqüências consenso específicas. Análises preliminares de EMSA de uma das quatro populações selecionadas revelaram evidências de que TcZPP8 possa ter afinidade de ligação à fita simples de DNA. __________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Zinc fingers are compact protein domains composed of a α-helix and a β-sheet held together by a zinc ion. Tandem arrays of zinc fingers are commonly used to recognize nucleic acids. Among other activities, they are involved in the processes of replication, transcription, and DNA repair. The nucleocapsid protein of HIV-1 contains a zinc finger motif CX2CX4HX4C that contributes to multiple steps of the viral life cycle, including the proper encapsidation of HIV RNA. In trypanosomatids, only a few of the proteins that contain such fingers were identified. In a 17-kb genomic fragment of Trypanosoma cruzi chromosome XX we identified three tandemly linked genes coding for CX2CX4HX4C zinc finger proteins. We also showed that similar genes are present in Trypanosoma brucei and Leishmania major sharing three monophyletic groups among these trypanosomatids. In T. cruzi, TcZFP8 corresponds to a novel gene coding for a protein containing eight zinc finger motifs. Homologous of TcZFP8 in T. brucei is apparently absent, while one candidate in L. major was identified. Molecular cloning of gene TcZFP8 and heterologous expression were performed in Escherichia coli. The purified recombinant protein His6x-TcZFP8 was used to produce antibody in rabbits and GST-TcZFP8 in SELEX and EMSA procedures. Using Western blot analysis, we observed the presence of this protein in all three forms of the parasite: amastigote, trypomastigote and epimastigote. Analysis using cytoplasm and nuclear cell extracts showed that this protein is present in the nuclear extracts and indirect immunofluorescence microscopy analysis confirmed the nuclear localization of the TcZFP8. SELEX experiment showed four different populations rich in C and/or G nucleotides, but with none consensus sequence. Preliminary EMSA from one population gave evidence that TcZFP8 has affinity to bind to singlestranded DNA.
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Transferência de DNA de Trypanosoma cruzi para retrotransposons line-1 de camundongos chagásicos tratados com nitroderivado benzonidazol

Sousa, Alessandro Oliveira de 26 July 2012 (has links)
Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, 2012. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2012-09-24T15:32:27Z No. of bitstreams: 1 2012_AlessandroOliveiraSousa.pdf: 3231529 bytes, checksum: 4d358e0ed623c1ab62cbc13a22bbaf57 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2012-09-27T11:11:49Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_AlessandroOliveiraSousa.pdf: 3231529 bytes, checksum: 4d358e0ed623c1ab62cbc13a22bbaf57 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-09-27T11:11:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_AlessandroOliveiraSousa.pdf: 3231529 bytes, checksum: 4d358e0ed623c1ab62cbc13a22bbaf57 (MD5) / As publicações de pesquisadores do Laboratório Multidisciplinar de Pesquisa em Doença de Chagas, na Faculdade de Medicina da Universidade de Brasília, sugerem que a patogênese da doença de Chagas pode ser explicada pela auto-imunidade de origem genética (Nitz e cols, 2004; Hecht e cols, 2010; Teixeira e cols, 2011). A hipótese que levou as investigações sobre transferência de DNA do Trypanosoma cruzi para o genoma do hospedeiro mamífero foi feita depois que se observou que coelhos tratados com a droga tripanocida benzonidazol desenvolveram lesões destrutivas no coração com intensidade semelhante àquela encontrada nos coelhos chagásicos que não tinham recebido a droga. Entretanto, pesquisadores de outros centros consideram que o tratamento das infecções pelo T. cruzi com o nitroderivado benzonidazol é eficaz nos casos agudos da doença. Ademais, há os que tratam chagásicos com a infecção crônica, na expectativa de aliviar sintomas e melhorar o prognóstico do caso. Não obstante, vários autores sugerem que o tratamento com o nitroderivado não elimina a infecção pelo T, cruzi e não melhora o quadro da doença clínica. Esta polêmica tem mais que importância semântica, pois, se a quimioterapia da doença de Chagas fosse satisfatória poderia esclarecer os papéis das infecções persistentes e da autoimunidade na patogênese da doença. Os estudos prévios de Nitz e cols., 2004; Hecht e cols, 2010; Teixeira e cols, 2011, mostram que sequências de minicírculo de DNA mitocondrial de T. cruzi (kDNA) integram frequentemente em retrotransposons LINE-1 no genoma hospedeiro, e sugerem que clones de linfócitos geneticamente modificados atacam e destroem o coração chagásico. Este estudo foi iniciado com o propósito de tentar falsear a teoria da origem genética da autoimunidade na doença de Chagas. Para isto, empregaram-se vários esquemas terapêuticos pelos quais grupos de camundongos com as infecções recentes pelo T. cruzi eram tratados com o nitroderivado benzonidazol, em dose quatro vezes acima (43 mg/kg) daquela usada para tratar a doença em humanos, e que era utilizado, alternativamente, em combinação com zidovudina (AZT) e ciprofloxacino (CIPRO), respectivamente, inibidores da transcriptase reversa e da Topoisomerase II. Essas enzimas bloqueiam vias metabólicas essenciais na integração do kDNA do T. cruzi no genoma (Rosa, 2005). Os resultados da investigação mostraram que os grupos de animais chagásicos tratados apenas com benzonidazol, ou em combinação com os inibidores, tiveram diminuição da quantidade de tripomastigotas de T.cruzi no sangue. Entretanto, jamais se observou cura parasitológica e imunológica (ausência de anticorpos específicos) nos animais submetidos aos diferentes esquemas terapêuticos. Ademais, todos os animais nos grupos tratados obtiveram positividade nos exames PCR específicos para identificação de DNA nuclear (nDNA) e de (kDNA) do protozoário. Diante desses resultados, foram conduzidos experimentos para avaliar se os esquemas terapêuticos empregados tinham bloqueado a integração do kDNA no genoma dos camundongos, infectados e infectados-tratados. Os resultados desses experimentos mostraram integrações de kDNA em retrotransposons LINE-1 do genoma de animais chagásicos que foram submetidos aos vários esquemas de tratamento, com frequências similares aquelas documentadas nos genomas dos camundongos controle positivos, infectados com T. cruzi e deixados sem tratamento. As populações de linfócitos T citotóxicos CD8+, γδ, e β (Vβ e Vβ1) atacam e destroem o coração chagásico. O conjunto de resultados desses experimentos mostra que não foi possível refutar (negar) a teoria auto-imune da patogênese da doença de Chagas. Lamentavelmente, confirmou-se que o tratamento das infecções pelo T. cruzi com o nitroderivado é insatisfatório. / The investigations conducted at the Chagas Disease Multidisciplinary Research Laboratory at the Faculty of Medicine of the University of Brasilia suggest that the origin of the pathogenesis of Chagas Disease may be explained by the genetically driven autoimmune rejection of the target host tissues. Early experiments had shown that chagasic rabbits treated with the anti-Trypanosoma cruzi nitroderivative benznidazole developed destructive lesions in the heart similar to those found in chagasic, but untreated animals. This observation led to the hypothesis that the parasite DNA retained in the body could call out autoimmune mechanisms in Chagas disease. This hypothesis spurted further investigations on the transfer of T. cruzi DNA to the host's genome. Inasmuch some researchers continue to believe that the treatment of the T. cruzi infections with the nitroderivative benzonidazole cure the Chagas disease, and others argue that the treatment should benefit those with the acute T. cruzi infections; prescriptions of the nitroderivative to treat the chronic infections aim at the prevention of disease outcome, aleviation of symptoms, and improvement of prognostics are recommended. Nevertheless, experimental and clinical investigations have shown that the treatment with the nitroderivative does not eradicate the T. cruzi infections and, therefore, the prognosis of the disease remains unchanged. This study subject bears practical importance, because it can show whether or not the chemotherapy of Chagas disease is satisfactory. Furthermore, its investigation in a suitable animal model may demonstrate any role played by the parasite persistence in the pathogenesis of the disease. Previous studies (Nitz e cols, 2004; Hecht e cols, 2010; Teixeira e cols, 2011) showed that the mitochondrial DNA minicircle sequence of T. cruzi integrates frequently into LINE-1 of the host's genome, and they suggest that clones of cytotoxic T lymphocytes, undergoing genotype modifications, attack and destroy the chagasic heart. This study was undertaken with the aim of falsifying the theory of the genetically driven autoimmune rejection of the heart in Chagas disease. We used several groups of mice with the T. cruzi infections, which were treated with the nitroderivative benznidazole four fold (43 mg/kg) above the dose used to treat human Chagas disease. Also, groups of chagasic mice were treated with benznidazole (43mg/ml) combined with either zidovudine (AZT) or ciprofloxacino (CIPRO), or with both, inhibitors of reverse transcriptase and of topoisomerase II,respectively. These enzymes were used to halt metabolic pathways for the integration of kDNA minicircle sequences into the host cell genome (Rosa, 2005). The results of these investigations showed that animals treated with benznidazole alone, or in combination with AZT, CIPRO, or with both inhibitors, diminished the number of T.cruzi trypomastigotes in the blood. However, the parasitologic cure was never achieved, for specif anti-parasite antibodies remained in tissues,regardless of the therapeutic regime used. Moreover, treated mice yielded positive PCR exams that identify the T. cruzi nuclear DNA (nDNA) and kDNA. Accordingly, further experiments were carried on to finding out whether the therapeutic regimes used had prevented the kDNA integration into the chagasic mice genome. These results revealed that the kDNA minicircle sequences integrated into retrotransposons LINE-1 of mice, which had received the therapeutic regimes, in a frequence not different from that observed in the positive control group of T. cruzi-infected mice, which did not receive any therapeutic regime. It was further shown that subsets of cytotoxic T lymphocytes CD8+, γδ, and β (Vβ and Vβ1) attacked and destroyed the chagasic heart. The results of these experiments reveal that it was not possible to falsify (deny) the genetically driven auto-immune theory that explains the pathogenesis of Chagas disease. Unfortunately, it was confirmed that the treatment of the T. cruzi infections with the nitroderivative benznidazole is unsatisfactory.
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Expressão heteróloga e citolocalização da y-Glutamilcisteína sintetase e Glutationa sintetase de Trypanosoma cruzi

Sousa, Isabel Garcia 11 February 2011 (has links)
Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Ciências Médicas, 2011 / Submitted by alcianira lima persch (alcyrpl@yahoo.com.br) on 2011-06-22T22:29:43Z No. of bitstreams: 1 2011_IsabelGarciaSousa.pdf: 2564047 bytes, checksum: 97b9b2a9bf641f22916bd222874a0c57 (MD5) / Approved for entry into archive by Guilherme Lourenço Machado(gui.admin@gmail.com) on 2011-06-27T11:52:11Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2011_IsabelGarciaSousa.pdf: 2564047 bytes, checksum: 97b9b2a9bf641f22916bd222874a0c57 (MD5) / Made available in DSpace on 2011-06-27T11:52:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2011_IsabelGarciaSousa.pdf: 2564047 bytes, checksum: 97b9b2a9bf641f22916bd222874a0c57 (MD5) / O sistema biológico depende de rígido controle do processo de oxidação proveniente do metabolismo. A oxidação pode resultar em danos irreparáveis em inúmeras moléculas importantes para a manutenção da fisiologia celular. Assim, há uma via metabólica voltada para manter esse sistema reduzido, que nos tripanosomatídeos parece ser única, e alguma interrupção causaria danos ao parasito. Nesse intuito, esse trabalho teve como objetivo estudar duas enzimas participantes da via de óxido-redução do Trypanosoma cruzi identificadas como -glutamilcisteína sintetase (GCS) e glutationa sintetase (GS). A sequência nucleotídica dos gene gcs e gs de T. cruzi codificam proteínas de 693 e 535 resíduos de aminoácidos de massa molecular 79,67 kDa e 58,63 kDa respectivamente. Essas proteínas já foram estudadas em muitos organismos, e apresentam sequências altamente conservadas entre os tripanosomatídeos patogênicos. O baixo grau de identidade com a enzima humana é bastante interessante, pois podem representar alvos específicos para o desenvolvimento de quimioterápicos seletivos. As proteínas recombinantes foram expressas em sistema heterólogo de E. coli, a partir do vetor de expressão gcs-pET28a e gs-pET28a. As proteínas foram purificadas sob condições desnaturantes, pois a rGCSTc só está presente na fração insolúvel do lisado bacteriano, e rGSTc da fração solúvel apresentou dificuldades em se ligar na coluna de afinidade. Os anticorpos policlonais produzidos pelos camundongos imunizados foram eficientes no reconhecimento das proteínas recombinantes e das proteínas nativas no extrato total de epimastigotas de T. cruzi. Análise da imunofluorescência revelou que as enzimas são expressas por todas as formas do T. cruzi e localizam-se no interior de vesículas no citoplasma do parasito. _________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Biological systems depend on the strict control of the oxidation process derived from the metabolism. Oxidation can result in irreparable damage to many molecules important to the maintenance of cellular physiology. Thus, there is a pathway to keep the system reduced, that in trypanosomatids appears to be unique, and any disruption would cause damage to the parasite. At this purpose, this work aimed to study two enzymes participating in the redox pathway of Trypanosoma cruzi, identified as _-glutamylcysteine synthetase (GCS) and glutathione synthetase (GS). The nucleotide sequence of the T. cruzi gcs and gs genes encode proteins of 693 and 535 amino acid residues with molecular masses 79.67 kDa and 58.63 kDa respectively. Their proteins have already been studied in many organisms and their sequences are highly conserved among pathogenic kinetoplastids. The low degree of identity with the human enzyme may represent specific targets for the development of selective chemotherapeutic agents. The recombinant proteins were expressed in E. coli using the expression vectors gcs-pET28a and gs-pET28a. The proteins were purified under denaturing conditions, because the rGCSTc is only present in the insoluble fraction of bacterial lysate and the soluble fraction of rGSTc does not bind to the affinity column under non-denaturating conditions. Polyclonal antibodies against the purified enzymes, raised in mice, were effective in the recognition of the recombinant proteins and their native forms in the total extract of epimastigotes of T.cruzi. Immunofluorescence analysis revealed that the enzymes are expressed in all forms of T. cruzi and located within vesicles in the cytoplasm of the parasite.
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Análise de proteínas nucleares reguladas na amastigogênese e de complexos proteicos de Trypanosoma Cruzi

Mandacaru, Samuel Coelho 21 February 2013 (has links)
Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2013. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2013-04-26T12:47:13Z No. of bitstreams: 1 2013_SamuelCoelhoMandacaru.pdf: 2461734 bytes, checksum: 53e3bd695ac68b937ab8d244d5b05392 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2013-04-29T11:24:05Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_SamuelCoelhoMandacaru.pdf: 2461734 bytes, checksum: 53e3bd695ac68b937ab8d244d5b05392 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-04-29T11:24:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_SamuelCoelhoMandacaru.pdf: 2461734 bytes, checksum: 53e3bd695ac68b937ab8d244d5b05392 (MD5) / Uma característica do Trypanosoma cruzi são as mudanças morfológicas que ocorrem durante seu ciclo de vida. A amastigogênese é um importante processo no ciclo de vida do parasita onde as formas tripomastigotas infectivas se diferenciam em amastigotas replicativas. A duplicação celular é um processo complexo, onde vários eventos estão envolvidos, dentre eles, a correta segregação das cromátides irmãs após a replicação do DNA, função exercida por um complexo denominado coesina. Neste trabalho, foi proposta caracterização de complexos proteicos de T.cruzi assim como a identificação de proteínas de complexos nucleares, cuja expressão se altera durante a amastigogênese. Por meio da técnica Blue Native PAGE (BN-PAGE) foi possível realizar a separação de complexos proteicos de lisado total das formas epimastigotas de Trypanosoma cruzi. Os componentes individuais dos complexos puderam ser visualizados em segunda dimensão após o gel ter sido corado com nitrato de prata. Experimentos de detecção imunológica por western blotting demonstraram a ausência da subunidade SCC1 do complexo coesina em amastigotas gerados por diferenciação in vitro de formas tripomastigotas em cultura axênica em pH 5. Porém, a subunidade SCC1 pode ser detectada em extratos proteicos de formas amastigotas que foram reincubadas por 10 h em meio de cultura com pH ajustado para 7,5, sugerindo que essas formas são capazes de manter suas propriedades replicativas. Por espectrometria de massas do tipo LC-MS/MS, 1.339 proteínas de T. cruzi foram identificadas de amostras provenientes dos ensaios de amastigogênese. Destas, 560 proteínas foram anotadas em bancos de dados como proteínas reguladas, 65 possuíam localização nuclear e 66 foram preditas como pertencentes a complexos proteicos. Na classificação das proteínas identificadas os grupos que correspondem àqueles envolvidos em metabolismo de ácidos nucleicos aparecem como predominantes. Proteínas que se ligam a DNA (9,23%), proteínas de ligação a RNA (13,85%) e proteínas que se ligam a nucleotídeos (18,46%) correspondem juntas a 41,54% do total de proteínas nucleares reguladas, corroborando o fato de que intensa atividade de transcrição e processamento de DNA e RNA ocorre em todas as etapas de diferenciação, além de outros principais grupos como as peptidases (15,38%), proteínas estruturais (13,85%) e atividade de hidrolases (12,31%). Para proteínas reguladas e envolvidas com complexos proteicos durante a amastigogênese os maiores grupos estão envolvidos em processos de transporte (25,58%), processos metabólicos (19,77%), processos metabólicos de compostos contendo nucleotídeos (16,28%), geração de precursores metabólicos e de energia (8,14%). ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / A feature of Trypanosoma cruzi is the morphological changes that occur during their life cycle. The amastigogenesisis an important process in the life cycle of the parasite where the infective trypomastigotes differentiate into replicative amastigotes. A cell replication is a complex process, where several events are involved, among them the correct segregation of sister chromatids after DNA replication, function performed by a complex called cohesin. In this work we proposed the characterization of T. cruzi protein complexes and the identification of proteins from nuclear complexes, whose expression is altered during amastigogenesis. Through the technique of Blue Native PAGE (BN-PAGE) it was possible the separation of protein complexes from total lysate of T. cruzi epimastigotes. The individual components of the complexes could be visualized after the second dimensional gel after stainingwith silver nitrate. Immunological detection experiments by western blotting demonstrated the absence of SCC1 subunit of cohesin complex in amastigotes generated by in vitro differentiation of trypomastigotes in axenic culture at pH 5.0. However, the subunit SCC1 was detected in protein extracts of amastigotes that were reincubated for 10 hours in a culture medium adjusted at pH 7.5, suggesting that these forms are able to maintain their replicative properties. By LC-MS/MS mass spectrometry, 1,339 proteins ofT.cruzi were identified in samples from mastigogenesis. Of these, 560 proteins were annotated in databases as regulated proteins, 65 have presented nuclear localization and 66 were predicted as belonging to protein complexes. In the classification of proteins involved in nucleic acid metabolism, this group appears to be predominant. Proteins which bind to DNA (9.23%), RNA-binding proteins (13.85%) and proteins that bind nucleotides (18.46%) correspond together to 41.54% of the total regulated nuclear proteins, confirming that strong transcription activity and DNA and RNA processing occur in all stages of differentiation, and other major groups such as peptidases (15.38%), structural proteins (13.85%) and activity of hydrolases (12.31%). For regulated proteins and protein complexes involved in amastigogenesis the largest groups are involved in transport processes (25.58%), metabolic processes (19.77%), metabolic processes of compounds containing nucleotides (16.28%), generation of metabolic precursors and energy (8.14%).
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Subproteômica de Trypanosoma cruzi : proteínas básicas e fosfoproteoma

Magalhães, Adriana Dias January 2010 (has links)
Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, 2010. / Submitted by Jadiana Paiva Dantas (jadi@bce.unb.br) on 2011-06-29T22:14:57Z No. of bitstreams: 1 2010_AdrianaDiasMagalhaes.pdf: 5174613 bytes, checksum: d240e42d60c95e87fc2a87623906127a (MD5) / Approved for entry into archive by Elna Araújo(elna@bce.unb.br) on 2011-07-14T18:59:06Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2010_AdrianaDiasMagalhaes.pdf: 5174613 bytes, checksum: d240e42d60c95e87fc2a87623906127a (MD5) / Made available in DSpace on 2011-07-14T18:59:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2010_AdrianaDiasMagalhaes.pdf: 5174613 bytes, checksum: d240e42d60c95e87fc2a87623906127a (MD5) / O agente etiológico da doença de Chagas é o protozoário flagelado Trypanosoma cruzi. A regulação da expressão gênica em T. cruzi dá-se principalmente ao nível pós-transcricional o que dificulta a correlação direta entre os níveis de mRNA e proteínas e torna atrativa a abordagem proteômica. Estudos teóricos anteriores predisseram uma distribuição bimodal entre as faixas ácidas e básicas de géis bidimensionais virtuais de tripanossomatídeos. Contudo, trabalhos experimentais com T. cruzi tem gerado perfis 2-DE com uma distribuição assimétrica e poucos spots protéicos na região alcalina. Com o objetivo de verificar se as diferenças entre os perfis reais e virtuais eram resultado de limitações técnicas das metodologias atuais de 2-DE em faixas básicas de pH, foram feitas análises proteômicas das formas de vida do T. cruzi utilizando-se condições otimizadas para a faixa de pH 6-11. Assim, os subproteomas alcalinos das formas tripomastigota e epimastigota foram comparados usando-se a metodologia de “gel dois-em-um” (“two-in one gel”) a qual, por minimizar as variações inerentes a 2-DE, facilitou a análise computacional de imagens. Um segundo estudo, concentrou-se na comparação das formas tripomastigota e amastigota, também utilizando uma estratégia de 2-DE-MS. Os resultados revelaram diferenças na expressão de proteínas entre as formas adaptativas do parasito, de acordo com suas características biológicas e corroboraram estudos proteômicos anteriores. Por exemplo, as enzimas relacionadas ao metabolismo de aminoácidos e desidrogenases foram mais abundantes na forma epimastigota, enquanto que trans-sialidases e proteínas paraflagelares foram encontradas especificamente na forma tripomastigota Sabendo-se que o fenômeno de fosforilação/desfosforilação de proteínas está implicado na diferenciação do T. cruzi, procedeu-se o estudo da variação do fosfoproteoma do parasito durante a amastigogênese pela detecção direta das proteínas fosforiladas em géis 2-DE. Assim, verificou-se que várias proteínas apresentaram variação de fosforilação ao longo da amastigogênese, principalmente aquelas associadas ao citoesqueleto, envolvidas no enovelamento protéico e com funções metabólicas. / The etiological agent of Chagas disease is the flagellate protozoan Trypanosoma cruzi. The fact that T. cruzi gene expression regulation occurs mainly at post transcriptional level prevents the direct correlation between mRNA and protein levels, and makes the proteomic approach very attractive. Previous theoretical studies predicted a bimodal distribution among acid and alkaline pH ranges in virtual 2-DE gels of trypanosomatides. On the other hand, 2-DE experiments on T. cruzi have generated assimetric profiles with very few spots on the alkaline region of the gel. Aiming at verifying whether the differences between real and virtual profiles were due to the technical imitations of current 2-DE methodologies in the basic pH range, we carried out proteome analysis of T. cruzi life stages using conditions optimized for the 6-11 pH range. Therefore, trypomastigote and epimastigote alkaline subproteomes were compared using the “two-inone gel” methodology which, by minimizing inherent 2-DE limitations, facilitated computational image analysis. A separate study focused on the comparison between trypomastigote and amastigote life stages also using a 2-DE-MS approach. Overall, the results revealed differences in protein expression between the adaptative forms of the parasite, in agreement with their biological traits, as well as corroborated previous proteomic studies. For instance, enzymes related with aminoacid metabolism and dehydrogenases were more abundant in the epimastigote stages while trans-sialidases and paraflagellar proteins were specifically found in trypomastigote 2-DE profiles. Since phosphorylation/dephosphorylation is implicated in T. cruzi differentiation, we followed variations of T. cruzi phosphoproteome during amastigogenesis through direct phosphoprotein detection in 2-DE gels. Thus, we verified that several proteins presented variation in phosphorylation profiles during amastigogenesis, specially those proteins associated wih cytoskeleton, involved in protein folding and those with metabolic functions.
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Desenvolvimento de linhagens TcI e TcII de Trypanosoma cruzi expressando proteínas fluorescentes para estudo da interação parasito-hospedeiro

Dias, Greicy Brisa Malaquias January 2016 (has links)
Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia e Biociências, Florianópolis, 2016. / Made available in DSpace on 2017-05-23T04:14:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 345764.pdf: 1327591 bytes, checksum: 16526788a991cb47c5948515e0df47a4 (MD5) Previous issue date: 2016 / Surtos de doença de Chagas aguda associados à transmissão pela via oral têm sido reportados no Brasil e em outros países da América do Sul. Contudo, estudos sobre a dinâmica da infecção por via oral ainda são incipientes. O presente trabalho teve por objetivo avaliar a interação in vitro e in vivo de linhagens transfectadas de T. cruzi TcI e TcII com plasmídeos pTREXRFP/GFPNeo e pROCKGFPNeo. Para tanto, foram geradas linhagens da cepa SC25 (TcI) e SC96 (TcII) expressando de maneira estável as proteínas fluorescentes RFPe GFP, respectivamente. A cepa Y expressando GFP foi utilizada em ensaios de interação parasito-hospedeiro. Estudos in vitro mostraram que a transfecção não alterou o crescimento e a capacidade de infecção das cepas. Ensaios de co-infecção em células THP-1 mostraram que misturas de parasitos TcI e TcII em diferentes proporções apresentaram níveis de infecção inferiores aos observados para as cepas em infecções isoladas eque uma mesma célula comporta a infecção pelas duas linhagens de parasitos. Triatomíneos infectados isoladamente com cada uma das cepas transfectadas apresentaram taxa de infecção semelhante. Contrariamente, infecções mistas nos insetos mostraram um predomínio de parasitos da linhagem TcII. Em camundongos a infecção pela via oral da cepa TcI não foi capaz de induzir parasitemia sanguínea detectável nos animais. Por outro lado, a cepa YGFP ocasionou parasitemia sanguínea patente e nas inoculações com misturas de TcI e TcII, apenas parasitos TcII foram detectados no sangue e tecidos de animais infectados. O tratamento de tripomastigotas da cepa SC25RFP com pepsina reduziu significativamente sua capacidade de infecção em células THP-1, sugerindo que a passagem pelo ambiente gástrico pode ter interferido negativamente na infecção de camundongos pela via oral. A avaliação histopatológica mostrou que o processo inflamatório na fase aguda foi mais intenso e com presença de parasitismo apenas no tecido cardíaco para a cepa YGFP. Na fase crônica a inflamação foi reduzida e não foram encontrados parasitos visíveis nos tecidos avaliados. Contudo, a PCR revelou a presença de DNA do parasito em todos os tecidos examinados. Os resultados do presente trabalho sugerem que a dinâmica da co-infecção está mais associada às características das cepas de T. cruzi do que a linhagem genética (DTU) à que elas pertencem. Parasitos transfectados expressando genes repórteres distintos pode ser uma ferramenta útil no estudo da dinâmica de infecção mista.<br> / Abstract : Acute Chagas' disease outbreaks associated with oral transmission have been reported in Brazil and other South American countries. However, oral infection dynamics studies are still incipient. The present work aimed to evaluate the in vitro and in vivo interaction of T. cruzi TcI and TcII transfected strains with plasmids pTREXRFP / GFPNeo and pROCKGFPNeo. Transfected SC25 (TcI) and SC96 (TcII) strains were showed stable RFP and GFP fluorescent proteins expression, respectively. Y strain expressing GFP was used in parasite-host interaction assays. In vitro studies showed that transfection did not afected the strains growth. Co-infection assays in THP-1 cells showed that mixtures of TcI and TcII parasites in different proportions had lower levels of infection than those observed for the isolated strains and that the same cell carries infection by the two strains of parasites. Triatomines infected with each transfected strains showed a similar infection rate. In contrast, mixed infections showed a predominance of TcII lineage parasites in the insect gut. In mice, oral infection with TcI strainwas not able to induce detectable blood parasitemia in the animals. On the other hand, the YGFP strain caused patent blood parasitemia and in mixed infections only TcII parasites were detected in blood and tissues of infected mice. Treatment of trypomastigotes of the SC25RFP strain with pepsin significantly reduced their ability to infect THP-1 cells, suggesting that passage through the gastric environment may have interfered with the parasite capacity to infect mice by oral route. The histopathological evaluation showed that inflammatory process was more intense in the acute phase and YGFP parasites were detected only in heart. In the chronic phase inflammation was reduced and no visible parasites were found in the evaluatedt issues. However, PCR revealed parasite DNA in all examined tissues. The present work suggest that co-infection dynamics is more associated with the T. cruzi strain characteristics than the genetic lineage (DTU) to which they belong. Transfected parasites expressing different reporter genes may be a useful tool for the study of mixed infection dynamic.
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Caracterização do complexo coesina de Trypanosoma cruzi

Ferreira, Renata Cristina Grangeiro 23 March 2011 (has links)
Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2011. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2011-05-23T14:35:35Z No. of bitstreams: 1 2011_RenataCristinaGrangeiroFerreira.pdf: 1966745 bytes, checksum: 185e5f2e728e61263180862a14d96500 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(tempestade_b@hotmail.com) on 2011-05-24T12:22:19Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2011_RenataCristinaGrangeiroFerreira.pdf: 1966745 bytes, checksum: 185e5f2e728e61263180862a14d96500 (MD5) / Made available in DSpace on 2011-05-24T12:22:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2011_RenataCristinaGrangeiroFerreira.pdf: 1966745 bytes, checksum: 185e5f2e728e61263180862a14d96500 (MD5) / A segregação das cromátides irmãs para os pólos opostos da célula durante a divisão celular é um evento complexo durante o ciclo de vida de uma célula eucariótica. Tanto na mitose quanto na meiose a coesão entre as cromátides irmãs é essencial para que ocorra a correta segregação cromossomal, evento sob a responsabilidade do complexo protéico chamado Coesina. Este complexo é melhor conhecido em leveduras e mamíferos, sendo formado por duas proteínas SMC (proteínas de manutenção estrutural dos cromossomos), SMC1 e SMC3, e duas proteínas SCC (proteínas de coesão das cromátides irmãs), a SCC1 (também conhecida como Mcd1 ou Rad21) e SCC3 (SA1 e SA2 em células de mamíferos). A coesina mantém as cromátides irmãs unidas a partir da fase S do ciclo celular e essa coesão é mantida até a transição entre a metáfase e a anáfase, quando as cromátides irmãs se separam para os pólos opostos da célula. Existem poucos estudos sobre a coesina em tripanossomatídeos e o projeto genoma mostrou a presença dos genes para todas as subunidades da Coesina em Trypanosoma cruzi, Trypanosoma brucei e a Leishmania major. Neste trabalho nós propusemos a análise da expressão e a imunocitolocalização das subunidades do complexo Coesina em T. cruzi. Anticorpo contra a subunidade TcSCC1 produzido em coelho foi utilizado em ensaios de western blot e imunofluorescência em microscopia confocal, para as formas amastigotas, epimastigotas e tripomastigotas de T. cruzi. Tais análises indicam uma maior detecção da proteína TcSCC1 na forma amastigotas de T. cruzi, apresentando variações no padrão da localização nuclear. Nas formas epimastigotas um sinal fraco foi detectado e nas formas tripomastigotas não houve sinalização. Estes resultados sugerem a presença da proteína TcSCC1 do complexo coesina principalmente no núcleo das formas amastigotas de T. cruzi. Os níveis de expressão dos genes para as quatro subunidades da coesina foram analisados por RT-PCR em tempo real nas três formas do T. cruzi e verificamos poucas diferenças entre estes níveis, o que sugere um controle pós-transcricional na expressão da SCC1 em T. cruzi. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / The segregation of sister chromatids to opposite poles of the cell during division is the most complex and, at the same time, the most important event during the life cycle of a eukaryotic cell. Both in mitosis and meiosis cohesion between sister chromatids is essential for the occurrence of the correct chromosomal segregation. The protein complex responsible for cohesion between chromatids is called Cohesin. The Cohesin complex is well known in yeast and mammals, consisting of two SMC (structural maintenance of chromosomes) proteins, SMC1 and SMC3, and two proteins SCC (sister chromatid cohesion) proteins, the SCC1 and SCC3 (SA1 and SA2 in mammalian cells). The Cohesin keeps sister chromatids together from S phase until the transition between metaphase and anaphase in cell cycle, when sister chromatids separate to the opposite poles of the cell. In trypanosomatids, there are few studies about this complex and the genome project revealed the presence of all Cohesin complex genes in Trypanosoma cruzi, Trypanosoma brucei and Leishmania major. In this work we proposed the analysis of the expression of the Cohesin subunits and its imunocytolocalization in T. cruzi cells. An antibody anti-TcSCC1 produced in rabbit, was used in western blots and immunofluorescence confocal microscopy analyses of amastigote, epimastigote and trypomastigote forms of T. cruzi. These analyses indicate that the TcSCC1 protein is detected mainly in the amastigote forms with distinct pattern of nucleus localization. Epimastigote form presented a weak signal for the anti-SCC1 antibody and trypomastigote form presented no signal. These results suggest that the SCC1 subunit of the Cohesin complex is present in T. cruzi and it is mainly evident in the nucleus of amastigote form of this parasite. The expression levels of each subunit of the Cohesin complex were analyzed by real time RT-PCR assays in the three forms of T. cruzi and it was found few differences between these levels, suggesting a post-transcriptional control in the SCC1 expression in T. cruzi.
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Análise filogenética e funcional das proteínas RBP7 e RBP40 em tripanossomatídeos

Slompo, Eloise Pavão Guerra January 2014 (has links)
Orientador : Prof. Dr. Bruno Dallagiovanna / Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular. Defesa: Curitiba, 30/07/2014 / Inclui referências : f. 105-111 / Resumo: Os organismos estão constantemente em modificação. Seja em resposta a pressões do ambiente, seja por eventos estocásticos, as modificações podem ser momentâneas ou hereditárias. Modificações momentâneas são desempenhadas pela regulação da expressão gênica, enquanto as hereditárias são os eventos evolutivos. A junção destas duas respostas biológicas, a evolução das redes regulatórias da expressão gênica, ainda é uma questão em aberto na biologia. O parasita unicelular Trypanosoma cruzi, além de sua importância médica, constitui um organismo modelo para o estudo da regulação pós-transcricional da expressão gênica. Devido à sua ramificação precoce na árvore filogenética dos seres vivos, é também um modelo no estudo da biologia evolutiva. Uma de suas RBPs (proteína de união ao RNA), a proteína regulatória TcRBP40, foi caracterizada em um estudo anterior. No atual trabalho foi determinada a sua localização celular: os reservossomos do parasita, estrutura anteriormente conhecida como de armazenamento nutricional. A presença desta proteína regulatória nesta organela, juntamente com outras proposições recentes, indica funções adicionais dos reservossomos para a biologia do parasita. Uma análise filogenética mostrou que o gene codificante da TcRBP40 originou-se junto com o gene da TcRBP7 a partir da duplicação de um gene ancestral, assim como seus homólogos em T. brucei (TbRBP7A e B). De acordo com a filogenia, os eventos de duplicação destes genes nestes organismos ocorreram de modo independente, após a divergência das duas espécies, e que estão acumulando mutações de modo assimétrico. As estruturas das proteínas foram preditas por modelagem por homologia e comparadas, sendo identificados os sítios divergentes. As proteínas TcRBP7 e TbRBP7A conservam maior semelhança, enquanto TcRBP40 é a mais divergente do grupo. Os alvos das proteínas TcRBP7 e TcRBP40 foram determinados por ribonômica in vivo e sequenciamento de nova geração, mostrando que menos de 10% são alvos em comum entre elas. Isso indica que estas RBPs de T. cruzi, apesar de conservarem 72% de identidade, regulam redes distintas de genes e portanto desempenham funções biológicas diferentes. Futuras análises poderão responder como as novas redes regulatórias surgem nos organismos, e como evoluem para desempenhar papéis distintos na biologia dos organismos. / Abstract: Organisms are constantly changing. In response to environmental pressures, or for stochastic reasons, those changes might be transient or inheritable. Transient changes are played by gene expression regulation, while inheritable ones consists on evolutionary events. The joining of both biological responses, which accounts for the gene expression regulatory networks evolution, is still an open question in biology. The unicellular parasite Trypanosoma cruzi, beyond its medical importance, is a model organism for posttranscriptional gene expression regulation studies. Due to its early-branching in the tree of life phylogeny, it is also a model for the study of evolution biology. One of its RBPs (RNA binding proteins), the regulatory protein TcRBP40, was characterized on a previous study. In this current work, its cellular location was determined: the parasite's reservosomes, previously known as a nutritional storage compartment. The presence of this regulatory protein inside this organelle, altogether with other recent propositions, indicates additional regulatory functions performed by reservosomes in the parasite's biology. A phylogenetic analysis revealed that TcRBP40 coding gene arose with TcRBP7 from the duplication of an ancestral gene, just as its T. brucei homologs (TbRBP7A and B). According to this phylogeny, the duplication events of these genes on those organisms occurred independently, after species divergency, and they are asymmetrically accumulating mutations. Protein structures were predicted by homology modeling and compared, identifying the divergent sites. The proteins TcRBP7 and TbRBP7A share the higher similarity, and TcRBP40 is the most divergent in this group. TcRBP7 and TcRBP40 targets were determined by in vivo ribonomics and next generation sequencing, showing less than 10% of overlap. This indicates that these T. cruzi RBPs, even though they conserve 72% identity, they regulate distinct gene networks and so play different biological roles. Other analysis may answer how the new regulatory gene networks arise in organisms, and how they evolve to play distinct roles in organisms' biology.
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Clonagem e expressão da Oligopeptidase Bsímile, da X-Prolil dipeptidil aminopeptidase e da Glutationa sintetase de Trypanosoma cruzi

Almeida, Keyla Caroline de January 2009 (has links)
Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, 2009. / Submitted by Elna Araújo (elna@bce.unb.br) on 2010-04-01T20:30:22Z No. of bitstreams: 1 2009_KeylaCarolinedeAlmeida.pdf: 3384486 bytes, checksum: 4504fcf88294c8a5ba06876f2bd4ccda (MD5) / Approved for entry into archive by Daniel Ribeiro(daniel@bce.unb.br) on 2010-05-06T19:01:10Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2009_KeylaCarolinedeAlmeida.pdf: 3384486 bytes, checksum: 4504fcf88294c8a5ba06876f2bd4ccda (MD5) / Made available in DSpace on 2010-05-06T19:01:10Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2009_KeylaCarolinedeAlmeida.pdf: 3384486 bytes, checksum: 4504fcf88294c8a5ba06876f2bd4ccda (MD5) Previous issue date: 2009 / Após um século da descoberta da Doença de Chagas, ainda não existe medicamento efetivo para o seu tratamento, e os chagásicos continuam sucumbindo às manifestações crônicas dessa grave enfermidade. A possibilidade de descobrir uma enzima ou uma via metabólica crucial para o ciclo de vida do parasita não se resume apenas à satisfação da curiosidade humana, mas também é fundamental para o desenvolvimento de fármacos que sirvam para combater as mais diferentes doenças, entre elas, a Doença de Chagas. Essa dissertação de mestrado descreve o estudo de três proteínas de Trypanosoma cruzi: duas proteases classificadas como serino-protease com domínio α/β hidrolase, pertencente ao clan SC e família S9 e S15, respectivamente - Oligopeptidase B símile (OPBsTc) e X-prolil dipeptidil aminopeptidase (X-PDAPTc) e uma proteína da via metabólica redox - a Glutationa sintetase (GSTc). A OPBsTc é uma enzima putativa de 903 aminoácidos com massa molecular esperada de 103,4 kDa sendo altamente conservada entre os cinetoplastídeos e ausente em humanos. A proteína recombinante foi expressa em E. coli BL21 Star (DE3) One Shot e purificada da fração insolúvel para produção de anticorpos em camundongo. Os soros foram utilizados em técnicas de Immunoblotting e imunocitolocalização na tentativa de confirmar a expressão da protease. Infelizmente, não foi possível confirmar a expressão da OPBsTc em nenhuma das três formas do parasita: epimastigota, tripomastigota e amastigosta. Também realizamos uma RT-PCR a partir do RNA da forma epimastigota, mas o resultado foi negativo. A segunda protease foi a X-PDAPTc, esta serino-protease é largamente estudada em Lactococcus lactis e parece ser um fator de virulência em Streptococci. Análises em bancos de dados mostraram que a distribuição da X-PDAPTc é restrita e não apresenta ortólogos em mamífero, além disso, a enzima tem 677 aminoácidos com massa molecular esperada de 76,8 kDa. A enzima foi produzida em E. coli BL21 Star (DE3) One Shot e purificada da fração insolúvel para produção de anticorpos em camundongo. X-PDAPTc é expressa na forma epimatigosta do parasito. A GSTc tem importante participação na biossíntese da glutationa para manutenção do ambiente redox no parasito. Em relação ao seu ortólogo em humanos, foi observada homologia reduzida, o que pode torná-la um alvo promissor para desenvolvimento de drogas, assim como as duas proteases citadas acima. Essa enzima tem 535 resíduos de aminoácidos e massa molecular predita de 58,6 kDa. A GSTc foi expressa e utilizada para testes de imunização. / After a century of the discovery of Chagas’ disease, there is still no effective medicine for its treatment, and patients still succumb to severe manifestations of the chronic disease. The possibility of discovering an enzyme or metabolic pathway crucial to the parasite life cycle is not only to satisfy the human curiosity, but it is also fundamental to the development of drugs used to combat many different diseases, including Chagas’ disease. This master's thesis describes the study of three proteins of Trypanosoma cruzi: two proteases classified as serine-protease with α / β hydrolase domain that belong to SC clan and family S9 and S15, respectively - Oligopeptidase B like (OPBsTc) and X-prolil dipeptidil aminopeptidase (X-PDAPTc) and a redox metabolic pathway enzyme - Glutathione synthetase (GSTc). The OPBsTc is a putative enzyme of 903 amino acids and molecular mass of 103.4 kDa. It is highly conserved among kinetoplastids and it is absent in humans. The recombinant protein was expressed in E. coli BL21 Star (DE3) One Shot and purified from the insoluble fraction for production of antibodies in mice. The sera were used in immunoblotting and immunocytology techniques in an attempt to confirm the expression of the protease. Unfortunately, we could not confirm the expression of OPBsTc in any of the three forms of the parasite: epimastigote, trypomastigote and amastigoste. We also performed a RT-PCR from total epimastigote RNA, but the result was negative. The second protease was X-PDAPTc, this serine-protease is extensively studied in Lactococcus lactis and it seems to be a factor of virulence in Streptococci. Analysis in databases showed that the distribution of X-PDAPTc is limited and it does not have any orthologs in mammalian. In addition, the enzyme has 677 amino acids with molecular mass of 76.8 kDa. The enzyme was produced in E. coli BL21 Star (DE3) One Shot and purified from the insoluble fraction for production of antibodies in mice. X-PDAPTc is expressed in the epimastigote form of the parasite. The GSTc has an important participation in the biosynthesis of glutathione in order to maintain redox environment of the parasite. The human ortholog shows low homology which may make it a promising target for drug development like the two proteases mentioned above. This enzyme has 535 amino acid residues and a predicted molecular mass of 58.6 kDa. The GSTc was expressed and used for immunization tests.

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