Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2008. / Submitted by Raquel Viana (tempestade_b@hotmail.com) on 2009-12-07T19:17:51Z No. of bitstreams: 1 2008_AndrelisseArruda.pdf: 4614269 bytes, checksum: f2e92575abbb605a32f9b7f74d9d7e17 (MD5) / Approved for entry into archive by Lucila Saraiva(lucilasaraiva1@gmail.com) on 2009-12-08T02:11:28Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2008_AndrelisseArruda.pdf: 4614269 bytes, checksum: f2e92575abbb605a32f9b7f74d9d7e17 (MD5) / Made available in DSpace on 2009-12-08T02:11:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2008_AndrelisseArruda.pdf: 4614269 bytes, checksum: f2e92575abbb605a32f9b7f74d9d7e17 (MD5) Previous issue date: 2008 / A levedura metilotrófica Pichia pastoris tem sido utilizada com sucesso para a expressão de várias proteínas heterólogas sendo que diversos vetores já foram desenvolvidos para este sistema. Os principais vetores de expressão de P. pastoris são baseados no promotor do gene AOX1 que codifica a enzima álcool oxidase 1. Alguns estudos têm sido realizados para o uso de promotores alternativos uma vez que o sistema AOX1 apresenta algumas desvantagens. Em nosso laboratório foi isolado e caracterizado o promotor do gene PGK1 de P. pastoris (PPGK1), um promotor forte e constitutivo, que representa uma alternativa promissora para a construção de novos vetores. O objetivo deste estudo foi determinar a região promotora mínima do PPGK1 por meio de deleções controladas utilizando o gene da α-amilase de Bacillus subtilis como gene repórter. Quatro deleções foram obtidas sendo que a menor (PPGKΔ3), com ~400 pb, ainda manteve atividade promotora. Foi demonstrado que esta seqüência é capaz de dirigir a integração de um vetor no genoma de P. pastoris e 51% dos clones transformantes tiveram mais de uma cópia integrada. O uso deste promotor propiciou a expressão heteróloga de α-amilase em altos níveis (250 U.mL-1). Também foram construídos vetores para expressão intracelular baseados no promotor PGK que, todavia, ainda necessitam ser aprimorados para uso em P. pastoris. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT / The methylotrophic yeast Pichia pastoris has been successfully used for the expression of heterologous proteins and several different expression vectors have been developed for this system. The main expression vectors for P. pastoris are based on the alcohol oxidase 1 gene promoter, AOX1. Some studies have been carried out aiming at the use of alternative promoters once the AOX1 system shows some disadvantages. Our laboratory has isolated and characterized the P. pastoris promoter from the PGK1 gene (PPGK1), a strong and constitutive promoter, which represents a promising alternative for the construction of new vectors. The aim of this study was to determine the minimal promoter sequences from PPGK1 through controlled deletions using the α-amylase gene from Bacillus subtilis as a reporter gene. Four deletions were obtained and the smallest (PPGK Δ3) with ~ 400 bp, still maintained promoter activity. We have demonstrated that this sequence was able to direct vector integration into the P. pastoris genome and 51% of the transformants showed more than one copy integrated. The use of this promoter allowed high level expression of α-amylase (250 UmL-1). Also, vectors for intracellular expression were based on the PGK promoter were also constructed which however still need to be improved for use in P. pastoris.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Departamento de Biologia Celular, 2010. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2011-04-27T13:27:34Z No. of bitstreams: 1 2010_VirginiaCarlaOliveira.pdf: 3994060 bytes, checksum: 2373a695593bfae3169b82c49fdbf49b (MD5) / Approved for entry into archive by Luanna Maia(luanna@bce.unb.br) on 2011-04-29T14:53:28Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2010_VirginiaCarlaOliveira.pdf: 3994060 bytes, checksum: 2373a695593bfae3169b82c49fdbf49b (MD5) / Made available in DSpace on 2011-04-29T14:53:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2010_VirginiaCarlaOliveira.pdf: 3994060 bytes, checksum: 2373a695593bfae3169b82c49fdbf49b (MD5) / O silenciamento gênico, ou RNA de interferência (RNAi), atua como um mecanismo de defesa contra infecções virais em organismos eucarióticos. Ao longo da evolução, os vírus adquiriram proteínas específicas com a capacidade de suprimir o silenciamento de RNA em diferentes pontos do processo. Como por exemplo, as proteínas AC2 de begomovírus, NS1 do vírus da gripe (Influenza A) e NSs de um tospovírus (Tomato spotted wilt virus - TSWV). Neste estudo, pretendeu-se induzir mecanismos de supressão de silenciamento gênico através da expressão heteróloga de AC2, NS1 e NSs por baculovírus AcMNPV – Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus, a fim de analisar o efeito na replicação viral em diferentes células de inseto. Assim, no primeiro capítulo, foi feita uma revisão sobre o silenciamento gênico, a ação de proteínas virais supressoras de RNAi e o uso potencial de baculovírus recombinantes como agentes bioinseticidas melhorados. O segundo capítulo descreve a clonagem dos genes AC2, NS1 e NSs, a construção dos baculovírus recombinantes (vAcAC2, vAcNS1 e vAcNSs) e os ensaios preliminares de infecção em célula e em larvas de inseto. Nesses ensaios, o vAcNSs (contendo o gene NSs) foi o recombinante com maior influência na replicação do baculovírus selvagem AcMNPV. Por sua vez, o terceiro capítulo relata a ação da proteína supressora de silenciamento NSs de TSWV, expressa pelo baculovírus vAcNSs, em três linhagens hospedeiras: uma permissiva, derivada de Trichoplusia ni (BTI-Tn-5B1-4); outra semipermissiva, derivada de Anticarsia gemmatalis (UFL-AG-286); e, uma linhagem não-permissiva, derivada de Bombyx mori (BM-5). Os resultados mostraram que vAcNSs, em células semipermissivas, obteve maior eficiência na replicação quando comparado ao selvagem, pois produziu mais vírus extracelulares; em uma linhagem celular não-permissiva, causou efeito citopático, enquanto a infecção com o tipo selvagem AcMNPV não provocou nenhuma alteração morfológica; aumentou a produção de poliedros do baculovírus tipo selvagem em todas as linhagens de células testadas; aumentou fortemente a expressão da proteína fluorescente verde (EGFP) nas células semipermissivas e em hemócitos de A. gemmatalis quando co-infectado com um AcMNPV recombinante contendo o gene egfp. A análise de microscopia confocal revelou que a NSs acumulou em abundância no citoplasma de células permissivas e semipermissivas. Em contraste, a NSs foi detectada no núcleo da célula não-permissiva. A ausência de moléculas curtas de RNA (siRNA) de transcritos de egfp em linhagens semipermissivas e permissivas indica atividade de supressão do silenciamento gênico. Por outro lado, vAcNSs não suprimiu o RNAi na linhagem celular nãopermissiva. Por fim, o quarto capítulo investiga a ação bioinseticida do baculovírus vAcNSs em larvas de Spodoptera frugiperda e Anticarsia gemmatalis - um hospedeiro permissivo e outro semi-permissivo, respectivamente. Não houve diferença estatisticamente significativa entre a DL50 do vAcNSs para S. frugiperda e A. gemmatalis, quando comparada à DL50 observada para o tipo selvagem AcMNPV. Entretanto, o TL50 foi significativamente diferente, com valores menores para vAcNSs em S. frugiperda [5,62 dias com 1 p.f.u. e 4,82 dias com 105 p.f.u.] e em A. gemmatalis [7,46 dias com 1 p.f.u. e 3,2 dias com 105 p.f.u.] quando em comparação com o TL50 do AcMNPV em S. frugiperda [8,5 dias com 1 p.f.u. e 7,52 dias com 105 p.f.u.] e em A. gemmatalis [20,11 dias com 1 p.f.u. e 7,34 dias com 105 p.f.u.]. Estes resultados corroboram os dados observados in vitro, indicando que a proteína NSs de TSWV aumenta a replicação do baculovírus e pode contribuir para gerar bioinseticidas mais eficientes. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Gene silencing, or RNA interference (RNAi), works as a eukaryotic defense mechanism against viral infections. During evolutionary time viruses acquired specific proteins, which are able to halt the silencing process in different steps of its biochemical pathway e.g. the AC2 protein from Begomovirus, the NS1 protein from influenza (Influenza A) and the NSs protein from Tomato spotted wilt virus (TSWV). In this study we sought generation and evaluation of the gene-silencing suppression effect of three different genes, AC2 from begomovirus, NS1 from Influenza A and NSs from TSWV, via heterologous expression by recombinant Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus (AcMNPV, genus Alphabaculovirus, family Baculoviridae) in different insect cell lines. In the first chapter, a review concerning gene silencing, suppression of gene silencing by viral proteins and the potential use of recombinant baculovirus as bio-insecticidal agents suitable for biological control is presented. The second chapter describes the cloning strategies designed for the construction of recombinant baculoviruses carrying the AC2, NS1 and NSs genes (vAcAC2, vAcNS1 and vAcNSs, respectively) as well as the results of preliminary insect cell infection assays. In these preliminary assays, vAcNSs had more influence on wild type AcMNPV replication than vAcAC2 and vAcNS1. The third chapter shows the effect of the protein NSs from TSWV on virus replication in different host insect cell lines: one permissive, Trichoplusia ni (BTI-Tn-5B1-4); other semi-permissive, Anticarsia gemmatalis (UFL-AG-286); and a non-permissive cell line, Bombyx mori (BM-5). Results showed that infection of the semi-permissive cell line by vAcNSs was more efficient than infection by wild type AcMNPV, since production of budded virus was higher. In the non-permissive cell line, vAcNSs was able to produce cytopathic effects whereas no morphological alteration was found when wild type AcMNPV was inoculated. When vAcNSs and wild type AcMNPV were co-inoculated, production of polyhedra was enhanced despite the insect cell line used. Co-infection of vAcNSs and a recombinant AcMNPV carrying the egfp gene was also evaluated. In the semi-permissive cell line and in A. gemmatalis hemocytes (permissive cell line) co-infection greatly increased enhanced green fluorescent protein (EGFP) expression. Northern blotting assays showed absence of small interfering RNA (siRNA) molecules associated to egfp transcripts in the permissive and semi-permissive cell lines, which indicates suppression of gene silencing activity by the NSs protein. On the other hand, vAcNSs was not able to suppress the siRNA production in the non-permissive cell line. Confocal microscopy analysis showed that the NSs protein accumulated abundantly in the cytoplasm of permissive and semipermissive infected cells. In contrast, high amounts of NSs were detected in the nuclei of nonpermissive cells. Finally, chapter four presents the study of the bio-insecticidal activity of vAcNSs on Spodoptera frugiperda and Anticarsia gemmatalis larvae, a permissive and semipermissive host, respectively. The vAcNSs LD50 for S. frugiperda and A. gemmatalis was not statistically different from wild-type AcMNPV. However, the LT50 values were significantly smaller for vAcNSs in S. frugiperda [5.62 days with 1 p.f.u. and 4.82 days with 105 p.f.u.] and A. gemmatalis [7.46 days with 1 p.f.u. and 3.20 days with 105 p.f.u.) when compared to the LT50 for AcMNPV in S. frugiperda [8.5 days with 1 p.f.u. and 7.52 days with 105 p.f.u.] and A. gemmatalis [20.11 days with 1 p.f.u. and 7.34 days with 105 p.f.u.]. These in vivo results are in accordance with the data observed in vitro indicating that the protein NSs from TSWV could efficiently improve baculovirus replication and be used to generate more effective bioinsecticides.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde, 2011. / Submitted by Max Lee da Silva (bruce1415@hotmail.com) on 2011-06-27T20:11:44Z No. of bitstreams: 1 2011_ThaísAlmeidaPereira.pdf: 676317 bytes, checksum: 27de971481e3dde2a4e41661e4d03e41 (MD5) / Approved for entry into archive by Guilherme Lourenço Machado(gui.admin@gmail.com) on 2011-06-28T12:41:37Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2011_ThaísAlmeidaPereira.pdf: 676317 bytes, checksum: 27de971481e3dde2a4e41661e4d03e41 (MD5) / Made available in DSpace on 2011-06-28T12:41:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2011_ThaísAlmeidaPereira.pdf: 676317 bytes, checksum: 27de971481e3dde2a4e41661e4d03e41 (MD5) / Biomoléculas são cada vez mais utilizadas em medicamentos e cosméticos e, principalmente aquelas destinadas a tratamentos dermatológicos, são, com freqüência, preparadas em farmácias magistrais. A capacidade de neutralização de conservantes por parte de proteínas e tensoativos não iônicos é bem conhecida, e a utilização desses dois componentes numa mesma formulação gera uma preocupação com relação à conservação desse tipo de produto farmacêutico, que, uma vez mal conservado, poderia gerar riscos à saúde de seus consumidores. Assim, o objetivo deste trabalho foi avaliar a eficácia de um sistema conservante composto por metilparabeno, propilparabeno e imidazolidinil uréia, de uma formulação base que continha um tensoativo não iônico e desta mesma formulação adicionada de diferentes biomoléculas farmacêuticas, além de realizar estudos de adaptação microbiana frente ao sistema conservante utilizado nas formulações que continham estas biomoléculas. Os resultados obtidos mostraram que a qualidade microbiológica, tanto das matérias-primas quanto das formulações testadas , está de acordo com os limites aceitos em compêndios oficiais. Os testes de avaliação da eficácia do sistema conservante mostraram que a formulação base está adequadamente conservada, mas que a presença das biomoléculas farmacêuticas estudadas na formulação, numa concentração de 3% (p/p) pode provocar modificações no comportamento do sistema conservante frente a alguns dos microrganismos testados. O ensaio de adaptação microbiana revelou que há uma tendência à adaptação ao sistema conservante por parte da maioria dos microrganismos testados quando estão presentes no meio de cultura o tensoativo não iônico e um dos ativos cosméticos estudados. A avaliação da concentração inibitória mínima sugere que as concentrações de sistema conservante utilizadas nas formulações testadas são eficazes, pois a concentração necessária à inibição de crescimento para os diferentes microrganismos padrões foi inferior ou igual à concentração utilizada nas formulações testadas. No entanto, a exposição dos microrganismos às biomoléculas farmacêuticas e ao tensoativo não iônico em concentrações crescentes, no teste de adaptação microbiana, produziu cepas de microrganismos cuja inibição necessitou de maiores concentrações dos conservantes, em alguns casos acima da concentração normalmente utilizada nas formulações. _________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Biomolecules have been progressively more used in medicines and cosmetics, and especially those aimed at dermatological treatments are often prepared in magistral pharmacies. The neutralizing ability of preservatives by nonionic surfactants and proteins is well known, and use of both these ingredients into the same formulation raises a concern regarding the conservation of this kind of pharmaceutical product which, once poorly preserved, could generate health risks for the consumers. Thus, the purpose of this study was to evaluate the effectiveness of a preservative system consisting of methylparaben, propylparaben and imidazolidinyl urea, in a basic formulation containing a nonionic surfactant and in this same formulation added with different pharmaceutical biomolecules. Furthermore, it had the intention to study the possibility of microbial adaptation to the preservative system when in presence of the studied biomolecules and nonionic surfactant. The results showed that the microbiological quality of both raw materials and the formulations tested complies with the limits accepted in literature. Evaluation of the preservative system effectiveness showed that the basic formulation is properly preserved, but the presence of studied biomolecules in the pharmaceutical formulation at a concentration of 3% (w/w) can promote changes in the behavior of the preservative system against some of the microorganisms tested. The microbial adaptation assay revealed that the majority of the microorganisms had a tendency to adapt to the preservative system when the nonionic surfactant and one of the tested cosmetic ingredients were present in the culture medium. Evaluation of minimum inhibitory concentration suggests that concentrations of the preservative system used in the formulations tested are effective, since the concentration needed to inhibit the different standard-microorganisms growth was lower than or equal to the preservative system concentration used in the formulations tested. However, exposure of microorganisms to pharmaceutical biomolecules and nonionic surfactant in increasing concentrations, situation acquired in microbial adaptation assay, produced strains of microorganisms whose inhibition required higher concentrations of the preservative system, in some cases above the concentration normally used in used formulations.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde, 2011. / Submitted by Shayane Marques Zica (marquacizh@uol.com.br) on 2011-10-10T17:54:14Z No. of bitstreams: 1 2011_ThaisAlmeidaPereira.pdf: 674619 bytes, checksum: 26115a1b99ec452decca105c27600c5a (MD5) / Approved for entry into archive by Camila Mendes(camila@bce.unb.br) on 2011-10-11T17:46:36Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2011_ThaisAlmeidaPereira.pdf: 674619 bytes, checksum: 26115a1b99ec452decca105c27600c5a (MD5) / Made available in DSpace on 2011-10-11T17:46:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2011_ThaisAlmeidaPereira.pdf: 674619 bytes, checksum: 26115a1b99ec452decca105c27600c5a (MD5) / Biomoléculas são cada vez mais utilizadas em medicamentos e cosméticos e, principalmente aquelas destinadas a tratamentos dermatológicos, são, com freqüência, preparadas em farmácias magistrais. A capacidade de neutralização de conservantes por parte de proteínas e tensoativos não iônicos é bem conhecida, e a utilização desses dois componentes numa mesma formulação gera uma preocupação com relação à conservação desse tipo de produto farmacêutico, que, uma vez mal conservado, poderia gerar riscos à saúde de seus consumidores. Assim, o objetivo deste trabalho foi avaliar a eficácia de um sistema conservante composto por metilparabeno, propilparabeno e imidazolidinil uréia, de uma formulação base que continha um tensoativo não iônico e desta mesma formulação adicionada de diferentes biomoléculas farmacêuticas, além de realizar estudos de adaptação microbiana frente ao sistema conservante utilizado nas formulações que continham estas biomoléculas. Os resultados obtidos mostraram que a qualidade microbiológica, tanto das matérias-primas quanto das formulações testadas , está de acordo com os limites aceitos em compêndios oficiais. Os testes de avaliação da eficácia do sistema conservante mostraram que a formulação base está adequadamente conservada, mas que a presença das biomoléculas farmacêuticas estudadas na formulação, numa concentração de 3% (p/p) pode provocar modificações no comportamento do sistema conservante frente a alguns dos microrganismos testados. O ensaio de adaptação microbiana revelou que há uma tendência à adaptação ao sistema conservante por parte da maioria dos microrganismos testados quando estão presentes no meio de cultura o tensoativo não iônico e um dos ativos cosméticos estudados. A avaliação da concentração inibitória mínima sugere que as concentrações de sistema conservante utilizadas nas formulações testadas são eficazes, pois a concentração necessária à inibição de crescimento para os diferentes microrganismos padrões foi inferior ou igual à concentração utilizada nas formulações testadas. No entanto, a exposição dos microrganismos às biomoléculas farmacêuticas e ao tensoativo não iônico em concentrações crescentes, no teste de adaptação microbiana, produziu cepas de microrganismos cuja inibição necessitou de maiores concentrações dos conservantes, em alguns casos acima da concentração normalmente utilizada nas formulações. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Biomolecules have been progressively more used in medicines and cosmetics, and especially those aimed at dermatological treatments are often prepared in magistral pharmacies. The neutralizing ability of preservatives by nonionic surfactants and proteins is well known, and use of both these ingredients into the same formulation raises a concern regarding the conservation of this kind of pharmaceutical product which, once poorly preserved, could generate health risks for the consumers. Thus, the purpose of this study was to evaluate the effectiveness of a preservative system consisting of methylparaben, propylparaben and imidazolidinyl urea, in a basic formulation containing a nonionic surfactant and in this same formulation added with different pharmaceutical biomolecules. Furthermore, it had the intention to study the possibility of microbial adaptation to the preservative system when in presence of the studied biomolecules and nonionic surfactant. The results showed that the microbiological quality of both raw materials and the formulations tested complies with the limits accepted in literature. Evaluation of the preservative system effectiveness showed that the basic formulation is properly preserved, but the presence of studied biomolecules in the pharmaceutical formulation at a concentration of 3% (w/w) can promote changes in the behavior of the preservative system against some of the microorganisms tested. The microbial adaptation assay revealed that the majority of the microorganisms had a tendency to adapt to the preservative system when the nonionic surfactant and one of the tested cosmetic ingredients were present in the culture medium. Evaluation of minimum inhibitory concentration suggests that concentrations of the preservative system used in the formulations tested are effective, since the concentration needed to inhibit the different standard-microorganisms growth was lower than or equal to the preservative system concentration used in the formulations tested. However, exposure of microorganisms to pharmaceutical biomolecules and nonionic surfactant in increasing concentrations, situation acquired in microbial adaptation assay, produced strains of microorganisms whose inhibition required higher concentrations of the preservative system, in some cases above the concentration normally used in used formulations.

Dissertação (Mestrado em Biologia Molecular)-Universidade de Brasília, Brasília, 2010. / Submitted by Jaqueline Ferreira de Souza (jaquefs.braz@gmail.com) on 2011-04-16T23:09:11Z No. of bitstreams: 1 2010_AdrieneAlvesdeOliveira.pdf: 669257 bytes, checksum: caccf186a24fa4e80ddf59c3ade9eccc (MD5) / Approved for entry into archive by Jaqueline Ferreira de Souza(jaquefs.braz@gmail.com) on 2011-04-16T23:10:20Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2010_AdrieneAlvesdeOliveira.pdf: 669257 bytes, checksum: caccf186a24fa4e80ddf59c3ade9eccc (MD5) / Made available in DSpace on 2011-04-16T23:10:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2010_AdrieneAlvesdeOliveira.pdf: 669257 bytes, checksum: caccf186a24fa4e80ddf59c3ade9eccc (MD5) / Paracoccidioidomicose (PCM) é uma micose sistêmica humana causada por espécies do fungo termo-dimórfico Paracoccidioides. Até há pouco tempo, apenas a espécie P. brasiliensis era reconhecida dentro deste gênero, mas recentemente foi identificada a espécie P. lutzii, filogeneticamente distante da anterior. A infecção é adquirida provavelmente pela inalação de propágulos transportados pelo ar derivados da forma miceliana do fungo e que se alojam principalmente nos pulmões. Vários estudos sugerem que o parasitismo intracelular do fungo seja importante na colonização do hospedeiro e na disseminação da doença. Para avaliar essa hipótese foi analisado comparativamente o perfil transcricional de Paracoccidioides - P. brasiliensis (Pb18) e P. lutzii (Pb01) recuperados do interior de pneumócitos humanos em cultura (A549) durante uma cinética de interação. Para tanto foi utilizada a técnica de microarranjos de cDNA no caso de P. lutzii e PCR em tempo real para os representantes das duas espécies. Os genes diferencialmente expressos identificados neste trabalho estão relacionados principalmente à limitação de glicose, resposta ao estresse oxidativo, remodelagem da parede celular e adesão aos tecidos do hospedeiro. Os resultados demonstram que de uma forma semelhante ao que ocorre no interior de macrófagos murinos peritoniais, Paracoccidioides apresenta uma plasticidade transcricional para sobreviver no microambiente de pneumócitos humanos, que de forma geral é semelhante entre as espécies analisadas. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Paracoccidioidomycosis (PCM) is a human systemic mycosis caused by the thermaldimorphic fungus Paracoccidioides. Until recently, P. brasiliensis was recognized as the only species inside this genus, nevertheless last year P. lutzii was acknowledged as new specie phylogenetically distant from the former. The infection is acquired by the inhalation of propagules derived from the mycelium form of the fungus and establishes itself mainly in the lungs. Various studies suggest that the intracellular parasitism of this fungus is relevant in the host’s colonization and the dissemination of the disease. In order to evaluate this hypothesis a comparative transcriptional profile between P. brasiliensis (Pb18) and P. lutzii (Pb01) obtained from the interior of human pneumocytes linage (A549), during the interaction kinetics, was analysed. For this objective, cDNA microarray was used for P. lutzii (Pb01) and Real Time PCR for the representatives of both species of Paracoccidioides (Pb18 and Pb01). The genes identified by this study as differentially expressed were related mostly to glucose limitation, oxidative stress response, cell wall remodelling and adhesion to host’s tissues. Our results demonstrated that, in a similar manner in which occurs inside peritoneal murine macrophages, Paracoccidioides displays a transcriptional plasticity to survive in the microenvironment of the human pneumocytes, which is alike between both species analysed.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2011. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2011-05-23T14:35:35Z No. of bitstreams: 1 2011_RenataCristinaGrangeiroFerreira.pdf: 1966745 bytes, checksum: 185e5f2e728e61263180862a14d96500 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(tempestade_b@hotmail.com) on 2011-05-24T12:22:19Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2011_RenataCristinaGrangeiroFerreira.pdf: 1966745 bytes, checksum: 185e5f2e728e61263180862a14d96500 (MD5) / Made available in DSpace on 2011-05-24T12:22:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2011_RenataCristinaGrangeiroFerreira.pdf: 1966745 bytes, checksum: 185e5f2e728e61263180862a14d96500 (MD5) / A segregação das cromátides irmãs para os pólos opostos da célula durante a divisão celular é um evento complexo durante o ciclo de vida de uma célula eucariótica. Tanto na mitose quanto na meiose a coesão entre as cromátides irmãs é essencial para que ocorra a correta segregação cromossomal, evento sob a responsabilidade do complexo protéico chamado Coesina. Este complexo é melhor conhecido em leveduras e mamíferos, sendo formado por duas proteínas SMC (proteínas de manutenção estrutural dos cromossomos), SMC1 e SMC3, e duas proteínas SCC (proteínas de coesão das cromátides irmãs), a SCC1 (também conhecida como Mcd1 ou Rad21) e SCC3 (SA1 e SA2 em células de mamíferos). A coesina mantém as cromátides irmãs unidas a partir da fase S do ciclo celular e essa coesão é mantida até a transição entre a metáfase e a anáfase, quando as cromátides irmãs se separam para os pólos opostos da célula. Existem poucos estudos sobre a coesina em tripanossomatídeos e o projeto genoma mostrou a presença dos genes para todas as subunidades da Coesina em Trypanosoma cruzi, Trypanosoma brucei e a Leishmania major. Neste trabalho nós propusemos a análise da expressão e a imunocitolocalização das subunidades do complexo Coesina em T. cruzi. Anticorpo contra a subunidade TcSCC1 produzido em coelho foi utilizado em ensaios de western blot e imunofluorescência em microscopia confocal, para as formas amastigotas, epimastigotas e tripomastigotas de T. cruzi. Tais análises indicam uma maior detecção da proteína TcSCC1 na forma amastigotas de T. cruzi, apresentando variações no padrão da localização nuclear. Nas formas epimastigotas um sinal fraco foi detectado e nas formas tripomastigotas não houve sinalização. Estes resultados sugerem a presença da proteína TcSCC1 do complexo coesina principalmente no núcleo das formas amastigotas de T. cruzi. Os níveis de expressão dos genes para as quatro subunidades da coesina foram analisados por RT-PCR em tempo real nas três formas do T. cruzi e verificamos poucas diferenças entre estes níveis, o que sugere um controle pós-transcricional na expressão da SCC1 em T. cruzi. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / The segregation of sister chromatids to opposite poles of the cell during division is the most complex and, at the same time, the most important event during the life cycle of a eukaryotic cell. Both in mitosis and meiosis cohesion between sister chromatids is essential for the occurrence of the correct chromosomal segregation. The protein complex responsible for cohesion between chromatids is called Cohesin. The Cohesin complex is well known in yeast and mammals, consisting of two SMC (structural maintenance of chromosomes) proteins, SMC1 and SMC3, and two proteins SCC (sister chromatid cohesion) proteins, the SCC1 and SCC3 (SA1 and SA2 in mammalian cells). The Cohesin keeps sister chromatids together from S phase until the transition between metaphase and anaphase in cell cycle, when sister chromatids separate to the opposite poles of the cell. In trypanosomatids, there are few studies about this complex and the genome project revealed the presence of all Cohesin complex genes in Trypanosoma cruzi, Trypanosoma brucei and Leishmania major. In this work we proposed the analysis of the expression of the Cohesin subunits and its imunocytolocalization in T. cruzi cells. An antibody anti-TcSCC1 produced in rabbit, was used in western blots and immunofluorescence confocal microscopy analyses of amastigote, epimastigote and trypomastigote forms of T. cruzi. These analyses indicate that the TcSCC1 protein is detected mainly in the amastigote forms with distinct pattern of nucleus localization. Epimastigote form presented a weak signal for the anti-SCC1 antibody and trypomastigote form presented no signal. These results suggest that the SCC1 subunit of the Cohesin complex is present in T. cruzi and it is mainly evident in the nucleus of amastigote form of this parasite. The expression levels of each subunit of the Cohesin complex were analyzed by real time RT-PCR assays in the three forms of T. cruzi and it was found few differences between these levels, suggesting a post-transcriptional control in the SCC1 expression in T. cruzi.

Orientadores : Maria Cecilia Barisson Villares, Marcelo de Carvalho Ramos / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-02T16:41:12Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Panunto_AlessandraCosta_M.pdf: 12920906 bytes, checksum: 263a29ecfa31e38c1f81b7326d7b06c5 (MD5) Previous issue date: 2002 / Resumo: A tuberculose é a principal causa de morte no mundo entre as doenças infecciosas, produzindo 2 milhões de óbitos ao ano. Estima-se que um terço da população mundial esteja infectada pelo Mycobacterium tuberculosis, ou seja, 1,7 bilhões de pessoas. Em países africanos, o problema da tuberculose e da aids adquiriu proporções de grande magnitude. Em Moçambique, o coeficiente de incidência é de 460 casos/100.000 habitantes/ano, com mortalidade de 129 casos/100.000 habitantes/ano. Este estudo documenta a relevância desse problema. Duzentos e trinta e sete isolados clínicos de Mycobacterium tuberculosis foram caracterizados por IS6110-RFLP e ¿Spoligotyping¿, com o objetivo de avaliar a biodiversidade do bacilo da tuberculose na cidade de Maputo, Moçambique, África, onde há uma elevada incidência de tuberculose. Os resultados obtidos com o uso da técnica IS6110-RFLP exibiram uma considerável variabilidade genotípica, ou seja, cerca de 70,5% dos exemplares analisados corresponderam a genótipos únicos. A interpretação desse achado deveria ser feita juntamente com o estudo epidemiológico clássico, bem como a ampliação do número de casos analisados. Porém, a grande variabilidade genotípica nesse cenário em que a transmissão da doença é intensa, dado o número elevado de casos, indica, provavelmente, a situação endêmica em si, bem como o tempo prolongado em que isso se dá. Além disso, a grande mobilidade interna, ocorrida depois das intensas guerras civis, trazendo para a cidade indivíduos de diversos outros locais, pode também ter contribuído para essa diversidade. Encontramos também uma alta freqüência de cepas com baixo número de cópias (20,2% da IS6110). Todos os isolados foram também submetidos ao ¿Spoligotyping¿. Essa técnica foi mais discriminatória para os isolados com menos de 6 cópias da IS6110 do que o RFLP e menos discriminatório para os isolados com mais de 6 cópias da IS6110. As famílias mais freqüentemente encontradas no conjunto das cepas foram: LAM, EAI, T e Beijing, distribuídas entre os 35 agrupamentos, com 193 isolados. Em ambos os agrupamentos, tanto os derivados da técnica ¿IS6110-RFLP¿, quanto o ¿Spoligotyping¿, não houve nenhuma correlação com a resistência à isoniazida, e mesmo com os isolados multirresistentes / Abstract: Tuberculosis is the leading cause of death among infectious diseases in the world, with approximately two million deaths each year. Among Sub-Saharan African countries, tuberculosis and AIDS represents an enormous problem. In Mozambique, the incidence of tuberculosis is as high as 460 cases/100,000 inhabitants/year, with a mortality rate of 129 people/100,000 inhabitants/year. The present study re-enforces the importance of this problem. A sample of 237 clinical strains of Mycobacterium tuberculosis isolated from HIV-infected patients, living in the city of Maputo, Mozambique, was genotipically characterized by IS6110-RFLP and Spoligotyping. IS6110-RFLP showed a considerable variability (70.5%) corresponding only to genotypes. Limitations in sampling, and scarce epidemiological data, may account for lack of definition of risk factors for TB transmission in this study. A high frequency of strains exhibiting low IS6110 copy number (n=20,2%) was observed. These strains were further genotyped by Spoligotyping. The most frequently found families, characterized with the use of this technique were: LAM, EAI, T and Beijing. These isolates (n=193) could be grouped in 35 clusters. Spoligotyping was more discriminatory for isolates exhibiting less than six IS6110 copies than RFLP. No correlation was found between resistance to INH, or even multidrug-resistance and clustering / Mestrado / Ciencias Biomedicas / Mestre em Ciências Médicas

Orientador: Roberto Alves Oliveira / Resumo: A co-digestão de água residuária da bovinocultura leiteira (ARBL) e água residuária do beneficiamento do café (ARC) em reatores anaeróbios de fluxo ascendente com manta de lodos (UASB, R1 e R2), em série, é inédita e importante para o desenvolvimento dos setores envolvidos. Foram utilizadas proporções de 100:0; 85:15, 70:30 e 50:50 de ARBL:ARC no afluente dos reatores UASB e aplicados tempo de detenção hidráulica (TDH) de 2 (R1) e 4 (R2) dias. Isto proporcionou cargas orgânicas volumétricas (COV) de 11,9 (valor médio obtido nos testes 1 e 2, sem adição de ARC); 12,9 (teste 3); 14,0 (teste 4) e 21,3 (teste 5) g DQOtotal (L d)-1 no R1. As maiores produções volumétricas de metano, de até 0,89 L CH4 (L reator d)-1 foram obtidas com COV de 14,0 g DQO (L d)-1. As concentrações médias de fenóis totais no afluente variaram entre 6 e 132 mg L-1 e as eficiências médias de remoção nos reatores UASB, em dois estágios, foram de 35 a 52% com concentração de 50 mg L-1 para efluente do R2 após adição de ARC que contém elevadas concentrações de fenóis totais e apresentam toxicidade ao tratamento anaeróbio podendo afetar a estabilidade do processo. O sistema foi eficiente para remoção de ovos de helmintos. Os Domínios Bacteria e Archaea, as Ordens Methanobacteriales, Methanomicrobiales e Methanosarcinales e as Famílias Methanosaetaceae e Methanosarcinaceae se apresentaram de forma sincrônica e equilibrada na co-digestão anaeróbia dos resíduos estudados. / Abstract: The co-digestion of dairy manure wastewater (DMW) and coffee processing wastewater (CPW) in up flow anaerobic sludge blanket (UASB, R1 and R2) in series is unprecedented and important for the development of the sectors involved. Proportions of 100: 0; 85:15, 70:30 and 50:50 DMW:CPW were used in the UASB reactors influent and applied hydraulic retention time (HRT) of 2 (R1) and 4 (R2) days. This provided organic loading rate (OLR) of 11.9 (mean value obtained in tests 1 and 2, without addition of CPW); 12.9 (test 3); 14.0 (test 4) and 21.3 (test 5) g CODtotal (L d) -1 on R1. The highest volumetric methane yields of up to 0.89 L CH4 (L reactor d) -1 were obtained with OLR of 14.0 g COD (L d) -1. The mean concentrations of total phenols in the affluent ranged from 6-132 mg L-1 and the mean removal efficiencies in two-stage UASB reactors were 35-52% with 50 mg L-1 concentration for R2 effluent after addition of ARC containing high concentrations of total phenols and toxicity to anaerobic treatment may affect process stability. The system was efficient for removal of helminth eggs. The Bacteria and Archaea Domains, the Methanobacteriales, Methanomicrobiales and Methanosarcinales Orders, and the Methanosaetaceae and Methanosarcinaceae families were presented in a synchronic and balanced manner in the anaerobic co-digestion of the residues studied. / Mestre

Orientadores: Arnaldo Yoshiteru Kuaye, Kathryn J. Boor / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-03T23:53:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Kabuki_DirceYorika_D.pdf: 1158257 bytes, checksum: e37465f074c6973fa67baa13e368f2fa (MD5) Previous issue date: 2004 / Resumo: Os queijos frescais estilo Hispânico são alimentos de alto risco à contaminação por L. monocytogenes e já foram associados à pelo menos dois surtos de listeriose nos Estados Unidos da América. O conhecimento maior das fontes de contaminação por L. monocytogenes no processamento de queijos frescos tipo Hispânico é crítico para permitir o desenvolvimento de estratégias mais eficazes para o controle deste perigo. Neste trabalho, foi realizado um diagnóstico da contaminação por L. monocytogenes em três indústrias processadoras de queijos frescais tipo Hispânico, nos Estados Unidos. Um total de 246 amostras ambientais foi coletado e analisado para L. monocytogenes utilizando-se o método preconizado pela ¿Food and Drug Administration¿ (FDA) e o método ¿Biosynth L. monocytogenes detection system¿ (LMDS). As amostras de queijo, produzidos nestas indústrias (n=111), foram analisadas utilizando-se o método da FDA, modificado pela inclusão dos meios de cultura ¿L. monocytogenes plating medium¿ (LMPM) e ¿Listeria monocytogenes confirmatory plating medium¿ (LMCM) utilizados no método LMDS. L. monocytogenes foi detectada em 6,3% dos queijos e 11,0% das amostras ambientais. Dentre as amostras ambientais, aquelas obtidas de caixa vazada de plástico, dreno e piso apresentaram alta ocorrência de L. monocytogenes, com taxas de 55,6%, 30,0% e 20,6%, respectivamente. Apenas uma indústria apresentou resultados positivos em amostras de queijos e de superfícies que contatavam o alimento. O método da FDA mostrou maior sensibilidade do que o método LMDS para detecção de L. monocytogenes em amostras ambientais, e a inclusão dos meios LMPM e LMCM não melhorou a performance do método do FDA para detecção do patógeno em queijos. A subtipagem molecular, através da análise alélica dos genes de virulência actA e hly e da ribotipagem automatizada, foi utilizada para traçar a contaminação por L. monocytogenes nas indústrias. O ribotipo DUP-1044A, que havia sido previamente associado a surtos de listeriose humana em vários estados nos Estados Unidos em 1998, foi o subtipo mais comumente identificado (20/36 isolados) e foi isolado em 2 estabelecimentos. Este ribotipo se mostrou persistente e amplamente disseminado em uma das indústrias, onde foi também responsável pela contaminação do produto final. Nossa hipótese é que cepas deste ribotipo tenham habilidade específica em permanecer no ambiente de processamento. Apesar dos surtos de listeriose terem sido associados a queijos Hispânicos produzidos com leite não pasteurizado, os resultados obtidos neste trabalho revelam que a permanente contaminação ambiental pode representar outra fonte importante de contaminação do produto final / Abstract: Latin-style fresh cheeses, which have been linked to at least two human listeriosis outbreaks in the US, are considered to be high risk foods for Listeria monocytogenes contamination. We evaluated L. monocytogenes contamination patterns in three Latin-style fresh cheese processing plants to gain a better understanding of L. monocytogenes contamination sources in the manufacture of these cheeses. Over a 6-month period, 246 environmental samples were collected and analyzed for L. monocytogenes using both the Food and Drug Administration (FDA) method and the Biosynth L. monocytogenes detection system (LMDS). Finished cheese samples from the same plants (n=111) were also analyzed by the FDA method, which was modified to include L. monocytogenes plating medium (LMPM) and the L. monocytogenes confirmatory plating medium (LMCM) used in the LMDS method. L. monocytogenes was detected in 6.3% of cheese and 11.0% of environmental samples. Crates, drains and floor samples showed the highest contamination rates with 55.6%, 30.0% and 20.6% L. monocytogenes positive samples, respectively. Finished products and food contact surfaces were positive in only one plant. The FDA method showed a higher sensitivity than the LMDS method for detection of L. monocytogenes from environmental samples. The addition of LMPM and LMCM media did not further enhance the performance of the FDA method for L. monocytogenes detection from finished products. Molecular subtyping (PCR-based allelic analysis of the virulence genes actA and hly and automated ribotyping) was used to track contamination patterns. Ribotype DUP-1044A, which had previously been linked to a 1998 multistate human listeriosis outbreak in the US, was the most commonly identified subtype (20/36 isolates) and was isolated from two plants. This ribotype was persistent and widespread in one factory, where it was also responsible for the contamination of finished products. We hypothesize that this ribotype may represent a clonal group with a specific ability to persist in food processing environments. While previous listeriosis outbreaks were linked to Latin-style fresh cheeses made from unpasteurized milk, the presence of this organism in pasteurized cheese products illustrates that persistent environmental contamination also represents an important source of finished product contamination / Doutorado / Doutor em Tecnologia de Alimentos