Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2008. / Submitted by Raquel Viana (tempestade_b@hotmail.com) on 2009-12-07T19:17:51Z No. of bitstreams: 1 2008_AndrelisseArruda.pdf: 4614269 bytes, checksum: f2e92575abbb605a32f9b7f74d9d7e17 (MD5) / Approved for entry into archive by Lucila Saraiva(lucilasaraiva1@gmail.com) on 2009-12-08T02:11:28Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2008_AndrelisseArruda.pdf: 4614269 bytes, checksum: f2e92575abbb605a32f9b7f74d9d7e17 (MD5) / Made available in DSpace on 2009-12-08T02:11:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2008_AndrelisseArruda.pdf: 4614269 bytes, checksum: f2e92575abbb605a32f9b7f74d9d7e17 (MD5) Previous issue date: 2008 / A levedura metilotrófica Pichia pastoris tem sido utilizada com sucesso para a expressão de várias proteínas heterólogas sendo que diversos vetores já foram desenvolvidos para este sistema. Os principais vetores de expressão de P. pastoris são baseados no promotor do gene AOX1 que codifica a enzima álcool oxidase 1. Alguns estudos têm sido realizados para o uso de promotores alternativos uma vez que o sistema AOX1 apresenta algumas desvantagens. Em nosso laboratório foi isolado e caracterizado o promotor do gene PGK1 de P. pastoris (PPGK1), um promotor forte e constitutivo, que representa uma alternativa promissora para a construção de novos vetores. O objetivo deste estudo foi determinar a região promotora mínima do PPGK1 por meio de deleções controladas utilizando o gene da α-amilase de Bacillus subtilis como gene repórter. Quatro deleções foram obtidas sendo que a menor (PPGKΔ3), com ~400 pb, ainda manteve atividade promotora. Foi demonstrado que esta seqüência é capaz de dirigir a integração de um vetor no genoma de P. pastoris e 51% dos clones transformantes tiveram mais de uma cópia integrada. O uso deste promotor propiciou a expressão heteróloga de α-amilase em altos níveis (250 U.mL-1). Também foram construídos vetores para expressão intracelular baseados no promotor PGK que, todavia, ainda necessitam ser aprimorados para uso em P. pastoris. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT / The methylotrophic yeast Pichia pastoris has been successfully used for the expression of heterologous proteins and several different expression vectors have been developed for this system. The main expression vectors for P. pastoris are based on the alcohol oxidase 1 gene promoter, AOX1. Some studies have been carried out aiming at the use of alternative promoters once the AOX1 system shows some disadvantages. Our laboratory has isolated and characterized the P. pastoris promoter from the PGK1 gene (PPGK1), a strong and constitutive promoter, which represents a promising alternative for the construction of new vectors. The aim of this study was to determine the minimal promoter sequences from PPGK1 through controlled deletions using the α-amylase gene from Bacillus subtilis as a reporter gene. Four deletions were obtained and the smallest (PPGK Δ3) with ~ 400 bp, still maintained promoter activity. We have demonstrated that this sequence was able to direct vector integration into the P. pastoris genome and 51% of the transformants showed more than one copy integrated. The use of this promoter allowed high level expression of α-amylase (250 UmL-1). Also, vectors for intracellular expression were based on the PGK promoter were also constructed which however still need to be improved for use in P. pastoris.

Orientador : Adilson Leite / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-31T15:24:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Silva_FelipeRodriguesda_D.pdf: 4547318 bytes, checksum: 371a21a5faca32c285ee8bbdd3d47760 (MD5) Previous issue date: 2001 / Doutorado

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia e Biociências, Florianópolis, 2015. / Made available in DSpace on 2016-10-19T12:47:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 338219.pdf: 1806932 bytes, checksum: cb4e68c860e46d1c5b4be98ef954ceed (MD5) Previous issue date: 2015 / Na levedura S. cerevisiae os carboidratos sacarose, maltose e maltotriose são fermentados por vias metabólicas diferentes: a sacarose é hidrolisada pela invertase extracelular (codificada pelos genes SUC), enquanto maltose e maltotriose são ativamente transportadas para dentro da célula e hidrolisadas pelas a-glicosidases presentes no citoplasma (ambas proteínas codificadas pelos genes MAL). Os genes SUC também permitem a síntese de uma forma intracelular da invertase, uma enzima com nenhuma função óbvia em leveduras. No entanto, a sacarose pode também ser metabolizada por células de levedura através dos transportadores e a-glicosidases codificados pelos genes MAL. Nossos resultados mostram que a maltotriose pode ser também eficientemente fermentada pelas células de S. cerevisiae através de seu transporte ativo mediado pela permease AGT1, um transportador MAL necessário para utilização de maltotriose, e sua hidrólise intracelular mediada pela invertase intracelular. A cepa brasileira industrial utilizada na produção de etanol combustível CAT-1 não pode fermentar maltotriose eficientemente devido ao promotor do AGT1 ser defeituoso. Para aumentar a fermentação de maltotriose por esta levedura, colocamos um promotor constitutivo (PGPD) à frente do gene AGT1 presente na cepa CAT-1, gerando a linhagem GMY05. No entanto, esta linhagem não foi capaz de fermentar eficientemente a maltotriose. Por outro lado, quando esta linhagem foi modificada para sobre-expressar a forma intracelular da invertase, por substituição da sequência sinal do gene SUC2 com o promotor constitutivo PADH1, a cepa iSUC2 obtida (GMY08) fermentou maltotriose eficientemente. Utilizando condições em que os genes MAL não são expressos, foi possível mostrar que a forma intracelular da invertase é capaz de hidrolisar a maltotriose (mas não maltose ou p-nitrofenil-a-glicosídico). Assim, os nossos resultados indicam uma sobreposição inesperada no metabolismo de sacarose e maltotriose por células de levedura, indicando que a invertase intracelular pode hidrolisar da maltotriose, e oferece novas abordagens a ser aplicadas para otimizar várias fermentações industriais que utilizam hidrolisados de amido, incluindo a panificação, produção de bebidas destiladas e cerveja, ou inclusive bioetanol.<br> / Abstract : It is well known that in the yeast S. cerevisiae the sugars sucrose, maltose and maltotriose are metabolized by different pathways: sucrose is hydrolyzed by the extracellular invertase (encoded by SUC genes), while maltose and maltotriose are actively transported into the cell and hydrolyzed by intracellular a-glucosidases (both proteins encoded by MAL genes). Furthermore, the SUC genes also allow the synthesis of an intracellular form of invertase, an enzyme with no obvious function in yeasts. We have already shown that sucrose can be metabolized by yeast cells through MAL-encoded transporters and a glucosidases. Now, our results will show that maltotriose can be efficiently fermented by S. cerevisiae cells through its active transport mediated by the AGT1 permease, a MAL transporter required for maltotriose utilization, and its intracellular hydrolysis mediated by the cytoplasmic invertase. The Brazilian industrial fuel-ethanol strain CAT-1 cannot ferment maltotriose efficiently due to a defective promoter of the AGT1 gene. To increase maltotriose fermentation by this strain, we placed a strong promoter (PGPD) in the AGT1 gene of strain CAT-1, generating strain GMY05. While the AGT1 gene was indeed over-expressed in this strain (measured by real-time PCR), maltotriose was still not fermented efficiently. However, when we over-expressed the intracellular form of invertase, by replacing the signal sequence of the SUC2 gene with the strong PPGK promoter, the resulting iSUC2 strain GMY08 fermented maltotriose efficiently. Using conditions were the MAL-encoded a glucosidases could not be expressed, we showed that the intracellular form of invertase could hydrolyze maltotriose (but not maltose or p-nitrophenyl-a-glucoside). Thus, our results indicate an unexpected overlap in sucrose-maltotriose metabolism by yeast cells, showing that the intracellular invertase allows efficient maltotriose hydrolysis, and offers new approaches that can be applied to optimize several industrial fermentation processes that use starch hydrolysates, including production of bread, distilled beverages and beer, or even bioethanol.

A maioria das plantas transgênicas disponíveis atualmente possuem seus insertos regulados por promotores fortes que induzem uma transcrição intensa, permanente e generalizada, o que causa gastos energéticos desnecessários e dificulta a regeneração de um maior número de indivíduos transgênicos. O objetivo principal que norteou o presente trabalho foi desenvolver uma série de vetores plasmidiais contendo sequências promotoras projetadas e artificialmente sintetizadas para modular a expressão de genes de interesse em plantas. O promotor CaMV35S serviu como base para teste de elementos cis e geração de novos cassetes artificiais de expressão (CAEs). Os elementos cis TATA-box, CAAT-box e sítio de início da transcrição (TSS) originais da sequência de 90 pb do promotor mínimo CaMV35S foram substituídos pelos consensos já definidos para sequências promotoras de plantas, e a distância entre o TSS e o ATG de início da tradução, que originalmente era de 8 nucleotídeos, foi alterada para 75. Sítios de restrição para endonucleases foram introduzidos em posições estratégicas do promotor de forma a permitir a ligação dos elementos cis a serem testados e substituição de genes repórteres por genes de interesse. A distância entre o CAAT-box e o TATA-box, que originalmente era de 28 pb, foi alterada para 34 pb pela inclusão de um sítio para EcoRV na posição -46 do promotor artificial. Para compor o CAE, foram escolhidos o gene repórter tdTomato-ER e o terminador da nopalina sintase (Tnos). Foi desenvolvida, também, uma versão do CAE contendo o promotor CAMV35S (35S-CAE) integral para ser utilizada como controle positivo nesse trabalho. A partir de dados da literatura científica, foram selecionados os elementos cis W1, AC e RHE cujas atividades foram comprovadas como críticas à expressão regulada em sementes, tecidos vasculares e raízes respectivamente. Os elementos W1 e AC foram adaptados ao sítio de SmaI do CAE, dando origem às versões W1-CAE e AC-CAE. Não foram obtidas versões de RHE-CAE até o momento. Todas as versões do CAE obtidas nesse trabalho foram adaptadas ao vetor pKGW da série Gateway e empregadas para a transformação genética de Arabidopsis thaliana. Somente plantas transformadas com as versões CAE e 35S-CAE foram recuperadas. Sinais de fluorescências do gene repórter regulado pelas diferentes versões do CAE, necessários para validação da atividade promotora dos mesmos, não foram verificados em quaisquer das plantas recuperadas até o presente. / Most transgenic plants currently available have their inserts regulated by strong promoters that induce intense, permanent, and generalized transcription, which may cause unnecessary energy costs, preventing the regeneration of a larger number of transgenic events. The main purpose of this work was to develop a set of plasmid vectors containing designed promoter sequences, artificially synthesized to modulate the expression of genes of interest in plants. The CaMV35S was used as core promoter to test cis elements and to generate new artificial expression cassettes (AECs). Original-TATA box, CAAT-box and transcriptional start site (TSS) of the minimal 90 bp CaMV35S promoter sequence were replaced by already defined plant consensus sequences, and the distance between TSS and ATG, that was originally of 8 bp, was changed to 75 bp. Endonuclease restriction sites were introduced in strategic positions of the promoter in order to enable the cloning of cis elements and the replacement of reporter genes by genes of interest. The distance between CAAT-box and TATA-box, originally with 28 bp, was changed to 34 bp since one EcoRV site was included at position -46 of the artificial promoter. The reporter gene TdTomato-ER and the terminator of the nopaline synthase gene (Tnos) were chosen to compose the AEC. It was also developed an AEC version containing the CAMV35S promoter (35S-AEC) to be employed as positive control in this study. The W1, AC and RHE cis elements, whose activities were respectively proven as critical to the regulated expression in seeds, vascular tissues and roots, were selected from the scientific literature to be assayed. The W1 and AC cis elements were adapted to the SmaI site of the AEC, giving rise to the W1-AEC and AC-AEC versions. We did not obtain RHE-AEC versions. All AEC versions that were obtained in this study were ligated into pKGW vector of the Gateway series, and all vectors were employed to genetically transform Arabidopsis thaliana. Only plants transformed with the AEC and 35S-AEC versions were recovered. Fluorescence signals of the reporter gene regulated by AEC different versions, which were necessary for validation of promoter activity, were not observed in any of the recovered plants up to the present.

Made available in DSpace on 2016-08-03T12:20:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Givaldo Mauro de Matos.pdf: 531980 bytes, checksum: 82d44b355ac9cf7bfdad285b138660aa (MD5) Previous issue date: 2003-09-11 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Esta dissertação de mestrado busca pesquisar a relação estabelecida pelo teólogo Ronald Cole-Turner, entre a engenharia genética e o conceito de co-criação , desenvolvido como uma alternativa para que se pense o papel do ser humano frente aos desenvolvimentos tecnológicos atuais. Tendo em vista o conceito da evolução, da criação contínua e dos potenciais gerados pela engenharia genética, Cole-Turner defende que o ser humano pode participar das atividades criativas de Deus por meio desta tecnologia, desde que priorize os aspectos redentivos que podem ser extraídos de seu uso. Faz isto em demonstrar, por meio do relato Jawista da criação, como o agir criativo de Deus está relacionado ao agir humano, através de suas tecnologias, e em relacionar os milagres de cura operados por Jesus nos evangelhos, como explicitação epistêmica da vontade de Deus, que pode ser participada pelos seres humanos. O objetivo básico desta pesquisa será o de relatar, no primeiro capítulo, o aspecto teórico da engenharia genética, nas suas possibilidades positivas e negativas. Em seguida, no capítulo segundo, se fará uma exposição do pensamento de Cole- Turner, em diálogo com outros interlocutores do tema. Por fim, no último capítulo, se verificará as respostas oferecidas às várias observações críticas que seu pensamento recebe. A hipótese é a de que, se a criação é um projeto contínuo e inacabado, e o destino dos seres humanos se encontra inserido dentro desta continuidade, seria coerente afirmar que estes possam participar das atividades de Deus em tais projetos. Como a evolução biológica é uma dimensão da criação, que ocorre por meio de transformações no capital genético dos organismos vivos, os seres humanos, tendo conhecimento e habilidade para repetir os processos verificados nestas modificações, poderão empreender seus esforços, tanto na área da técnica, como na da ética, para participarem da consecução dos propósitos de Deus.(AU)

Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós Graduação, Universidade Federal de Ouro Preto. / Submitted by Oliveira Flávia (flavia@sisbin.ufop.br) on 2015-10-14T19:39:08Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 22190 bytes, checksum: 19e8a2b57ef43c09f4d7071d2153c97d (MD5) DISSERTAÇÃO_Isolamento CaracterizaçãoLeveduras.pdf: 2901856 bytes, checksum: d1f5aa633bd34cdce02e904c1e878faf (MD5) / Approved for entry into archive by Gracilene Carvalho (gracilene@sisbin.ufop.br) on 2015-10-26T14:40:30Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 22190 bytes, checksum: 19e8a2b57ef43c09f4d7071d2153c97d (MD5) DISSERTAÇÃO_Isolamento CaracterizaçãoLeveduras.pdf: 2901856 bytes, checksum: d1f5aa633bd34cdce02e904c1e878faf (MD5) / Made available in DSpace on 2015-10-26T14:40:30Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 22190 bytes, checksum: 19e8a2b57ef43c09f4d7071d2153c97d (MD5) DISSERTAÇÃO_Isolamento CaracterizaçãoLeveduras.pdf: 2901856 bytes, checksum: d1f5aa633bd34cdce02e904c1e878faf (MD5) Previous issue date: 2014 / O processo de oxidação biológica do manganês (Mn) já é conhecido para bactérias e fungos, entretanto, ainda não é conhecida a participação de leveduras neste processo. Para investigar esta hipótese, o objetivo geral desse trabalho foi isolar leveduras e avaliar capacidade de oxidar o Mn(II). Inicialmente oito leveduras foram isoladas a partir de água de mina brasileira e cultivadas em meio YPD contendo de 1 a 54mM de Mn(II). Foi observado crescimento de leveduras em até 32mM deste íon. Também observou-se alteração na morfologia da colônia, escurecimento do meio de cultura e/ou escurecimento das colônias, sugerindo a capacidade de oxidar o Mn(II). Posteriormente os isolados foram caracterizados pelo perfil de assimilação de fontes de carbono (Auxanograma), os quais mostraram que dentre as oito leveduras isoladas, três eram Candida guilliermondii e cinco Rhodotorula mucilaginosa. Para confirmar a identificação das espécies, foi utilizada a estratégia de sequenciamento e análise filogenética da região ITS1–5.8S-ITS2. Os resultados confirmaram a identificação dos isolados de R. mucilaginosa, enquanto que os três isolados previamente identificadas como C. guilliermondii foram reclassificados em Meyerozyma gulliermondii (teleomorfo de C. guilliermondii) e Meyerozyma caribbica (teleomorfo de Candida fermentati). A seguir, foram realizados ensaios para avaliar a capacidade dos isolados de remover o íon Mn(II). Para isso foi utilizado meio YPD contendo 0,91mM do íon Mn(II), sendo avaliados durante sete dias: o crescimento das leveduras, pH e o decaimento do Mn (II), medido por espectrometria de emissão atômica com fonte plasma. M. guilliermondii e M. caribbica foram capazes de remover 100% do Mn(II) presente no meio de cultivo, enquanto R. mucilanigonosa removeu 10%. Não foi observado aumento do pH durante os ensaios, sugerindo que a remoção do Mn(II) foi biológica. A seguir, os ensaios foram reproduzidos nas mesmas condições e as leveduras, submetidas a microscopia eletrônica de varredura acoplada a microanálise de EDS. Os dados sugerem alteração na textura das células e o revestimento da parede celular com Mn para os isolados M. guilliermondii e M. caribbica. Também foram analisadas colônias mantidas em placas contendo 32mM de Mn(II) evidenciando que as leveduras foram capazes de oxidar e adsorver o Mn que estava no meio de cultura. Tomados em conjunto, os dados obtidos neste trabalho permitem concluir que M. guilliermondii e M. caribbica possuem um importante papel no ciclo biogeoquímico do manganês. _________________________________________________________________________________________ / ABSTRACT: The biological process of Mn oxidation has been known for bacteria and fungi, however, it isn’t known the participation of yeasts in this process. To investigate this hypothesis, the aim of this study was to isolate yeasts and assess the ability of Mn(II) oxidation. Initially, eight yeasts were isolated from a Brazilian mine water and cultured on YPD medium containing 1 to 54mm of Mn(II). It was observed that the yeasts grew up to 32mM of this ion. It was also observed browning of the medium and/or darkening of the colony, suggesting the ability to catalyze the oxidation of Mn(II) ion, in addition to change in colony morphology. Among the isolates, three were identified as Candida guilliermondii and five as Rhodotorula mucilaginosa by using the assimilation of carbon sources (Auxanogram) profile. This identification was confirmed by sequencing and phylogenetic analysis of the ITS1-5.8S-ITS2 region. The results confirmed the identification of R. mucilaginosa isolates, while three isolates previously identified as C. guilliermondii have been reclassified as Meyerozyma gulliermondii (teleomorph of C. guilliermondii) and Meyerozyma caribbica (teleomorph of Candida fermentati). Smallscale batch experiments with YPD medium containing 0,91mM of Mn(II) in a one weeklong period was performed to evaluate Mn(II) removal ability by the isolates. During this time, isolates growth and pH were monitored and decay of Mn(II) were measured by atomic emission spectrometry with plasma source. M. guilliermondii and M. caribbica were able to remove 100% of Mn(II) of the medium, whereas R. mucilanigonosa removed 10%. We not observed an increase in pH medium during the assay, suggesting the occurrence of biological Mn(II) removal. Furthermore, the isolates grew up on YPD medium with and without Mn(II) ion were analyzed by scanning electron microscopy coupled with EDS microanalysis. The data suggest abnormal cells texture and the cell wall coating with Mn in M. guilliermondii and M. caribbica isolates. Colonies maintained on plates containing 32mM of Mn(II) have also been analyzed, showing that the yeasts were able to oxidize and adsorb the Mn of the medium. The results obtained in this study allow us to conclude that M. guilliermondii and M. caribbica play an important role in the biogeochemical cycling of manganese.

A maioria das plantas transgênicas disponíveis atualmente possuem seus insertos regulados por promotores fortes que induzem uma transcrição intensa, permanente e generalizada, o que causa gastos energéticos desnecessários e dificulta a regeneração de um maior número de indivíduos transgênicos. O objetivo principal que norteou o presente trabalho foi desenvolver uma série de vetores plasmidiais contendo sequências promotoras projetadas e artificialmente sintetizadas para modular a expressão de genes de interesse em plantas. O promotor CaMV35S serviu como base para teste de elementos cis e geração de novos cassetes artificiais de expressão (CAEs). Os elementos cis TATA-box, CAAT-box e sítio de início da transcrição (TSS) originais da sequência de 90 pb do promotor mínimo CaMV35S foram substituídos pelos consensos já definidos para sequências promotoras de plantas, e a distância entre o TSS e o ATG de início da tradução, que originalmente era de 8 nucleotídeos, foi alterada para 75. Sítios de restrição para endonucleases foram introduzidos em posições estratégicas do promotor de forma a permitir a ligação dos elementos cis a serem testados e substituição de genes repórteres por genes de interesse. A distância entre o CAAT-box e o TATA-box, que originalmente era de 28 pb, foi alterada para 34 pb pela inclusão de um sítio para EcoRV na posição -46 do promotor artificial. Para compor o CAE, foram escolhidos o gene repórter tdTomato-ER e o terminador da nopalina sintase (Tnos). Foi desenvolvida, também, uma versão do CAE contendo o promotor CAMV35S (35S-CAE) integral para ser utilizada como controle positivo nesse trabalho. A partir de dados da literatura científica, foram selecionados os elementos cis W1, AC e RHE cujas atividades foram comprovadas como críticas à expressão regulada em sementes, tecidos vasculares e raízes respectivamente. Os elementos W1 e AC foram adaptados ao sítio de SmaI do CAE, dando origem às versões W1-CAE e AC-CAE. Não foram obtidas versões de RHE-CAE até o momento. Todas as versões do CAE obtidas nesse trabalho foram adaptadas ao vetor pKGW da série Gateway e empregadas para a transformação genética de Arabidopsis thaliana. Somente plantas transformadas com as versões CAE e 35S-CAE foram recuperadas. Sinais de fluorescências do gene repórter regulado pelas diferentes versões do CAE, necessários para validação da atividade promotora dos mesmos, não foram verificados em quaisquer das plantas recuperadas até o presente. / Most transgenic plants currently available have their inserts regulated by strong promoters that induce intense, permanent, and generalized transcription, which may cause unnecessary energy costs, preventing the regeneration of a larger number of transgenic events. The main purpose of this work was to develop a set of plasmid vectors containing designed promoter sequences, artificially synthesized to modulate the expression of genes of interest in plants. The CaMV35S was used as core promoter to test cis elements and to generate new artificial expression cassettes (AECs). Original-TATA box, CAAT-box and transcriptional start site (TSS) of the minimal 90 bp CaMV35S promoter sequence were replaced by already defined plant consensus sequences, and the distance between TSS and ATG, that was originally of 8 bp, was changed to 75 bp. Endonuclease restriction sites were introduced in strategic positions of the promoter in order to enable the cloning of cis elements and the replacement of reporter genes by genes of interest. The distance between CAAT-box and TATA-box, originally with 28 bp, was changed to 34 bp since one EcoRV site was included at position -46 of the artificial promoter. The reporter gene TdTomato-ER and the terminator of the nopaline synthase gene (Tnos) were chosen to compose the AEC. It was also developed an AEC version containing the CAMV35S promoter (35S-AEC) to be employed as positive control in this study. The W1, AC and RHE cis elements, whose activities were respectively proven as critical to the regulated expression in seeds, vascular tissues and roots, were selected from the scientific literature to be assayed. The W1 and AC cis elements were adapted to the SmaI site of the AEC, giving rise to the W1-AEC and AC-AEC versions. We did not obtain RHE-AEC versions. All AEC versions that were obtained in this study were ligated into pKGW vector of the Gateway series, and all vectors were employed to genetically transform Arabidopsis thaliana. Only plants transformed with the AEC and 35S-AEC versions were recovered. Fluorescence signals of the reporter gene regulated by AEC different versions, which were necessary for validation of promoter activity, were not observed in any of the recovered plants up to the present.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2014. / Submitted by Jaqueline Ferreira de Souza (jaquefs.braz@gmail.com) on 2014-08-07T13:40:15Z No. of bitstreams: 1 2014_LidiaNascimentoQueiroz_Parcial.pdf: 497818 bytes, checksum: 7e4ff8edf43e92feb69984ba825ac6f5 (MD5) / Approved for entry into archive by Patrícia Nunes da Silva(patricia@bce.unb.br) on 2014-08-07T13:51:45Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_LidiaNascimentoQueiroz_Parcial.pdf: 497818 bytes, checksum: 7e4ff8edf43e92feb69984ba825ac6f5 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-08-07T13:51:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_LidiaNascimentoQueiroz_Parcial.pdf: 497818 bytes, checksum: 7e4ff8edf43e92feb69984ba825ac6f5 (MD5) / A ocorrência de perdas de produção na cultura de soja no Brasil é reflexo, entre outros fatores, do déficit hídrico. Ferramentas de melhoramento genético visam fornecer subsídios para contornar esses problemas na medida em que possibilitam a introdução de genes exógenos nas plantas, envolvidos na resposta a estresses ambientais. Vários genes de fatores de transcrição em plantas foram caracterizados e relacionados à tolerância ao estresse hídrico. Dentre eles, o gene do fator de transcrição HaHB11, de girassol, que atua como regulador positivo da cascata de sinalização dependente de ABA (ácido abscísico), aumentando a expressão dos genes de resposta que resultariam na tolerância a estresse hídrico. Na tentativa de obter plantas transgênicas de soja mais tolerantes à seca, o gene do fator HaHB11 foi clonado no vetor pAHAS e a construção obtida foi utilizada para transformação genética de soja via biobalística, utilizando embriões zigóticos como tecido alvo. Foram gerados 14 eventos de transformação, sendo que plantas da segunda geração do primeiro evento apresentaram um locus único de integração dos transgenes. Assim, plantas T4 deste primeiro evento, com 14 dias após a germinação, foram testadas em bioensaios para avaliação da resposta ao estresse hídrico. As plantas transgênicas apresentaram menor perda de água na parte aérea comparadas com as WT durante o estresse, além de possuírem mais raízes laterais desenvolvidas. Além disso, as plantas transgênicas também se recuperaram melhor da condição de estresse. Estes resultados indicam que as plantas transgênicas tiveram melhor desempenho durante o estresse hídrico, e que isso provavelmente está ligado a uma via de resposta dependente de ABA. No entanto, ensaios adicionais são necessários para elucidar melhor o papel do transgene em soja. / The occurrence of losses of soybean (Glycine max) production in Brazil is related, among other factors, to water deficit. Breeding techniques aimed at addressing these problems have continuously failed due to their inability to introduce desirable genes that may be involved in response to environmental stress. Several genes of transcription factors related to drought tolerance in plants have been characterized. Among them, is the gene for sunflower transcription factor HaHB11, which acts as a positive regulator of the ABA-dependent (abscisic acid) signaling cascade, by increasing gene expression response, which results in tolerance to water stress. In an attempt to obtain transgenic drought-tolerant soybeans plants, the HaHB11 gene was cloned into the pAHAS vector and the construction obtained was used for soybean genetic transformation via biolistic using zygotic embryos as target tissues. Fourteen transformation events were generated, and plants arising from the second generation of the first event had a single locus for the gene. Fourteen days after germination plants from this first event were subjected to a bioassay to assess their response to water stress. In addition to developing more lateral roots, transgenic plants showed lower water loss in shoots compared non-transgenic plants when subjected to water stress,. In addition, transgenic plants also recovered better from stress condition. These results indicate that transgenic plants performed better during water stress, and this may be linked to an ABA-dependent response pathway. However, additional trials are required to further elucidate the role of the transgene in soybean.

Tese(doutorado)—Universidade de Brasília, Departamento de Biologia Celular, Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2011. / Submitted by Sabrina Silva de Macedo (sabrinamacedo@bce.unb.br) on 2012-07-03T15:45:44Z No. of bitstreams: 1 2011_CristianeTeresinhaCitadin.pdf: 2307833 bytes, checksum: 153d8486e61c946638efe8f3e173fc9b (MD5) / Approved for entry into archive by Jaqueline Ferreira de Souza(jaquefs.braz@gmail.com) on 2012-07-05T18:09:54Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2011_CristianeTeresinhaCitadin.pdf: 2307833 bytes, checksum: 153d8486e61c946638efe8f3e173fc9b (MD5) / Made available in DSpace on 2012-07-05T18:09:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2011_CristianeTeresinhaCitadin.pdf: 2307833 bytes, checksum: 153d8486e61c946638efe8f3e173fc9b (MD5) / O feijão-caupi (Vigna unguiculata L. Walp) é uma leguminosa de grande importância na alimentação humana, e tem sido alvo de melhoramento clássico por décadas, no entanto, algumas características, como resistência a estresses bióticos e teores de aminoácidos sulfurados em sementes, ainda não puderam ser incorporados. Nas últimas três décadas, uma série de tentativas foi realizada com intuito de desenvolver protocolos reprodutíveis na geração de feijão-caupi transgênico que permitam a expressão de genes de importância agronômica, especialmente aqueles que não foram incorporados pelo melhoramento clássico. No momento atual, vários pesquisadores têm estabelecido com sucesso procedimentos para transformação genética de feijão-caupi. Neste trabalho é relatada a obtenção de feijão-caupi transgênico resistente ao herbicida Imazapyr. Para isso, foram utilizados vetores contendo um cassete de expressão constitutivo da enzima AtAHAS. Estas plantas foram transformadas pela técnica de biobalística e um total de 16 linhagens transgênicas confirmadas por análises de Southern blot. Bioensaios para determinar a tolerância ao herbicida foram realizados usando diferentes concentrações de imazapyr. Algumas linhagens mostraram alta tolerância, sobrevivendo em até 400g/ha de imazapyr e não apresentando sintomas ao herbicida, demonstrando que o gene Atahas é capaz de gerar tolerância a herbicida a Imazapyr em feijão-caupi. Também é reportado neste trabalho, a introdução do gene de uma δ-zeína do milho (Zea mays) de 18 kDa (dzs18), que é rica em resíduos aminoácidos de metionina. Análises de Southern blot confirmaram a introdução do transgene no genoma da planta em múltiplos loci. No entanto, a segregação na progênie ficou próxima de uma razão de 1:1, sugerindo interferência na produção de gameta. Análises de expressão da proteína em sementes da única planta transgênica segregante foram negativas. Assim sendo, neste trabalho não foi possível analisar aumento dos níveis de metionina na semente. Não é possível concluir ainda o motivo da não expressão da δ-zeína em caupi, necessitando da geração de um número maior de eventos transgênicos segregantes. Dentre as plantas transformadas para expressar o gene dzs18, duas apresentaram fenótipo de esterilidade juntamente com multibrotação, multifloração e escasso número de folhas. Essas observações levaram a questionar se as mutações eram devido ao um efeito do transgene ou de mutagênese insercional, além de questionar que alterações nas flores poderiam estar levando ao fenótipo de esterilidade. Análises de Southern blot mostraram a presença de múltiplas cópias do transgene, aumentando as chances de que o fenótipo observado esteja relacionado com mutagênese insercional. Análise de polens e óvulos mostrou sérias alterações, além de indeiscência das anteras, explicando o fenótipo de esterilidade, concluindo tratar-se de alterações na maturação dos gametas. RT-PCR das folhas confirmou a presença de transcritos do transgene, sugerindo que as alterações podem estar relacionadas também com a expressão da δ-zeína. Os dados gerados não são capazes de confirmar se as mutações se devem ao transgene ou a mutagênese insercional, por isso mais análises precisam ser realizadas, incluindo a geração de mais eventos para esse transgene. Para isso também, bibliotecas de Genome walking foram confeccionadas para futura análise e correlação entre os lócus de inserção do transgene no genoma de feijão-caupi. _________________________________________________________________________________ ABSTRACT / The cowpea (Vigna unguiculata L. Walp) is a legume of great importance for human nutrition. Some characteristics, such as resistance to biotic stress and levels of sulfur amino acids in seeds, have not yet been incorporated by the classical breeding. In the last three decades several attempts were made in order to develop reproducible protocols for generation of transgenic cowpea plants, allowing the expression of genes of agronomic importance. At the present, several researchers have successfully established procedures for genetic transformation of cowpea, presenting evidence of stable transgene integration, which segregated in a Mendelian fashion. In this work it is reported the obtaintion of transgenic cowpea lines resistant to the imidazolinone herbicide group. For this, we used vectors containing a cassette for the AtAHAS enzyme constitutive expression. These lines were transformed by the biolistic system and a total of 16 transgenic lines was confirmed by Southern blot analysis. Bioassays to determine the tolerance to herbicide was carried out using different concentrations of imazapyr. Some lines showed high tolerance, surviving to 400g/ha imazapyr and presenting no herbicide symptoms. Different levels of tolerance could not be associated to the integrity of the expression cassette. It is also reported in this paper, the introduction in cowpea of an 18 kDa δ-zein gene of maize (Zea mays), which is rich in methionine amino acid residues. Southern blot analysis confirmed the introduction of the transgene into the plant genome at multiple loci. However, the segregation in the progeny did not occurred as expected, being closed to a segregation ration of 1:1, suggesting interference with the production of gametes. Analysis of protein expression in transgenic seeds of single plant segregating was negative. Thus, was not possible to analyze increased levels of methionine in the seed. It is not yet possible to conclude the reason for the negative expression of δ-zein in cowpea, necessitating the generation more number of segregating transgenic events. Among the plants transformed to express the δ-zein gene, two of then showed a sterility phenotype with multiple formation of both shoots and flowers. In addition, a small number of leaves was also observed. These lines had multiple copies of the transgene integrated into the genome, as observed in the Southern blot analysis, increasing the chances that the observed phenotype is related to insertional mutagenesis. Analysis of pollen and ovules showed serious change, and indehiscence anthers, explaining the phenotype of sterility, concluding that it is changes in the gametes maturation. RT-PCR confirmed the presence of sheets of transcripts of the transgene, suggesting that the changes may also be related to the expression of δ-Zein. The data generated are not able to confirm if mutations are due to the transgene or insertional mutagenesis, so further analysis must be performed, including generation of more transgene events. Genome walking libraries were prepared for further analysis and correlation between the locus of insertion of the transgene in the genome of cowpea.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2007. / Submitted by Thaíza da Silva Santos (thaiza28@hotmail.com) on 2009-12-15T19:46:20Z No. of bitstreams: 1 2007_PollyannaPfrimer.pdf: 1059709 bytes, checksum: 8164ee6bf9cb611160660a0168601a11 (MD5) / Approved for entry into archive by Lucila Saraiva(lucilasaraiva1@gmail.com) on 2010-01-18T22:07:47Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2007_PollyannaPfrimer.pdf: 1059709 bytes, checksum: 8164ee6bf9cb611160660a0168601a11 (MD5) / Made available in DSpace on 2010-01-18T22:07:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2007_PollyannaPfrimer.pdf: 1059709 bytes, checksum: 8164ee6bf9cb611160660a0168601a11 (MD5) Previous issue date: 2007-02-15 / A uricase, uma enzima que converte ácido úrico em alantoína, é comumente usada em kits comerciais de dosagem de ácido úrico. Com a finalidade de produzir esta enzima em grande escala por técnicas de Engenharia Genética, o gene da uricase de Bacillus subtilis subtilis foi clonado e expresso em Escherichia coli. Para tanto, foi feita uma PCR utilizando-se como template o DNA cromossomal de B. subtilis e primers específicos para amplificação do gene pucLM. O amplicon foi sub-clonado seguindo-se seqüenciamento para a confirmação da seqüência do gene e clonagem do gene pucLM no vetor de expressão pET21a. Esse vetor de expressão permite a fusão do gene da uricase com uma cauda de histidina His . O vetor resultante, pETURI, foi usado para 6x transformar as linhagens de E. coli BL21 DE3? pLysS, BL21 (DE3) C41, BL21 (DE3) C43, BL21 (DE3) PRILL e SURE, e a indução da expressão. Amostras da linhagem de E. coli BL21 DE3? pLysS foram selecionadas para o presente estudo. Essas células foram coletadas em diversos tempos de indução e analisadas por SDS-PAGE, que revelou a presença de uma proteína de indução de ~63 kDa. A espectrometria de massa foi utilizada para determinar a massa molecular da enzima recombinante, tendo detectado um íon com massa molecular de 58,67 kDa. Análises de Western Blot confirmaram a presença da cauda de histidina na proteína de indução e detectaram degradação da enzima recombinante na porção N-terminal. A purificação foi realizada em uma coluna de afinidade Ni-NTA. Ensaios enzimáticos detectaram uma proteína estável com pH ótimo 8,0, temperatura ótima entre 25ºC e 37ºC e atividade uricásica na fração eluída com atividade específica de 39 U/mg. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Uricase, an enzyme that converts uric acid into allantoin, is commonly used in commercial kits for uric acid detection. Aiming to produce this enzyme in industrial scale using Genetic Engineering techniques, the uricase gene of Bacillus subtilis subtilis was cloned and expressed in Escherichia coli. In order to achieve this, a PCR was performed using B. subtilis cromossomal DNA as template and specific primers to amplify the gene pucL. The amplicon was sub-cloned following sequencing to confirm the gene sequence and cloning of the gene pucL in vector of expression pET21a. This vector of expression permits the fusion of the uricase gene with a histidine tag His . The resulting vector, pETURI, was used to transform the strains of 6x E. coli BL21 DE3? pLysS, BL21 (DE3) C41, BL21 (DE3) C43, BL21 (DE3) PRILL, and SURE, and the expression was induced by adding IPTG to the culture media. Samples of E. coli BL21 DE3? pLysS strain were selected to be used in the present study. These cells were collected in several induction times and analyzed by SDS- PAGE, which revealed the presence of a ~63-kDa induction protein. Mass espectrometry was used to determine the molecular mass of the recombinant enzyme, having detected an ion with molecular mass of 58,67 kDa. Western Blot analyses confirmed the presence of the histidine tag in the induction protein and detected degradation of the recombinant enzyme in the N-terminal portion. Purification was carried out in Ni-NTA affinity column. Enzymatic essays detected a stable protein with optimum pH 8.0, optimum temperature ranging from 25ºC and 37ºC, and uricase activity in the eluding fraction with specific activity of 39 U/mg.