Orientador : Paulo Arruda / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-13T23:34:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Silva_MarcioJoseda_M.pdf: 3699857 bytes, checksum: ac8518eab3393fe2040ba3b2aa9657a5 (MD5) Previous issue date: 1991 / Mestrado / Genetica Vegetal / Mestre em Ciências Biológicas

Orientador : William Jose da Silva / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-14T03:46:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ribeiro_FatimaSilviaMendonca_M.pdf: 3014928 bytes, checksum: 9b16ee049a57fdc44db9cee5b0b5cd5d (MD5) Previous issue date: 1992 / Mestrado / Genetica / Mestre em Ciências Biológicas

Verbenoxylum (Verbenaceae – Lamiales) é um gênero monotípico de hábito arbóreo restrito ao limite sul da Mata Atlântica. Apesar da presença de um estudo filogenético sobre a classificação da família Verbenaceae empregando marcadores moleculares, o posicionamento de Verbenoxylum reitzii permanece incerto. Através de estudos filogenéticos moleculares é possível investigar o relacionamento entre os organismos e processos evolutivos que possam ter tido papel importante na diferenciação e distribuição dos mesmos. Análises de diversidade genética com marcadores moleculares que tenham histórias evolutivas distintas podem promover um entendimento mais profundo de eventos históricos e recentes que possam ter influenciado na distribuição da variabilidade genética atual. Estudos genéticos populacionais e de modelagem de nicho ecológico (ENM; combina distribuição geográfica e variáveis ambientais) em espécies vegetais da Mata Atlântica podem auxiliar a desvendar a influência das mudanças climáticas geradas pelos ciclos glaciais/interglaciais na composição desta floresta. Este trabalho teve por objetivo contribuir para o entendimento da história evolutiva de V. reitzii através de análises filogenéticas e de diversidade genética populacional. Foram realizados quatro trabalhos que correspondem aos capítulos desta tese. No primeiro capítulo, foi inferido o posicionamento de V. reitzii em Verbenaceae com base nos marcadores moleculares trnL-trnF e ndhF. Os resulatdos mostraram que esta espécie está incluída na tribo Duranteae, sendo grupo-irmão de Recordia Moldenke (gênero monotípico endêmico da Bolívia). Foi proposta uma nova combinação para V. reitzii que foi incluída em Recordia. No segundo capítulo, foram desenvolvidos 11 marcadores variáveis do tipo SSRs para V. reitzii e foi testada a transferabilidade destes nos gêneros relacionados Recordia e Duranta. Dez loci de SSRs amplificaram em Recordia e nenhum em Duranta. No terceiro capítulo, foram utilizados dez loci de SSRs (desenvolvidos no capítulo 2) junto com regiões do cpDNA para caracterizar a variabilidade intraespecífica de V. reitzii. Além disto, foram realizadas análises de ENMs e testes de hipóteses de divergência e conservatismo de nicho para V. reitzii e R. boliviana. Os resultados apontaram uma diversidade genética baixa para V. reitzii, que pode ser associada com a sua distribuição restrita, pequeno tamanho populacional e efeito fundador. As ENMs indicaram que a distribuição atual de Verbenoxylum e Recordia deve ter sido influenciada por mudanças climáticas do passado e os testes de divergência e conservatismo de nicho mostraram a importânica de variáveis ambientais na divergência e distribuição das duas espécies. Por fim, no quarto capítulo, foram analisadas as relações evolutivas dentro da tribo Duranteae, a qual Verbenoxylum pertence, utilizando marcadores do cpDNA e nucleares de sequência. / Verbenoxylum (Verbenaceae – Lamiales) is a monotypic tree genus restricted to the southern limit of the Brazilian Atlantic Forest. Despite of the presence of a phylogenetic study on the classification of the Verbenaceae family using molecular markers, the placement of Verbenoxylum reitzii remains uncertain. Using molecular phylogenetic studies it is possible to investigate the relationship between organisms and the evolutionary processes that might have had an important role on their differentiation and distribution. Genetic diversity analyses with molecular markers that present distinct evolutionary histories may provide a deeper understanding of historical and recent events that might have influenced on the present distribution of genetic variability. Population genetic studies and ecological niche modeling (ENM; combines geographic distribution and environmental variables) for plant species from the Atlantic forest might help to reveal the influence of environmental changes generated as consequences of the glacial/interglacial cycles in the composition of this forest. The aim of the present project was to contribute for the understanding of V. reitzii evolutionary history through phylogenetic and population genetic diversity analyses. Four studies were developed which correspond to the chapters of the present thesis. In the first chapter, the position of V. reitzii within the Verbenaceae was inferred based on the molecular markers trnL-trnF e ndhF. The results showed that this species is included in the tribe Duranteae, sister to Recordia Moldenke (monotypic genus endemic to Bolivia). A new combination for V. reitzii was proposed, including the species in Recordia. In the second chapter, 11 variable SSRs markers were developed for V. reitzii and cross-amplification was tested in the related genera Recordia and Duranta. Ten loci amplified in Recordia and all failed in Duranta. In the third chapter, ten SSR loci (developed in chapter 2) were used along with cpDNA regions to evaluate the intraspecific variability in V. reitzii. Besides, ENMs and tests of hypotheses of niche divergence and conservatism were performed for V. reitzii and R. boliviana. The results indicated that V. reitzii has a low genetic diversity, which may be related to its narrow distribution, small population size, and founder effect. The ENMs pointed that the present distribution of Verbenoxylum and Recordia may have been influenced by past climatic changes and the tests of niche divergence and conservatism showed the importance of environmental variables on the diversification and distribution of the two species. Lastly, in the fourth chapter, evolutionary relationships within Duranteae, the tribe where Verbenoxylum belongs, were analyzed using plastidial and nuclear markers.

A eficiência da técnica de cultura de anteras, em escala comercial, ainda pode ser considerada baixa quando medida em número de plantas duplo-haplóides férteis obtidas para cada antera estabelecida in vitro. Dessa forma, o presente trabalho é pioneiro no estudo detalhado da embriogênese in vitro do micrósporo e do grão de pólen de cevada (Hordeum vulgare L. ssp. vulgare). Com o objetivo de contribuir para o aperfeiçoamento da técnica de cultura de anteras foi analisada a embriogênese, com especial ênfase na etapa da indução, através de análises citológicas e histológicas de anteras cultivadas in vitro. Foram analisadas uma cultivar brasileira de cevada, em comparação com linhagens de duas outras cultivares brasileiras, que foram selecionadas, por seleção divergente para maior ou para menor resposta na indução da rota embriogênica e, respectivamente, para menor ou para maior capacidade de regenerar plântulas verdes. Somente foram estabelecidas em cultivo in vitro as anteras que apresentaram micrósporos e pólens jovens, das linhagens selecionadas da cultivar A-05 (S3A22 e S3A23), e da cultivar BR-2(S3B63 e, apenas na cultura de anteras, S3B61), bem como da cultivar MN-599 (nãoselecionada). Para as análises histológicas, foram fixadas, a cada dois dias, duas anteras, correspondentes a cada fileira da mesma espiga, após o início do cultivo in vitro. As anteras em cultivo e respectivas estruturas multicelulares foram fixadas em FAA 50%, desidratadas em série etílica e incluídas em hidroxietilmetacrilato. Os blocos de resina polimerizada foram secionados longitudinalmente com 3 mm de espessura. Para as análises citológicas foram fixadas, de cada espiga recém-coletada, três espiguetas sendo uma da base, outra do meio e outra do ápice. Após o pré-tratamento à baixa temperatura (5 °C), porém antes do cultivo in vitro, foram fixadas três anteras (amostras utilizadas como controles). A cada três dias, durante o cultivo, três anteras foram fixadas (até 18 dias). As anteras em cultivo e estruturas multicelulares foram fixadas em Farmer e FAA 50%, transferidas após 24 horas para etanol 70%. Na cultura in vitro das anteras houve diferenças entre uma das linhagens da cultivar A-05 em relação a cultivar MN- 599, na produção inicial de estruturas embriogênicas, diferença que desapareceu na produção total. Entretanto, houve diferenças na formação dos xiii embriões: a cv.MN-599 formou embriões bem diferenciados ao passo que a linhagem S3A22 produziu um número aparentemente menor, sendo que os embriões não eram bem diferenciados. A linhagem S3B63 não apresentou embriões até o final da análise histológica. Considerando que a amostra dessa linhagem, mantida em cultura, formou plantas verdes, pode-se propor que a formação de embriões deve ocorrer posteriormente ao desenvolvimento da cv.MN-599. Cabe destacar que houve diferenças significativas entre as cultivares A-05 e BR-2 quanto à regeneração de plântulas verdes. Esses resultados indicam ter havido maior eficiência da seleção em relação à etapa da regeneração. Com relação às categorias classificatórias dos micrósporos e grãos de pólen, constatou-se que desde o início da análise histológica (2o dia de cultivo in vitro) até o final (34o dia), foram observados micrósporos, o mesmo tendo sido observado na análise citológica. Os grãos de pólen multinucleados ocorreram praticamente em todo o período de cultivo in vitro, em ambas análises; não ocorrendo nos controles da citologia (antes do cultivo); os multinucleados foram observados a partir do 3o dia, enquanto que os multicelulares a partir do 4o dia de cultivo. As estruturas multicelulares foram observadas a partir do 8o dia. A quantidade e o tamanho das estruturas multicelulares foram variáveis ao longo da análise histológica, sendo que do 14o ao 20o dia foram encontradas as de maiores dimensões, resultantes da proliferação celular por mitoses sucessivas. A partir do 22o dia (cultivar MN- 599), a ocorrência de estruturas multicelulares no interior dos lóculos da antera diminuiu, predominando o processo de proliferação externo às anteras. Para as linhagens, a partir do 18o dia foram observadas estruturas multicelulares liberadas das anteras. A análise das estruturas multicelulares permitiu classificá-las em quatro categorias: 1. SFD: Sem forma definida; 2. MAC: meristema apical caulinar; 3. MAR: meristema apical radical embrionário adventício; e 4. Embriões. As estruturas amorfas apareceram em maior número, quando comparadas com as outras categorias. Em síntese: as linhagens selecionadas e a cultivar diferiram não apenas no tempo necessário para a formação dos embriões, mas também no desenvolvimento dos mesmos, que foi mais diferenciado na cultivar MN-599, porém sendo observados mais cedo na linhagem S3A22 e S3A23, do que na cultivar MN-599. / The efficiency of anther culture technique, on a commercial scale, can be considered low when the number of fertile double-haploid plants obtained from single anthers established in vitro is evaluated. The present work pioneers a detailed study of in vitro microspores and young pollen embryogenesis of barley (Hordeum vulgare L ssp. vugare). Aiming for the improvement of anther culture technique, cytological and histological analyses of barley in vitro embryogenesis were made, with special emphasis on the induction stage. A Brazilian cultivar of barley (MN-599) was compared with strains of two other cultivars, previously selected, for three generations, for divergent responses to the induction process of in vitro culture, as well as to green plant regeneration, i.e. better response to induction and worse to green plant regeneration (strains S3A22 and S3A23 selected from cultivar A-05) or worse response to induction and better to green plant regeneration (S3B63 and S3B61 – the last one only analyzed for anther culture; both obtained from cv. BR-2). Only anthers with microspores and young pollen grains were cultured in vitro. For the histological analyses, two anthers from each row of the same spike were fixed, every two days after the beginning of in vitro culture. Anthers and respective multicellular structures were fixed in 50% FAA, dehydrated in ethylic series and included in hydroxyethylmetacrylate. The blocks of polymerized resin were longitudinally cut into 3mm thick sections. For the cytological analyses, three spikelets were fixed, one from the base, other from the middle and another from the top of each just collected spike. After the low temperature (5 oC) pretreatment, but before in vitro culture, three anthers (from the opposite row of each spike) were fixed . These two samples were used as controls. Every three days after the beginning of in vitro culture, three anthers were fixed – until the 18th day. Anthers and multicellular structures from in vitro culture were fixed in Farmer or 50% FAA and transferred to 70% ethanol after 24 hours. Differences were observed between in vitro cultivated anthers of one strain of cv A-05 and cultivar MN-599, in their initial production of embryogenic structures, but the total, final production did not differ. But differences were observed between cultivar MN- 599 and strain S3A22 in embryo formation: cv. MN-599 produced well differentiated embryos, but embryos of strain S3A22, besides in smaller number, were less differentiated. No embryo was found in all histologically analyzed samples of strain S3B63. However, considering that another sample of this same strain also cultivated in vitro generated green plants, one can propose that embryos formation does occur but later than in cv. MN-599, after 34 days in culture. One should emphasize that significant differences were found between the cultivars A-05 and BR-2 as for green plant generation. These results indicate that selection was more efficient for the plant regeneration step than for the induction phase. As for the results of in vitro culture of microspores and pollen grains, it was observed that, from the first sample of histological analyses (2nd day of in vitro culture) until the last one (34th day in culture), microspores were always present; the same was observed for the cytological analyses. Multinucleated pollen grains were observed at almost all analyzed samples; but they did not occur in the two controls of cytological analyses – i.e. before in vitro culture. Multinucleated grains were observed, in culture, from the 3rd day on. Multicellular were present in vitro culture from the 4th day on. Multicellular structures were first observed at 8th day. Multicellular structures varied in number and size at different samples of histological analysis, reaching the largest size from the 14th to the 20th day, as a result of cell proliferation due to successive mitoses. From the 22nd day on, in cultivar MN-599, there was a decrease in number of multicellular structures inside the anther loculi, but an increase and predominance of proliferation outside the anthers. As for the strains, from the 18th day on, multicellular structures liberated from the anthers were observed. The analyses of multicellular structures allowed to classify them in four classes: 1. SFD = without a defined shape; 2. MAC = shoot apical meristem; 3. MAR = adventitious embryonary apical root meristem; and 4. Embryos. The largest class was that of amorphous structures, when compared with the remaining classes. Summarizing, it was shown that the selected strains and the non-selected cultivar differed, not only in time needed for embryos formation, but also in the degree of embryo differentiation; embryos of cultivar MN-599 were well-differentiated, what was not observed for strain S3A22 and S3A23; however these strains produced embryos earlier than the cultivar.

O gênero Cunila D. Royen ex L. (Lamiaceae) encontra-se na América de forma disjunta, apresentando dois centros de distribuição de espécies, um na América do Norte e outro na América do Sul o qual apresenta três seções: Incanae, Incisae e Spicatae. As espécies do gênero Cunila são usadas na medicina popular com várias finalidades, o óleo essencial destas espécies apresenta atividades sobre microorganismos patogênicos e insetos. Os resultados obtidos neste trabalho, a partir do seqüenciamento de regiões nucleares e plastidiais, contribuem para elucidar a história evolutiva deste gênero, sendo este o primeiro relato filogenético para o gênero Cunila. Baseado nos resultados fortemente apoiados pelos diversos tratamentos estatísticos se pode observar a parafilia do gênero Cunila, sugerindo-se ainda a união de duas seções geneticamente muito similares, as seções arbustivas Incanae e Incisae. Paralelamente a este estudo, os marcadores moleculares ISSR foram aplicados visando contribuir para a classificação das espécies Sul-Americanas. Os resultados obtidos apontam para a separação destas espécies em dois grupos: arbustos e subarbustos, reforçando os resultados referentes à análise filogenética do gênero. O grupo de espécies arbustivas foi formado pelas seções Incanae e Incisae, enquanto que o grupo subarbustivo foi formado pela seção Spicatae. Os marcadores moleculares ISSR foram empregados, igualmente, no estudo de variabilidade genética dentro e entre populações de Cunila menthoides. Cada população foi caracterizada como um "pool" gênico distinto correspondendo a sua distribuição geográfica, apresentando baixa variabilidade intrapopulacional, e indicando que cada população é derivada de um limitado número de plantas com baixa troca gênica entre as populações. Diferentes populações de C. menthoides foram sujeitas à hidrodestilação por arraste a vapor e seu óleo essencial analisado em GS e GS-MS. Dois diferentes quimiotipos foram observados: pulegona e linalol, sendo que alguns indivíduos apresentaram variações relativas entre as percentagens de pulegona e mentona. Na rota biossintética dos monoterpenos, pulegona pode ser reduzido a mentona, pela ação da enzima pulegona redutase (PR). A alta ou baixa expressão da PR pode resultar no respectivo aumento ou diminuição de produção de mentona ou pulegona. O quimiotipo linalol foi formado unicamente por uma população, enquanto que todas as outras populações estudadas integraram o grupo caracterizado por pulegona. A seção Incanae é composta por uma única espécie: Cunila incana. A análise de seu óleo essencial demonstrou alta percentagem de sesquiterpenos, não sendo esta uma característica do gênero, sendo que todas as pesquisas realizadas com óleos essenciais de outras espécies do gênero indicaram altas concentrações de monoterpenos, e por conseqüência, poucos compostos sesquiterpênicos. Os resultados obtidos contribuem para o conhecimento químico e genético deste gênero com enorme potencial aromático e medicinal, o qual possui ampla distribuição no Rio Grande do Sul. / The genus Cunila D. Royen ex L. (Lamiaceae) is an american genus and presents two centers of distribution, one in North America and another in the southern of South America. It´s species are classified into three sections: Incanae, Incisae and Spicatae. Cunila species are used in folk medicine for a lot purposes, moreover, Cunila essential oils have compounds responsible for antibacterial, antifungal and insecticidal activity. The results obtained in this work, based on the sequencing from nuclear and chloroplast sets, contributed to clarify the origin and evolution of these species, being the first phylogenetic report for this genus. Based on the strongly statistical supported results the paraphyly of Cunila were reported and we suggest the union of the two South American sections formed by shrubs species (Incisae and Incanae). In addition, the molecular markers ISSR were applied to contribute with the classification of the South American species. The results showed two main clusters, one consisting of shrubs and the second by subshrubs species, which refforces the data showed in the phylogenetic study. The shrub group was composed by species representing Incanae and Incisae sections, meanwhile the subshrub group was characterized by the species from Spicatae section. The molecular markers ISSR were also applied to access inter and intrapopulational genetic variability of Cunila menthoides. Each population were characterized as a distinct genetic pool according with the geographic distribution, populations analyzed were genetically structured with low genetic variability, indicating that each population derives from a limited number of plants with low gene flow between populations. Air-dried samples of individual plants of different populations of C. menthoides were extracted by steam distillation and analyzed using GS and GS-MS. Two different chemotypes were observed: pulegone and linalool. Some samples showed a variation in the percentage of menthone/pulegone. In the monoterpenes biosynthetic pathway, pulegone can be reduced to menthone, by pulegone reductase (PR). Overexpression and cosuppression of PR can result in the respective increase or decrease in the production of menthone and pulegone. The linalool chemotype was formed by only one population; meanwhile all the other populations analyzed composed the group characterized by pulegone. The Incanae section is represented by C. incana. The essential oil obtained from this species showed high concentrations of sesquiterpenes, differing of the essential oil obtained from the other Cunila species, which is characterized by high concentration of monoterpenes and consequently low concentrations of sesquiterpenes compounds. The results obtained in this work, corresponding to a increase in the chemical and genetic knowledge of this genus which represent a great aromatic and medicinal potential, and show large distribution in the Rio Grande do Sul State.

Passiflora actinia Hook. (Passifloraceae) é uma liana típica da Floresta Atlântica, que cresce geralmente no interior ou eventualmente na borda de florestas até seus ramos atingirem a parte mais alta e exposta à luz do dossel. A espécie possui uma ampla distribuição, desde a encosta Atlântica até a borda oriental do Planalto Brasileiro, não avançando muito em direção a oeste. A Floresta Atlântica está entre os biomas mais ricos em biodiversidade do mundo, especialmente em termos de endemismos. Devido a grande utilização de seus recursos e ao desmatamento para cultivo agrícola, pastoril e ocupação imobiliária, a fragmentação da floresta aumenta constantemente, trazendo consigo os efeitos prejudiciais à biodiversidade. Estudos filogenéticos e filogeográficos envolvendo P. actinia determinaram seu posicionamento próximo de P. elegans Mast. e demonstraram uma estruturação da variabilidade genética no sentido norte-sul da distribuição. Com o intuito de avaliar os padrões de variabilidade genética de populações de P. actinia ao longo de sua distribuição geográfica, através da análise de marcadores moleculares nucleares e plastidiais e determinar os efeitos climáticos sobre a distribuição desta diversidade, nós aplicamos métodos filogeográficos e de modelagem climática para o passado, presente e futuro. Os tempos de diversidade encontrados para P. actinia datam do Pleistoceno e os resultados indicam uma forte influência das mudanças climáticas deste período na estruturação da diversidade genética desta espécie. Os resultados de modelagem climática indicaram a manutenção de áreas adequadas para a espécie em localidades de maior altitude e sua redução em áreas de baixa altitude, especialmente para cenários com maiores concentrações de carbono. O risco maior para a manutenção desta espécie é a destruição de seu habitat por desflorestamento. Sendo assim, a espécie P. actinia pode ser considerada um excelente parâmetro para descrever os acontecimentos históricos que levaram à formação da Floresta Atlântica e um indicador das transformações futuras. Seu monitoramento poderá auxiliar no controle da ação antrópica sobre a Floresta Atlântica e na preservação da biodiversidade nesta região considerada como hotspot de diversidade. / Passiflora actinia Hook. (Passifloraceae) is a vine species typical from the Atlantic Forest. Usually, it grows inside or on the edge of forests where the branches reach the highest part and exposed to light in the canopy. The species has a wide distribution from the Atlantic slope to the eastern edge of the Brazilian Plateau, not much moving toward the west. The Atlantic Forest is among the richest in biodiversity biomes in the world, especially in terms of endemism. Due to the great use of its resources and deforestation for agricultural farming, pastoral, and property occupation, forest fragmentation constantly increases, bringing the effects harmful to biodiversity. Phylogenetic and phylogeographic studies involving P. actinia determined its position close to P. elegans Mast. and demonstrated a genetic structuring the variability in the north-south distribution sense. In order to assess the genetic variability patterns of P. actinia, we analyzed populations throughout its geographical distribution based on nuclear and plastid molecular markers employing phylogeographic methods and climate modelling analyses to past, present, and future implementing an ensemble forecasting framework. The diversification age in P. actinia was compatible to Pleistocene period indicating strong influence of climate changes over genetic diversity distribution to this species. Our results predicted the persistence of suitable regions to P. actinia located in highlands and forecast a reduction in lowlands, especially for the scenario with higher greenhouse gas concentration. Most preserving efforts must be focused over localities carrying unique genetic units and distributed areas with more climatic instability. Habitat loss due to deforestation in Atlantic Forest constitutes the major risk to this species maintenance that comprises only few populations and low diversity indices. Thus, P. actinia can be considered an excellent parameter describing historical events that led to the formation of Atlantic Forest and an indicator of future changes. Monitoring this species may be helpful to control anthropic effect on the Atlantic Forest and to preserve the biodiversity in this region considered as a hotspot of diversity.

Verbenoxylum (Verbenaceae – Lamiales) é um gênero monotípico de hábito arbóreo restrito ao limite sul da Mata Atlântica. Apesar da presença de um estudo filogenético sobre a classificação da família Verbenaceae empregando marcadores moleculares, o posicionamento de Verbenoxylum reitzii permanece incerto. Através de estudos filogenéticos moleculares é possível investigar o relacionamento entre os organismos e processos evolutivos que possam ter tido papel importante na diferenciação e distribuição dos mesmos. Análises de diversidade genética com marcadores moleculares que tenham histórias evolutivas distintas podem promover um entendimento mais profundo de eventos históricos e recentes que possam ter influenciado na distribuição da variabilidade genética atual. Estudos genéticos populacionais e de modelagem de nicho ecológico (ENM; combina distribuição geográfica e variáveis ambientais) em espécies vegetais da Mata Atlântica podem auxiliar a desvendar a influência das mudanças climáticas geradas pelos ciclos glaciais/interglaciais na composição desta floresta. Este trabalho teve por objetivo contribuir para o entendimento da história evolutiva de V. reitzii através de análises filogenéticas e de diversidade genética populacional. Foram realizados quatro trabalhos que correspondem aos capítulos desta tese. No primeiro capítulo, foi inferido o posicionamento de V. reitzii em Verbenaceae com base nos marcadores moleculares trnL-trnF e ndhF. Os resulatdos mostraram que esta espécie está incluída na tribo Duranteae, sendo grupo-irmão de Recordia Moldenke (gênero monotípico endêmico da Bolívia). Foi proposta uma nova combinação para V. reitzii que foi incluída em Recordia. No segundo capítulo, foram desenvolvidos 11 marcadores variáveis do tipo SSRs para V. reitzii e foi testada a transferabilidade destes nos gêneros relacionados Recordia e Duranta. Dez loci de SSRs amplificaram em Recordia e nenhum em Duranta. No terceiro capítulo, foram utilizados dez loci de SSRs (desenvolvidos no capítulo 2) junto com regiões do cpDNA para caracterizar a variabilidade intraespecífica de V. reitzii. Além disto, foram realizadas análises de ENMs e testes de hipóteses de divergência e conservatismo de nicho para V. reitzii e R. boliviana. Os resultados apontaram uma diversidade genética baixa para V. reitzii, que pode ser associada com a sua distribuição restrita, pequeno tamanho populacional e efeito fundador. As ENMs indicaram que a distribuição atual de Verbenoxylum e Recordia deve ter sido influenciada por mudanças climáticas do passado e os testes de divergência e conservatismo de nicho mostraram a importânica de variáveis ambientais na divergência e distribuição das duas espécies. Por fim, no quarto capítulo, foram analisadas as relações evolutivas dentro da tribo Duranteae, a qual Verbenoxylum pertence, utilizando marcadores do cpDNA e nucleares de sequência. / Verbenoxylum (Verbenaceae – Lamiales) is a monotypic tree genus restricted to the southern limit of the Brazilian Atlantic Forest. Despite of the presence of a phylogenetic study on the classification of the Verbenaceae family using molecular markers, the placement of Verbenoxylum reitzii remains uncertain. Using molecular phylogenetic studies it is possible to investigate the relationship between organisms and the evolutionary processes that might have had an important role on their differentiation and distribution. Genetic diversity analyses with molecular markers that present distinct evolutionary histories may provide a deeper understanding of historical and recent events that might have influenced on the present distribution of genetic variability. Population genetic studies and ecological niche modeling (ENM; combines geographic distribution and environmental variables) for plant species from the Atlantic forest might help to reveal the influence of environmental changes generated as consequences of the glacial/interglacial cycles in the composition of this forest. The aim of the present project was to contribute for the understanding of V. reitzii evolutionary history through phylogenetic and population genetic diversity analyses. Four studies were developed which correspond to the chapters of the present thesis. In the first chapter, the position of V. reitzii within the Verbenaceae was inferred based on the molecular markers trnL-trnF e ndhF. The results showed that this species is included in the tribe Duranteae, sister to Recordia Moldenke (monotypic genus endemic to Bolivia). A new combination for V. reitzii was proposed, including the species in Recordia. In the second chapter, 11 variable SSRs markers were developed for V. reitzii and cross-amplification was tested in the related genera Recordia and Duranta. Ten loci amplified in Recordia and all failed in Duranta. In the third chapter, ten SSR loci (developed in chapter 2) were used along with cpDNA regions to evaluate the intraspecific variability in V. reitzii. Besides, ENMs and tests of hypotheses of niche divergence and conservatism were performed for V. reitzii and R. boliviana. The results indicated that V. reitzii has a low genetic diversity, which may be related to its narrow distribution, small population size, and founder effect. The ENMs pointed that the present distribution of Verbenoxylum and Recordia may have been influenced by past climatic changes and the tests of niche divergence and conservatism showed the importance of environmental variables on the diversification and distribution of the two species. Lastly, in the fourth chapter, evolutionary relationships within Duranteae, the tribe where Verbenoxylum belongs, were analyzed using plastidial and nuclear markers.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Botânica, Programa de Pós-Graduação em Botânica, 2012. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2013-08-12T15:27:09Z No. of bitstreams: 1 2012_ThaisMouraCipriano.pdf: 1150410 bytes, checksum: c573e438ea0d422e47bfb59e0a8a2761 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2013-08-13T10:49:52Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_ThaisMouraCipriano.pdf: 1150410 bytes, checksum: c573e438ea0d422e47bfb59e0a8a2761 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-08-13T10:49:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_ThaisMouraCipriano.pdf: 1150410 bytes, checksum: c573e438ea0d422e47bfb59e0a8a2761 (MD5) / Os fatores de transcrição (TF) chamados de DREB pertencem à grande família AP2/ERF e tem envolvimento em interações proteína-proteína e ligação com o DNA. As proteínas AP2/ERF têm funções importantes na regulação da transcrição de genes de uma grande variedade de processos biológicos relacionados com o crescimento e desenvolvimento, bem como várias respostas a estímulos ambientais, regulando a expressão de genes vegetais que respondem a estresses bióticos e abióticos. Neste estudo, um fator de transcrição AP2/ERF (chamado de RcDREB1) foi isolado de mamona (Ricinus communis L.) e sua a expressão foi analisada em sementes em desenvolvimento, folhas, caules e flores (sépalas, anteras e ovários) de plantas cultivadas sob condições de campo. Os transcritos foram detectados em grãos de pólen, com um pico durante a antese. A sequência de aminoácidos do RcDREB1 foi comparada com outras proteínas AP2/ERF TF e apresentou identidade de 38-78%. A análise filogenética resultou na classificação desse gene como um membro da subfamília CBF/DREB, sendo enraizado juntamente com genes do subgrupo A-5. O promotor RcDREB1 foi fusionado com o gene repórter gus e utilizado para transformar tabaco (Nicotiana tabacum L.) por Agrobacterium tumefaciens. As plantas transgênicas foram submetidas a vários tratamentos de estresse abiótico (temperaturas baixas e elevadas, seca, salinidade e ABA exógeno) e nenhuma expressão de GUS foi detectada, sugerindo que o promotor RcDREB1 não é ativo nas condições testadas. As análises in silico revelaram a presença de três cópias do elemento regulador pólen-específico (AGAAA) na região 5' do RcDREB1. A expressão de GUS foi observada somente em grãos de pólen, começando durante a abertura da flor e permanecendo no início do processo de senescência, no qual, grãos de pólen maduros são liberados das anteras. Além disso, os grãos de pólen desidratados também expressaram o gene gus. Este é o primeiro estudo sobre um gene DREB apresentando expressão pólen-específica. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / DREB transcription factors (TF) belong to the superfamily of AP2/ERF and their involvement in protein-protein interactions and DNA binding has been proposed. AP2/ERF proteins have important functions in the transcriptional regulation of a variety of biological processes related to growth and development, as well as various responses to environmental stimuli, regulating expression of plant biotic and abiotic stress-responsive genes. In this study an transcription factor AP2/ERF (named RcDREB1) was isolated from castor bean (Ricinus communis L.) and its expression was analyzed in developing seeds, leaves, stems and flowers (sepals, anthers and ovaries) of plants cultivated under field conditions. Transcripts were only observed in pollen grains, peaking during anthesis. The RcDREB1 deduced amino acid sequence was compared to other AP2/ERF TF proteins and presented 38–78% identity. Phylogenetic analysis classified it as a member of the CBF/DREB subfamily, rooting with the subgroup A-5. The RcDREB1 promoter was fused to the gus reporter gene and used to transform tobacco (Nicotiana tabacum L.) using Agrobacterium tumefaciens. Transgenic plants were exposed to various abiotic stress treatments (low and high temperatures, drought, salinity and exogenous ABA) and no detectable GUS expression was observed, suggesting that the RcDREB1 promoter is not active under tested conditions. In silico analyses revealed the presence of three copies of the regulatory late pollen-specific element (AGAAA) in the RcDREB1 5´-region. GUS expression was only observed in pollen grains, starting when the flower opened and initiating the senescence process; at this point, desiccated mature pollen grains are released from anthers. In addition, dehydrated developing pollen grains also expressed the gus gene. This is the first study on a DREB gene presenting pollen-specific expression.

O gênero Cunila D. Royen ex L. (Lamiaceae) encontra-se na América de forma disjunta, apresentando dois centros de distribuição de espécies, um na América do Norte e outro na América do Sul o qual apresenta três seções: Incanae, Incisae e Spicatae. As espécies do gênero Cunila são usadas na medicina popular com várias finalidades, o óleo essencial destas espécies apresenta atividades sobre microorganismos patogênicos e insetos. Os resultados obtidos neste trabalho, a partir do seqüenciamento de regiões nucleares e plastidiais, contribuem para elucidar a história evolutiva deste gênero, sendo este o primeiro relato filogenético para o gênero Cunila. Baseado nos resultados fortemente apoiados pelos diversos tratamentos estatísticos se pode observar a parafilia do gênero Cunila, sugerindo-se ainda a união de duas seções geneticamente muito similares, as seções arbustivas Incanae e Incisae. Paralelamente a este estudo, os marcadores moleculares ISSR foram aplicados visando contribuir para a classificação das espécies Sul-Americanas. Os resultados obtidos apontam para a separação destas espécies em dois grupos: arbustos e subarbustos, reforçando os resultados referentes à análise filogenética do gênero. O grupo de espécies arbustivas foi formado pelas seções Incanae e Incisae, enquanto que o grupo subarbustivo foi formado pela seção Spicatae. Os marcadores moleculares ISSR foram empregados, igualmente, no estudo de variabilidade genética dentro e entre populações de Cunila menthoides. Cada população foi caracterizada como um "pool" gênico distinto correspondendo a sua distribuição geográfica, apresentando baixa variabilidade intrapopulacional, e indicando que cada população é derivada de um limitado número de plantas com baixa troca gênica entre as populações. Diferentes populações de C. menthoides foram sujeitas à hidrodestilação por arraste a vapor e seu óleo essencial analisado em GS e GS-MS. Dois diferentes quimiotipos foram observados: pulegona e linalol, sendo que alguns indivíduos apresentaram variações relativas entre as percentagens de pulegona e mentona. Na rota biossintética dos monoterpenos, pulegona pode ser reduzido a mentona, pela ação da enzima pulegona redutase (PR). A alta ou baixa expressão da PR pode resultar no respectivo aumento ou diminuição de produção de mentona ou pulegona. O quimiotipo linalol foi formado unicamente por uma população, enquanto que todas as outras populações estudadas integraram o grupo caracterizado por pulegona. A seção Incanae é composta por uma única espécie: Cunila incana. A análise de seu óleo essencial demonstrou alta percentagem de sesquiterpenos, não sendo esta uma característica do gênero, sendo que todas as pesquisas realizadas com óleos essenciais de outras espécies do gênero indicaram altas concentrações de monoterpenos, e por conseqüência, poucos compostos sesquiterpênicos. Os resultados obtidos contribuem para o conhecimento químico e genético deste gênero com enorme potencial aromático e medicinal, o qual possui ampla distribuição no Rio Grande do Sul. / The genus Cunila D. Royen ex L. (Lamiaceae) is an american genus and presents two centers of distribution, one in North America and another in the southern of South America. It´s species are classified into three sections: Incanae, Incisae and Spicatae. Cunila species are used in folk medicine for a lot purposes, moreover, Cunila essential oils have compounds responsible for antibacterial, antifungal and insecticidal activity. The results obtained in this work, based on the sequencing from nuclear and chloroplast sets, contributed to clarify the origin and evolution of these species, being the first phylogenetic report for this genus. Based on the strongly statistical supported results the paraphyly of Cunila were reported and we suggest the union of the two South American sections formed by shrubs species (Incisae and Incanae). In addition, the molecular markers ISSR were applied to contribute with the classification of the South American species. The results showed two main clusters, one consisting of shrubs and the second by subshrubs species, which refforces the data showed in the phylogenetic study. The shrub group was composed by species representing Incanae and Incisae sections, meanwhile the subshrub group was characterized by the species from Spicatae section. The molecular markers ISSR were also applied to access inter and intrapopulational genetic variability of Cunila menthoides. Each population were characterized as a distinct genetic pool according with the geographic distribution, populations analyzed were genetically structured with low genetic variability, indicating that each population derives from a limited number of plants with low gene flow between populations. Air-dried samples of individual plants of different populations of C. menthoides were extracted by steam distillation and analyzed using GS and GS-MS. Two different chemotypes were observed: pulegone and linalool. Some samples showed a variation in the percentage of menthone/pulegone. In the monoterpenes biosynthetic pathway, pulegone can be reduced to menthone, by pulegone reductase (PR). Overexpression and cosuppression of PR can result in the respective increase or decrease in the production of menthone and pulegone. The linalool chemotype was formed by only one population; meanwhile all the other populations analyzed composed the group characterized by pulegone. The Incanae section is represented by C. incana. The essential oil obtained from this species showed high concentrations of sesquiterpenes, differing of the essential oil obtained from the other Cunila species, which is characterized by high concentration of monoterpenes and consequently low concentrations of sesquiterpenes compounds. The results obtained in this work, corresponding to a increase in the chemical and genetic knowledge of this genus which represent a great aromatic and medicinal potential, and show large distribution in the Rio Grande do Sul State.

A eficiência da técnica de cultura de anteras, em escala comercial, ainda pode ser considerada baixa quando medida em número de plantas duplo-haplóides férteis obtidas para cada antera estabelecida in vitro. Dessa forma, o presente trabalho é pioneiro no estudo detalhado da embriogênese in vitro do micrósporo e do grão de pólen de cevada (Hordeum vulgare L. ssp. vulgare). Com o objetivo de contribuir para o aperfeiçoamento da técnica de cultura de anteras foi analisada a embriogênese, com especial ênfase na etapa da indução, através de análises citológicas e histológicas de anteras cultivadas in vitro. Foram analisadas uma cultivar brasileira de cevada, em comparação com linhagens de duas outras cultivares brasileiras, que foram selecionadas, por seleção divergente para maior ou para menor resposta na indução da rota embriogênica e, respectivamente, para menor ou para maior capacidade de regenerar plântulas verdes. Somente foram estabelecidas em cultivo in vitro as anteras que apresentaram micrósporos e pólens jovens, das linhagens selecionadas da cultivar A-05 (S3A22 e S3A23), e da cultivar BR-2(S3B63 e, apenas na cultura de anteras, S3B61), bem como da cultivar MN-599 (nãoselecionada). Para as análises histológicas, foram fixadas, a cada dois dias, duas anteras, correspondentes a cada fileira da mesma espiga, após o início do cultivo in vitro. As anteras em cultivo e respectivas estruturas multicelulares foram fixadas em FAA 50%, desidratadas em série etílica e incluídas em hidroxietilmetacrilato. Os blocos de resina polimerizada foram secionados longitudinalmente com 3 mm de espessura. Para as análises citológicas foram fixadas, de cada espiga recém-coletada, três espiguetas sendo uma da base, outra do meio e outra do ápice. Após o pré-tratamento à baixa temperatura (5 °C), porém antes do cultivo in vitro, foram fixadas três anteras (amostras utilizadas como controles). A cada três dias, durante o cultivo, três anteras foram fixadas (até 18 dias). As anteras em cultivo e estruturas multicelulares foram fixadas em Farmer e FAA 50%, transferidas após 24 horas para etanol 70%. Na cultura in vitro das anteras houve diferenças entre uma das linhagens da cultivar A-05 em relação a cultivar MN- 599, na produção inicial de estruturas embriogênicas, diferença que desapareceu na produção total. Entretanto, houve diferenças na formação dos xiii embriões: a cv.MN-599 formou embriões bem diferenciados ao passo que a linhagem S3A22 produziu um número aparentemente menor, sendo que os embriões não eram bem diferenciados. A linhagem S3B63 não apresentou embriões até o final da análise histológica. Considerando que a amostra dessa linhagem, mantida em cultura, formou plantas verdes, pode-se propor que a formação de embriões deve ocorrer posteriormente ao desenvolvimento da cv.MN-599. Cabe destacar que houve diferenças significativas entre as cultivares A-05 e BR-2 quanto à regeneração de plântulas verdes. Esses resultados indicam ter havido maior eficiência da seleção em relação à etapa da regeneração. Com relação às categorias classificatórias dos micrósporos e grãos de pólen, constatou-se que desde o início da análise histológica (2o dia de cultivo in vitro) até o final (34o dia), foram observados micrósporos, o mesmo tendo sido observado na análise citológica. Os grãos de pólen multinucleados ocorreram praticamente em todo o período de cultivo in vitro, em ambas análises; não ocorrendo nos controles da citologia (antes do cultivo); os multinucleados foram observados a partir do 3o dia, enquanto que os multicelulares a partir do 4o dia de cultivo. As estruturas multicelulares foram observadas a partir do 8o dia. A quantidade e o tamanho das estruturas multicelulares foram variáveis ao longo da análise histológica, sendo que do 14o ao 20o dia foram encontradas as de maiores dimensões, resultantes da proliferação celular por mitoses sucessivas. A partir do 22o dia (cultivar MN- 599), a ocorrência de estruturas multicelulares no interior dos lóculos da antera diminuiu, predominando o processo de proliferação externo às anteras. Para as linhagens, a partir do 18o dia foram observadas estruturas multicelulares liberadas das anteras. A análise das estruturas multicelulares permitiu classificá-las em quatro categorias: 1. SFD: Sem forma definida; 2. MAC: meristema apical caulinar; 3. MAR: meristema apical radical embrionário adventício; e 4. Embriões. As estruturas amorfas apareceram em maior número, quando comparadas com as outras categorias. Em síntese: as linhagens selecionadas e a cultivar diferiram não apenas no tempo necessário para a formação dos embriões, mas também no desenvolvimento dos mesmos, que foi mais diferenciado na cultivar MN-599, porém sendo observados mais cedo na linhagem S3A22 e S3A23, do que na cultivar MN-599. / The efficiency of anther culture technique, on a commercial scale, can be considered low when the number of fertile double-haploid plants obtained from single anthers established in vitro is evaluated. The present work pioneers a detailed study of in vitro microspores and young pollen embryogenesis of barley (Hordeum vulgare L ssp. vugare). Aiming for the improvement of anther culture technique, cytological and histological analyses of barley in vitro embryogenesis were made, with special emphasis on the induction stage. A Brazilian cultivar of barley (MN-599) was compared with strains of two other cultivars, previously selected, for three generations, for divergent responses to the induction process of in vitro culture, as well as to green plant regeneration, i.e. better response to induction and worse to green plant regeneration (strains S3A22 and S3A23 selected from cultivar A-05) or worse response to induction and better to green plant regeneration (S3B63 and S3B61 – the last one only analyzed for anther culture; both obtained from cv. BR-2). Only anthers with microspores and young pollen grains were cultured in vitro. For the histological analyses, two anthers from each row of the same spike were fixed, every two days after the beginning of in vitro culture. Anthers and respective multicellular structures were fixed in 50% FAA, dehydrated in ethylic series and included in hydroxyethylmetacrylate. The blocks of polymerized resin were longitudinally cut into 3mm thick sections. For the cytological analyses, three spikelets were fixed, one from the base, other from the middle and another from the top of each just collected spike. After the low temperature (5 oC) pretreatment, but before in vitro culture, three anthers (from the opposite row of each spike) were fixed . These two samples were used as controls. Every three days after the beginning of in vitro culture, three anthers were fixed – until the 18th day. Anthers and multicellular structures from in vitro culture were fixed in Farmer or 50% FAA and transferred to 70% ethanol after 24 hours. Differences were observed between in vitro cultivated anthers of one strain of cv A-05 and cultivar MN-599, in their initial production of embryogenic structures, but the total, final production did not differ. But differences were observed between cultivar MN- 599 and strain S3A22 in embryo formation: cv. MN-599 produced well differentiated embryos, but embryos of strain S3A22, besides in smaller number, were less differentiated. No embryo was found in all histologically analyzed samples of strain S3B63. However, considering that another sample of this same strain also cultivated in vitro generated green plants, one can propose that embryos formation does occur but later than in cv. MN-599, after 34 days in culture. One should emphasize that significant differences were found between the cultivars A-05 and BR-2 as for green plant generation. These results indicate that selection was more efficient for the plant regeneration step than for the induction phase. As for the results of in vitro culture of microspores and pollen grains, it was observed that, from the first sample of histological analyses (2nd day of in vitro culture) until the last one (34th day in culture), microspores were always present; the same was observed for the cytological analyses. Multinucleated pollen grains were observed at almost all analyzed samples; but they did not occur in the two controls of cytological analyses – i.e. before in vitro culture. Multinucleated grains were observed, in culture, from the 3rd day on. Multicellular were present in vitro culture from the 4th day on. Multicellular structures were first observed at 8th day. Multicellular structures varied in number and size at different samples of histological analysis, reaching the largest size from the 14th to the 20th day, as a result of cell proliferation due to successive mitoses. From the 22nd day on, in cultivar MN-599, there was a decrease in number of multicellular structures inside the anther loculi, but an increase and predominance of proliferation outside the anthers. As for the strains, from the 18th day on, multicellular structures liberated from the anthers were observed. The analyses of multicellular structures allowed to classify them in four classes: 1. SFD = without a defined shape; 2. MAC = shoot apical meristem; 3. MAR = adventitious embryonary apical root meristem; and 4. Embryos. The largest class was that of amorphous structures, when compared with the remaining classes. Summarizing, it was shown that the selected strains and the non-selected cultivar differed, not only in time needed for embryos formation, but also in the degree of embryo differentiation; embryos of cultivar MN-599 were well-differentiated, what was not observed for strain S3A22 and S3A23; however these strains produced embryos earlier than the cultivar.