Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2017-02-10T17:16:53Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 761778 bytes, checksum: ecca750c172b279fb9ce213dddba2559 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-02-10T17:16:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 761778 bytes, checksum: ecca750c172b279fb9ce213dddba2559 (MD5) Previous issue date: 2016-05-24 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Sondas cromossomo-específicas referem-se a um conjunto de sequências de DNA marcadas com fluorescência, específicas de um par cromossômico, visualizadas através da hibridização em preparações citogenéticas. Tais sondas possibilitam a visualização altamente sensível e exclusiva de cromossomos individuais, ampliando a resolução diferencial de cariótipos. Elas podem ser empregadas em análises de organização do genoma, genômica comparativa, estudos evolutivos e filogenéticos, auxiliar na identificação de pares de homólogos, comparação cariotípica e obtenção de mapas físicos com marcas que auxiliem em programas de melhoramento genético. Técnicas de microdissecção de cromossomos, juntamente com métodos de isolamento e amplificação do DNA microdissectado, representam ferramentas úteis para serem aplicadas na construção dessas sondas cromossomo-específicas. Um fator considerado limitante no uso da microdissecção é a necessidade de coletar em torno de 20 cópias de um determinado cromossomo. Isso implica na necessidade de reconhecimento prévio do alvo e a certeza na identificação. A utilização de um único cromossomo resolve essa questão e possibilita a construção de sondas sem necessidade de identificação prévia, além de reduzir os esforços relativos à microdissecção. Considerando o potencial informativo dessas sondas e o desafio de construí-las a partir de um único cromossomo, o presente trabalho foi realizado com objetivo de padronizar metodologias para construção de sondas cromossomo-específicas a partir de um cromossomo isolado por microdissecção. Para tanto, foram realizadas adaptações das técnicas para obtenção de cromossomos mitóticos e meióticos adequados para caracterização cariotípica e aplicação das técnicas de microdissecção e hibridização in situ fluorescente. Foram utilizadas metáfases provenientes de cultura de linfócitos humanos para padronização de (i) métodos de microdissecção; (ii) enzimas adequadas e condições de amplificação de um cromossomo por DOP-PCR; (iii) enzimas para a marcação fluorescente das sondas por random primer e (iv) condições de estringência para a hibridização in situ fluorescente (FISH). Após essas padronizações iniciais, as metodologias foram empregadas em milho (Zea mays) e pimentão (Capsicum annuum) para primeiros testes envolvendo espécies vegetais. Foram obtidas sondas cromossomo-específicas para o par 2 do cariótipo humano, para o par cromossômico 1 de milho e para pimentão (provavelmente o par 7 ou 8). Esses resultados demonstraram que, apesar da construção de sondas cromossomo-específicas ser uma metodologia extensa e desafiadora, a padronização de cada etapa possibilitou a marcação de um par específico a partir da coleta de um único cromossomo para humano, milho e pimentão. A microdissecção, a transferência do material para o microtubo e a comparação de diferentes parâmetros na amplificação por DOP-PCR foram consideradas como as etapas mais críticas do processo. A qualidade das preparações cromossômicas foi um fator crucial para aplicação das metodologias de microdissecção e FISH. Esse trabalho revela estratégias baseadas na microdissecção de um único cromossomo que possibilitaram a produção de sondas cromossomo-específicas para diferentes organismos, como humano, milho e pimentão. As etapas padronizadas poderão direcionar os procedimentos de construção de sondas cromossomo-específicas para todos os cromossomos dos cariótipos das espécies utilizadas nesse trabalho, bem como poderão ser aplicadas em outras plantas. / Chromosome-specific probes are DNA sequences, fluorescently labelled specifically for a chromosome pair. Such probes can be applied for analysis in evolutionary and phylogenetic studies, for karyotype comparison and to obtain physical maps that help in plant breeding programs. Techniques of chromosome microdissection, along with methods of isolation and amplification of microdissected DNA, represent useful tools to be employed in the construction of chromosome-specific probes. A considered limiting factor in the use of microdissection is the necessity to collect around 20 copies of a particular chromosome. This implies the need of prior recognition of the target and the conviction in identification. The use of a single chromosome solves this issue and allows the construction of probes without prior identification, besides reducing the efforts on microdissection. Considering the potential of these informative probes, this study aimed to compare and standardize methods of classical and molecular cytogenetics to build probes. Therefore, technical adjustments were made to obtain mitotic and meiotic chromosomes suitable for karyotype characterization and application in microdissection techniques and in situ hybridization. Metaphases from human lymphocytes were used to standardization of (i) microdissection methods; (ii) chromosomes amplification; (iii) DNA fluorescent labelling and (iv) stringency conditions for fluorescence in situ hybridization (FISH). After the initial protocol standardization, the methodologies were used in maize (Zea mays) and sweat peppers (Capsicum annuum). A chromosome-specific probe for pair 2 of human chromosomes, a probe to chromosome 1 of corn and a probe for sweat pepper (probably the pair 7 or 8) were obtained. Although chromosome-specific probes construction involves many steps, the standardization of each process stages allowed, in our conditions, to obtain a specific probe from a single chromosome for humans, corn and sweat pepper. The microdissection and the comparison of different DOP-PCR parameters were considered as the most critical steps of the process. Human and plant chromosomes showing preserved morphology and structure provided a suitable template DNA for probes construction. The quality of chromosome preparation was a key factor for the microdissection and application of FISH methodologies. This work reveals strategies based on microdissection of a single chromosome that made possible the production of chromosome-specific probes for different organisms, such as human, corn and pepper. Standardized steps may guide the procedures of chromosome-specific probes construction for all chromosomes of karyotypes of the species used in this work, and it may be applied to other plant.

O silenciamento gênico tem sido utilizado extensivamente para facilitar a investigação de eventos da biologia vegetal. Ele pode ser induzido de diferentes modos, sendo que o passo chave para sua ocorrência é a presença de RNA fita dupla (dsRNA). A fim de avaliar um método rápido de obtenção de silenciamento para análise funcional em larga escala, foi inoculado dsRNA ou siRNA diretamente em folhas de plantas de arroz e de Nicotiana benthamiana. Os dsRNAs de seqüências do gene pds e do gene codificante da ferritina foram obtidos através da síntese in vivo e in vitro e o siRNA de PDS de arroz, derivado somente de síntese in vitro. O gene pds codifica a enzima fitoeno desaturase (PDS), uma enzima chave na biossíntese de carotenóides, que protege a clorofila das plantas contra o foto-branqueamento. O silenciamento deste gene mostra um fenótipo visível, claramente demonstrado através do uso de um inibidor químico da síntese desta enzima. No presente estudo, plantas de arroz e de N. benthamiana inoculadas com dsRNAs derivados do gene pds não apresentaram mudanças fenotípicas. Para avaliação de um outro método foi adaptado um vetor de silenciamento estável, no qual foram inseridos fragmentos de cDNA nas orientações senso e antisenso do gene de ferritina de arroz. O papel da ferritina, segundo experimentação in vitro, pode estar ligada à tolerância de certos cultivares de arroz às altas concentrações de ferro. O aprimoramento das metodologias de silenciamento e de transformação poderá resultar em uma ferramenta mais útil para a análise funcional em larga escala de genes de arroz. / Gene silencing has been used extensively to facilitate the investigation of different events in plant biology. It can be induced through different ways. The key step for its occurrence is the presence of double strand RNA (dsRNA). In order to evaluate a fast method to obtain silencing for functional analysis in a wide scale, either dsRNAs or siRNAs were directly inoculated in the leaves of rice and N. benthamiana plants. The dsRNAs the sequences of the pds gene and of the coding region of the ferritin gene were obtained through in vivo or in vitro synthesis, the siRNA PDS of rice were derived from synthesis in vitro. The pds gene codifies for the enzyme phytoene desaturase (PDS), a key enzyme in the biosynthesis of carotenoids, which protects the clorophil from the plants against photo-bleaching. The silencing of this gene shows a visible phenotype, clearly demonstrated through a chemical inhibition of PDS synthesis. However, no phenotypical changes were observed in either rice or N. benthamiana plants inoculated with dsRNA of the pds gene. In the present study, it was also adapted a vector for stable transformation, in which were inserted cDNA fragments of both, sense and antisense, orientations of the rice ferritin gene. In vitro experiments show that ferritin could be connected to the tolerance to high concentrations of iron of certain cultivars of rice. The improvement of silencing and transformation methodologies could result in a more useful tool for the functional analysis of rice genes in a wide scale.

A macieira (Malus x domestica Borkh.) é uma frutífera de grande importância econômica que apresenta dormência invernal. Sua produtividade depende da superação da dormência, a qual é dependente de um somatório de períodos de frio hibernal. Este somatório é variável entre genótipos. Análises gênicas permitiram demonstrar que as vias de síntese de hormônios são diferencialmente ativadas ou reprimidas na dormência e na brotação de macieiras e outros vegetais. Apesar do avanço na compreensão da regulação gênica deste mecanismo, ainda existem carências da compreensão das vias de regulação de metabólitos nesta fase. A gema dormente é um material difícil de ser trabalhado por apresentar tecidos lignificados ricos em pigmentos e compostos fenólicos e com alta tendência à oxidação. Pelo presente trabalho, teve-se por foco o desenvolvimento de método de extração, purificação e detecção/quantificação de hormônios vegetais nas gemas dormentes de macieira e a utilização desse método na caracterização do balanço hormonal destas gemas. O método desenvolvido é sensível e preciso, com capacidade de análise de sete hormônios vegetais (ABA, GA3, GA4, IAA, JA, SA e Zea), tanto em gemas dormentes como em tecidos pigmentados, lignificados e com alto efeito matriz. Foram coletadas amostras de gemas de macieira ao longo da dormência de cultivares com requerimento de frio contrastante (Gala Standard e Castel Gala, requerentes de 600 e 300 horas de frio, respectivamente), sobre porta-enxertos com contrastes de vigor (alto vigor, Maruba; médio vigor, Maruba/M9; e baixo vigor, M9), ao longo de um inverno com alta oferta de frio para a região (901 CH in 2016). A modulação hormonal de gemas dormentes foi semelhante entre as cultivares mesmo com fenótipos de brotação diferentes. Não houve quantificação dos hormônios propostos no começo da endodormência. ABA e GA4 foram os principais reguladores da dormência em um mecanismo muito similar ao da dormência de sementes. Porta-enxertos podem atrasar a brotação com estímulo de carga de ABA, como ocorre com M9. Isso demonstra o papel fundamental dos hormônios na dormência e como o estudo de porta-enxertos pode ajudar no desenvolvimento da pomicultura. / The apple tree (Malus x domestica Borkh.) is an economically important fruit tree that presents winter dormancy. Its productivity depends on dormancy overcoming, which is dependent on a sum of periods of chilling during winter. This sum is variable among genotypes. Genetic analyses allowed to show that hormonal biosynthetic pathways are differentially activated or repressed in dormancy and sprouting in apple trees and other plants. Despite the advances in the understanding of the genetic regulation during this mechanism, there is still a lack of knowledge about relevant metabolic pathways in this phase. The dormant bud is a difficult material to work with since it presents lignified tissues with pigments and phenolic compounds that are highly susceptible to oxidation. The present work focused on the development of a method for the extraction, purification and detection/quantification of plant hormones in apple dormant buds and the use of this method to characterize the hormonal balance in these gems. The developed method is sensitive and accurate, allowing the analyses of seven plant hormones (ABA, GA3, GA4, IAA, JA, SA and Zea) in dormant buds or in pigmented, lignified tissues highly susceptible to matrix effect. Samples of apple buds were collected along the dormancy period from cultivars with contrasting cold requirements (Gala Standard and Castel Gala, which require 600 and 300 chilling hours, respectively), on rootstocks with contrasting vigor (high vigor, Maruba; medium vigor, Maruba/M9; and low vigor, M9), during a particularly cold winter to the region (901 CH in 2016). The hormonal modulation of dormant buds was similar among cultivars even with different bud break phenotypes. There was no quantification of the proposed hormones at the beginning of endodormancy. ABA and GA4 were the main regulators of dormancy in a cold year by a mechanism very similar to that found in seed dormancy. Rootstocks may delay bud break with ABA loading stimulus, as occurs with M9. This demonstrates the key role of hormones in dormancy and how the study of rootstocks may help the development of pomiculture.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Departamento de Biologia Celular, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2017. / Submitted by Patrícia Nunes da Silva (patricia@bce.unb.br) on 2018-05-04T16:36:40Z No. of bitstreams: 1 2017_BárbaraMüllerSalomãodeFaria.pdf: 7857359 bytes, checksum: 1add6e6244a6621a34c2191694ccfd8b (MD5) / Approved for entry into archive by Patrícia Nunes da Silva (patricia@bce.unb.br) on 2018-05-04T16:43:45Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2017_BárbaraMüllerSalomãodeFaria.pdf: 7857359 bytes, checksum: 1add6e6244a6621a34c2191694ccfd8b (MD5) / Made available in DSpace on 2018-05-04T16:43:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017_BárbaraMüllerSalomãodeFaria.pdf: 7857359 bytes, checksum: 1add6e6244a6621a34c2191694ccfd8b (MD5) / Esta tese de doutorado apresenta resultados de pesquisa em seleção genômica ampla (GS) e estudos de associação genômica ampla (GWAS) em seis populações de melhoramento de Eucalyptus, com o objetivo de avaliar o potencial destas abordagens em explicar a herdabilidade, detectar associações significativas e predizer fenótipos de características de crescimento. No primeiro capítulo foram comparadas as abordagens de predição genômica e associação genômica ampla para características de crescimento em populações de melhoramento de Eucalyptus benthamii ( = 505) e Eucalyptus pellita ( = 732). Ambas as espécies são de crescente interesse comercial para o desenvolvimento de germoplasma adaptado a estresses ambientais. A capacidade preditiva atingiu 0,16 em E. benthamii e 0,44 em E. pellita para crescimento em diâmetro. As capacidades preditivas usando BLUP genômico ou diferentes métodos Bayesianos atingiram resultados semelhantes, indicando que as características de crescimento se ajustam adequadamente ao modelo infinitesimal. Nenhuma diferença foi detectada na capacidade preditiva quando diferentes conjuntos de SNPs foram utilizados, com base na posição (equidistantes no genoma, dentro de genes, podados considerando o desequilíbrio de ligação ou em cromossomos individuais), desde que o número total de SNPs utilizados fosse superior a 5.000. As capacidades preditivas obtidas pela remoção de parentesco entre as populações de treinamento e validação caíram para quase zero em E. benthamii e foram reduzidas pela metade em E. pellita. Esses resultados corroboram a visão atual de que o parentesco é o principal motor da predição genômica, embora algum desequilíbrio de ligação histórico provavelmente tenha sido capturado para E. pellita. Um estudo de associação genômica identificou apenas uma associação significativa para volume em E. pellita, ilustrando o fato de que, embora a predição genômica seja capaz de explicar grandes proporções da herdabilidade, muito pouco ou quase nada é capturado em associações significativas usando a abordagem de GWAS nas populações de melhoramento do tamanho avaliado neste estudo. Este estudo forneceu dados experimentais adicionais que indicam perspectivas positivas de usar dados genômicos para capturar grandes proporções de herdabilidade e predizer características de crescimento em espécies florestais com acurácias iguais ou melhores do que aquelas capturadas pela seleção fenotípica convencional. Adicionalmente, esses resultados documentaram a superioridade da abordagem de GS na capacidade de capturar grandes proporções da variância genética para crescimento, em comparação com o valor limitado da abordagem de GWAS ao se considerar aplicações no melhoramento operacional. A maioria dos estudos de GWAS em plantas, no entanto, assim como este descrito acima, tem sofrido com um poder estatístico limitado, especialmente para características complexas. Tamanhos amostrais maiores são necessários no sentido de aumentar a capacidade de detecção de variantes, especialmente aquelas de baixa frequência e de pequeno efeito. Devido aos desafios logísticos e altos custos para aumentar o tamanho das populações em estudos de associação, uma alternativa tem sido a implementação de Joint-GWAS, utilizando informações combinadas de populações independentes. Joint-GWAS utiliza diferentes abordagens estatísticas para combinar os resultados de múltiplos estudos em um esforço para aumentar o poder de detecção em relação a estudos individuais, melhorar as estimativas do tamanho dos efeitos e/ou resolver a incerteza quando resultados dos estudos individuais não concordam. No segundo capítulo desta tese de doutorado foi realizado um estudo de associação genômica ampla utilizando dados de quatro populações independentes para características de crescimento, montando assim uma população de associação consideravelmente maior do que estudos anteriores em espécies florestais. Dados de um total de 3.373 árvores de quatro populações híbridas de Eucalyptus grandis x Eucalyptus urophylla não relacionadas, cada uma delas com 758 a 979 indivíduos, foram utilizados. Estas populações haviam sido genotipadas com uma plataforma de SNP comum desenvolvida para Eucalyptus permitindo assim a implementação de Joint-GWAS. O impacto da correção para estrutura de população e/ou parentesco sobre a capacidade de detecção de associações significativas foi explorado utilizando seis modelos estatísticos com base na análise de SNPs individuais. Uma redução drástica no número de associações significativas foi observada ao se adotar correções mais rigorosas. Foi avaliado ainda o desempenho de diferentes abordagens de mapeamento de associação utilizando segmentos genômicos contendo vários SNPs em contrates com SNPs individuais. A abordagem de mapeamento de herdabilidades regionais, nas quatro populações analisadas de forma independente, identificou regiões genômicas que explicaram individualmente 3-13% da herdabilidade genômica. Variantes raras foram detectadas usando abordagens de Joint-GWAS baseadas em conjuntos de SNPs dentro de genes e em segmentos específicos. Associações foram detectadas em genes relacionados à biossíntese da parede celular e resistência à doença, sugerindo potenciais efeitos pleiotrópicos no crescimento da árvore. De maneira geral, o aumento do tamanho amostral e a aplicação de diferentes abordagens de análise combinada de populações ainda revelaram um número limitado de associações, corroborando a complexidade de características de crescimento e a provável participação de um grande número de variantes de pequeno efeito de difícil detecção no controle de crescimento. Entretanto, estes resultados indicam ainda que à medida que mais programas de melhoramento de Eucalyptus adotarem genômica para predizer fenótipos com base em uma plataforma SNP comum, conjuntos de dados cada vez maiores ficarão disponíveis e Joint-GWAS como descrito neste estudo de forma inédita em espécies florestais, será capaz de contribuir para a identificação de SNPs ou segmentos genômicos que controlam proporções relevantes da herdabilidade. / This doctoral thesis presents results of research in genomic selection (GS) and genome-wide associations studies (GWAS) in six Eucalyptus breeding populations, with the objective of evaluating the potential of these approaches in explaining heritability, detecting significant associations and predicting phenotypes of growth traits. In the first chapter, genomic prediction approaches and association studies for growth traits in Eucalyptus benthamii ( = 505) and Eucalyptus pellita ( = 732) breeding populations were compared. Both species are of increasing commercial interest for the development of germplasm adapted to environmental stresses. Predictive ability reached 0.16 in E. benthamii and 0.44 in E. pellita for diameter growth. Predictive abilities using either Genomic BLUP or different Bayesian methods reached similar results, indicating that growth adequately fits the infinitesimal model. No difference was detected in predictive ability when different sets of SNPs were utilized, based on position (equidistantly genome-wide, inside genes, linkage disequilibrium pruned or on single chromosomes), as long as the total number of SNPs used was above ~5,000. Predictive abilities obtained by removing relatedness between training and validation sets fell near zero for E. benthamii and were halved for E. pellita. These results corroborate the current view that relatedness is the main driver of genomic prediction, although some historical linkage disequilibrium was likely captured for E. pellita. A genome-wide association study identified only one significant association for volume growth in E. pellita, illustrating the fact that while genome-wide regression is able to account for large proportions of the heritability, very little or none is captured into significant associations using GWAS in breeding populations of the size evaluated in this study. This study provided further experimental data supporting positive prospects of using genome-wide information to capture large proportions of trait heritability and predict growth traits in trees with accuracies equal or better than those attainable by phenotypic selection. Additionally, our results documented the superiority of the wholegenome regression approach in accounting for large proportions of the heritability of complex traits, such as growth, in contrast to the limited value of the local GWAS approach toward breeding applications. Most GWAS in plants, like the one described above, have suffered from limited statistical power especially for complex traits. Larger sample sizes are needed to enhance the ability to identify variants, especially those of low-frequency and small effect. Due to the challenges and high costs of increasing sample size in GWAS, an alternative has been to implement Joint-GWAS, using the combined information from independent populations. Joint-GWAS use different statistical approaches to combine the results from multiple studies in an effort to increase detection power over individual studies, improve estimates of the size of the effect and/or to resolve uncertainty when reports from individual studies disagree. In the second chapter of this doctoral thesis, a GWAS for growth traits was performed by assembling a considerably larger association population than any previous GWAS in forest trees. Data for a total of 3,373 trees across four unrelated Eucalyptus grandis x Eucalyptus urophylla hybrid breeding populations, with samples sizes varying between 758 and 979 individuals, were used. These populations had been genotyped with a common SNP platform for Eucalyptus species, thus allowing a Joint-GWAS implementation. The impact of correcting for population structure and/or relatedness on the detection of significant associations was explored using six single-SNP GWAS models. A drastic reduction in the number of significant associations detected was observed when more stringent correction was adopted. We also evaluated the performance of different segment-based GWAS approaches involving several SNPs simultaneously in comparison to single-SNP analyses. Regional heritability mapping, in these four populations independently, pinpointed genomic regions that individually explained 3-13% of the genomic heritability. Rare variants were detected using gene and region-based Joint-GWAS approaches. Associations were detected into genes related to cell wall biosynthesis and disease resistance, suggesting potential pleiotropic effects on tree growth. In general, the increase in sample size and the application of different approaches of Joint-GWAS still revealed a limited number of associations, corroborating the complexity of growth traits and the likely participation of a large number of variants of small effect of difficult detection in the control of growth traits. However, these results further indicate that as more Eucalyptus breeding programs adopt genomics to predict phenotypes based on a common SNP platform, increasing datasets will be available and Joint-GWAS as described in this study for the first time in forest trees, will be able to contribute to the identification of SNPs or genomic segments controlling relevant portions of trait heritability.

Os agrupamentos de ferro-enxofre (Fe-S) são grupos prostéticos necessários para a manutenção da vida, pois estão envolvidos em diversos processos incluindo a transferência de elétrons, reações metabólicas, sinalização e regulação da expressão gênica. As plantas realizam fotossíntese e respiração, dois processos que requerem proteínas Fe-S, sendo os únicos organismos em que a síntese destas proteínas é compartimentalizada. Diversos fatores afetam o desenvolvimento das plantas, entre eles, a temperatura baixa, fator limitante à produtividade e à distribuição geográfica das plantas, incluindo Eucalyptus grandis, uma espécie com grande importância econômica. Neste trabalho foi realizada uma análise transcricional dos genes NFS1, ISA1 e ISU1 de E. grandis após diferentes estúmlos por meio de PCR quantitativa (qRT-PCR) e microarranjos. Após o tratamento de plântulas de E. grandis com frio, foram realizados experimentos de qRT-PCR. Os resultados foram normalizados com os genes constitutivos codificadores da histona H2B e da ribonucleoproteína L23A. Considerando tal normalização, ISU1 aumentou sua expressão em 0,6 e 1,7 vezes, NFS1 apresentou um aumento de 6 e 8 vezes, enquanto ISA1 apresentou um aumento de 69 a 114 vezes em relação à condição controle. Utilizando-se a técnica de microarranjos, foi analisada a diferença de expressão entre folhas e xilema de árvores maduras de E. grandis. O gene NFS1 apresentou maior expressão nas folhas do que em xilema, porém os genes ISA1 e ISU1 apresentaram um padrão de expressão equivalente entre os dois tipos de tecidos. Esses resultados sugerem que (i) os genes NFS1 e ISA1 podem estar relacionados à resposta celular ao estresse causado por frio; e que (ii) os aumentos na expressão devem-se, provavelmente, ao metabolismo de enxofre e à indução de enzimas antioxidantes. Foi também realizado um experimento de curva de tempo com a submissão de plântulas de E. grandis ao resfriamento, objetivando-se verificar em que momento esses genes começam a ter suas expressões aumentadas. O gene ISU1 apresentou maior expressão gênica nas primeiras duas horas de tratamento, caindo drasticamente logo após este período. O gene ISA1, que havia apresentado a maior expressão relativa no experimento anterior, não apresentou diferença significativa no padrão de expressão durante as 16 horas de resfriamento, assim como o gene NFS1. Esses resultados indicam que as proteínas Fe-S, frente ao resfriamento, estão possivelmente envolvidas na recuperação das plantas após tal estresse. / Iron-sulfur (Fe-S) clusters are prosthetic groups required for the maintenance of life because they are involved in various vital processes, including electron transfers, metabolic reactions, signaling and regulation of gene expression. Plants perform photosynthesis and respiration, two processes that require Fe-S proteins, and are the only organisms in which the synthesis of these proteins is compartmentalized. Several factors and stresses affect the development of plants including low temperature, which is a productivity-limiting factor and restricts plants to certain geographical distributions, including Eucalyptus grandis, a species with significant economic importance. The aim of this study is to perform an analysis of E. grandis NFS1 and ISA1 gene expressions after different stimuli through quantitative PCR (qRT-PCR) and microarrays. qRT-PCR experiment were conducted on plants submitted to a cold treatment. The results were normalized with the housekeeping genes encoding histone H2B and ribonucleoprotein L23A. Considering such normalizations, ISU1 increased the expression 0.6 and 1-fold, NFS1 showed a 6 and 8-fold increase in comparison with the control condition, while ISA1 gene increased 69 and 114-fold. Using microarrays, the difference in expression between leaves and xylem of E. grandis was analyzed. The NFS1 gene showed higher expression in leaves than in xylem, but the ISA1and ISU1 showed equivalent pattern of expression in both types of tissues. These results suggest that (i) NFS1 and ISA1 genes are related to the cellular response to the stress caused by chilling, and that (ii) the increased expression should be probably due to the metabolism of sulfur and to the induction of antioxidative enzymes. A time-course experiment was also conducted during the cold stress of E. grandis plants to look at which moment these genes begin to increase their expressions. The ISU1 gene showed higher expression in the first 2 hours of treatment, and than decreased severally after this period. The ISA1 gene, which had shown the highest expression in the previous experiment, did not show significant differences in the pattern of expression during the 16 hours of chilling treatment, as well as the NFS1 gene. These results indicate that Fe-S proteins, in response to low temperature, are possibly involved in the recovery of the plants after this stress.

A obtenção de novas cultivares de uvas de mesa e a compreensão da regulação da expressão gênica, associada à formação do fruto de uma cultivar de uva sem semente, constituem pré-requisitos essenciais para o desenvolvimento de ferramentas aplicadas ao melhoramento genético para essas espécies. Com este objetivo, dois trabalhos foram conduzidos a partir do estudo de transcritos derivados de frutos da cultivar (cv) Sultanina de videira. No primeiro trabalho, três bibliotecas subtraídas foram construídas a partir de RNA total de frutos em diferentes estádios de formação, utilizando-se uma metodologia modificada da análise representacional diferencial (RDA), denominada análise representacional de transcritos em grupos (BRAT). Um total de 2.500 fragmentos derivados de transcritos (TDFs) foram identificados e clonados a partir de estádios específicos do desenvolvimento do fruto. Após sequenciamento e análise in silico, 1.554 (62,16%) dos transcritos foram validados de acordo com a qualidade da sequência. A montagem das sequências derivadas de genes expressos (ESTs) resultou em 726 singletos e 69 clusters, com aproximadamente 76% de redundância. Entre os TDFs identificados, onze genes candidatos e dois genes-referência foram selecionados e submetidos a uma análise aprofundada dos seus perfis de expressão temporal por RT-qPCR. A expressão de sete genes foi concordante com os estádios específicos do desenvolvimento dos frutos. Entre os candidatos selecionados os genes a seguir listados são possivelmente os mais promissores quando se considera o desenvolvimento do fruto da cv. Sultanina: (i) VvUBP1 (proteína de ligação a oligouridilatos), (ii) VvRIP1 (proteínas induzidas pelo amadurecimento), (iii) VvP450 (citocromo P450), (iv) VvDOF1 (proteína do tipo Dof); (v) VvERF1 (fator de transcrição responsivo ao etileno), e (vi) VvGID1L1 (receptor de ácido giberélico). Num segundo momento, foi realizado um estudo mais detalhado dos genes Dof de videira. Tais genes correspondem a um grupo de fatores de transcrição específicos de plantas, os quais estão envolvidos na regulação de diferentes funções, tais como, resposta ao estresse, hormônios e luz, sinalização de fitocromo, germinação de sementes e expressão gênica tecido-específica. A família de genes Dof de videira compreende 26 membros, sendo que as sequências de aminoácidos de todos os domínios Dof alinham perfeitamente, incluindo resíduos de cisteína que são críticos para a ligação de zinco e outros resíduos conservados em fatores de transcrição Dof de A. thaliana, O. sativa e outras plantas. Baseado na análise de domínios Dof, sugere-se que estes domínios sejam possivelmente funcionais em videira. A localização física dos genes Dof nos cromossomos de videira foi realizada. Além disso, foi conduzida uma análise filogenética comparando o grupo de genes Dof em videira com os seus homólogos em outras duas eudicotiledôneas completamente sequenciadas, A. thaliana e Populus, permitindo identificar claramente clusters de genes parálogos e ortólogos. Por fim, os perfis de expressão de todos os 26 genes Dof foram estudados por RT-qPCR em nove órgãos de videira. / Table grapes production and kwnolegment about the gene expression regulation associated with the formation of seedless grape cultivar, constitute essential prerequisites for the development of tools applied to genetic improvement of this plant species. To this end, two studies were conducted using the analysis of transcripts derived from fruits of the Sultanina cultivar (cv.) grapevine. In the first study, three subtracted libraries were constructed from total RNA from fruit different developmental stages using a modified methodology of Representational Difference Analysis (RDA), named Bulk Representational Analysis of Transcripts (BRAT). A total of 2,500 transcripts-derived fragments (TDFs) were identified and cloned from specific stages of fruit development. After sequencing and analysis in silico, 1,554 (62.16%) transcripts were validated in accordance with the sequence quality. The assembly of sequences derived from expressed genes (ESTs) resulted in 726 singletons and 69 clusters, with overall EST redundancy of approximately 76%. Among the TDFs identified eleven candidate genes and two reference genes were selected and subjected to a thorough analysis of their temporal expression profiles by RT-qPCR. Among them, seven genes proved to be in agreement with the stage-specific expression. Among candidates selected from those differentially expressed, the genes listed below were considered the most promising when considering the fruit development in grapevine cv. Sultanina: (i) VvUBP1(oligouridylate binding protein), (ii)VvRIP1 (ripening induced protein), (iii) VvP450 (cytochrome P450), (iv) VvDOF1 (Dof-like protein), (v) VvERF1 (ethylene-responsive transcription factor), and (vi) VvGID1L1 (gibberellins receptor). The second study detailed the grapevine Dof gene family. Dof proteins are involved in the regulation of different functions such as plant response to stress, hormones and light phytochrome signaling, seed germination and tissue-specific gene expression. The Dof gene grapevine family includes 26 members. The amino acid sequences deduced from Dof domains matched perfectly including cysteine residues critical for zinc binding and other residues known to be conserved in Dof transcription factors from A. thaliana, O. sativa and other plants. Based on analysis of Dof domains, it is suggested that all grapevine Dof domains are possibly functional. The physical location of Dof genes in grapevine chromosome was determined. A phylogenetic study comparing grapevine Dof genes with their counterparts in two other eudicots completely sequenced, A. thaliana and Populus, allowed us to identify clear clusters of paralogous and orthologs genes. Finally, the expression profiles of all 26 Dof genes was studied by RT-qPCR in nine vegetative and reproductive grapevine organs.

A macieira (Malus x domestica Borkh.) é uma frutífera de grande importância econômica que apresenta dormência invernal. Sua produtividade depende da superação da dormência, a qual é dependente de um somatório de períodos de frio hibernal. Este somatório é variável entre genótipos. Análises gênicas permitiram demonstrar que as vias de síntese de hormônios são diferencialmente ativadas ou reprimidas na dormência e na brotação de macieiras e outros vegetais. Apesar do avanço na compreensão da regulação gênica deste mecanismo, ainda existem carências da compreensão das vias de regulação de metabólitos nesta fase. A gema dormente é um material difícil de ser trabalhado por apresentar tecidos lignificados ricos em pigmentos e compostos fenólicos e com alta tendência à oxidação. Pelo presente trabalho, teve-se por foco o desenvolvimento de método de extração, purificação e detecção/quantificação de hormônios vegetais nas gemas dormentes de macieira e a utilização desse método na caracterização do balanço hormonal destas gemas. O método desenvolvido é sensível e preciso, com capacidade de análise de sete hormônios vegetais (ABA, GA3, GA4, IAA, JA, SA e Zea), tanto em gemas dormentes como em tecidos pigmentados, lignificados e com alto efeito matriz. Foram coletadas amostras de gemas de macieira ao longo da dormência de cultivares com requerimento de frio contrastante (Gala Standard e Castel Gala, requerentes de 600 e 300 horas de frio, respectivamente), sobre porta-enxertos com contrastes de vigor (alto vigor, Maruba; médio vigor, Maruba/M9; e baixo vigor, M9), ao longo de um inverno com alta oferta de frio para a região (901 CH in 2016). A modulação hormonal de gemas dormentes foi semelhante entre as cultivares mesmo com fenótipos de brotação diferentes. Não houve quantificação dos hormônios propostos no começo da endodormência. ABA e GA4 foram os principais reguladores da dormência em um mecanismo muito similar ao da dormência de sementes. Porta-enxertos podem atrasar a brotação com estímulo de carga de ABA, como ocorre com M9. Isso demonstra o papel fundamental dos hormônios na dormência e como o estudo de porta-enxertos pode ajudar no desenvolvimento da pomicultura. / The apple tree (Malus x domestica Borkh.) is an economically important fruit tree that presents winter dormancy. Its productivity depends on dormancy overcoming, which is dependent on a sum of periods of chilling during winter. This sum is variable among genotypes. Genetic analyses allowed to show that hormonal biosynthetic pathways are differentially activated or repressed in dormancy and sprouting in apple trees and other plants. Despite the advances in the understanding of the genetic regulation during this mechanism, there is still a lack of knowledge about relevant metabolic pathways in this phase. The dormant bud is a difficult material to work with since it presents lignified tissues with pigments and phenolic compounds that are highly susceptible to oxidation. The present work focused on the development of a method for the extraction, purification and detection/quantification of plant hormones in apple dormant buds and the use of this method to characterize the hormonal balance in these gems. The developed method is sensitive and accurate, allowing the analyses of seven plant hormones (ABA, GA3, GA4, IAA, JA, SA and Zea) in dormant buds or in pigmented, lignified tissues highly susceptible to matrix effect. Samples of apple buds were collected along the dormancy period from cultivars with contrasting cold requirements (Gala Standard and Castel Gala, which require 600 and 300 chilling hours, respectively), on rootstocks with contrasting vigor (high vigor, Maruba; medium vigor, Maruba/M9; and low vigor, M9), during a particularly cold winter to the region (901 CH in 2016). The hormonal modulation of dormant buds was similar among cultivars even with different bud break phenotypes. There was no quantification of the proposed hormones at the beginning of endodormancy. ABA and GA4 were the main regulators of dormancy in a cold year by a mechanism very similar to that found in seed dormancy. Rootstocks may delay bud break with ABA loading stimulus, as occurs with M9. This demonstrates the key role of hormones in dormancy and how the study of rootstocks may help the development of pomiculture.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária, Programa de Pós-Graduação em Agronomia, 2014. / Submitted by Ana Cristina Barbosa da Silva (annabds@hotmail.com) on 2014-11-20T15:04:27Z No. of bitstreams: 1 2014_SabrinaIsabelCostadeCarvalho.pdf: 3345455 bytes, checksum: 3215d3ce87c71dae6711fbd788c10b41 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2014-11-24T15:00:32Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_SabrinaIsabelCostadeCarvalho.pdf: 3345455 bytes, checksum: 3215d3ce87c71dae6711fbd788c10b41 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-11-24T15:00:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_SabrinaIsabelCostadeCarvalho.pdf: 3345455 bytes, checksum: 3215d3ce87c71dae6711fbd788c10b41 (MD5) / As pimentas são parte da riqueza cultural e do valioso patrimônio genético da biodiversidade brasileira. O desenvolvimento de novas cultivares de pimentas e híbridos com características agronômicas e industriais de interesse depende da variabilidade disponível dos seus recursos genéticos. O objetivo geral desse trabalho foi realizar estudos filogenéticos e de diversidade genética em Capsicum utilizando marcadores moleculares e características morfológicas visando subsidiar ações de conservação e uso de recursos genéticos de C. frutescens e C. chinense em programas de melhoramento para o desenvolvimento de tipos varietais brasileiros como a pimenta malagueta. Os objetivos específicos foram: estudar a filogenia e a diversidade genética de Capsicum spp. com base em marcadores ISSR (Inter Simple Sequence Repeat) e características morfológicas relacionadas ao grau de domesticação; analisar a transferibilidade de primers microssatélites (SSR - Simple Sequence Repeats) de C. annuum para C. frutescens e C. chinense; confirmar a existência de híbridos naturais; caracterizar a coleção ativa de germoplasma de C. frutescens da Embrapa Hortaliças; estabelecer uma coleção nuclear de C. frutescens e comparar a coleção nuclear à população base do melhoramento. As ações de pesquisa foram realizadas na Embrapa Hortaliças, Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia e Embrapa Cerrados, localizadas em Brasília, DF. Quatro acessos silvestres coletados na região Amazônica (CNPH 4315, CNPH 4325B, CNPH 4337 e CNPH 4372), popularmente conhecidos como olho-de-peixe ou olho-de periquito, foram caracterizados utilizando marcadores ISSR como C. chinense e apresentaram frutos com características típicas de espécie silvestre. O acesso silvestre CNPH 4353, conhecido como malaguetinha foi morfologicamente e molecularmente classificado como C. frutescens. É possível, ainda, que esses materiais coletados na Bacia Amazônica, considerada a maior área de diversidade de C. chinense, compartilhem das mesmas características morfológicas dos ancestrais silvestres dessa espécie. A transferibilidade de um conjunto de primers SSR de C. annuum foi testada para as espécies C. frutescens e C. chinense. Dos 185 primers SSR de C. annuum (CA) analisados, 116 (62,7%) apresentaram transferibilidade para as duas espécies. Destes, 19 (16,37%) apresentaram-se polimórficos com uma média de 2,89 alelos por loco para C. frutescens e 35 (30,17%) mostraram polimorfismo com uma média de 3,3 alelos por loco para C. chinense. Com base no estudo da transferibilidade, 17 primers CA podem ser utilizados para se analisar amostras constituídas por C. chinense e C. frutescens. Essas duas espécies são muito próximas geneticamente, sendo difícil a distinção dos acessos, principalmente considerando-se a possibilidade de ocorrência de híbridos naturais. Para confirmar a ocorrência de híbridos interespecíficos naturais, foram realizados testes de viabilidade polínica e compatibilidade genética, caracterização morfológica, caracterização molecular e teor de capsaicinóides. Os resultados mostraram que, embora as espécies C. chinense e C. frutescens apresentem similaridades e características compartilhadas com sobreposição de caracteres morfológicos, são de fato distintas pelas análises com marcadores SSR. Testes de viabilidade polínica e de compatibilidade genética mostraram CNPH 4325A e CNPH 4361 como resultados de hibridização natural, em especial o acesso CNPH 4361, que apresentou características morfológicas de ambas as espécies, posição intermediária tanto no dendrograma como no gráfico de dispersão na análise molecular, ocorrência de alelos em heterozigose em seis loci e conteúdo intermediário de capsaicina, de 154 mil SHU. A avaliação da variabilidade genética dos 115 acessos que compõem a coleção ativa de germoplasma de C. frutescens da Embrapa Hortaliças foi realizada com base em 57 características morfológicas e 239 alelos de 24 loci de marcadores SSR. Este estudo permitiu a formação de seis grupos de similaridade em cada uma das análises e mostrou que os acessos são divergentes, havendo variabilidade genética para desenvolvimento de cultivares de C. frutescens para diversos nichos como: comercialização in natura e produção de conservas e molhos. Os marcadores SSR demonstraram maior capacidade de discriminação em relação aos descritores morfológicos. A altura e a largura das plantas foram as variáveis que apresentaram maior contribuição no índice de diversidade genética. Foi possível o estabelecimento da coleção nuclear com 13 acessos de C. frutescens representando 77% da variabilidade genética da coleção ativa, utilizando-se 239 alelos de 24 loci de marcadores moleculares SSR, 57 características morfológicas e diferentes estratégias de seleção. A melhor estratégia para formação da coleção nuclear foi evidenciada pela seleção dos acessos nos diferentes grupos de similaridade estabelecidos por marcadores moleculares SSR e incidência de viroses. Características morfológicas e moleculares foram utilizadas para avaliar e comparar a variabilidade genética dessa coleção nuclear (13 acessos), de uma população base de melhoramento genético (6 acessos) e de uma coleção ativa (104 acessos) de C. frutescens. Verificou-se maior variabilidade genética entre os acessos da coleção nuclear em relação à população base, tanto na caracterização morfológica quanto na molecular. Os resultados demonstram que os acessos da coleção nuclear podem aumentar a base genética dos programas de melhoramento genético de C. frutescens, maximizando as possibilidades de combinações gênicas desejáveis. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Peppers are part of the cultural wealth and of the valuable genetic patrimony of the Brazilian biodiversity. The development of new pepper cultivars and hybrids with agronomic and industrial traits of interest relies on the variability of the genetic resources available. The overall objective of this work was to study phylogenetics and genetic diversity in Capsicum using molecular markers as well as morphologic characteristics to subsidize conservation and use of genetic resources of C. frutescens and C. chinense in breeding programs for the development of Brazilian varietal types such as the malagueta pepper. The specific objectives were: to study phylogenetics and genetic diversity of Capsicum spp. based on ISSR (Inter Simple Sequence Repeat) markers and morphological characteristics related to the degree of domestication; to analyze the transferability of microsatellite primers (SSR - Simple Sequence Repeats) from C. annuum to C. frutescens and C. chinense; to confirm the existence of natural hybrids; to characterize the C. frutescens active germplasm collection of Embrapa Vegetables; to establish a core collection of C. frutescens and to compare the core collection to the base population of a breeding program. The research activities were carried out at Embrapa Vegetables, Embrapa Genetic Resources and Biotechnology and Embrapa Cerrados, in Brasilia, Federal District. Four wild accessions collected in the Amazon region (CNPH 4315, CNPH 4325B, CNPH 4337 and CNPH 4372) popularly known as olho-de-peixe or olho-de-periquito, were characterized using ISSR as C. chinense and presented fruits with traits typical of wild species. The wild accession CNPH 4353 known as malaguetinha was morphologically and molecularly classified as C. frutescens. Probably, these accessions collected in the Amazon Basin, the area with the largest diversity of C. chinense, share morphological characteristics with wild ancestors of this species. Transferability of a set of microsatellite primers of C. annuum was tested for the species C. frutescens and C. chinense. From the 185 C. annuum SSR primers (CA) analyzed, 116 (62.7%) showed transferability for both species. Of them, 19 (16.37%) were polymorphic with an average of 2.89 alleles per locus for C. frutescens and 35 (30.17%) showed polymorphism with an average of 3.3 alleles per locus for C. chinense. Based on the study of transferability, 17 CA primers can be used to analyze samples of C. chinense and C. frutescens. These two species are genetically very similar, making it difficult to distinguish the accessions, especially considering the possibile occurence of natural hybrids. To confirm the occurrence of natural interspecific hybrids, pollen viability and genetic compatibility tests were carried out, as well as morphological and molecular characterization with the analysis of capsaicinoids content. Although the species C. chinense and C. frutescens share similarities with overlapping morphological characteristics, they are actually different by analysis with SSR primers. Pollen viability and genetic compatibility tests pointed CNPH 4325A and CNPH 4361 as a result of natural hybridization, especially CNPH 4361, which showed morphological characteristics typical of both species, intermediate position in the dendrogram and in the scatter plot of the molecular analysis, occurrence of heterozygous alleles at six loci and intermediate content of capsaicin, of 154,000 SHU. The genetic variability of 115 accessions that compose the C. frutescens active germplasm collection of Embrapa Vegetables was based on 57 morphological characteristics and 239 alleles from 24 SSR loci. This study allowed the formation of six similarity groups in each analysis and showed that the accessions are diverse, presenting genetic variability for the development of cultivars of C. frutescens for a number of markets, such as the fresh-fruit and the processed-fruit (canning and sauces) markets. The SSR markers showed greater capacity for discrimination of morphological descriptors. Height and width of plants were the variables that showed the highest contribution to the coefficient of genetic diversity. A core collection was settled with 13 accessions of C. frutescens representing 77 % of the genetic variability of the active collection, gathering 239 alleles of 24 SSR loci, 57 morphological and agronomic characteristics and different selection strategies. The best strategy for settling the core collection was evidenced by the selection of accessions from different groups of similarity of the SSR analysis associated to the evaluation of incidence of viruses. Morphologic, agronomic and molecular characteristics were used to evaluate and compare the genetic variability of this core collection (13 accessions), a base population of the breeding program (6 accessions) an active collection (104 accessions) of C. frutescens. A higher genetic variability among accessions of the core collection was verified in comparison to the base population, both in the morphological and molecular characterization. The results show that accessions of the core collection can improve the genetic base of breeding programs of C. frutescens, maximizing the chances of desirable gene combinations.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária, Programa de Pós-Graduação em Agronomia, 2015. / Submitted by Ana Cristina Barbosa da Silva (annabds@hotmail.com) on 2015-05-14T17:35:29Z No. of bitstreams: 1 2015_PaulaAndreaOsorioCarmona.pdf: 1970624 bytes, checksum: 1f6ffa3c7c7744ea2032f86ac0768750 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2015-05-15T12:07:31Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015_PaulaAndreaOsorioCarmona.pdf: 1970624 bytes, checksum: 1f6ffa3c7c7744ea2032f86ac0768750 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-05-15T12:07:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015_PaulaAndreaOsorioCarmona.pdf: 1970624 bytes, checksum: 1f6ffa3c7c7744ea2032f86ac0768750 (MD5) / A batata-doce é uma importante cultura tuberosa cultivada em regiões tropicais, subtropicais e temperadas do mundo. É conhecida como uma excelente fonte de vitaminas do complexo B, ácido ascórbico, α-tocoferol, fibra dietética, minerais e polissacarídeos. Adicionalmente, algumas variedades são rica fonte de fitoquímicos, como o β-caroteno, precursor da vitamina A e antocianinas, compostos fenólicos que apresentam diversas funções fisiológicas no organismo humano. Contudo, vários fatores são limitantes para a produção da cultura; dentre eles, a ocorrência de insetos de solo e nematoides, que danificam severamente as raízes tuberosas, depreciando a sua aparência e provocando danos diretos à produção. Foram realizados três experimentos em campo com o objetivo de avaliar características morfoagronômicas e físico-químicas e a resistência a insetos de solo de clones de batata-doce; e um experimento em casa de vegetação visando avaliar a reação de genótipos de batata-doce à infecção por M. javanica, M. incognita raça 1 e M. enterolobii em Brasília - DF. No primeiro ensaio foram estudados 23 genótipos, sendo avaliados 17 caracteres morfoagronômicos e físico-químicos das raízes. Constatou-se que a maioria dos materiais genéticos avaliados foram similares com relação aos descritores utilizados. Porém há possibilidade de obtenção de variabilidade genética e genótipos superiores, cruzando-se genitores dissimilares como o clone CNPH 69, que se destacou por suas altas produtividades comercial e total; o clone CNPH 59, que apresentou altas produtividades e altos teores de matéria seca e de sólidos solúveis totais; o clone CNPH 80, que exibiu bom formato e moderada resistência aos insetos de solo; a cultivar Brazlândia Rosada, que apresentou altos teores de amido e alta produtividade e o acesso CNPH 55, que mostrou o maior teor de proteína e alto teor de fibra bruta. No segundo experimento foram caracterizados morfoagronomicamente 26 genótipos de batata-doce. Posteriormente avaliaram-se as características físico-químicas de 13 materiais. As cultivares Brazlândia Roxa, Beauregard, BRS Rubissol, Princesa e Brazlândia Branca e os clones CNPH 60, CNPH 46, CNPH 1796 e CNPH 08, com altas produtividades, atingiram mais de 80% de raízes comerciais. Os clones CNPH 1796, CNPH 80, CNPH 08 e CNPH 05 mostraram aptidão para mesa. Os acessos CNPH 69 e CNPH 66 podem ser boas alternativas para processamento industrial ou alimentação animal. Os clones CNPH 05, CNPH 1232 e a cultivar Beauregard proporcionaram os maiores teores de fibra bruta. Os genótipos CNPH 05, BRS Rubissol, Beauregard e CNPH 1796, destacaram-se com relação aos conteúdos mais elevados de proteína bruta. Foi observado na cultivar Brazlândia Roxa o maior rendimento de amido. As maiores concentrações de carotenoides foram observadas nos genótipos Beauregard, BRS Amélia e CNPH 1232. No terceiro ensaio foi avaliado o desempenho morfoagronômico de 30 genótipos de batata-doce. Verificou-se que os clones CNPH 1232, CNPH 1357, CNPH 1298, CNPH 1197 e CNPH 1208 e as cultivares Beauregard e Brazlândia Branca destacaram-se quanto ao rendimento total de raízes. Os clones CNPH 1310 e CNPH 1192, com altas produtividades totais, apresentaram suscetibilidade aos insetos de solo e os formatos menos desejáveis. As características produtividade comercial, número de raízes comerciais por planta, produtividade total, comprimento, diâmetro, porcentagem de raízes comerciais, formato e número total de raízes por planta, evidenciaram alta presença do componente genético na expressão destes caracteres e grande possibilidade de sucesso com a seleção. No quarto experimento o trabalho objetivou avaliar o nível de resistência de 44 genótipos de batata-doce aos nematoides-das-galhas do gênero Meloidogyne (M. javanica, M. incógnita raça 1 e M. enterolobii). A classificação dos níveis de resistência foi realizada de acordo com o fator de reprodução dos nematoides. M. javanica foi a espécie menos agressiva infectando 9,09% dos genótipos. A raça 1 de M. incognita reproduziu-se exitosamente em 47,73% dos materiais. M. enterolobii foi a espécie mais virulenta tendo como hospedeiros suscetíveis 79,55% dos clones avaliados. Dos 44 genótipos de batata-doce avaliados, 52,27% foram resistentes a M. javanica e M. incognita raça 1; 18,18% foram resistentes à infecção por M. javanica e M. enterolobii e 13,64% foram resistentes a M. incognita raça 1 e M. enterolobii e simultaneamente a M. javanica, M. incognita raça 1 e M. enterolobii. As correlações entre a resistência à infecção por M. javanica, M. incognita raça 1 e M. enterolobii e as cores da periderme e da polpa dos tubérculos não foram estatisticamente significativas. / Sweet potato is an important tuberous crop grown in the tropics, sub-tropics and warm temperate regions of the world. It is known as an excellent source of B vitamins, ascorbic acid, α-tocopherol, dietary fiber, minerals and polysaccharides. Additionally, some varieties are rich source of phytochemicals, such as β-carotene, vitamin A precursor and anthocyanins, phenolic compounds which show various physiological functions in the human body. However, several factors are limiting for the production of the culture; among them, the occurrence of soil insects and nematodes, which severely damage the tuberous roots, depreciating their appearance and causing direct damage to the production. Three experiments were conducted, with the objective of evaluating morphoagronomic and physicochemical characteristics and the resistance to soil insects of sweet potato clones; and one experiment in greenhouse to evaluate the reaction of sweet potato genotypes to infection by M. javanica, M. incognita race 1 and M. enterolobii in Brasília - DF. In the first experiment, 23 genotypes were studied, being evaluated 17 morphoagronomic and physicochemical characteristics of the roots. It was found that the most of the genotypes analyzed is similar with respect to the descriptors used. However, it is possible to obtain genetic variability and superior genotypes, crossing genetically dissimilar parents as the CNPH 69 clone, which stood out for its high marketable and total yield; the CNPH 59 clone, which in addition to its high productivity showed high content of dry matter and total soluble solids; the CNPH 80 clone, which exhibited good shape and moderate resistance to soil insects; the Brazlândia Rosada cultivar, which showed high levels of starch and productivity and the CNPH 55 access; which showed the highest protein content and high crude fiber content. In the second experiment were characterized morpho-agronomically 26 sweet potato genotypes. Subsequently, the physicochemical characteristics of 13 materials were evaluated. The Brazlândia Roxa, Beauregard, BRS Rubissol, Princesa and Brazlândia Branca cultivars and the CNPH 60, CNPH 46, CNPH 1796 and CNPH 08 clones, with high total yield, reached more than 80% of marketable roots. The CNPH 1796, CNPH 80, CNPH 08 and CNPH 05 clones showed suitability for human consumption. The CNPH 69 and CNPH 66 accessions can be good alternatives for industrial processing or animal feed. The CNPH 05, CNPH 1232 clones and the Beauregard cultivar provided the highest crude fiber contents. The CNPH 05, BRS Rubissol, Beauregard and CNPH 1796 genotypes, stood out in relation to the highest crude protein contents. The Brazlândia Roxa cultivar showed the highest yield of starch. The highest total carotenoids content were observed in the Beauregard, BRS Amélia and CNPH 1232 genotypes. In the third experiment the morphoagronomic performance of 30 sweet potato genotypes was evaluated. It was found that the CNPH 1232, CNPH 1357, CNPH 1298, CNPH 1197 and CNPH 1208 clones and the Beauregard and Brazlândia Branca cultivars, stood out in relation to the total yield of roots. The CNPH 1310 and CNPH 1192 clones, with high total yields, showed susceptibility to soil insects and the less desirable shapes of roots. The characteristics marketable yield, number of marketable roots per plant, total yield, length, diameter, percentage of marketable roots, shape and total number of roots per plant, showed high presence of the genetic component in the expression of these characteristics and great possibility of successful with the selection. In the fourth experiment, the study aimed to evaluate the resistance level of 44 sweet potato genotypes to root-knot nematodes of the genus Meloidogyne (M. javanica, M. incognita raça 1 e M. enterolobii). The classification of the resistance levels was defined by the nematodes reproduction factors. M. javanica was the less aggressive specie infecting 9.09% of the genotypes. M. incognita race 1 reproduced successfully on 47.73% of the materials. M. enterolobii was the most virulent specie, which had as susceptible hosts 79.55% of the clones. Among the 44 sweet potato genotypes studied, 52.27% were resistant to M. javanica and M. incognita race 1; 18.18% were resistant to the infection by M. javanica and M. enterolobii and 13.64% were resistant to M. incognita race 1 and M. enterolobii and simultaneously to M. javanica, M. incognita race 1 and M. enterolobii. Correlations between the resistance to the infection by M. javanica, M. incognita race 1 and M. enterolobii and the colors of periderm and flesh of storage roots were not statistically significant.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Departamento de Biologia Celular, 2012. / Submitted by Alaíde Gonçalves dos Santos (alaide@unb.br) on 2013-06-24T14:51:11Z No. of bitstreams: 1 2012_CarolinaPaolaSansaloni.pdf: 5318992 bytes, checksum: dde47187b1abc046f14521cb2bd0972f (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2013-06-24T15:28:37Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_CarolinaPaolaSansaloni.pdf: 5318992 bytes, checksum: dde47187b1abc046f14521cb2bd0972f (MD5) / Made available in DSpace on 2013-06-24T15:28:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_CarolinaPaolaSansaloni.pdf: 5318992 bytes, checksum: dde47187b1abc046f14521cb2bd0972f (MD5) / Espécies de Eucalyptus tem sido utilizadas com sucesso para plantios florestais devido ao seu rápido crescimento, sua capacidade de adaptação às diversas condições edafo-climáticas e pelo seu potencial econômico na produção de energia, fibra e madeira sólida, reduzindo assim a pressão sobre as florestas tropicais e a biodiversidade associada. Marcadores moleculares tais como RAPD, AFLP, microssatélites, e mais recentemente SFP e SNPs têm contribuído para a caracterização e conservação dos recursos genéticos do gênero Eucalyptus, auxiliando também na compreensão da evolução do gênero, além de permitir a construção de mapas de ligação e identificação de QTLs (Quantitative trait loci). Entretanto, estas técnicas são lentas, laboriosas, apresentam limitações de cobertura genômica e envolvem custos elevados para a análise de muitos indivíduos. Diversity Arrays Technology (DArT) é um método baseado em hibridização que permite genotipar centenas a milhares de marcadores num simples ensaio. Esta tecnologia gera um perfil genômico com um alto rendimento e um grande poder de transferibilidade entre espécies. Neste trabalho é apresentado o desenvolvimento da primeira plataforma de genotipagem de alto desempenho de marcadores DArTs em microarranjo para o gênero Eucalyptus, e demonstrada sua eficiência em estudos de diversidade genética, filogenia e mapeamento genético. Foram desenvolvidas 18 bibliotecas genômicas de complexidade reduzida a partir de 64 espécies diferentes do gênero. Um total de 23.808 fragmentos de DNA foram avaliados para revelação de polimorfismos DArT, e 13.300 (56%) destes declarados polimórficos entre um painel de triagem composto por 284 indivíduos. Destes, 7.680 marcadores foram selecionados para a construção de um microarranjo de genotipagem para uso em rotina. Em um estudo de diversidade intra-específica, 4.752 marcadores foram polimórficos e 5.013 mostraram segregação mendeliana em seis populações segregantes não relacionadas, com uma média de 2.211 marcadores polimórficos por população. Na etapa seguinte do trabalho, foi otimizada a tecnologia de genotipagem por sequenciamento DArT-seq para a construção de um mapa genético de alta densidade para uma população segregante do cruzamento entre árvores elite de E. grandis (BRASUZ1 x M4D31). A população foi genotipada com o microarranjo DArT e com a técnica DArTseq. Enquanto o microarranjo DArT forneceu 1.088 marcadores, a genotipagem DArT-seq forneceu 2.449. No total, um mapa de ligação integrado por 564 marcadores DArT, 1.930 marcadores DArTseq e 29 microssatélites foi construído. Além destes marcadores, mais de 1.500 SNPs derivados da metodologia DArT-seq foram obtidos proporcionando uma vantagem adicional pela inclusão de marcadores co-dominantes no mapa. O desenvolvimento de metodologias de genotipagem por sequenciamento (GbS) via enzimas de restrição como DArT-seq ou captura com sondas, representa uma aplicação adicional das tecnologias de "next generation sequencing" além do sequenciamento, 2 potencializando a análise genética com marcadores moleculares. A combinação do elevado número de marcadores, baixo custo, metodologia relativamente accessível e uso de reagentes universais, aponta para um uso crescente de GbS nos próximos anos nas mais diversas aplicações em estudos de genética de populações, investigações evolutivas e em apoio ao melhoramento acelerando e aumentando a precisão da seleção direcional de características multifatoriais complexas. _______________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Species of Eucalyptus have been successfully used for forest plantations due to its rapid growth, its ability to adapt to various soil and climatic conditions and its economic use in energy, fiber and solid wood, reducing pressure on tropical forests and associated biodiversity. Molecular markers such as RAPD, AFLP, microsatellites, and more recently SFP and SNPs have contributed to the characterization and conservation of genetic resources of the genus, to the understanding of the evolution of the genus, and allowing the construction of linkage and QTLs maps. However, these techniques are slow, laborious, provide limited genome coverage and are costly for the analysis of large sample sizes. Diversity Arrays Technology (DArT) is a hybridization-based method that allows genotyping hundreds to thousands of markers in a single assay. This technology generates a genomic profile with high throughput and transferability between species. This study presents the development of the first high throughput genotyping platform for species of Eucalyptus based on a DArT microarray and demonstrates its use for diversity, phylogeny and mapping studies. A total of 18 reduced representation genomic libraries from 64 different species of the genus were developed. A total of 23,808 DNA fragments were screened for polymorphism and 13,300 (56%) of them declared polymorphic in a panel of 284 individuals. Out of these, 7,680 markers were selected to populate a routine DArT genotyping microarray. In an inter-specific diversity study, 4,752 were deemed polymorphic while 5,013 showed Mendelian segregation when assessed in six inter-specific mapping pedigrees, with an average of 2,211 polymorphic markers per pedigree. The subsequent step of the study, involved the optimization of the genotyping-by-sequencing technology called DArT-seq to construct a high density genetic map for a segregating population derived from the E. grandis elite trees (BRASUZ1 x M4D31). The population was genotyped both with the DArT microarray and with DArT-seq. While the DArT microarray yielded 1,088 markers, the DArT-seq method supplied 2,449 markers. In total, an integrated linkage map with 564 DArT markers, 1,930 DArT-NGS markers and 29 microsatellites was built. Besides these mapped markers, an additional set of over 1,500 SNPs derived from DArT-seq were scored providing an additional advantage by the inclusion of co-dominant markers on the map. The development of genotyping by sequencing (GBS) 3 methods via restriction enzymes as DART-seq or capture probes, represents a further application of the technologies of "next generation sequencing" beyond sequencing, empowering the genetic analysis with molecular markers. The combination of the large number of markers, low cost, relatively accessible methodology and use of universal reagents, points to an increased use of GBS in the coming years in several applications in studies of population genetics, evolutionary investigations and in support to plant breeding accelerating and increasing accuracy of directional selection for complex multi-factorial traits.