A macieira (Malus x domestica Borkh.) é uma frutífera de grande importância econômica que apresenta dormência invernal. Sua produtividade depende da superação da dormência, a qual é dependente de um somatório de períodos de frio hibernal. Este somatório é variável entre genótipos. Análises gênicas permitiram demonstrar que as vias de síntese de hormônios são diferencialmente ativadas ou reprimidas na dormência e na brotação de macieiras e outros vegetais. Apesar do avanço na compreensão da regulação gênica deste mecanismo, ainda existem carências da compreensão das vias de regulação de metabólitos nesta fase. A gema dormente é um material difícil de ser trabalhado por apresentar tecidos lignificados ricos em pigmentos e compostos fenólicos e com alta tendência à oxidação. Pelo presente trabalho, teve-se por foco o desenvolvimento de método de extração, purificação e detecção/quantificação de hormônios vegetais nas gemas dormentes de macieira e a utilização desse método na caracterização do balanço hormonal destas gemas. O método desenvolvido é sensível e preciso, com capacidade de análise de sete hormônios vegetais (ABA, GA3, GA4, IAA, JA, SA e Zea), tanto em gemas dormentes como em tecidos pigmentados, lignificados e com alto efeito matriz. Foram coletadas amostras de gemas de macieira ao longo da dormência de cultivares com requerimento de frio contrastante (Gala Standard e Castel Gala, requerentes de 600 e 300 horas de frio, respectivamente), sobre porta-enxertos com contrastes de vigor (alto vigor, Maruba; médio vigor, Maruba/M9; e baixo vigor, M9), ao longo de um inverno com alta oferta de frio para a região (901 CH in 2016). A modulação hormonal de gemas dormentes foi semelhante entre as cultivares mesmo com fenótipos de brotação diferentes. Não houve quantificação dos hormônios propostos no começo da endodormência. ABA e GA4 foram os principais reguladores da dormência em um mecanismo muito similar ao da dormência de sementes. Porta-enxertos podem atrasar a brotação com estímulo de carga de ABA, como ocorre com M9. Isso demonstra o papel fundamental dos hormônios na dormência e como o estudo de porta-enxertos pode ajudar no desenvolvimento da pomicultura. / The apple tree (Malus x domestica Borkh.) is an economically important fruit tree that presents winter dormancy. Its productivity depends on dormancy overcoming, which is dependent on a sum of periods of chilling during winter. This sum is variable among genotypes. Genetic analyses allowed to show that hormonal biosynthetic pathways are differentially activated or repressed in dormancy and sprouting in apple trees and other plants. Despite the advances in the understanding of the genetic regulation during this mechanism, there is still a lack of knowledge about relevant metabolic pathways in this phase. The dormant bud is a difficult material to work with since it presents lignified tissues with pigments and phenolic compounds that are highly susceptible to oxidation. The present work focused on the development of a method for the extraction, purification and detection/quantification of plant hormones in apple dormant buds and the use of this method to characterize the hormonal balance in these gems. The developed method is sensitive and accurate, allowing the analyses of seven plant hormones (ABA, GA3, GA4, IAA, JA, SA and Zea) in dormant buds or in pigmented, lignified tissues highly susceptible to matrix effect. Samples of apple buds were collected along the dormancy period from cultivars with contrasting cold requirements (Gala Standard and Castel Gala, which require 600 and 300 chilling hours, respectively), on rootstocks with contrasting vigor (high vigor, Maruba; medium vigor, Maruba/M9; and low vigor, M9), during a particularly cold winter to the region (901 CH in 2016). The hormonal modulation of dormant buds was similar among cultivars even with different bud break phenotypes. There was no quantification of the proposed hormones at the beginning of endodormancy. ABA and GA4 were the main regulators of dormancy in a cold year by a mechanism very similar to that found in seed dormancy. Rootstocks may delay bud break with ABA loading stimulus, as occurs with M9. This demonstrates the key role of hormones in dormancy and how the study of rootstocks may help the development of pomiculture.

A macieira (Malus x domestica Borkh.) é uma frutífera de grande importância econômica que apresenta dormência invernal. Sua produtividade depende da superação da dormência, a qual é dependente de um somatório de períodos de frio hibernal. Este somatório é variável entre genótipos. Análises gênicas permitiram demonstrar que as vias de síntese de hormônios são diferencialmente ativadas ou reprimidas na dormência e na brotação de macieiras e outros vegetais. Apesar do avanço na compreensão da regulação gênica deste mecanismo, ainda existem carências da compreensão das vias de regulação de metabólitos nesta fase. A gema dormente é um material difícil de ser trabalhado por apresentar tecidos lignificados ricos em pigmentos e compostos fenólicos e com alta tendência à oxidação. Pelo presente trabalho, teve-se por foco o desenvolvimento de método de extração, purificação e detecção/quantificação de hormônios vegetais nas gemas dormentes de macieira e a utilização desse método na caracterização do balanço hormonal destas gemas. O método desenvolvido é sensível e preciso, com capacidade de análise de sete hormônios vegetais (ABA, GA3, GA4, IAA, JA, SA e Zea), tanto em gemas dormentes como em tecidos pigmentados, lignificados e com alto efeito matriz. Foram coletadas amostras de gemas de macieira ao longo da dormência de cultivares com requerimento de frio contrastante (Gala Standard e Castel Gala, requerentes de 600 e 300 horas de frio, respectivamente), sobre porta-enxertos com contrastes de vigor (alto vigor, Maruba; médio vigor, Maruba/M9; e baixo vigor, M9), ao longo de um inverno com alta oferta de frio para a região (901 CH in 2016). A modulação hormonal de gemas dormentes foi semelhante entre as cultivares mesmo com fenótipos de brotação diferentes. Não houve quantificação dos hormônios propostos no começo da endodormência. ABA e GA4 foram os principais reguladores da dormência em um mecanismo muito similar ao da dormência de sementes. Porta-enxertos podem atrasar a brotação com estímulo de carga de ABA, como ocorre com M9. Isso demonstra o papel fundamental dos hormônios na dormência e como o estudo de porta-enxertos pode ajudar no desenvolvimento da pomicultura. / The apple tree (Malus x domestica Borkh.) is an economically important fruit tree that presents winter dormancy. Its productivity depends on dormancy overcoming, which is dependent on a sum of periods of chilling during winter. This sum is variable among genotypes. Genetic analyses allowed to show that hormonal biosynthetic pathways are differentially activated or repressed in dormancy and sprouting in apple trees and other plants. Despite the advances in the understanding of the genetic regulation during this mechanism, there is still a lack of knowledge about relevant metabolic pathways in this phase. The dormant bud is a difficult material to work with since it presents lignified tissues with pigments and phenolic compounds that are highly susceptible to oxidation. The present work focused on the development of a method for the extraction, purification and detection/quantification of plant hormones in apple dormant buds and the use of this method to characterize the hormonal balance in these gems. The developed method is sensitive and accurate, allowing the analyses of seven plant hormones (ABA, GA3, GA4, IAA, JA, SA and Zea) in dormant buds or in pigmented, lignified tissues highly susceptible to matrix effect. Samples of apple buds were collected along the dormancy period from cultivars with contrasting cold requirements (Gala Standard and Castel Gala, which require 600 and 300 chilling hours, respectively), on rootstocks with contrasting vigor (high vigor, Maruba; medium vigor, Maruba/M9; and low vigor, M9), during a particularly cold winter to the region (901 CH in 2016). The hormonal modulation of dormant buds was similar among cultivars even with different bud break phenotypes. There was no quantification of the proposed hormones at the beginning of endodormancy. ABA and GA4 were the main regulators of dormancy in a cold year by a mechanism very similar to that found in seed dormancy. Rootstocks may delay bud break with ABA loading stimulus, as occurs with M9. This demonstrates the key role of hormones in dormancy and how the study of rootstocks may help the development of pomiculture.

A macieira (Malus x domestica Borkh.) é uma frutífera de grande importância econômica que apresenta dormência invernal. Sua produtividade depende da superação da dormência, a qual é dependente de um somatório de períodos de frio hibernal. Este somatório é variável entre genótipos. Análises gênicas permitiram demonstrar que as vias de síntese de hormônios são diferencialmente ativadas ou reprimidas na dormência e na brotação de macieiras e outros vegetais. Apesar do avanço na compreensão da regulação gênica deste mecanismo, ainda existem carências da compreensão das vias de regulação de metabólitos nesta fase. A gema dormente é um material difícil de ser trabalhado por apresentar tecidos lignificados ricos em pigmentos e compostos fenólicos e com alta tendência à oxidação. Pelo presente trabalho, teve-se por foco o desenvolvimento de método de extração, purificação e detecção/quantificação de hormônios vegetais nas gemas dormentes de macieira e a utilização desse método na caracterização do balanço hormonal destas gemas. O método desenvolvido é sensível e preciso, com capacidade de análise de sete hormônios vegetais (ABA, GA3, GA4, IAA, JA, SA e Zea), tanto em gemas dormentes como em tecidos pigmentados, lignificados e com alto efeito matriz. Foram coletadas amostras de gemas de macieira ao longo da dormência de cultivares com requerimento de frio contrastante (Gala Standard e Castel Gala, requerentes de 600 e 300 horas de frio, respectivamente), sobre porta-enxertos com contrastes de vigor (alto vigor, Maruba; médio vigor, Maruba/M9; e baixo vigor, M9), ao longo de um inverno com alta oferta de frio para a região (901 CH in 2016). A modulação hormonal de gemas dormentes foi semelhante entre as cultivares mesmo com fenótipos de brotação diferentes. Não houve quantificação dos hormônios propostos no começo da endodormência. ABA e GA4 foram os principais reguladores da dormência em um mecanismo muito similar ao da dormência de sementes. Porta-enxertos podem atrasar a brotação com estímulo de carga de ABA, como ocorre com M9. Isso demonstra o papel fundamental dos hormônios na dormência e como o estudo de porta-enxertos pode ajudar no desenvolvimento da pomicultura. / The apple tree (Malus x domestica Borkh.) is an economically important fruit tree that presents winter dormancy. Its productivity depends on dormancy overcoming, which is dependent on a sum of periods of chilling during winter. This sum is variable among genotypes. Genetic analyses allowed to show that hormonal biosynthetic pathways are differentially activated or repressed in dormancy and sprouting in apple trees and other plants. Despite the advances in the understanding of the genetic regulation during this mechanism, there is still a lack of knowledge about relevant metabolic pathways in this phase. The dormant bud is a difficult material to work with since it presents lignified tissues with pigments and phenolic compounds that are highly susceptible to oxidation. The present work focused on the development of a method for the extraction, purification and detection/quantification of plant hormones in apple dormant buds and the use of this method to characterize the hormonal balance in these gems. The developed method is sensitive and accurate, allowing the analyses of seven plant hormones (ABA, GA3, GA4, IAA, JA, SA and Zea) in dormant buds or in pigmented, lignified tissues highly susceptible to matrix effect. Samples of apple buds were collected along the dormancy period from cultivars with contrasting cold requirements (Gala Standard and Castel Gala, which require 600 and 300 chilling hours, respectively), on rootstocks with contrasting vigor (high vigor, Maruba; medium vigor, Maruba/M9; and low vigor, M9), during a particularly cold winter to the region (901 CH in 2016). The hormonal modulation of dormant buds was similar among cultivars even with different bud break phenotypes. There was no quantification of the proposed hormones at the beginning of endodormancy. ABA and GA4 were the main regulators of dormancy in a cold year by a mechanism very similar to that found in seed dormancy. Rootstocks may delay bud break with ABA loading stimulus, as occurs with M9. This demonstrates the key role of hormones in dormancy and how the study of rootstocks may help the development of pomiculture.

A macieira (Malus x domestica Borkh.) é uma frutífera de clima temperado que possui grande importância econômica mundialmente, sendo sua produtividade intimamente relacionada à saída do processo de dormência hibernal. Este processo pode ser definido como a incapacidade da planta iniciar o crescimento meristemático mesmo sob condições favoráveis e os mecanismos de controle molecular da dormência em macieiras ainda são pouco compreendidos. O objetivo do presente trabalho foi investigar o perfil gênico diferencial entre cultivares de macieiras contrastantes para requerimento de frio. As cultivares selecionadas foram Gala e sua mutante espontânea Castel Gala, as quais apresentam alto e baixo requerimento de frio, respectivamente. A técnica de hibridização supressiva subtrativa (SSH) permitiu a identificação de 28 genes candidatos à regulação da dormência. Análises de RT-qPCR foram realizadas visando a validação da expressão diferencial dos genes selecionados, assim como caracterizá-los transcricionalmente em três cultivares distintas durante um ciclo de crescimento e de dormência. Dos 28 genes candidatos, 17 apresentaram o mesmo perfil diferencial identificado por SSH. Um acúmulo sazonal de transcritos durante o inverno foi identificado para alguns genes e as cultivares de maior requerimento de frio apresentaram acúmulo de transcritos por mais tempo. Este perfil permitiu-nos sugerir que estes genes podem estar atuando na regulação dos processos de dormência e de aclimatação ao frio. Dos 17 genes validados, aqueles codificadores de proteínas DAM, desidrinas, GAST1, LTI65, NAC, histonas variantes H2A.Z e RAP2.12 apresentaram os maiores contrastes transcricionais entre as cultivares analisadas durante o inverno e constituem-se como fortes candidatos a participantes do processo de progressão da dormência em macieiras. Finalmente, a família de genes codificadores de desidrinas de macieira teve seus membros identificados e caracterizados transcricionalmente. Análises in silico permitiram a identificação de oito modelos gênicos preditos de desidrinas no genoma de macieira. As cadeias peptídicas deduzidas foram classificadas conforme a presença dos segmentos conservados YnSKn. Um perfil sazonal de regulação da expressão foi identificado, com a presença de um pico de acúmulo de transcritos durante o inverno, o que sugere a presença de um mecanismo similar de regulação entre genes de desidrinas de macieira. / Apple tree (Malus x domestica Borkh.) is a temperate fruit crop of great economic importance worldwide and its productivity is related with the release from a bud dormancy process. This process is defined as the plant inability to initiate growth from meristems under favorable conditions and molecular information about dormancy control in apple trees is limited. The aim of the present work was to investigate the differential gene expression profiles between apple tree cultivars contrasting in chilling requirement for breaking dormancy. The selected apple cultivars were Gala and its derived bud sport Castel Gala, which displays high and low chilling requirement, respectively. A suppression subtractive hybridization (SSH) assay yielded 28 candidate genes putatively associated to dormancy cycling. RT-qPCR analyses were performed in order to validate the differential expression profiles and also to transcriptionally characterize the selected genes in three distinct apple tree cultivars during a growth to dormancy cycle. Among the 28 candidate genes, 17 confirmed the differential expression profile predicted by SSH. A seasonal transcript accumulation during the winter was identified to some genes, with high chilling requirement cultivars presenting higher levels of transcripts. This profile allowed us to suggest that these genes may be acting on dormancy regulation and cold acclimation. Out of the 17 candidate genes, those coding for DAM, dehydrins, GAST1, LTI65, NAC, histone variants H2A.Z and RAP2.12 displayed major differences in gene expression between cultivars through the winter and are strong candidates to play key roles on dormancy progression in apple trees. Finally, we identified and transcriptionally characterized the dehydrin gene family in apple trees. In silico analyses allowed us to identify eight predicted gene models for dehydrins in the apple genome. Deduced polypeptides were classified according to the presence of the conserved YnSKn segments. A seasonal regulation of gene expression was observed, with higher transcript accumulation during the winter. This data suggests that a similar mechanism of transcript regulation is acting through the apple dehydrin genes.

A macieira (Malus x domestica Borkh.) é uma frutífera de clima temperado que possui grande importância econômica mundialmente, sendo sua produtividade intimamente relacionada à saída do processo de dormência hibernal. Este processo pode ser definido como a incapacidade da planta iniciar o crescimento meristemático mesmo sob condições favoráveis e os mecanismos de controle molecular da dormência em macieiras ainda são pouco compreendidos. O objetivo do presente trabalho foi investigar o perfil gênico diferencial entre cultivares de macieiras contrastantes para requerimento de frio. As cultivares selecionadas foram Gala e sua mutante espontânea Castel Gala, as quais apresentam alto e baixo requerimento de frio, respectivamente. A técnica de hibridização supressiva subtrativa (SSH) permitiu a identificação de 28 genes candidatos à regulação da dormência. Análises de RT-qPCR foram realizadas visando a validação da expressão diferencial dos genes selecionados, assim como caracterizá-los transcricionalmente em três cultivares distintas durante um ciclo de crescimento e de dormência. Dos 28 genes candidatos, 17 apresentaram o mesmo perfil diferencial identificado por SSH. Um acúmulo sazonal de transcritos durante o inverno foi identificado para alguns genes e as cultivares de maior requerimento de frio apresentaram acúmulo de transcritos por mais tempo. Este perfil permitiu-nos sugerir que estes genes podem estar atuando na regulação dos processos de dormência e de aclimatação ao frio. Dos 17 genes validados, aqueles codificadores de proteínas DAM, desidrinas, GAST1, LTI65, NAC, histonas variantes H2A.Z e RAP2.12 apresentaram os maiores contrastes transcricionais entre as cultivares analisadas durante o inverno e constituem-se como fortes candidatos a participantes do processo de progressão da dormência em macieiras. Finalmente, a família de genes codificadores de desidrinas de macieira teve seus membros identificados e caracterizados transcricionalmente. Análises in silico permitiram a identificação de oito modelos gênicos preditos de desidrinas no genoma de macieira. As cadeias peptídicas deduzidas foram classificadas conforme a presença dos segmentos conservados YnSKn. Um perfil sazonal de regulação da expressão foi identificado, com a presença de um pico de acúmulo de transcritos durante o inverno, o que sugere a presença de um mecanismo similar de regulação entre genes de desidrinas de macieira. / Apple tree (Malus x domestica Borkh.) is a temperate fruit crop of great economic importance worldwide and its productivity is related with the release from a bud dormancy process. This process is defined as the plant inability to initiate growth from meristems under favorable conditions and molecular information about dormancy control in apple trees is limited. The aim of the present work was to investigate the differential gene expression profiles between apple tree cultivars contrasting in chilling requirement for breaking dormancy. The selected apple cultivars were Gala and its derived bud sport Castel Gala, which displays high and low chilling requirement, respectively. A suppression subtractive hybridization (SSH) assay yielded 28 candidate genes putatively associated to dormancy cycling. RT-qPCR analyses were performed in order to validate the differential expression profiles and also to transcriptionally characterize the selected genes in three distinct apple tree cultivars during a growth to dormancy cycle. Among the 28 candidate genes, 17 confirmed the differential expression profile predicted by SSH. A seasonal transcript accumulation during the winter was identified to some genes, with high chilling requirement cultivars presenting higher levels of transcripts. This profile allowed us to suggest that these genes may be acting on dormancy regulation and cold acclimation. Out of the 17 candidate genes, those coding for DAM, dehydrins, GAST1, LTI65, NAC, histone variants H2A.Z and RAP2.12 displayed major differences in gene expression between cultivars through the winter and are strong candidates to play key roles on dormancy progression in apple trees. Finally, we identified and transcriptionally characterized the dehydrin gene family in apple trees. In silico analyses allowed us to identify eight predicted gene models for dehydrins in the apple genome. Deduced polypeptides were classified according to the presence of the conserved YnSKn segments. A seasonal regulation of gene expression was observed, with higher transcript accumulation during the winter. This data suggests that a similar mechanism of transcript regulation is acting through the apple dehydrin genes.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Fitopatologia, 2017. / Submitted by Fernanda Percia França (fernandafranca@bce.unb.br) on 2017-03-31T20:04:12Z No. of bitstreams: 1 2017_BiancaSamayAngelinoBonfim.pdf: 1074842 bytes, checksum: 4d1edc3bbc2f110de3b7d9cb95124ed3 (MD5) / Rejected by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br), reason: Fernanda, Por favor, verificar os metadados (resumos e assunto). Obrigada! on 2017-04-20T12:51:44Z (GMT) / Submitted by Fernanda Percia França (fernandafranca@bce.unb.br) on 2017-04-25T16:11:06Z No. of bitstreams: 1 2017_BiancaSamayAngelinoBonfim.pdf: 1074842 bytes, checksum: 4d1edc3bbc2f110de3b7d9cb95124ed3 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2017-04-27T23:19:42Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2017_BiancaSamayAngelinoBonfim.pdf: 1074842 bytes, checksum: 4d1edc3bbc2f110de3b7d9cb95124ed3 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-04-27T23:19:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017_BiancaSamayAngelinoBonfim.pdf: 1074842 bytes, checksum: 4d1edc3bbc2f110de3b7d9cb95124ed3 (MD5) / O cultivo comercial da macieira no Brasil iniciou-se na década de 70 e atualmente constitui uma atividade econômica de grande importância para a região Sul, cuja produção corresponde a 99% do total produzido no país. Apesar dos altos índices de produção, a produtividade da cultura é reduzida devido a ocorrência de pragas e doenças. Entre as principais doenças, as podridões pós-colheita destacam-se pelas perdas mais elevadas em relação as ocorridas no campo, pois além dos custos de produção, são adicionadas despesas de colheita, classificação, embalagem, transporte, armazenamento e comercialização. A podridão olho de boi é uma doença pós-colheita causada por um complexo de espécies do gênero Neofabraea, sendo que a ocorrência de cada táxon varia de acordo com a região geográfica. Por exemplo, N. alba é a única espécie relatada no Chile enquanto que N. alba, N. kienholzii e N. perennans já foram registradas na Polônia. O primeiro relato da podridão olho de boi no Brasil ocorreu em 1995 e até 2016, o agente etiológico da doença foi identificado como N. perennans. A identificação foi baseada principalmente nas características morfológicas, no entanto, estudos recentes demonstram a importância da inclusão de dados moleculares para a diferenciação das espécies. Portanto, esse trabalho tem o objetivo de identificar e caracterizar morfomolecularmente as espécies de Neofabraea associadas a podridão olho de boi e avaliar a agressividade e o crescimento micelial dos isolados em diferentes temperaturas. Os isolados foram obtidos de frutos sintomáticos coletados em Campo Belo do Sul-SC, Fraiburgo-RS, São Joaquim-SC e Vacaria-RS para extração do DNA genômico e amplificação parcial do gene da β-tubulina. Entre os 92 isolados identificados, 10 espécimes provenientes de Fraiburgo (4) e Vacaria (6) pertencem a N. actinidiae e 82 isolados obtidos em Campo Belo do Sul (15), Fraiburgo (36), São Joaquim (12) e Vacaria (19) pertencem a Neofabraea sp., indicando que a podridão olho de boi no Brasil é causada por duas espécies do gênero Neofabraea. Para a identificação precisa, isolados representativos de cada espécie e localidade foram selecionados para sequenciamento das regiões ITS, LSU, e RPB2 e para a caracterização morfológica. Após a abordagem morfomolecular, conclui-se que Neofabraea sp. e N. actinidiae ocorrem na proporção 8:1, sendo que Neofabraea sp. ocorre em Campo Belo do Sul-SC, Fraiburgo-SC, São Joaquim-SC e Vacaria-RS enquanto N. actinidiae foi encontrada somente em Fraiburgo e Vacaria. Adicionalmente, esse é o primeiro relato de N. actinidiae causando a podridão olho de boi da maçã. Isolados representativos de cada espécie e localidade foram utilizados para avaliação da agressividade e do crescimento micelial a 5°C, 17°C e 25 ºC. A agressividade foi determinada pelo tamanho das lesões em frutos de maçãs ‘Fuji’ ocasionadas pela inoculação de uma suspensão de conídios e o crescimento micelial pelo tamanho do diâmetro das colônias cultivadas em extrato de malte ágar. Após os testes, verifica-se que Neofabraea sp. é mais agressiva que N. actinidiae e que existe uma variação fisiológica intraespecífica para o crescimento micelial e a agressividade dos isolados sob diferentes temperaturas. / The commercial cultivation of apple trees in Brazil began in the 1970's and it is currently an economic activity of great importance in the country´s southern region, which accounts for 99% of the total domestic production. Despite the high fruit yields, crop productivity is limited by the occurrence of pests and diseases. Among the main diseases, postharvest rot losses are higher than field losses, due to the associated costs of harvesting, sorting, packaging, transportation, storage and commercialization. The bull’s eye rot is a post-harvest disease caused by a complex of species of the genus Neofabraea, and the occurrence of each taxon varies according to geographic region. For example N. alba is the only species reported in Chile whereas N. alba, N. kienholzii and N. perennans have already been recorded in Poland. The first report of bull’s eye rot in Brazil was made in 1995 and, until 2016, the etiological agent of the disease was identified as N. perennans. The identification was mainly based on the morphological characters, however, recent studies demonstrate the importance of the inclusion of molecular data for species differentiation. Therefore, this work aimed to identify and characterize morphologically and molecularly the Neofabraea species associated with bull’s eye rot and to evaluate the aggressiveness and mycelial growth of the isolates at different temperatures. The isolates were obtained from symptomatic fruits collected in Campo Belo do Sul-SC, Fraiburgo-RS, São Joaquim-SC and Vacaria-RS for extraction of genomic DNA and partial amplification of the β-tubulin gene. Among the 92 isolates identified, 10 specimens from Fraiburgo (4) and Vacaria (6) were shown to belong to N. actinidiae, while 82 isolates obtained from Campo Belo do Sul (15), Fraiburgo (36), São Joaquim (12) and Vacaria (19) were determined to belong to Neofabraea sp., indicating that bull’s eye rot in Brazil is caused by two species of the genus Neofabraea. For the precise identification, representative isolates of each species and locality were selected for sequencing of the ITS, LSU, and RPB2 regions and for the morphological characterization. After the morphomolecular approach, we concluded that Neofabraea sp. and N. actinidiae occur in the ratio 8:1, and Neofabraea sp. occurs in Campo Belo do Sul-SC, Fraiburgo-SC, São Joaquim-SC and Vacaria-RS whereas N. actinidiae was found only in Fraiburgo and Vacaria. Furthermore, this is the first report of N. actinidiae causing apple bull’s eye rot. Representative isolates of each species and locality were used to evaluate aggressiveness and mycelial growth at 5 ° C, 17 ° C and 25 ° C. Aggressiveness was determined by the size of lesions on 'Fuji' apple fruits following inoculation of a conidial suspension. Mycelial growth rates were determined by the size of the colonies grown in agar malt extract. Neofabraea sp. was consistently more aggressive than N. actinidiae. Additionally, an intraspecific physiological variation was found for the mycelial growth rate and isolate aggressiveness to fruits under different temperatures.

A macieira (Malus x domestica Borkh.) é uma frutífera de clima temperado que possui grande importância econômica mundialmente, sendo sua produtividade intimamente relacionada à saída do processo de dormência hibernal. Este processo pode ser definido como a incapacidade da planta iniciar o crescimento meristemático mesmo sob condições favoráveis e os mecanismos de controle molecular da dormência em macieiras ainda são pouco compreendidos. O objetivo do presente trabalho foi investigar o perfil gênico diferencial entre cultivares de macieiras contrastantes para requerimento de frio. As cultivares selecionadas foram Gala e sua mutante espontânea Castel Gala, as quais apresentam alto e baixo requerimento de frio, respectivamente. A técnica de hibridização supressiva subtrativa (SSH) permitiu a identificação de 28 genes candidatos à regulação da dormência. Análises de RT-qPCR foram realizadas visando a validação da expressão diferencial dos genes selecionados, assim como caracterizá-los transcricionalmente em três cultivares distintas durante um ciclo de crescimento e de dormência. Dos 28 genes candidatos, 17 apresentaram o mesmo perfil diferencial identificado por SSH. Um acúmulo sazonal de transcritos durante o inverno foi identificado para alguns genes e as cultivares de maior requerimento de frio apresentaram acúmulo de transcritos por mais tempo. Este perfil permitiu-nos sugerir que estes genes podem estar atuando na regulação dos processos de dormência e de aclimatação ao frio. Dos 17 genes validados, aqueles codificadores de proteínas DAM, desidrinas, GAST1, LTI65, NAC, histonas variantes H2A.Z e RAP2.12 apresentaram os maiores contrastes transcricionais entre as cultivares analisadas durante o inverno e constituem-se como fortes candidatos a participantes do processo de progressão da dormência em macieiras. Finalmente, a família de genes codificadores de desidrinas de macieira teve seus membros identificados e caracterizados transcricionalmente. Análises in silico permitiram a identificação de oito modelos gênicos preditos de desidrinas no genoma de macieira. As cadeias peptídicas deduzidas foram classificadas conforme a presença dos segmentos conservados YnSKn. Um perfil sazonal de regulação da expressão foi identificado, com a presença de um pico de acúmulo de transcritos durante o inverno, o que sugere a presença de um mecanismo similar de regulação entre genes de desidrinas de macieira. / Apple tree (Malus x domestica Borkh.) is a temperate fruit crop of great economic importance worldwide and its productivity is related with the release from a bud dormancy process. This process is defined as the plant inability to initiate growth from meristems under favorable conditions and molecular information about dormancy control in apple trees is limited. The aim of the present work was to investigate the differential gene expression profiles between apple tree cultivars contrasting in chilling requirement for breaking dormancy. The selected apple cultivars were Gala and its derived bud sport Castel Gala, which displays high and low chilling requirement, respectively. A suppression subtractive hybridization (SSH) assay yielded 28 candidate genes putatively associated to dormancy cycling. RT-qPCR analyses were performed in order to validate the differential expression profiles and also to transcriptionally characterize the selected genes in three distinct apple tree cultivars during a growth to dormancy cycle. Among the 28 candidate genes, 17 confirmed the differential expression profile predicted by SSH. A seasonal transcript accumulation during the winter was identified to some genes, with high chilling requirement cultivars presenting higher levels of transcripts. This profile allowed us to suggest that these genes may be acting on dormancy regulation and cold acclimation. Out of the 17 candidate genes, those coding for DAM, dehydrins, GAST1, LTI65, NAC, histone variants H2A.Z and RAP2.12 displayed major differences in gene expression between cultivars through the winter and are strong candidates to play key roles on dormancy progression in apple trees. Finally, we identified and transcriptionally characterized the dehydrin gene family in apple trees. In silico analyses allowed us to identify eight predicted gene models for dehydrins in the apple genome. Deduced polypeptides were classified according to the presence of the conserved YnSKn segments. A seasonal regulation of gene expression was observed, with higher transcript accumulation during the winter. This data suggests that a similar mechanism of transcript regulation is acting through the apple dehydrin genes.

A macieira é depreciada por muitos insetos, principalmente pela lagarta-enroladeira-da-macieira Bonagota salubricola (Lepidoptera: Tortricidae). Até o momento seu controle nos pomares comerciais é feito quase exclusivamente com inseticidas químicos. Alternativamente, este trabalho teve por objetivo verificar a mortalidade in vitro de larvas de segundo instar de B. salubricola frente a ação de isolados dos fungos Nomuraea, Beauveria e Metarhizium. Cada grupo foi tratado com suspensões de 2x105 a 2x109 con/mL, exceto para o grupo controle, tratado com solução Tween-80 0,1%. Também avaliou-se a sobrevivência pupal, expressão de proteases e a compatibilidade com inseticidas químicos. Uma das linhagens de Beauveria e as três de Metarhizium foram patogênicas a B. salubricola, sendo que os níveis de virulência aumentaram em função da concentração de conídios. A linhagem E6 de M. anisopliae destacou-se por proporcionar um controle de até 88% com TL50 de 1,66 dias; a maior virulência relacionou-se positivamente com o aumento da produção enzimática, sendo esta linhagem também compatível com tebufenozide. Esses resultados evidenciam o potencial dos fungos entomopatogênicos no controle de B. salubricola, visando sua aplicação principalmente nos pomares MIP. / Submitted by Marcelo Teixeira (mvteixeira@ucs.br) on 2014-05-22T18:08:57Z No. of bitstreams: 1 Dissertacao Fransoe Alan Anhalt.pdf: 344663 bytes, checksum: 694ff008e7b7d673abebeb21f63ebf44 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-05-22T18:08:57Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao Fransoe Alan Anhalt.pdf: 344663 bytes, checksum: 694ff008e7b7d673abebeb21f63ebf44 (MD5) / The apple tree is deprecated by many insects, especially by leaf-roller-apple Bonagota salubricola (Lepidoptera: Tortricidae). Its control in commercial orchards is done almost exclusively with chemical insecticides. Alternatively, this work aimed at the evaluation of the in vitro susceptibility of larvae of the second ínstar of Bonagota salubricola to isolates of Nomuraea, Beauveria and Metarhizium fungus. Each group was treated with suspensions ranged of 2x105 con/mL a 2x109 con/mL, except for the control group, treated with solution Tween-80 0.1%. Also was evaluated the pupal survival, expression of proteases and compatibility with chemical insecticides. One strain of Beauveria and three strain of Metarhizium were pathogenic to B. salubricola, and the levels of virulence increased depending of conidia concentration. The strain E6 of M. anisopliae stood out for marking a control up to 88% with LT50 of 1.66 days, the largest virulence related positively to the increased production enzyme, and this strain was also compatible with tebufenozide. Those results demonstrate the potential of entomopathogenic fungi in control of B. salubricola, principally on the orchards IPM.

A macieira é depreciada por muitos insetos, principalmente pela lagarta-enroladeira-da-macieira Bonagota salubricola (Lepidoptera: Tortricidae). Até o momento seu controle nos pomares comerciais é feito quase exclusivamente com inseticidas químicos. Alternativamente, este trabalho teve por objetivo verificar a mortalidade in vitro de larvas de segundo instar de B. salubricola frente a ação de isolados dos fungos Nomuraea, Beauveria e Metarhizium. Cada grupo foi tratado com suspensões de 2x105 a 2x109 con/mL, exceto para o grupo controle, tratado com solução Tween-80 0,1%. Também avaliou-se a sobrevivência pupal, expressão de proteases e a compatibilidade com inseticidas químicos. Uma das linhagens de Beauveria e as três de Metarhizium foram patogênicas a B. salubricola, sendo que os níveis de virulência aumentaram em função da concentração de conídios. A linhagem E6 de M. anisopliae destacou-se por proporcionar um controle de até 88% com TL50 de 1,66 dias; a maior virulência relacionou-se positivamente com o aumento da produção enzimática, sendo esta linhagem também compatível com tebufenozide. Esses resultados evidenciam o potencial dos fungos entomopatogênicos no controle de B. salubricola, visando sua aplicação principalmente nos pomares MIP. / The apple tree is deprecated by many insects, especially by leaf-roller-apple Bonagota salubricola (Lepidoptera: Tortricidae). Its control in commercial orchards is done almost exclusively with chemical insecticides. Alternatively, this work aimed at the evaluation of the in vitro susceptibility of larvae of the second ínstar of Bonagota salubricola to isolates of Nomuraea, Beauveria and Metarhizium fungus. Each group was treated with suspensions ranged of 2x105 con/mL a 2x109 con/mL, except for the control group, treated with solution Tween-80 0.1%. Also was evaluated the pupal survival, expression of proteases and compatibility with chemical insecticides. One strain of Beauveria and three strain of Metarhizium were pathogenic to B. salubricola, and the levels of virulence increased depending of conidia concentration. The strain E6 of M. anisopliae stood out for marking a control up to 88% with LT50 of 1.66 days, the largest virulence related positively to the increased production enzyme, and this strain was also compatible with tebufenozide. Those results demonstrate the potential of entomopathogenic fungi in control of B. salubricola, principally on the orchards IPM.

A macieira (Malus x domestica Borkh.) é uma frutífera de clima temperado de grande importância econômica, e sua produtividade está diretamente relacionada à dormência. Além dos genes responsáveis pelo controle molecular, uma série de proteínas e metabólitos também é recrutada para proteger a integridade da gema dormente, destacando-se as desidrinas (DHN) e as enzimas galactinol sintases (GolS). As DHNs são proteínas que atuam na resposta adaptativa vegetal a estresses abióticos, enquanto que GolS são enzimas responsáveis pela síntese de galactinol, essencial à síntese de oligossacarídeos da família da rafinose (RFOs), os quais se acumulam em resposta a estresses abióticos. O objetivo do presente trabalho foi explorar a adaptação das gemas a condições de estresse a que são submetidas na dormência, visando identificar genes com potencial uso biotecnológico. Para tal, foram identificados e caracterizados os genes codificadores de DHNs e GolS no genoma da macieira por meio da utilização de ferramentas in silico para estudar a evolução, experimentos a campo e sob condições controladas, análises de expressão, localização subcelular, e geração de plantas transgênicas. As análises evolutivas sugerem que eventos de duplicação do genoma inteiro (WGD) foram responsáveis por moldar a evolução e diversificação dos genes GolS em macieira, enquanto que no caso das DHN eventos de duplicação em tandem e WGD nortearam a sua evolução. Nossos resultados sugerem que DHNs, galactinol e rafinose integram uma série de mecanismos que agem em conjunto durante a dormência a fim de proteger a integridade da gema, além dos carboidratos constituírem uma fonte de energia para a brotação. Ao longo da evolução, o aparecimento de novas estruturas e programas de desenvolvimento, tais como a gema e a dormência, necessitaram de adaptação de vias moleculares já estabelecidas, o que ajuda a explicar por que as dormências de gemas e de sementes compartilham rotas moleculares comuns. Finalmente, o gene MdDHN11 foi funcionalmente caracterizado e nossos resultados fornecem evidências de que MdDHN11 desempenha importantes papéis durante o desenvolvimento da semente de maçã, protegendo o embrião e o endosperma de alterações no status da água. Além disso, apenas a planta superexpressando MdDHN11 sobreviveu ao ensaio de simulação de seca, confirmando o potencial uso biotecnológico de DHNs de macieira no aumento da tolerância ao déficit hídrico. / Apple tree (Malus x domestica Borkh.) is a temperate fruit crop of great economic importance worldwide and its productivity is related to bud dormancy. Besides genes responsible for the molecular control of the process, a number of proteins and metabolites are also recruited to protect bud integrity, such as dehydrins (DHN) and galactinol synthases (GolS). DHNs are proteins that act on plant adaptive responses to abiotic stresses, while GolS are enzymes that catalyze for the synthesis of galactinol, an essential carbohydrate in the synthesis of raffinose family oligosaccharides (RFOs), which also accumulate in response to abiotic stresses. The objective of this work was to explore bud adaptation to stress conditions that occur during dormancy to identify genes with potential biotechnological applications. DHN and GolS genes were identified and characterized in the apple genome employing in silico tools, experiments under field and controlled conditions, expression analysis, subcellular localization assays, and the generation of transgenic plants. Evolutionary analyses suggest that whole genome duplication (WGD) events were responsible for shaping the evolution and diversification of GolS genes in apple, whereas WGD and tandem duplication events could be held accountable for DHN evolution. Our results suggest that DHNs, galactinol and raffinose integrate a series of mechanisms that act together during dormancy in order to protect bud integrity, besides the carbohydrates being an energy source for budbreak. During evolution, the appearance of new structures and developmental programs, such as buds and dormancy, required the adaptation of already established molecular pathways, partially explaining why bud and seed dormancy share common pathways. Finally, the MdDHN11 gene has been functionally characterized and our results provide evidences that MdDHN11 plays important roles during apple seed development by protecting the embryo and the endosperm from water deficit. Moreover, only the plant overexpressing MdDHN11 survived the water withholding assay, confirming the potential biotechnological use of apple DHNs in increasing tolerance to drought.