Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, 2010. / Submitted by Jadiana Paiva Dantas (jadi@bce.unb.br) on 2011-06-29T22:14:57Z
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2010_AdrianaDiasMagalhaes.pdf: 5174613 bytes, checksum: d240e42d60c95e87fc2a87623906127a (MD5) / O agente etiológico da doença de Chagas é o protozoário flagelado Trypanosoma cruzi. A regulação da expressão gênica em T. cruzi dá-se principalmente ao nível pós-transcricional o que dificulta a correlação direta entre os níveis de mRNA e proteínas e torna atrativa a abordagem
proteômica. Estudos teóricos anteriores predisseram uma distribuição bimodal entre as faixas ácidas e básicas de géis bidimensionais virtuais de tripanossomatídeos. Contudo, trabalhos experimentais com T. cruzi tem
gerado perfis 2-DE com uma distribuição assimétrica e poucos spots protéicos na região alcalina. Com o objetivo de verificar se as diferenças entre os perfis reais e virtuais eram resultado de limitações técnicas das metodologias atuais de 2-DE em faixas básicas de pH, foram feitas análises
proteômicas das formas de vida do T. cruzi utilizando-se condições otimizadas para a faixa de pH 6-11. Assim, os subproteomas alcalinos das formas tripomastigota e epimastigota foram comparados usando-se a
metodologia de “gel dois-em-um” (“two-in one gel”) a qual, por minimizar as
variações inerentes a 2-DE, facilitou a análise computacional de imagens. Um
segundo estudo, concentrou-se na comparação das formas tripomastigota e amastigota, também utilizando uma estratégia de 2-DE-MS. Os resultados revelaram diferenças na expressão de proteínas entre as formas adaptativas do parasito, de acordo com suas características biológicas e corroboraram
estudos proteômicos anteriores. Por exemplo, as enzimas relacionadas ao metabolismo de aminoácidos e desidrogenases foram mais abundantes na forma epimastigota, enquanto que trans-sialidases e proteínas paraflagelares foram encontradas especificamente na forma tripomastigota
Sabendo-se que o fenômeno de fosforilação/desfosforilação de proteínas está implicado na diferenciação do T. cruzi, procedeu-se o estudo da variação do fosfoproteoma do parasito durante a amastigogênese pela detecção direta das proteínas fosforiladas em géis 2-DE. Assim, verificou-se que várias proteínas apresentaram variação de fosforilação ao longo da amastigogênese, principalmente aquelas associadas ao citoesqueleto,
envolvidas no enovelamento protéico e com funções metabólicas. / The etiological agent of Chagas disease is the flagellate protozoan Trypanosoma cruzi. The fact that T. cruzi gene expression regulation occurs mainly at post transcriptional level prevents the direct correlation between mRNA and protein levels, and makes the proteomic approach very attractive.
Previous theoretical studies predicted a bimodal distribution among acid and
alkaline pH ranges in virtual 2-DE gels of trypanosomatides. On the other hand, 2-DE experiments on T. cruzi have generated assimetric profiles with very few spots on the alkaline region of the gel.
Aiming at verifying whether the differences between real and virtual profiles were due to the technical imitations of current 2-DE methodologies in the basic pH range, we carried out proteome analysis of T. cruzi life stages using conditions optimized for the 6-11 pH range. Therefore, trypomastigote
and epimastigote alkaline subproteomes were compared using the “two-inone gel” methodology which, by minimizing inherent 2-DE limitations, facilitated computational image analysis. A separate study focused on the comparison between trypomastigote and amastigote life stages also using a 2-DE-MS approach. Overall, the results revealed differences in protein expression between the adaptative forms of the parasite, in agreement with their biological traits, as well as corroborated previous proteomic studies. For instance, enzymes related with aminoacid metabolism and dehydrogenases
were more abundant in the epimastigote stages while trans-sialidases and
paraflagellar proteins were specifically found in trypomastigote 2-DE profiles.
Since phosphorylation/dephosphorylation is implicated in T. cruzi differentiation, we followed variations of T. cruzi phosphoproteome during amastigogenesis through direct phosphoprotein detection in 2-DE gels. Thus, we verified that several proteins presented variation in phosphorylation profiles during amastigogenesis, specially those proteins associated wih cytoskeleton, involved in protein folding and those with metabolic functions.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.unb.br:10482/9065 |
| Date | January 2010 |
| Creators | Magalhães, Adriana Dias |
| Contributors | Ricart, Carlos André Ornelas, Charneau, Sébastien Olivier |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UnB, instname:Universidade de Brasília, instacron:UNB |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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