Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Farmácia, Florianópolis, 2014. / Made available in DSpace on 2015-02-05T20:34:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 330011.pdf: 10288260 bytes, checksum: 4f2e6f664c9ef0b1ddbc6b2c49b93c33 (MD5) Previous issue date: 2014 / Os fármacos utilizados nos tratamentos atuais de tripanossomatídeos, Trypanosoma cruzi (doença de Chagas) e Leishmania spp. (leishmanioses) são caros, limitados e não são eficazes, o que aponta para a necessidade urgente de desenvolvimento de novas moléculas ativas. Neste sentido, o presente trabalho está direcionado à síntese de compostos potencialmente ativos contra esses parasitas. Considerando a abordagem de planejamento de fármacos, o ponto de partida desse trabalho foram alguns estudos prévios indicando a atividade antitripanossoma promissora de neolignanas. Neste trabalho, partindo dos aldeídos comerciais (4-metoxibenzaldeído, 3,4-dimetoxibenzaldeído, benzaldeído e 1,3-benzodioxole-5-carbaldeído), foram preparados os respectivos derivados isoxazólicos 3,5-dissubstituídos, através da reação de cicloadição[3+2] 1,3 dipolar entre um dipolo (óxido de nitrila) e um dipolarófilo (álcool propargílico), com rendimentos entre 55-76%. A partir desses heterociclos foram preparados os derivados azida como intermediários para a segunda reação de cicloadição. Essa reação, catalisada por cobre(I), envolveu a adição de alcinos terminais ao grupamento azido (1,3 cicloadição azida- alquino catalisada por cobre, reação de Huisge), resultando na formação de uma biblioteca de 72 compostos contendo os anéis isoxazol e 1,2,3 triazol, com rendimentos na ordem de 50- 98%. Esses compostos, a maioria dos quais de estrutura ainda não descrita na literatura, foram caracterizados através dos RMN 1H, 13C ou HSQC e espectrometria de massas (LC-MS) de alta resolução. A obtenção dos compostos bis-heterocíclicos contendo os anéis isoxazol e triazol foi através de uma rota sintética relativamente simples e, de modo geral, com ótimos rendimentos, sem subprodutos e em um curto tempo reacional.<br> / Abstract : The drugs used in current treatments of trypanosomatids, Trypanosoma cruzi (Chagas disease) and Leishmania spp. (leishmaniasis) are expensive, limited and are not effective, poiting the urgent need for development of new active molecules. In this way, the aim of this work is the synthesis compounds with potentially active against these parasites. Considering the approach of drug design, the starting point of this work was some previous studies indicating promising trypanocidal activity for some neolignans. In this work, initially four commercial aldehydes (4-methoxybenzaldehyde, 3,4-dimethoxybenzaldehyde, benzaldehyde and 1,3-benzodioxole-5-carbaldehyde) were used to prepare the 3,5-disubstituted isoxazoles derivative by cycloaddition reaction 1,3dipole between a dipole (nitrile oxide) and dipolarophile (propargyl alcohol), in 55-76% of yields. With these compounds, were prepared heterocycles azides derivatives as intermediates for the second cycloaddition reaction. This reaction of cycloaddition was catalyzing by copper(I), it involved the addition of terminal alkynes to azide group (1,3 azide-alkyne cycloaddition catalyzed by copper, Huisgen reaction), resulting in a library of 72 compounds containing the isoxazole ring and 1,2,3 triazole, with yields in the range 50-98%. Most of these compounds have not been described in the literature and all of them were characterized by 1H NMR, 13C NMR or HSQC and mass spectrometry (LC-MS) in high resolution. The attainment of the bis-heterocyclic compounds containing isoxazole and triazole rings was possible a relatively simple synthetic route, generally in good yields, without by products and at a short reaction time.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:31:28Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011-11-02Bitstream added on 2014-06-13T18:42:08Z : No. of bitstreams: 1 picka_mcm_dr_botfm.pdf: 676245 bytes, checksum: a6e43d3fc4dbf3cd5803d699dd97a61f (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Universidade Estadual Paulista (UNESP) / Receptores Toll-like (TLRs), em células apresentadoras de antígenos, têm importante papel no reconhecimento microbiano e no desenvolvimento da resposta imune adaptativa. Na infecção por T. cruzi, a imunidade celular, medida pela atividade de citocinas pró-inflamatórias, como IL-12 e IFN-γ, do perfil Th1, associadas ao TNF-α, reduz a carga parasitária na fase crônica. Simultaneamente, a IL-4 e a IL-10, do perfil Th2, são responsáveis por amortecer os fortes efeitos da ação pró-inflamatória. Características do parasita, como variação antigênica e diversidade genética das linhagens de T. cruzi, também têm influência na resposta imune do hospedeiro. Assim, este estudo teve como objetivos, em infecção experimental com cepas de diferentes origens de T. cruzi: fazer a caracterização molecular das cepas; determinar os momentos evolutivos da infecção (curva de parasitemia e sobrevida) e verificar a expressão gênica relativa de TLR 2, TLR 4, IL-12p40, IFN-γ,TNF-α, IL-10 e IL-4 em cada momento da infecção. Para isso, foram utilizadas duas cepas de T. cruzi isoladas de pacientes chagásicos crônicos, ZMC e JLP, e a cepa Y de T. cruzi. Camundongos machos Balb/C foram infectados com 104 tripomastigotas/animal e distribuídos em: G1, infectados com a cepa Y; G2, infectados com a cepa ZMC; e G3, infectados com a cepa JLP de T. cruzi. Os momentos para a determinação da expressão gênica das variáveis estudadas foram definidos segundo curva de parasitemia e de sobrevida previamente realizadas: M1: 24 h p.i.; M2: início da fase aguda; M3: fase aguda; M4:momento da queda importante e de manutenção da parasitemia e M5: momento final, determinado pela curva de sobrevida. Todas as cepas foram classificadas no grupo TCII, apesar de apresentarem comportamentos distintos em relação ao número de parasitas... / Toll-like receptors (TLRs), in antigen-presenting cells, play an important role in microbial recognition and adaptive immune response development. In T. cruzi infection, cellular immunity, mediated by the activity of proinflammatory cytokines such as IL-12 and IFN-γ, of the Th1 profile, associated with TNF-α, reduces parasite load in the chronic phase. Simultaneously, IL-4 and IL-10, of the Th2 profile, are responsible for controlling the strong proinflammatory effects of Th1 profile. Parasite characteristics, such as antigen variation and genetic diversity of T. cruzi strains, also influence host immune response. Hence, by using experimental infection with T. cruzi strains of different origins, this study aimed at: performing the molecular characterization of the strains; determining the evolutive moments of the infection (parasitemia and survival curve) and analyzing the relative gene expression of TLR 2, TLR 4, IL-12p40, IFN-γ,TNF-α, IL-10 and IL-4 at each moment of infection. To that end, two T. cruzi strains, ZMC and JLP, isolated from chronic chagasic patients, and the Y strain of T. cruzi were used. Male Balb/C mice were infected with 104 trypomastigotes/animal and distributed into: G1, infected with the Y strain; G2, infected with the ZMC strain; and G3, infected with the JLP of T. cruzi. The moments for determination of gene expression of the studied variables were defined according to the curve of parasitemia and survival that was previously performed: M1: 24 h p.i.; M2: beginning of the acute phase; M3: acute phase; M4: moment of important decrease and maintenance of parasitemia and M5: final moment, determined by the survival curve. All the strains were classified in the TCII group although they showed different behaviors in relation to the number of circulating parasites, day of the acute phase peak and... (Complete abstract click electronic access below)

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2012. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2012-11-19T12:07:48Z No. of bitstreams: 1 2012_CarlosFernandoRochaPimentel.pdf: 4136753 bytes, checksum: 3e1660d2869e3ec5c9235fa6a84074b5 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2012-11-21T14:25:47Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_CarlosFernandoRochaPimentel.pdf: 4136753 bytes, checksum: 3e1660d2869e3ec5c9235fa6a84074b5 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-11-21T14:25:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_CarlosFernandoRochaPimentel.pdf: 4136753 bytes, checksum: 3e1660d2869e3ec5c9235fa6a84074b5 (MD5) / Este estudo é parte de linha de pesquisa do Laboratório Multidisciplinar de Pesquisa em Doença de Chagas, na Faculdade de Medicina da Universidade de Brasília, que visa ao mapeamento das integrações de sequências de minicírculos de DNA mitocondrial (kDNA) de Trypanosoma cruzi em famílias de residentes em diferentes ecossistemas brasileiros. Nesta dissertação foram analisados sêmens de 53 adultos de dois municípios do Estado do Pará. O trabalho foi conduzido para identificar e caracterizar os sítios de integração das mutações de kDNA em células do sêmem e determinar a de presença do DNA nuclear (nDNA) do T. cruzi em adultos na idade reprodutiva. Foram analisadas amostras de DNA do sêmen de 53 homens. Os testes PCR mostraram que em 44 amostras (83%) havia nDNA. Em mais quatro amostras (48/53) os testes PCR revelaram amplicons de kDNA parasita. Estes quatro últimos sugerem que as sequências de minicírculos poderiam estar integradas ao genoma de pessoas sem a infecção ativa pelo T. cruzi. Então, a técnica tpTAIL-PCR foi usada para caracterizar as mutações de kDNA nos cromossomos das células analisadas. Foram encontradas 142 mutações no genoma de 38 indivíduos (72%) do estudo. Essas mutações foram localizadas (56,6%) em LINE-1 dispersos nos genomas. Ademais, verificou-se que 32,5% dessas mutações achavam-se no locus AL7313741.4 de LINE-1, no cromossomo X. Apenas nove eventos de integração de kDNA ocorreram em regiões codificadoras do genoma. Entre essas, encontram-se mutações em genes de quinases, receptor olfatório e em outros sítios não determinados. Em 24 casos (16,8%) o kDNA ligado ao LINE-1 estava acompanhado de fragmento de sequência de DNA retroviral, sugerindo recombinação e “hitchhiking’’. De grande interesse, os resultados sugerem a possibilidade de transmissão da infecção por 83% dos homens que tem o nDNA do T. cruzi no sêmen e, assim, a reprodução sexuada pode contribuir para transferência e herança das mutações de kDNA nas progênies das famílias do estudo. / This study stems for a research line that has been carried on the Chagas Disease Multidisciplinary Research Laboratory at the Faculty of Medicine, University of Brasilia, which aims at the mapping of the integrations of the mithocondrial minicircle sequences (kDNA) from Trypanosoma cruzi in members of familes living in different Brazilian ecosystems. Herein, we analysed samples of semen from 53 men from two counties at the State of Pará, Brazil. The research was conducted aiming at the identification and characterization of kDNA mutation hotspots in semen cells, so as to determine the rate of presence of the parasite nuclear DNA (nDNA) in adults at reproductive age. A total of 53 semen samples DNA were analysed. The PCR exams showed nDNA in 44 samples (83%), and further four samples (48/53) yielded kDNA amplicons. These results suggest that sequences of kDNA minicircles can integrate into the human genome in the absence of an active T. cruzi infection. Then, we used the tpTAIL-PCR technique to characterize the kDNA mutations on chromosomes of analyzed cells. A minimum of 142 mutations were disclosed in the genome of 38 family members (72%). These mutations were localized in LINE-1 (56.6%) disperse all through the genome. However, it was observed that 32.5% of such mutations were present in the locus AL7313741.4 of LINE-1, a chromosome X. Nine mutation events were found in coding regions of the genome. Among these, there were mutations in protein-kinase, and in the olfactory genes, and, also in undetermined sites. Further 24 mutations (16.8%) showed the kDNA covalently linked to LINE-1, and these chimeras were attached to fragments of retroviral DNA sequences, thus suggesting recombination and hitchhiking. Of great interest, the results suggest the possibility of transmission of the infections from 83% of men showing the DNA from T. cruzi in the semen, and, therefore, sexual reproduction may contribute to lateral transfer and inheritance of kDNA mutations in the progeny of the study families.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde, 2008. / Submitted by Diogo Trindade Fóis (diogo_fois@hotmail.com) on 2009-10-08T15:51:32Z No. of bitstreams: 1 2008_RodrigoGurgelGoncalves.pdf: 6113992 bytes, checksum: 6877e14dbfe0f48f5a28cf454844cb2b (MD5) / Approved for entry into archive by Gomes Neide(nagomes2005@gmail.com) on 2010-07-21T18:22:10Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2008_RodrigoGurgelGoncalves.pdf: 6113992 bytes, checksum: 6877e14dbfe0f48f5a28cf454844cb2b (MD5) / Made available in DSpace on 2010-07-21T18:22:10Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2008_RodrigoGurgelGoncalves.pdf: 6113992 bytes, checksum: 6877e14dbfe0f48f5a28cf454844cb2b (MD5) Previous issue date: 2008 / Triatomíneos silvestres do gênero Rhodnius freqüentemente invadem casas na América Latina, mantendo o risco de transmissão da doença de Chagas. Nesta tese, foram feitas análises filogeográficas, morfométricas e de distribuição geográfica potencial de populações de Rhodnius no Brasil central, focando Rhodnius neglectus, a principal espécie encontrada em palmeiras no Cerrado. Os triatomíneos foram capturados em palmeiras (Mauritia flexuosa) de quatro bacias hidrográficas (Tocantins, São Francisco, Paraná e Paraguai) e os índices de infestação e infecção por tripanossomatídeos foram analisados. A morfometria geométrica foi aplicada para identificar quais espécies de Rhodnius do grupo R. prolixus são encontradas em palmeiras e casas no Brasil central e para analisar a variação morfológica de populações silvestres de R. neglectus. A distribuição geográfica potencial de R. neglectus foi analisada usando modelagem de nicho ecológico (GARP) baseada na relação entre variáveis ambientais e os registros de ocorrência obtidos durante o estudo. A análise filogeográfica de R. neglectus foi baseada no polimorfismo de seqüências de citocromo b do DNA mitocondrial, testando a hipótese de diferenciação entre populações pelo processo de isolamento por distância. A freqüência de palmeiras infestadas variou de 11 a 100% nas 40 áreas amostradas, sendo coletados 1.581 espécimes em 177 palmeiras, principalmente em ninhos de pássaros; 3,8% dos triatomíneos examinados estavam infectados por tripanossomatídeos (Trypanosoma cruzi e T. rangeli). As análises morfométricas permitiram uma reclassificação quase perfeita dos indivíduos em suas respectivas espécies. Os padrões de forma não revelaram diferenças consistentes entre a maioria dos espécimes coletados nas casas no Brasil central e R. neglectus, mostrando também que R. robustus e R. neglectus ocorrem simpatricamente ao sul da Amazônia. Esses resultados suportam fortemente a idéia que espécimes de R. neglectus, e não de R. prolixus, têm invadido as casas no Brasil central. Os métodos de morfometria geométrica aplicados para explorar a variação fenotípica em R. neglectus mostraram variação significativa de tamanho de asas e, principalmente, cápsulas cefálicas entre as populações analisadas. A temperatura foi a variável ambiental que mais influenciou o tamanho, sendo os menores espécimes encontrados nas áreas mais frias. Entretanto, nenhuma variação significativa de forma foi observada entre populações de diferentes bacias hidrográficas. Os modelos de nicho ecológico foram capazes de predizer, com alta probabilidade, áreas de ocorrência de R. neglectus no bioma Cerrado. Áreas de Caatinga, savanas amazônicas, Pantanal e Chaco boliviano apresentaram menores probabilidades de ocorrência da espécie. Uma grande sobreposição foi observada entre a distribuição de R. neglectus, palmeiras e pássaros. Ao incluir novos registros de R. neglectus, o presente estudo revelou um aumento da distribuição a oeste e nordeste do Brasil na 'diagonal de ecorregiões abertas/secas da América do Sul'. O seqüenciamento da porção 5´ do citocromo b em 144 indivíduos de 33 populações resultou em um fragmento de 567pb, revelando a existência de 13 haplótipos únicos e 22 sítios variáveis. Os haplótipos obtidos formaram um grupo monofilético bem suportado, sendo identificados como R. neglectus e separados claramente das outras espécies de Rhodnius do grupo R. prolixus. Os dois haplótipos mais freqüentes ocorreram em áreas separadas por distâncias maiores que 1.700 km e de três bacias hidrográficas. Haplótipos compartilhados foram observados em áreas de ambas as margens dos principais rios e ambos os lados da Serra Geral de Goiás. As populações de Alto Paraíso-GO e da bacia do Paraguai (Mato Grosso) apresentaram haplótipos únicos e altos níveis de diversidade nucleotídica e divergência entre populações. A rede de haplótipos apresentou dois grupos geograficamente distintos (oeste e leste), mas não houve evidência de isolamento por distância (Mantel, p = 0,446). A dispersão de espécimes de R. neglectus entre no Brasil central poderia ocorrer a partir de um mecanismo passivo de transporte por aves. Finalmente, esses resultados podem auxiliar os programas de vigilância vetorial da doença de Chagas, visto que a invasão das casas por espécimes de Rhodnius mantém o risco de transmissão e limita a eficiência das estratégias de controle. / Sylvatic triatomines of the genus Rhodnius commonly fly into houses in Latin America, maintaining the risk of Chagas disease transmission. In this thesis, phylogeographical, morphological and potential geographical distribution analyses of Rhodnius populations in central Brazil were carried out, focusing in R. neglectus, the major species found in palm trees in the Brazilian Savannah. Bugs were captured in Mautitia flexuosa palm trees from four hydrogeographic basins (Tocantins, Sao Francisco, Parana and Paraguay); the infestation and trypanosomatid infection indices were analyzed. Geometric morphometric methods were applied to identify the Rhodnius species of the R. prolixus group and to analyze the morphometric variation among R. neglectus populations from these basins. The hypothesis of phenotypic plasticity related to some environment variables was also tested. The potential geographical distribution of R. neglectus was analyzed by using ecological niche modeling (GARP) based on the relation of environmental variables and occurrence records. The phylogeographic analyses of R. neglectus populations were based on polymorphisms of cytochrome b sequences, testing the hypotheses of differentiation and isolation by distance. The frequency of infested palms varied from 11 to 100% in the 40 sampled areas, and 1,581 specimens were collected in 177 palms, mainly in bird nests; 3.8% of the examined bugs were infected by trypanosomatids (Trypanosoma cruzi and T. rangeli). Morphometric analyses of shape variation allowed for an almost perfect reclassification of individuals to their putative species. Shape patterning revealed no consistent differences between most specimens collected inside houses in central Brazil and R. neglectus, and also showed that R. robustus and R. neglectus occur sympatrically in southern Amazonia. These results strongly support the idea that R. neglectus, and not R. prolixus, is the species invading houses in central Brazil. The geometric morphometric methods applied to assess the intraspecific phenotypic variation in R. neglectus showed significant size variation among populations.Wing and head size were influenced by temperature: the smallest specimens were found in the coldest areas. Nevertheless, no significant shape variation was observed among populations of different geographical basins. The ecological niche models were able to predict the occurrence of R. neglectus as a characteristic (although not endemic) species of the Cerrado biome. Meanwhile, Caatinga, Amazonian savannas, Pantanal, and the Bolivian Chaco appear as areas with lower predicted presence probability for the species. A high overlap was observed among the distributions of R. neglectus, some palm trees and birds. By including new records for R. neglectus, the present study has revealed a wider distribution towards the west and northeast areas of Brazil in the ‘diagonal of open/dry ecoregions of South America’. The sequencing of 5´- end of the cytochrome b gene in 144 individuals from 33 populations resulted in a fragment of 567bp, revealing the existence of 13 different haplotypes and 22 variable sites. These haplotypes formed a well-supported monophyletic group identified as R. neglectus and clearly separated for other Rhodnius species of the ‘R. prolixus group’. The two more frequent haplotypes occurred in areas separated by a distance over 1,700 km and from three different hydrogeographic basins. Shared haplotypes were also observed in areas from both sides of large rivers and both sides of ‘Serra Geral de Goias’. The populations from Alto Paraiso-GO and from the Paraguay basin (Mato Grosso) presented unique haplotypes and higher levels of nucleotide diversity and divergence among populations. The haplotype network analysis showed two geographically distinct groups (western and eastern) but there was no evidence of isolation by distance (Mantel, p = 0,446). The dispersal of R. neglectus specimens among the basins may occur through passive carriage by birds. Finally, these results should help the Chagas disease vector surveillance program, given that household invasion by Rhodnius species maintains disease transmission risk and limits the effectivenes of control strategies.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, 2006. / Submitted by Fernanda Weschenfelder (nandaweschenfelder@gmail.com) on 2009-10-15T16:32:13Z No. of bitstreams: 1 2006_Cléver Gomes Cardoso.pdf: 3825807 bytes, checksum: fa425243c1f9587505e90174fef1191a (MD5) / Approved for entry into archive by Luanna Maia(luanna@bce.unb.br) on 2009-12-03T13:02:37Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2006_Cléver Gomes Cardoso.pdf: 3825807 bytes, checksum: fa425243c1f9587505e90174fef1191a (MD5) / Made available in DSpace on 2009-12-03T13:02:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2006_Cléver Gomes Cardoso.pdf: 3825807 bytes, checksum: fa425243c1f9587505e90174fef1191a (MD5) Previous issue date: 2006 / Acredita-se que a origem e evolução dos seres vivos foram antecedidas por uma complexa rede de interações entre moléculas, microrganismos e células em metazoários. Nesse processo, inúmeros eventos de rearranjo e transferência gênica teriam concorrido para o aumento da complexidade do genoma dos seres hoje existentes. O acúmulo de moléculas de DNA no núcleo das células eucariontes aumentou progressivamente a complexidade da herança genética, configurando um ponto chave na evolução dos organismos. Neste contexto, as evidências trazidas pela pesquisa relatada aqui mostram que os genomas continuam a receber um fluxo de DNA mediante a transferência gênica horizontal (TGH), seguida da herança das novas moléculas pela progênie. Acumulam-se as evidências mostrando que vários genes nos organismos eucariontes são oriundos de procariontes. Até recentemente a TGH era considerada evento raro que teria acontecido apenas em épocas remotas, visto que só era conhecida pela presença de ortólogos em genomas de procariontes e eucariontes. Entretanto, a pesquisa desenvolvida no nosso laboratório mostra que TGH é um evento esperado toda vez que o T. cruzi infecta uma célula eucarionte. O nosso modelo sugere que a barreira refletia apenas a dificuldade de flagrar tal evento entre seres vivos filogeneticamente distantes. Portanto, a noção que TGH seja um processo já extinto ou, na melhor hipótese, de muito baixa freqüência, não foi confirmada. A evidência em favor desta conclusão se encontra nos nossos achados prévios de TGH em coelhos, humanos e aves, onde a transferência de DNA de eucarionte para eucarionte foi documentada. O trabalho apresentado aqui documenta a integração de minicírculos de kDNA de T. cruzi no genoma de aves (TGH) e a sua transmissão vertical (TGV) para a progênie. As galinhas são susceptíveis ao T.cruzi somente nos primeiros dias de desenvolvimento embrionário. Após o oitavo dia de incubação a infecção intra-ovo é eliminada pela imunidade inata do embrião. Verificamos que no período crucial da infecção e do desenvolvimento do embrião ocorre a infecção da célula tronco pelo T. cruzi – ambos em acelerado processo de multiplicação – quando, então, ocorre a TGH. A demonstração de TGH (seqüências de minicírculos de kDNA do T. cruzi) para o genoma da galinha refratária à infecção representa, portanto, um modelo biológico limpo para o estudo da integração de kDNA que gera alterações genotípicas e patologia semelhante àquela da doença de Chagas humana. Indo além, foi documentada TGV pelo cruzamento de aves kDNA-positivas, permitindo a produção de progênie também kDNA-positivas, nas gerações F1, F2 e F3. A comprovação da TGV foi feita pela documentação da integração do kDNA no genoma de espermatozóides e de óvulos das aves kDNA-positivas. As aves kDNA-positivas (F0, F1, F2 e F3) desenvolveram sinais típicos da doença de Chagas: lesões nos músculos estriados cardíaco e esquelético, músculos lisos e gânglios parassimpáticos foram documentadas. Nas galinhas com kDNA integrado em seu genoma (portanto, sem a infecção) observou-se unidades mínimas de rejeição, caracterizadas por infiltrados mononucleares e lise da célula alvo. A confluência de unidades mínimas de rejeição reproduz a miocardite difusa típica da doença letal em hospedeiros mamíferos. Os achados deste estudo sugerem que a alteração genômica causada pela inserção de kDNA possa desencadear reação auto-imune no organismo hospedeiro. De fato, as lesões severas da doença de Chagas em aves com kDNA do parasito em seus genomas são sugestivas de que o T. cruzi é vetor de doença genética. A continuação do estudo que mostra integração de DNA do T. cruzi no hospedeiro, livre do parasito e alterações patológicas oriundas dessa mutação, pode contribuir para a elucidação dos mecanismos patogênicos que associam auto-imunidade com as lesões típicas da doença de Chagas. / It has been said that origin and evolution of live organisms were anticipated by network interactions among molecules, microorganisms and cells into complex metazoa. It appears, in this process took place countless events of horizontal transfer of DNA (HGT) amongst species far distant in the phylogenetic tree, thus promoting increasing complexity of the existing organism genomes. The accumulation of DNA molecules in the eukaryote cell nucleus led to sustainable genetic inheritance, thus portraying a main pathway for the evolution of species. Within this framework, the research reported herein is consistent with the idea that genomes from eukaryotes can receive continuous flow of DNA by HGT. Furthermore, it has also been shown that HGT molecules can be inherited vertically (VGT) by the progeny. These observations are in keeping with previous evidence showing prokaryote orthologues that would have been inherited by eukaryotes. Although until recently HGT had been considered a rare event that took place in early epochs, as suggested by the evidence recently found in the vertebrate’s genome sequencing databank, the research carried out in our Laboratory shows that HGT is indeed a mostly expected event, which could be consistently demonstrated in vitro and in vivo. This demonstration does not confirm a previous concept describing HGT as a rare event, which would occur at a rather low frequency. The data reported here shows that HGT can be detected in each host cell undergoing T. cruzi infections and, therefore HGT was shown in a high ratio of chicks born from T. cruzi–infected eggs. In conjunction, our previous studies have shown a gamut of HGT in different in vitro and in vivo models depicting DNA transfer from eukaryote to eukaryote. The work presented here shows sequences of kDNA minicircles from T. cruzi integrated (HGT) within the chicken genome. Furthermore, crossings of kDNA-positive birds resulted in the transfer of the kDNA integrations (VGT) to progeny. The chickens are refractory to the T. cruzi infections, although the infections could get established in early stages of the embryos; after ten days of incubation the T. cruzi infection could be eliminated by the embryo innate immune response. We verified that in the crucial early period of the infection and embryo development the chick stem cells can be T. cruzi-infected. Thereafter host cell and parasite undergoing accelerated multiplication created the grounds for HGT. The demonstration of HGT of sequences of minicircles of kDNA to the chicken genome represents a clean biological system, since birds are refractory to T. cruzi. Accordingly, the chicken model allowed the study of the kDNA-integration that generate genotype alterations and pathology similar to those described in human Chagas disease. Besides, we have demonstrated VGT by the crossings of kDNA-positive birds, which yielded kDNA-integrated progeny. The kDNA-positive F1, F2 e F3 birds were obtained and proved to carry VGT through the kDNA integrations in male and female gametes. The kDNA-integrated birds (F0, F1, F2 e F3) developed clinical signals typical of Chagas disease: destructive lesions were documented in the striated skeletal and heart muscles, in the smooth muscles and in the parasympathetic ganglia. In the kDNA-integrated but parasite-free birds there were minimal rejection units characterized by the immune system mononuclear cell infiltrates and lyses of the host’s self target cells. The confluence of a gamut of minimal rejection units did reproduce a typical diffuse myocarditis hallmark of Chagas disease affecting mammal hosts. These results show that genomic alterations stemming form kDNA insertion-mutation can provoke auto-immune rejection of host tissues. In fact, the documentation of severe Chagas lesions in kDNA-integrated birds is consistent with our hypothesis that the T. cruzi is vector of a genetic disease. Further studies are required to unravel the practical consequences resulting from the T. cruzi kDNA integration in the parasite-free host organism. Such demonstrate could ultimately show much such kDNA integrations contribute to the development of pathological lesions typical of Chagas disease. Moreover, these studies could elucidate the molecular mechanisms of pathogenesis calling forth auto-immunity in Chagas disease.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2008. / Submitted by Thaíza da Silva Santos (thaiza28@hotmail.com) on 2010-02-27T13:10:04Z No. of bitstreams: 1 2008_LiliamOliveiraFariaMacaneiro.pdf: 5316928 bytes, checksum: 8b6b4bf2363826478be7e3e2b86f38e9 (MD5) / Approved for entry into archive by Daniel Ribeiro(daniel@bce.unb.br) on 2010-03-02T00:08:13Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2008_LiliamOliveiraFariaMacaneiro.pdf: 5316928 bytes, checksum: 8b6b4bf2363826478be7e3e2b86f38e9 (MD5) / Made available in DSpace on 2010-03-02T00:08:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2008_LiliamOliveiraFariaMacaneiro.pdf: 5316928 bytes, checksum: 8b6b4bf2363826478be7e3e2b86f38e9 (MD5) Previous issue date: 2008-09-12 / Trypanosoma cruzi, agente etiológico da Doença de Chagas, pode persistir por muitos anos no hospedeiro mamífero, sugerindo que este parasita escapa do sistema imunológico através da regulação negativa nas vias de processamento de antígenos. Dentro da via de apresentação de antígenos intracelulares MHC classe I, a grande maioria de peptídeos antigênicos é gerada pelo proteassoma, um complexo multicatalítico responsável pela degradação intracelular de proteínas. Em vertebrados, três subunidades catalíticas b1i, b2i e b5i, cuja expressão é induzida pela citocina interferon-g (IFN-g), substituem três subunidades catalíticas constitutivas b1, b2 e b5 na partícula 20S do proteassoma, formando o imunoproteassoma. Neste trabalho, nós analisamos se a composição ou a expressão de proteassomas 20S e imunoproteassomas foi alterada em células HeLa e L6 infectadas pelo T. cruzi. Experimentos de RT-PCR e de eletroforese bidimensional comparando células controle e infectadas, com e sem tratamento com IFN-g não apresentaram diferença na composição do imunoproteassoma ou na expressão de suas subunidades em ambos os tipos celulares. No entanto, as atividades símile tripsina e símile quimotripsina do proteassoma foram 2,5 e 3,6 vezes maiores nas células infectadas com T. cruzi, do que nas células não infectadas. Entretanto, o nível de expressão protéica das subunidades b1i e b2i do imunoproteassoma foi reduzido quase pela metade em células HeLa infectadas com T. cruzi e tratadas posteriormente com IFN-g por 24 h. Este resultado sugere que a formação do imunoproteassoma é inibida em células infectadas pelo T. cruzi com posterior tratamento com IFN-g, por um mecanismo de regulação traducional das subnidades induzidas. / Trypanosoma cruzi, the etiological agent of Chagas’ disease, may persist for many years in its mammalian host, suggesting that this parasite escape from the immune surveillance by down regulating antigen processing pathway. In the MHC class I pathway, the vast majority of antigenic peptides are generated by the proteasome, a multicatalytic complex responsible for the degradation of intracellular proteins. In vertebrates, three catalytic subunits b1i, b2i and b5i, whose expression is induced by the cytokine gamma interferon (IFN-g), replace the three constitutive catalytic subunits b1, b2 and b5 in the core 20S proteasome, generating the immunoproteasome. Here, we analysed whether proteasome subunit composition or expression of the proteasome 20S and immunoproteasome were altered upon infection of HeLa and L6 cells by T. cruzi. RT-PCR and two-dimensional gel electrophoresis experiments comparing non-infected or infected cells, untreated or treated cells with IFN-g did not show differences between the immunoproteasome and expression of its mRNA subunits. However, the proteasome’s trypsin-like and chymotrypsin-like activities were 2.5 and 3.6 times higher in infected cells than in non-infected cells. On the other hand, in infected HeLa cells followed by treatment with IFN-g for 24 h, expression of the immunoproteasome b1i and b2i subunits was reduced. This result indicates that the generation of immunoproteasomes is inhibited in T. cruzi-infected cells followed treating with IFN-g by a posttranslational mechanism of the inducible subunits.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, 2008. / Submitted by Raquel Viana (tempestade_b@hotmail.com) on 2010-03-09T20:55:25Z No. of bitstreams: 1 Tese_Versao Final.pdf: 2558640 bytes, checksum: 5ffc716ac59120309c02bc4e5d8a643c (MD5) / Approved for entry into archive by Daniel Ribeiro(daniel@bce.unb.br) on 2010-04-06T19:30:48Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Tese_Versao Final.pdf: 2558640 bytes, checksum: 5ffc716ac59120309c02bc4e5d8a643c (MD5) / Made available in DSpace on 2010-04-06T19:30:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese_Versao Final.pdf: 2558640 bytes, checksum: 5ffc716ac59120309c02bc4e5d8a643c (MD5) Previous issue date: 2008 / Neste estudo, nós confirmamos e estendemos o conhecimento sobre a transferência de minicírculos de kDNA de Trypanosoma cruzi para o genoma humano. Foram analisadas cinco famílias cujos parentais (G0) eram portadores da doença de Chagas. Foi possível observar a integração de kDNA de T. cruzi no genoma de todos os chagásicos estudados. Concomitantemente, investigamos a transferência gênica vertical (TGV) das seqüências integradas de kDNA para as progênies G1 e G2. A TGV foi identificada em 45% dos descendentes de chagásicos. As análises das regiões do genoma humano que flanqueavam as seqüências de kDNA mostraram a integração de minicírculos de kDNA preferencialmente em retrotransposons LINE (71% dos clones). As integrações foram identificadas também em retroelementos não-autonônomos (12%), em ilha CpG (1%) e em alguns genes (4%). Nos demais clones (12%), não foi possível determinar os loci de integração do kDNA no genoma. A análise da estrutura do kDNA integrado revelou duas seqüências consensos de minicírculos que são inseridas mais freqüentemente que as outras, sugerindo que suas características estruturais possam favorecer o processo de integração. Acreditamos que micro-homologias ricas em AC, presentes nos minicírculos do T. cruzi e no genoma humano, podem mediar a integração do kDNA por recombinação homóloga. Os nossos achados sugerem remodelagem do genoma hospedeiro na região de justaposição das seqüências de minicírculos de kDNA no genoma humano. As análises in silico sugerem que o fenômeno descrito aqui pode resultar no surgimento de novas proteínas ou na alteração de expressão de genes pré-existentes. O real significado de tais mutações não fica restrito à Doença de Chagas, mas, sim, estende-se ao longo do processo da evolução, onde a fixação dessas mutações ajudaria a impulsionar um fluxo genético introdutor de complexidade crescente às espécies. / In this study we showed the transference of Trypanosoma cruzi kDNA minicircle sequences into the human genome. All founders (G0) of five families having the chronic T. cruzi infections had the kDNA integrated into retrotransposable elements. Additionally, we demonstrated the vertical gene transfer (VGT) of those kDNA mutations to their G1 e G2 progenies. Indeed, VGT was demonstrated in 45% of Chagas patients’ descendents. The analyses of the juxtaposition regions of the kDNA to the human genome revealed that the minicircle sequences integrate preferentially into retrotransposable LINE in 71% of those mutations. These mutations were also present in non-authonomous retroelements (12%), CpG island (1%) and putatively in some genes (4%). The remaining mutations (12%) were present in undetermined loci in some chromosomes. The structure of the kDNA integrated into the host genome revealed main consensus types I and II sequences, which were found in the integration sites in high ratio then other minicircles integrated in defined loci. It appears that some particular feature in those consensus sequences favor their insertion in those loci. We believe that AC-rich micro-homologies present in the T. cruzi kDNA minicircles and in the human genome could mediate the parasite DNA integration by homologous recombination mechanism. Our findings suggest that host DNA shuffling and recombination may occur at the integration site. It appears that the phenomenon of kDNA integration may alter pre-existing genes expression or they may generate chimera proteins. The true meanings of those mutations appear not to be limited to Chagas disease. We understand that the observed genetic drift of 55% of the kDNA mutation in the progeny may help to propel a robust genetic flux possibly associated with genome growth and increasing complexity of species. We propose that the fixation of those mutations appear to influence the evolution process.

Tese (Doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2009. / Submitted by Jaqueline Ferreira de Souza (jaquefs.braz@gmail.com) on 2011-04-16T22:53:32Z No. of bitstreams: 1 2009_RafaelAugustoPontesGuercio.pdf: 10289520 bytes, checksum: 3de1a51d5e96afab44a98e4da95f7438 (MD5) / Approved for entry into archive by Jaqueline Ferreira de Souza(jaquefs.braz@gmail.com) on 2011-04-16T22:55:33Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2009_RafaelAugustoPontesGuercio.pdf: 10289520 bytes, checksum: 3de1a51d5e96afab44a98e4da95f7438 (MD5) / Made available in DSpace on 2011-04-16T22:55:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2009_RafaelAugustoPontesGuercio.pdf: 10289520 bytes, checksum: 3de1a51d5e96afab44a98e4da95f7438 (MD5) / O agente etiológico da Doença de Chagas é o parasito flagelado Trypanosoma cruzi (T. cruzi), o qual possui um ciclo de vida alternado entre vetores triatomíneos e hospedeiros mamíferos. A regulação da expressão gênica em T. cruzi dá-se ao nível pós-transcricional o que impossibilita a correlação direta entre os níveis de mRNA e proteínas e ao mesmo tempo torna atrativa a abordagem proteômica. O presente trabalho pretendeu contribuir com os estudos proteômicos do parasito seguindo duas vertentes, sendo a primeira a proteômica comparativa dos diferentes estágios de vida do T. cruzi com Ênfase nas proteínas Ácidas e a segunda a caracterização subproteômica de T. cruzi de uma fração enriquecida em organelas de alta densidade. Assim, foram padronizados perfis eletroforéticos bidimensionais em géis de poliacrilamida (2-DE) usando gradientes estreitos de pH nas faixas de pH 3-5,6NL; 5,3-6,5 para extratos totais das formas epimastigota, tripomastigota e amastigota. Os perfis bidimensionais das formas tripomastigota e amastigota mostraram-se bastante complexos com mais de 1.000 spots/gel e foram analisados computacionalmente a fim de detectarem-se spots proteicos estágio-específicos e diferencialmente expressos. Proteínas dos géis foram identificadas por técnicas de espectrometria de massa (MS). No que diz respeito ao subproteoma organelar, foi isolada da forma epimastigota uma fração de organelas de alta densidade. Análises por microscopia eletrônica de transmissão, e por imunotransferência, mostraram claramente um forte enriquecimento de núcleo. Os spots dos géis bidimensionais, em faixa ampla de pH 3-10 e nas faixas de pH 4-7 e pH 6-11, foram identificados por MS sendo encontradas proteínas nucleares, mitocondriais, flagelares e glicosomais e diversas proteínas hipotéticas. / The flagellate parasite Trypanosoma cruzi (T. cruzi), the etiological agent of Chagas disease, possesses an alternate life cycle between triatomine vectors and mammalian hosts. The fact that T. cruzi gene expression regulation is posttranscriptional prevents the direct correlation between mRNA and protein levels and makes the proteomic approach very attractive. The present work aimed at contributing to the parasite proteomic studies following two different approaches, the comparative proteomics of T. cruzi life stages emphasizing the acidic proteins and the subproteome characterization of a T. cruzi fraction enriched in high density organelles. Thus, narrow pH range (pH 3-5.3 and pH 5.3-6.5) were optimized for protein extracts of epimastigote, tripomastigote and amastigote cells. The resulting tripomastigote and amastigote 2-DE profiles, that were rather complex, displaying more than 1,000 spots/gel, were computationally analyzed in order to determine stage-specific an differentially expressed spots.The 2-DE spots of interest were identified by mass spectrometry (MS) methods. Concerning the T. cruzi subproteome we isolated a fraction from epimastigote cells that was enriched in high density organelles including nuclei as confirmed by transmission electron microscopy, and immunoblotting. The spots of the 2-DE gels in the pH ranges 3- 10, 4-7 and 6-11 were identified by MS displaying nuclear, mitochondrial, flagellar, glycosomal as well as hypothetical proteins.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde, 2009. / Submitted by Washington da Silva Chagas (washington@bce.unb.br) on 2012-01-06T23:51:01Z No. of bitstreams: 1 2009_JoãoLuizdeSousaCarvalho.pdf: 1185651 bytes, checksum: 4eeaef4758c8349c25dc0150e70634ab (MD5) / Approved for entry into archive by Patrícia Nunes da Silva(patricia@bce.unb.br) on 2012-01-18T19:11:55Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2009_JoãoLuizdeSousaCarvalho.pdf: 1185651 bytes, checksum: 4eeaef4758c8349c25dc0150e70634ab (MD5) / Made available in DSpace on 2012-01-18T19:11:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2009_JoãoLuizdeSousaCarvalho.pdf: 1185651 bytes, checksum: 4eeaef4758c8349c25dc0150e70634ab (MD5) / As cinco principais espécies triatomínicas responsáveis pela transmissão da doença de Chagas no Brasil são, por ordem de importância, Triatoma infestans, Panstrongylus megistus, Triatoma brasilensis, Trriatoma pseudomaculata e Triatoma sordida. O controle do T. infestans no ambiente domiciliar pode propiciar sua substituição por outras espécies nativas da área. Após certificação da eliminação da transmissão vetorial pelo T. infestans no Estado de Goiás, foi escolhido o município de Posse/GO, para avaliar a importância do T. sordida na transmissão domiciliar da doença de Chagas, tendo sido aferidos os seguintes parâmetros; domiciliação, fonte alimentar, relação com animais reservatórios silvestres e relação com o homem. Os resultados permitem afirmar que o T. sordida não é responsável por transmissão endêmica intradomiciliar da doença de Chagas no município de Posse/GO Não há evidência de colonização intradomiciliar pelo T. sordida e suas taxas de infecção pelo Trypanosoma cruzi, são mínimas em função de a sua preferência alimentar por aves as quais sãorefratárias à infecção por este protozoário (T.cruzi). __________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Chagas' disease most important triatominae species vectors in Brazil are: Triatoma infestans, Panstrongylus megistus, Triatoma brasiliensis, Trriatoma pseudomaculata and Triatoma sordida. After T. infestans vetorial transmission elimination it can be replaced by other native species of triatominae, thus proceeding Chagas' disease transmission. How important is T. sordida in transmiting Chagas' disease inside the house in Posse County Goiás State, Brazil was determined by checking: its presence inside the houses; its food sources; its contact with infected wild animals and its contact with men. The data found T. sordida not responsible for Chagas' disease transmission inside the houses in Posse/GO. Trypanosoma cruzi infection rates are very low and its main food source is birds which cannot be infected by T. Cruzi.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ceilândia, Programa de Pós-Graduação em Ciências e Tecnologias em Saúde, 2013. / Submitted by Alaíde Gonçalves dos Santos (alaide@unb.br) on 2014-02-18T14:09:58Z No. of bitstreams: 1 2013_MauricioFarnese.pdf: 1726214 bytes, checksum: 8eb23c08dcf2d229143b6daaa0152746 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2014-02-19T12:35:50Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_MauricioFarnese.pdf: 1726214 bytes, checksum: 8eb23c08dcf2d229143b6daaa0152746 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-02-19T12:35:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_MauricioFarnese.pdf: 1726214 bytes, checksum: 8eb23c08dcf2d229143b6daaa0152746 (MD5) / A doença de Chagas, causada pelo protozoário Trypanosoma cruzi atinge milhões de pessoas em todo mundo, especialmente na América Latina, onde é endêmica. Em seu ciclo de vida, o parasito passa por diversos processos de diferenciação para adaptar-se a diferentes condições dentro do hospedeiro mamífero e do inseto triatomíneo. Componentes localizados na superfície do parasito e da célula hospedeira desempenham papéis importantes na invasão, entretanto os mecanismos envolvidos são muito discutidos. Sabe-se que a sinalização mediada por Ca2+ é um aspecto importante na invasão celular e na diferenciação do parasito. A calmodulina (CaM) é uma proteína citoplasmática Ca2+-dependente em eucariotos que regula várias proteínas. A ligação da CaM ao Ca2+ induz uma mudança conformacional que promove a interação desta com diversas proteínas com importantes funções biológicas. A CaM de T.cruzi (TcCaM) tem sido associada à várias funções diferentes como regulação do crescimento, estimulação enzimática, transdução de sinais, além de modular os efeitos do Ca2+. Desta forma, a fim de melhor entender o envolvimento das proteínas ligantes de CaM (CaM-BPs) nos processos de invasão e diferenciação de T. cruzi, foram adotadas nesse trabalho duas abordagens de identificação de proteínas ligantes de Ca2+ e/ou CaM. Primeiramente pela análise bioinformática de proteínas diferencialmente expressas durante a amastigogênese e proteínas presentes na superfície do parasito. Foram preditas 17 proteínas ligantes de Ca2+ dentre as identificadas com expressão regulada durante a amastigogênese e 36 proteínas na superfície de tripomastigota e amastigota. Estas possuem funções enzimática, de armazenamento, transporte dentre outras. A segunda foi uma abordagem experimental onde identificamos 6 proteínas, as quais desempenham funções estruturais, motilidade, adesão ou enzimática. Esta segunda vertente foi realizada experimentalmente por uma abordagem proteômica. As CaM-BPs extraídas da forma epimastigota foram enriquecidas por cromatografia de afinidade e separadas em géis eletroforéticos (1D-PAGE e 2D-PAGE). A identificação por espectrometria de massas foi iniciada e já foram identificados componentes da estrutura celular como α- e β-tubulinas, proteína paraflagellar rod putativa e uma proteína de transdução de sinal intracellular, a HSP70. Esses dados auxiliam no entendimento sobre como o Ca2+, a TcCaM e seus ligantes participam em processos celulares como invasão e diferenciação do T. cruzi. / Chagas' disease, caused by the protozoan Trypanosoma cruzi, afflicts millions worldwide especially in Latin America where it is endemic. During its life-cycle, the parasite undergoes several differentiation events in order to adapt to a variety of conditions inside both mammalian host and triatomine vector. Components from both parasite and host-cell surfaces play major roles in invasion, however the mechanisms involved are still much discussed. It is known that Ca2+ mediated signaling is an important aspect of host-cell invasion and parasite differentiation. Calmodulin (CaM) is a citoplasmic Ca2+-dependent protein that regulates several proteins in eukaryotes and the binding of Ca2+ to CaM induces conformational changes, which promotes the interaction to a variety of other proteins with important biological functions. T. cruzi CaM (TcCaM) has been linked to several functions such as growth regulation, enzyme stimulation, and signal transduction, besides modulating the effects of Ca2+ concentration. Thus, in order to better understand the involvement of CaM binding proteins (CaM-BPs) in the invasion process and T. cruzi differentiation, was adopted here two approaches to identify Ca2+- and/or CaM- binding proteins. First though bioinformatic prediction of such proteins among those identified as differentially expressed during amastigogenesis and those presented in the parasite cell surface. It was predicted 18 Ca2+-binding proteins with regulated expression level during differentiation and 36 in the surface of trypomastigotes and/or amastigotes. These have enzymatic, storage, transportation and others functions. The second was an experimental approach where we identified 6 proteins, which play structural, motility, adhesion or enzymatic functions. This second part was an experimental proteomic approach, where CaM-BPs from epimastigotes were enriched by affinity chromatography and separated by gel electrophoresis (1D-PAGE and 2D-PAGE). Mass spectrometric identifications were initiated and it already has been identified cell structure components such as α-and β-tubulins, putative paraflagellar rod proteins and a signal transduction protein, the HSP70. This data contribute to the understanding of the involvement of Ca2+, TcCaM and their ligands in the invasion and differentiation processes.