Introdução: O diabetes mellitus tipo 1 (DM1) é uma doença autoimune crônica e progressiva caracterizada por descompensações metabólicas frequentemente acompanhadas por desidratação e cetoacidose. Os agentes virais parecem ter um papel importante no desencadeamento da destruição autoimune que leva ao desenvolvimento do DM1. Entre as cepas virais estudadas, a família dos enterovírus foi associada ao surgimento da doença em humanos. Um dos mediadores do dano viral é o RNA fita dupla (RNAfd) gerado durante a replicação e transcrição do RNA e DNA viral. O gene TLR3 codifica um receptor endoplasmático pertencente à família dos Pattern- Recognition Receptors (PRR), o qual reconhece o RNAfd, tendo um importante papel na resposta imune inata desencadeada por infecção viral. A ligação do RNAfd ao TLR3 desencadeia a liberação de citocinas proinflamatórias, como interferons, as quais exibem uma potente ação anti-viral; assim, protegendo as células não infectadas e induzindo apoptose naquelas já contaminadas. Dessa forma, esse estudo teve como objetivo investigar a associação entre polimorfismos no gene TLR3 e o DM1. Métodos: As frequências dos polimorfismos rs5743313, rs11721827, rs3775291, rs13126816 e rs7668666 no gene TLR3 foram analisadas em 476 pacientes com DM1 e em 507 indivíduos não-diabéticos saudáveis. Os haplótipos construídos a partir da combinação dos cinco polimorfismos estudados e suas frequências foram inferidos utilizando o programa Phase 2.1, o qual implementa o método estatístico bayesiano. Resultados: Todos os genótipos estão de acordo com o esperado pelo Equilíbrio de Hardy-Weinberg. Os polimorfismos rs3775291 e rs13126816 foram associados com risco para DM1 em diferentes modelos de herança, com a associação mais forte sendo observada para o modelo aditivo [OR= 2,3 (IC 95% 1,3-4,1) e OR= 2,1 (IC 95% I 1,4-3,2); respectivamente]. Os demais polimorfismos estudados não foram associados ao DM1. Interessantemente, a frequência de DM1 aumentou quanto maior o número de alelos mutados dos cinco polimorfismos estudados presente nos haplótipos (p-trend= 0,002). Além disso, em pacientes com DM1, os alelos mais raros dos polimorfismos rs5743313 e rs11721827 foram associados com menor idade de diagnóstico do DM1 e a um pior controle glicêmico. Conclusão: Os polimorfismos rs3775291 e rs13126816 no gene TLR3 estão associados com risco para o DM1 em indivíduos do Sul do Brasil, enquanto os polimorfismos rs5743313 e rs11721827 estão associados com idade de diagnóstico precoce e a um pior controle glicêmico. O número de alelos de risco nos haplótipos formados pelos cinco polimorfismos estudados no gene TLR3 parece influenciar o risco para DM1, sugerindo que esses polimorfismos interagem na suscetibilidade para a doença. / Introduction: Type 1 diabetes mellitus (T1DM) is a chronic, progressive autoimmune disease characterized by metabolic decompensation often leading to dehydration and ketoacidosis. Viral agents seem to have an important role in triggering the autoimmune destruction that leads to the development of T1DM. Among several viral strains investigate so far, the enterovirus family has been consistently associated with the onset of T1DM in humans. One of the mediators of viral damage is the double-stranded RNA (dsRNA) generated during replication and transcription of viral RNA and DNA. The Toll-like receptor 3 (TLR3) gene codes for an endoplasmic receptor of the patternrecognition receptors (PRRs) family that recognizes dsRNA, playing an important role in the innate immune response triggered by viral infection. Binding of dsRNA to the TLR3 triggers the release of proinflammatory cytokines, such as interferons, which exhibit potent antiviral action; thus, protecting uninfected cells and inducing apoptosis of infected ones. Therefore, this study aimed to investigate whether TLR3 polymorphisms were associated with T1DM. Methods: Frequencies of the TLR3 rs5743313, rs11721827, rs3775291, rs13126816 and rs7668666 polymorphisms were analyzed in 476 T1DM patients and in 507 healthy subjects. Haplotypes constructed from the combination of these polymorphisms were inferred using Bayesian statistical method. Results: All genotypes are in agreement with those predicted by the Hardy-Weinberg equilibrium. The rs3775291 and rs13126816 polymorphisms were associated with T1DM in different inheritance models, with the strongest association being observed for the additive model [OR= 2.3 (95% CI 1.3-4.1) and OR= 2.1 (95% CI 1.4-3.2); respectively]. The other three polymorphisms were not significantly associated with T1DM. Interestingly, the prevalence of T1DM was higher as more risk alleles of the five polymorphisms were present (P trend = 0.002). Moreover, in T1DM patients, the minor alleles of the rs5743313 and rs117221827 polymorphisms were associated with an early age at diagnosis and worse glycemic control. Conclusion: The TLR3 rs3775291 and rs13126816 polymorphisms are associated with risk for T1DM in Southern Brazilian subjects, while the rs5743313 and rs11721827 polymorphisms are associated with age at T1DM diagnosis and worst glycemic control. The number of risk alleles of the five TLR3 polymorphisms in the haplotypes seems to influence the risk for T1DM, suggesting that these polymorphisms might interact in the susceptibility for the disease.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2007. / Submitted by Aline Jacob (alinesjacob@hotmail.com) on 2010-01-21T19:05:20Z No. of bitstreams: 1 2007_GiseleFerreiraEsteves.pdf: 4786645 bytes, checksum: 022fe241400fc9eeb51f7a8933799cca (MD5) / Approved for entry into archive by Lucila Saraiva(lucilasaraiva1@gmail.com) on 2010-01-21T22:29:08Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2007_GiseleFerreiraEsteves.pdf: 4786645 bytes, checksum: 022fe241400fc9eeb51f7a8933799cca (MD5) / Made available in DSpace on 2010-01-21T22:29:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2007_GiseleFerreiraEsteves.pdf: 4786645 bytes, checksum: 022fe241400fc9eeb51f7a8933799cca (MD5) Previous issue date: 2007 / A hemoglobina de Cerdocyon thous (HbCt) foi purificada e cristalizada pelo método de difusão de vapor a 21°C na condição PEG 4000 16%, Hepes-Na 0,1 M pH 7,8. Os dados cristalográficos foram coletados no Laboratório Nacional de Luz Síncrotron (LNLS). O grupo espacial do cristal é do tipo P212121, com os eixos da célula unitária de a=52,73; b=84,24 e c=130,28 Å, correspondentes a cristais do sistema ortorrômbico. A estrutura cristalográfica da HbCt foi resolvida até o limite de 2,2 Å de resolução, pelo método de substituição molecular utilizando a estrutura da hemoglobina de Chrysocyon brachyurus (PDB ID: 1FHJ) como modelo. O modelo final obtido após o refinamento foi depositado no PDB com o código 2B7H, apresentando boa qualidade conforme indicado por vários parâmetros, dentre eles, o valor baixo dos fatores de temperatura, o Rfactor de 0,168 e Rfree de 0,232. A estrutura dessa hemoglobina apresenta uma água como ligante do ferro e sua organização estrutural assemelha-se às hemoglobinas do tipo metahemoglobina. A sua estrutura cristalográfica foi utilizada como um modelo de estudo para análise do comprometimento estrutural tridimensional com substituições de aminoácidos em posições específicas. Para isso, foram utilizadas estruturas cristalográficas de hemoglobinas de humano e de cavalo, disponíveis no PDB. Além dessas substituições uma análise detalhada da relação estrutura vs estabilidade foi feita. Por ser uma proteína multimérica, a desnaturação da hemoglobina varia de acordo com a condição de pH e o tipo de desnaturante utilizado. Neste trabalho, o processo de desdobramento da HbCt e da hemoglobina de Pseudalopex vetulus (HbPv) foi realizado para analisar a estabilidade dessas moléculas. Estes ensaios foram acompanhados por fluorescência e dicroísmo circular utilizando a uréia, a guanidina, diferentes pHs e a temperatura como agentes desnaturantes. Além disso, foi analisado o efeito do surfactante catiônico brometo de hexadeciltrimetil amônio (CTAB) na estabilidade das hemoglobinas, por dicroísmo circular. A HbCt é mais estável em pH ácido e mais instável do que a HbPv em pH básico. Esses dados foram comparados com a cianometahemoglobina humana. O CTAB na concentração de 0,5 e 1 mM para HbCt e HbPv, respectivamente estabiliza as hemoglobinas principalmente pelo efeito de hidratação preferencial. Uma análise da relação da estabilidade de hemoglobinas com a estrutura tridimensional foi feita baseando-se nos modelos tridimensionais da HbCt, humana e de cavalo. Comparando com a hemoglobina humana, as modificações apresentadas na HbCt tendem a ser estabilizadoras. Em contrapartida, comparando com a hemoglobina eqüina, as modificações apresentadas na HbCt tendem a ser desfavoráveis para a estabilidade conformacional. As substituições e o comprometimento com a organização estrutural, causadas no ambiente molecular, foram caracterizadas e podem servir de modelo para o desenho racional de proteínas mais estáveis, com vistas à aplicação biotecnológica, como é o caso do desenvolvimento do sangue artificial recentemente descrito na literatura. Esse tipo de estudo pode ser aplicado como um modelo da relação estrutura vs estabilidade de proteínas em geral, mas principalmente para aquelas com maior número de entradas no PDB e que merecem atenção pela função e aplicação biotecnológica. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT / The hemoglobin from C. thous (HbCt) was purified and crystallized by hanging drop vapor diffusion method at 21oC in 16% PEG 4000, 0.1 M Hepes-Na pH 7.8. The crystallographic data were collected in the National Laboratory of Synchrotron Light (LNLS). The crystals grew in space group P212121 (orthorhombic type) with cell dimensions of a=52.73, b=84.24 and c=130.28 Å. The crystallographic structure of the HbCt was solved at 2.2 Å resolution, by molecular replacement using the structure of the hemoglobin from Chrysocyon brachyurus (pdb 1FHJ)as a search model. The model was refined and deposited in the PDB under the code 2B7H with structural quality indicated by some parameters, among them, the low value of B-factor, the Rfactor of 0.168 and the Rfree of 0.232. The hemoglobin presents one water molecule as ligand of the iron characterizing the methemoglobin form. The structural organization of the subunits of the HbCt is similar to the known hemoglobins. The crystallographic structure of HbCt and hemoglobins from human and horse were used as models to study the structural effects concerning the amino acid substitutions in specific positions and the consequent conformational changes of the respective molecular environment. Indeed, an extensive analysis of the relationship between estructure and stability was done. The hemoglobin is a multimeric protein and its unfolding process depends of several conditions such as pH and denaturing agent. In this work, the unfolding process of the HbCt and the hemoglobin from Pseudalopex vetulus (HbPv) was performed by fluorescence and circular dichroism using urea, guanidine, different pHs and temperature as denaturing agents. Moreover, the stabilizing effect of the cationic surfactant hexadecyltrimethyl ammonium bromide (CTAB) was analyzed by circular dichroism. HbCt is more stable in acid pH and more instable than HbPv in basic pH. The CTAB, at 0.5 and 1.0 mM for HbCt and HbPv, respectively, stabilizes the hemoglobins mainly by preferential hydration. An analysis of the relationship between stability and the threedimensional structure was done based on the three-dimensional models of HbCt, human and horse. The differences in amino acidic content of HbCt comparing with the human hemoglobin tend to stabilize the HbCt. On the other hand, comparing with equine hemoglobin, the modifications presented in HbCt tend to be unfavorable for the conformational stability. VII The amino acidic substitutions and the consequent conformational changes in the molecular environment of the HbCt were characterized. Generally, this study is very important for rational design of stable proteins with biotechnological applications. For hemoglobin, in particular, this study is fundamental in order to produce the artificial blood, a new tendency of pharmaceutical companies, as recently described in the literature.

O alelo mutante termo-condicionalmente letal pso4-1 do gene PRP19, que codifica uma proteína associada ao spliceossoma, permitiu investigar a influência deste gene no processamento de pré-mRNA, reparação do DNA e esporulação. Fenótipos relacionados a genes portadores de introns foram correlacionados à temperatura. Sistemas repórteres para processamento de pré-mRNA e RT-PCR mostraram que eficiência de processamento de mRNA no mutante pso4-1 é inversamente correlacionada com a temperatura de crescimento. Uma mutação pontual, substituindo uma leucina por uma serina foi identificada dentro da região codificadora N-terminal do alelo Pso4-1 e afeta as propriedades bioquímicas de Pso4-1p. Entre 24 clones isolados utilizando o sistema doishíbridos, 7 foram identificados como partes dos genes RAD2, RLF2 e DBR1. RAD2 codifica uma endonuclease indispensável para a via reparação por excisão de nucleotídeos (NER), RLF2 codifica a subunidade maior do fator de montagem da cromatina I, cuja deleção resulta em sinsibilidade à radiação UVC, enquanto que DBR1 codifica uma enzima que atua sobre substratos de RNA na forma lariat, degradando estruturas lariat em introns durante o processamento de mRNA. A caracterização dos fenótipos após tratamentos com mutágenos em linhagens mutantes simples e duplos de rad2∆, rlf2∆ e pso4-1 mostraram sensibilidade aumentada para para mutantes rad2∆/pso4-1 e rlf2∆/pso4-1, sugerindo uma interferência funcional destas proteínas no processo dereparação do DNA em Saccharomyces cerevisiae. O mecanismo exato de reparação de pontes inter-cadeia (ICL) em S. cerevisiae não é ainda totalmente conhecido. Identificando novos fenótipos e isolando proteínas potencialmente capazes de interagir com Pso2p através da técnica do sistema dois-híbridos, foi possível extender a caracterização deste gene específica para reparação de pontes intercadeia. Tratamentos com acetaldeído (ACA), um metabólito natural da via glicolítica, foi mais tóxico a linhagem mutante pso2 em comparação com a linhagem selvagem e também capaz de induzir a expressão da fusão contendo o promotor de PSO2 à lacZ (PSO2-lacZ) por um fator comparável à tratamentos com outros agentes indutores de ICLs, indicando que o metabólito natural ACA pode causar danos do tipo ICL em S. cerevisiae. A utilização do sistema dois-híbridos permitiu isolar partes de proteínas codificadas por nove diferentes genes, entre eles a proteína quinase Pak1p, um supressor de mutações termosensíveis da DNA Polimerase alfa. Pak1p interage com a extremidade C-terminal conservada de Pso2p, uma região da proteína recentemente nomeada β-CASP entre v ortólogos conhecidos do gene PSO2. A integridade do domínio β-CASP é essencial para a reparaçãode DNA proficiente como demonstrado em ensaios de complementação com mutantes pso2 ∆. Comparação da sobrevivência após tratamento com agentes mutagênicos de simples mutantes pso2 ∆ e pak1 ∆ assim com o dulpo mutante pso2 ∆/pak1 ∆ revelaram que o gene PAK1 é necessário para reparação do DNA proficiente como na linhagem selvagem. A interação epistática dos dois alelos mutantes na linhagem duplo mutante sugere que Pak1p atua na mesma via de reparação a qual PSO2 pertence e que PAK1 constitui um novo locus envolvido na reparação do DNA em S. cerevisiae.

A transferência gênica baseada em retrovírus permite o carregamento e integração de um material genético exógeno ao genoma de uma célula alvo, o que permite a expressão estável do transgene tanto in vitro quanto in vivo. Até o momento não existiam lentivetores que permitam a clonagem de diferentes genes sob promotores de expressão gênica regulada por tetraciclina e também a análise de expressão através do IRES - sistema repórter. No presente trabalho, foi criada uma série de lentivetores contendo plasticidade estrutural para permitir a clonagem de diferentes genes, sítios únicos de clivagem para clonagem de diferentes promotores, elemento TRE para regular a expressão do transgene com tetraciclina ou doxiciclina e o sítio IRES expressando duas proteínas repórteres: GFP ou DsRed. A série de vetores produzidos, denominados pLR1, pLR2 e pLR3 possue o promotor RSV antecedido pelo elemento TRE e um sítio de clonagens múltiplas. Além disso, o pLR2 possui o sistema IRES-GFP e o pLR3 o sistema IRES-DsRed para geração de mRNA bicistrônico. A eficiência funcional de cada um dos elementos utilizados nas estruturas de cada um dos plasmídeos os transforma numa boa ferramenta biotecnológica para transferência gênica estável. / Gene transfer based upon lentiviral vectors allows the integration of exogenous genes into the genome of a target cell, turning these vectors into a powerful tool that allows stable expression of transgenes in mammalian cells both in vitro as well as in vivo. Currently, no plasmids for lentivirus are available that allow cloning of different genes to be regulated for different promoters or regulates by tetracycline and, also, that permit the analysis of the expression through a IRES - reporter gene system. In this work, we have generated a series of lentiviral vectors containing: a malleable structure to allow the cloning of different target genes in a multicloning site (mcs); unique sites to exchange promoters; TRE element to regulate the transgene expression with molecules such as tetracycline or doxicycline, and internal ribosome entry site followed by one of two reporter genes: GFP or DsRed. The series of vectors were named pLR1, pLR2 and pLR3. This vector serie has the RSV promoter flanked by a TRE element and a multicloning site. Also, the pLR2 plasmid has the IRES-GFP sequence after the mcs while pLR3 has IRES-DsRed for the generation of a bicistronic mRNA. The functional efficiency of each element used in the different plasmid structures transforms the plasmid serie into a powerful biotechnology tool for stable gene transfer.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:22:54Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011-10-14Bitstream added on 2014-06-13T20:29:17Z : No. of bitstreams: 1 alvares_ds_me_sjrp_parcial.pdf: 173190 bytes, checksum: cab7a213c81655763fbd037e0d6a8d9b (MD5) Bitstreams deleted on 2014-08-22T14:57:14Z: alvares_ds_me_sjrp_parcial.pdf,Bitstream added on 2014-08-22T15:02:14Z : No. of bitstreams: 1 000685783.pdf: 1376550 bytes, checksum: 14dbf4c00dfa490970cb6a8e13c51c8c (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Estudos de visualização de GUVs por microscopias de fluorescência e contraste de fase, realizados com três mastoparanos (MP-1, N-MP-1 e MPX), evidenciam que alguns destes peptídeos induzem a formação de regiões densas na superfície das GUVS que foram atribuídas a agregacão ou segregação lipídica. Evidências experimentais anteriores mostraram que estes peptídeos apresentam atividade interfacial e suas cargas líquidas +2, +3 e +4 conferem atividade lítica preferencial em vesículas aniônicas, bem como atividade antimicrobiana contra bactérias Gram negativas e Gram positivas. A formação de domínios poderia ser um mecanismo lítico alternativo para a atividade interfacial. Segregação lipídica induzida por estes peptídeos foi então avaliada por calorimetria diferencial de varredura (DSC), observando-se o impacto destes peptídeos nas propriedades termotrópicas de misturas de lipídios que são miméticas de bactérias Gram negativas. As misturas binárias utilizadas foram POPE:DOPG (3:1) e DPPE:DPPG (4:1 e 1:4). A transição de fase gel-líquida cristalina da mistura POPE:DOPG em 20mM PIPES (140mM NaCl + 1mM EDTA, pH=7,4) foi centrada em 14 oC com um ”ombro”em, apro-ximadamente, 16 oC indicando miscibilidade incompleta destes lipídios. Na razão molar de lipídio por peptídeo (L/P)=400, os três peptídeos estudados induziram aumento na temperatura de fusão (Tm) de suspensão de vesículas multilamelares. Destes peptídeos MP-1, com carga +2, mostrou a maior variação de Tm. As mudanças em Tm foram observadas ser dependente da relação L/P, sendo maior deslocamento de Tm em L/P=15. O aumento da temperatura de transição de fase indica interação preferencial destes... / GUVs visualization studies by fluorescence and phase contrast microscopies, carried out with three mastoparan peptides (MP-1, N-MP-1 and MPX) provided evidences that some of these peptides induce dense regions in the GUV’s surfaces that were attributed to aggregation or lipid segregation. Previous experimental evidences showed that these peptides display inter-facial activity and their net charges +2, +3 and +4 confer preferential lytic activity in anionic vesicles as well as antimicrobial activity against Gram negative and Gram positive bacteria. The domain formation could be an alternative lytic mechanism for the interfacial activity. Lipid segregation induced by these peptides was then evaluated by differential scanning calorime-try (DSC), by observing the impact of these peptides on the thermotropic properties of lipid mixtures which are mimetics of the Gram negative bacteria. The binary mixtures used were POPE:DOPG (3:1) and DPPE:DPPG (4:1 and 1:4). The gel to liquid crystalline phase transi-tion of the mixture POPE:DOPG in 20 mM PIPES (140 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH7.4) was centered in 14 oC with a shoulder in approximately 16 oC indicating incomplete miscibility. At lipid to peptide molar ratio (L/P)=400 the three peptides studied induced increase of the melting temperature Tm of multilamelar vesicle suspensions. From these peptides MP-1, with charge +2, showed the largest variation of Tm. The changes in Tm were observed to be dependent on the L/P ratio, displacing to larger temperature for L/P =15 ratio. The increase in the of the phase transition temperature indicate preferential interaction of these peptides with the anionic com-ponent of the mixture leading to the formation of domains enriched with the other component (POPE) which, in pure state, has the largest Tm. Other three peptides... (Complete abstract click electronic access below)

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:23:01Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2012-02-29Bitstream added on 2014-06-13T20:29:34Z : No. of bitstreams: 1 prandini_thr_me_botib.pdf: 557611 bytes, checksum: d3fc30980a3b1907390cb1a9dcc2047b (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Leveduras do gênero Candida são consideradas os principais agentes de micoses sistêmicas oportunistas, que aumentaram nas duas últimas décadas, devido ao número cada vez maior de hospedeiros com algum grau de comprometimento do sistema imune. Diferentes espécies podem apresentar diferentes perfis clínico-epidemiológicos, assim, um maior conhecimento do perfil molecular e uma correta identificação dos isolados faz-se necessária. Com o sequenciamento de genomas completos de algumas espécies de Candida, tornou-se possível a descoberta e melhor compreensão de algumas regiões gênicas peculiares com importantes implicações evolutivas, biotecnológicas e de desenvolvimento de novas opções terapêuticas. Dentre estas regiões gênicas, destacam-se alguns elementos genéticos parasitas, dentre eles os inteins ou internal proteins, descobertos recentemente e ainda pouco estudados em populações de Candida. Este trabalho avaliou a ocorrência dos inteins nos genes VMA (ATPase vacuolar) e ThrRS (treonil RNAt-sintetase) na população de Candida de interesse médico (C. albicans, C. parapsilosis, C. tropicalis e C. glabrata), possibilitando um maior conhecimento dos perfis moleculares e filogenéticos dos isolados causadores de infecção em nossa região. Foi comprovado também que ambos os inteins aqui pesquisados apresentam um potencial como marcador molecular para a identificação destas espécies, bem como as espécies crípticas do complexo psilosis / Not available

Orientador: Marcio José Tiera / Banca: Sebastião Roberto Taboga / Banca: Laura Tiemi Okano / Banca: Mário Sérgio Galhiane / Banca: Miguel Jafelicci Júnior / Resumo: A quitosana tem emergido na última década como um bom candidato para a entrega genética devido suas propriedades, como baixa toxicidade, biodegradabilidade e versatilidade, como vetor em administração intravenosa e oral. Além disso, possui a capacidade de condensar de forma eficiente com o DNA formando poliplexos resistentes, o que é importante para evitar a degradação por desoxirribonucleases ( DNAses). As nanopartículas resultantes têm recebido grande atenção por suas potenciais aplicações em terapia gênica não viral. Neste trabalho foi realizada a síntese, caracterização e estudo físico químico das nanopartículas formadas pela interação de derivados hidrofílicos de quitosana com DNA. As interações entre derivados de quitosana contendo os grupos fosforilcolina e os grupos poli(etileno glicol) com DNA foram investigadas com base nos efeitos da razão de cargas, pH e conteúdo dos grupos substituintes (PC e PEG) sobre o tamanho e estabilidade dos complexos. Nos estudos foram utilizadas as técnicas de fluorescência com o ensaio do brometo de etídio (EtBr), eletroforese em gel de agarose, espalhamento de luz dinâmico e microscopia de fluorescência. O tamanho e estabilidade coloidal das nanopartículas preparadas com quitosana desacetilada (CHD), quitosana-fosforilcolina (CH-PC) e quitosana-PEG (CH-PEG) mostraram-se fortemente dependentes do conteúdo dos grupos hidrofílicos, bem como, da razão de cargas e pH. A força de interação foi avaliada por meio de ensaio com EtBr. Para razões de carga (N/P) maiores que 5,0, nenhuma liberação do DNA foi observada das nanopartículas por eletroforese em gel. As nanopartículas formadas pela interação dos derivados com DNA (CH-PC-DNA e CH-PEG-DNA) em baixos valores de pH exibiram uma maior resistência à agregação quando... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Chitosan has been recognised in the past decade as a good candidate for gene delivery due to its properties as low toxicity, biodegradability and versatility as a carrier for intravenous and oral administration. Also, the ability to condense efficiently with DNA forming tight polyplexes is important to avoid the degradation by DNAses. The resulting nanoparticles have received great attention for their potential applications in nonviral gene therapy. In this work it was carried out the synthesis, characterization and physicochemical studies of nanoparticles formed by the interaction of hydrophilic derivatives of chitosan with DNA. The interactions between chitosan derivatives containing phosphorylcholine (CH-PC) and poly(ethylene glycol) (CH-PEG) moieties and calf thymus DNA (DNA) were investigated focusing on the effects of the charge ratio, the pH and phosphorylcholine content on the size and stability of the complexes using the ethidium bromide fluorescence assay, gel electrophoresis, dynamic light scattering and fluorescence microscopy. The size and colloidal stability of deacetylated chitosan (CH-DNA), CH-PC-DNA and CH-PEG-DNA complexes were strongly dependent upon phosphorylcholine (PC) and poly(ethylene glycol) contents, charge ratios and pH. The interaction strengths were evaluated by ethidium bromide fluorescence and, at N/P ratios higher than 5.0, no DNA release was observed in any synthesized CH-PC-DNA and CH-PEG-DNA polyplexes by gel electrophoresis. The CH-PC-DNA and CH-PEG-DNA polyplexes exhibited a higher resistance to aggregation compared to deacetylated chitosan (CHD) at neutral pH. At low pH values highly charged chitosan and its phosphorylcholine and PEG derivatives had strong binding affinity with DNA, whereas at higher pH values chitosan (CHD) formed... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Orientador: Eduardo Bagagli / Coorientador: Raquel Cordeiro Theodoro / Banca: Robson Francisco Carvalho / Banca: Renata Castiglioni Pascon / Resumo: Leveduras do gênero Candida são consideradas os principais agentes de micoses sistêmicas oportunistas, que aumentaram nas duas últimas décadas, devido ao número cada vez maior de hospedeiros com algum grau de comprometimento do sistema imune. Diferentes espécies podem apresentar diferentes perfis clínico-epidemiológicos, assim, um maior conhecimento do perfil molecular e uma correta identificação dos isolados faz-se necessária. Com o sequenciamento de genomas completos de algumas espécies de Candida, tornou-se possível a descoberta e melhor compreensão de algumas regiões gênicas peculiares com importantes implicações evolutivas, biotecnológicas e de desenvolvimento de novas opções terapêuticas. Dentre estas regiões gênicas, destacam-se alguns elementos genéticos parasitas, dentre eles os inteins ou internal proteins, descobertos recentemente e ainda pouco estudados em populações de Candida. Este trabalho avaliou a ocorrência dos inteins nos genes VMA (ATPase vacuolar) e ThrRS (treonil RNAt-sintetase) na população de Candida de interesse médico (C. albicans, C. parapsilosis, C. tropicalis e C. glabrata), possibilitando um maior conhecimento dos perfis moleculares e filogenéticos dos isolados causadores de infecção em nossa região. Foi comprovado também que ambos os inteins aqui pesquisados apresentam um potencial como marcador molecular para a identificação destas espécies, bem como as espécies crípticas do complexo psilosis / Abstract: Not available / Mestre

Resumo: Protonectina e Protonectina 1-6 são peptídeos extraídos do veneno da vespa social Agelaia pallipes pallipes. O primeiro apresenta atividade hemolítica, de degranulação de mastócitos e quimiotática, enquanto o segundo apresenta somente a atividade quimiotática quando atuam isoladamente. A associação destes dois peptídeos, em proporção 1:1 produz um aumento nas atividades hemolíticas e de degranulação de mastócitos, enquanto a atividade quimiotática decresce acentuadamente, ou seja, em associação apresentam um comportamento mais acentuado de interação com membranas. Dados de dicroísmo circular mostram que, quando associados, há um pequeno acréscimo no percentual de aminoácidos em conformação de hélice-α. A proposta deste trabalho é analisar, usando dinâmica molecular, os aspectos conformacionais da Protonectina isolada e em associação com a Protonectina 1 - 6 em misturas de TFE-água, para entender se e como ocorre essa associação, procurando destacar quais fatores podem ser determinantes nesse processo. A Protonectina isolada foi estudada por meio de dinâmicas moleculares de equilíbrio e dinâmica associada ao método de troca de réplicas. Com esse método, obteve-se dezesseis trajetórias de 60 ns varrendo o intervalo de temperaturas de 287 a 342 K, usando uma conformação em hélice alfa ideal como estrutura inicial. Usando o software WHAM e parâmetros como o RMSD e a primeira das componentes de uma Análise de Componentes Principais, PCA, como coordenadas de reação, obteve-se a superfície de energia livre, que apresenta dois mínimos principais. O mínimo com energia mais baixa contém estruturas ordenadas, com parte dos resíduos em alfa-hélice, ou em hélice-5 ou, ainda, numa combinação de "turns" e B-bridges, enquanto conformações aleatórias são encontradas no segundo mínimo. Destes dados o tempo de transição... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Protonectin and Protonectin 1- 6 are peptides extracted from the venom of the social wasp Agelaia pallipes pallipes. While Protonectin presents hemolytic, mast cell degranulation and chimiotactic activities, protonectin 1-6 just presents the chimiotactic activity. When these peptides are mixed at 1:1 molar ratio the hemolytic and mast cell degranulation activities increase while the chemiotactic decreases significantly. Circular Dicroism data shows a small increase in the amount of residues in ordered structures, alfa helix, for example. The purpose of this work is to analyse the conformational features of these peptides isolated and in association in TFE-water mixtures using molecular dynamics simulation to understand if this association occurs or not and how. The Protonectin was studied using equilibrium MD simulations and associating Molecular dynamics and the replica exchange methods. With this method, sixteen trajectories of the 60 ns in the range 287 - 342 K was simulated, all the replicas starting from an ideal alfa helix. Using the WHAM software, RMSD parameters and the first Principal Components Analysis, PCA, we have the free energy surface, that presents two principals minimums. One corresponding to structures with some organization some residues in α-helix, 5-helix or turns associated with b-bridges. The other minimum presents structures in coil conformation. The "folding" time were stimated and the stability of the conformations are discussed. Starting from typical structures found in the equilibrium dynamic associated with the replica exchange method six 60 ns trajectories were simulated. These simulations comprove some stabilization of the structures found at the energy minimum. The association of Protonectin and Protonectin 1- 6 was studied using equilibrium molecular dynamics run during at ~300 ns in the ambient temperature. The results suggest that there... (Complete abstract click electronic access below) / Orientador: José Roberto Ruggiero / Coorientador: Jorge Chahine / Banca: Pedro Geraldo Pascutti / Banca: Márcia Perez dos Santos Cabrera / Mestre

Resumo: Usando o modelo de Peyrard-Bishop [2] exploramos o limiar de energia para existência de localização de energia, assim como a dinâmica de um par de cadeias de osciladores representando o DNA. Em trabalho recente [9], obteve-se o limiar de energia para uma cadeia homogênea. Neste trabalho os resultados para cadeias homogêneas e não homogêneas serão considerados. A não homogeneidade é tratada na forma de blocos com diferentes parâmetros para o potencial de Morse. O potencial de Morse é usado para simular as ligações de hidrogênio que estabilizam a dupla hélice do DNA. Esta é uma primeira aproximação para a molécula real.Os resultados mostram que o valor da energia crítica, a energia mínima para haver localização de energia, é uma função da presença de interfaces entre os blocos e a dinâmica revela que essa localização se restringe ao bloco inicialmente excitado. / Abstract: Using the Peyrard-Bishop model [2] we explore the threshold energy for energy localization as well as the dynamics of a DNA chain. In a recent work [9], the threshold energy for localization in homogeneous chain have been obtained. Here results for homogeneous and nonhomogeneous chains are considered. This nonhomogeneity is treated as blocks with different values for the parameters in the Morse Potential, the usually used potential function for simulating the Hbonds in the DNA double helix. This is a suitable first approximation for the real molecule. The results show the threshold energy depends on the presence of block interfaces and the dynamics shows that localization is restricted to the block initially excited. / Orientador: José Roberto Ruggiero / Coorientador: Elso Drigo Filho / Banca: José Roberto Ruggiero / Banca: Jayme Vicente de Luca Filho / Banca: Masayoshi Tsuchida / Mestre