Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Neurociências. / Made available in DSpace on 2012-10-23T15:44:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 239614.pdf: 1037726 bytes, checksum: 6ba900140f9987836a0852d2d3d595ad (MD5)

Made available in DSpace on 2012-05-07T15:26:23Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) 000011.pdf: 1883510 bytes, checksum: 4dab12121182cd9303da92a01e0b0507 (MD5) Previous issue date: 2006 / RasGEF1b é um fator de troca de nucleotídeos guanina (GEF) hipotético e altamente conservado. Esse gene contém um domínio RASGEFN com um motivo zíper de leucina e um domínio RASGEF com três sítios de localização nuclear. A expressão do mRNA do RasGEF1b em macrófagos é induzida por diferentes agonistas de receptores do tipo Toll (TLRs), tais como LPS (TLR4), GPI-mucina (TLR2) e Poli I:C (TLR3). A fim de expressar a proteína recombinante, nós clonamos o cDNA do RasGEF1b no vetor pQE-30, utilizado para transformar bactérias E. coli (XL1-Blue). A His-RasGEF1b expressa em bactérias foi purificada utilizando tampão com alto conteúdo de uréia, seguido por cromatografia de afinidade utilizando resina carregada com níquel. A expressão da proteína foi confirmada em gel 2D, análise por espectometria de massa e Western blotting utilizando um anticorpo monoclonal anti-His. Além disso, o cDNA do RasGEF1b foi inserido em um plasmídeo que permite a fusão do epitopo FLAG (pFLAGCMV2) com a proteína RasGEF1b. O pFLAGCMV2 codificando o cDNA do RasGEF1b foi utilizado para transfectar células HEK293T e a expressão protéica foi avaliada com gel 2D gel e Western blotting utilizando um anticorpo monoclonal anti-FLAG. A proteína reconhecida pelo anti-FLAG mostrou um peso molecular aparente de 56 KDa e ponto isoelétrico de 7,25. Utilizando a técnica de centrifugação diferencial e anticorpos monoclonais para as proteínas específicas das diferentes frações subcelulares, nós demonstramos que a proteína FLAG-RasGEF1b estava presente principalmente nas frações de núcleo e de membranas pesadas. Através do alinhamento entre seqüências da RasGEF1b de diferentes espécies filogeneticamente distintas vimos que esta proteína é altamente conservada com similaridade de 57 por cento a 97 por cento em relação à RasGEF1b murina.

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Os objetivos da presente tese de doutorado foram os de investigar o papel das purinas, em especial da guanina, da inosina e da guanosina, na nocicepção e compreender os mecanismos responsáveis pelos efeitos extracelulares desses compostos. Os resultados estão divididos em três partes, de acordo com sua natureza, em revisão da literatura (parte um), experimental, em animais e em humanos (parte dois) e discussão (parte três). Para o desenvolvimento da primeira parte, uma extensa revisão da literatura em relação ao papel extracelular das purinas na nocicepção foi realizada. Na segunda parte desta tese, procedimentos experimentais em animais demonstraram que a guanina e a inosina administradas por via intratecal, são antinociceptivas em diversos modelos de dor, além da guanosina administrada via intraperitoneal com seu efeito antinociceptivo em modelo de dor neuropática em camundongos. A administração intratecal de guanina e inosina causou um aumento significativo nos níveis de inosina e oxipurinas no líquido cefalorraquiano (LCR). Os níveis de guanina no LCR não foram detectados de forma acurada através da presente metodologia cromatográfica. Diversos testes comportamentais demonstraram o baixo potencial de toxicidade apresentado pelas purinas administradas por via intratecal. A seguir, os mecanismos de ação envolvidos nos efeitos antinociceptivos da guanina e da inosina foram investigados através de métodos farmacológicos, demonstrando que ambos parecem compartilhar mecanismos semelhantes, envolvendo a ativação de receptores adenosinérgicos Também demonstramos que o alopurinol, um derivado das purinas e inibidor da xantina oxidase normalmente utilizado para o tratamento de hiperuricemia, também produziu efeito analgésico em pacientes em pós-operatório imediato de histerectomia abdominal, além de apresentarem aumento de xantina e diminuição de ácido úrico no LCR. Apesar da utilização clínica das purinas ser demasiadamente precoce, podemos inferir que a utilização de alopurinol poderia ser uma excelente estratégia para testar nossas hipóteses, pois demonstra a vantagem de estar aprovado para uso comercial, apresentar boa tolerabilidade e baixo custo. Os resultados apresentados nesta tese ratificam o papel das purinas nos mecanismos de transmissão da dor e um novo papel para a guanina, a inosina e a guanosina é proposto: a modulação da dor. Diversos derivados purinérgicos são alvos para desenvolvimento de novos fármacos e podem ser úteis no tratamento de dor relacionada a hiperestimulação do sistema adenosinérgico e glutamatérgico. / The aim of this thesis was to investigate the role of purines, especially guanine, inosine and guanosine, against the nociception and to understand the mechanisms responsible for the extracellular effects of these compounds. The results are divided into three parts, according to their nature, in review of the literature (part one), experimental, in animals and humans (part two) and discussion (part three). For the development of the first part, an extensive review of the literature regarding the extracellular role of purines in the nociception was performed. In the second part of this thesis, experimental procedures in animals demonstrated that guanine and inosine administered intrathecally are antinociceptive in several models of pain. Additionally, guanosine, administered intraperitoneally, produced antinociceptive effects in a model of neuropathic pain in mice. Intrathecal administration of guanine and inosine caused a significant increase in inosine and oxypurine levels in the cerebrospinal fluid (CSF). The levels of guanine in the CSF were not accurately detected by the present chromatographic methodology. Several behavioral tests have demonstrated the low toxicity potential of intrathecal purines. Furthermore, the mechanisms of action involved in the antinociceptive effects of guanine and inosine have been investigated through pharmacological methods, demonstrating that both seem to share similar mechanisms, involving the activation of adenosinergic receptors We also demonstrated that allopurinol, a purine derivative and xanthine oxidase inhibitor commonly used for the treatment of hyperuricemia, also produced an analgesic effect in patients in the immediate postoperative period of abdominal hysterectomy, in addition to increased xanthine and decreased uric acid in the CSF. Although the clinical use of purines is too premature, we can infer that the use of allopurinol could be an excellent strategy to test our hypotheses, since it demonstrates the advantage of being approved for commercial use, presenting good tolerability and low cost. The results presented in this thesis confirm the role of purines in pain transmission mechanisms and a new role for guanine, inosine and guanosine is proposed: pain modulation. A number of purinergic derivatives are targets for the development of novel drugs and may be useful in the treatment of pain related to hyperstimulation of the adenosinergic and glutamatergic system.

Os objetivos da presente tese de doutorado foram os de investigar o papel das purinas, em especial da guanina, da inosina e da guanosina, na nocicepção e compreender os mecanismos responsáveis pelos efeitos extracelulares desses compostos. Os resultados estão divididos em três partes, de acordo com sua natureza, em revisão da literatura (parte um), experimental, em animais e em humanos (parte dois) e discussão (parte três). Para o desenvolvimento da primeira parte, uma extensa revisão da literatura em relação ao papel extracelular das purinas na nocicepção foi realizada. Na segunda parte desta tese, procedimentos experimentais em animais demonstraram que a guanina e a inosina administradas por via intratecal, são antinociceptivas em diversos modelos de dor, além da guanosina administrada via intraperitoneal com seu efeito antinociceptivo em modelo de dor neuropática em camundongos. A administração intratecal de guanina e inosina causou um aumento significativo nos níveis de inosina e oxipurinas no líquido cefalorraquiano (LCR). Os níveis de guanina no LCR não foram detectados de forma acurada através da presente metodologia cromatográfica. Diversos testes comportamentais demonstraram o baixo potencial de toxicidade apresentado pelas purinas administradas por via intratecal. A seguir, os mecanismos de ação envolvidos nos efeitos antinociceptivos da guanina e da inosina foram investigados através de métodos farmacológicos, demonstrando que ambos parecem compartilhar mecanismos semelhantes, envolvendo a ativação de receptores adenosinérgicos Também demonstramos que o alopurinol, um derivado das purinas e inibidor da xantina oxidase normalmente utilizado para o tratamento de hiperuricemia, também produziu efeito analgésico em pacientes em pós-operatório imediato de histerectomia abdominal, além de apresentarem aumento de xantina e diminuição de ácido úrico no LCR. Apesar da utilização clínica das purinas ser demasiadamente precoce, podemos inferir que a utilização de alopurinol poderia ser uma excelente estratégia para testar nossas hipóteses, pois demonstra a vantagem de estar aprovado para uso comercial, apresentar boa tolerabilidade e baixo custo. Os resultados apresentados nesta tese ratificam o papel das purinas nos mecanismos de transmissão da dor e um novo papel para a guanina, a inosina e a guanosina é proposto: a modulação da dor. Diversos derivados purinérgicos são alvos para desenvolvimento de novos fármacos e podem ser úteis no tratamento de dor relacionada a hiperestimulação do sistema adenosinérgico e glutamatérgico. / The aim of this thesis was to investigate the role of purines, especially guanine, inosine and guanosine, against the nociception and to understand the mechanisms responsible for the extracellular effects of these compounds. The results are divided into three parts, according to their nature, in review of the literature (part one), experimental, in animals and humans (part two) and discussion (part three). For the development of the first part, an extensive review of the literature regarding the extracellular role of purines in the nociception was performed. In the second part of this thesis, experimental procedures in animals demonstrated that guanine and inosine administered intrathecally are antinociceptive in several models of pain. Additionally, guanosine, administered intraperitoneally, produced antinociceptive effects in a model of neuropathic pain in mice. Intrathecal administration of guanine and inosine caused a significant increase in inosine and oxypurine levels in the cerebrospinal fluid (CSF). The levels of guanine in the CSF were not accurately detected by the present chromatographic methodology. Several behavioral tests have demonstrated the low toxicity potential of intrathecal purines. Furthermore, the mechanisms of action involved in the antinociceptive effects of guanine and inosine have been investigated through pharmacological methods, demonstrating that both seem to share similar mechanisms, involving the activation of adenosinergic receptors We also demonstrated that allopurinol, a purine derivative and xanthine oxidase inhibitor commonly used for the treatment of hyperuricemia, also produced an analgesic effect in patients in the immediate postoperative period of abdominal hysterectomy, in addition to increased xanthine and decreased uric acid in the CSF. Although the clinical use of purines is too premature, we can infer that the use of allopurinol could be an excellent strategy to test our hypotheses, since it demonstrates the advantage of being approved for commercial use, presenting good tolerability and low cost. The results presented in this thesis confirm the role of purines in pain transmission mechanisms and a new role for guanine, inosine and guanosine is proposed: pain modulation. A number of purinergic derivatives are targets for the development of novel drugs and may be useful in the treatment of pain related to hyperstimulation of the adenosinergic and glutamatergic system.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina. Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Neurociências. / Made available in DSpace on 2013-07-15T23:04:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 220700.pdf: 435548 bytes, checksum: e67c11cdbea7b974fe16f764e957d80a (MD5)

Os objetivos da presente tese de doutorado foram os de investigar o papel das purinas, em especial da guanina, da inosina e da guanosina, na nocicepção e compreender os mecanismos responsáveis pelos efeitos extracelulares desses compostos. Os resultados estão divididos em três partes, de acordo com sua natureza, em revisão da literatura (parte um), experimental, em animais e em humanos (parte dois) e discussão (parte três). Para o desenvolvimento da primeira parte, uma extensa revisão da literatura em relação ao papel extracelular das purinas na nocicepção foi realizada. Na segunda parte desta tese, procedimentos experimentais em animais demonstraram que a guanina e a inosina administradas por via intratecal, são antinociceptivas em diversos modelos de dor, além da guanosina administrada via intraperitoneal com seu efeito antinociceptivo em modelo de dor neuropática em camundongos. A administração intratecal de guanina e inosina causou um aumento significativo nos níveis de inosina e oxipurinas no líquido cefalorraquiano (LCR). Os níveis de guanina no LCR não foram detectados de forma acurada através da presente metodologia cromatográfica. Diversos testes comportamentais demonstraram o baixo potencial de toxicidade apresentado pelas purinas administradas por via intratecal. A seguir, os mecanismos de ação envolvidos nos efeitos antinociceptivos da guanina e da inosina foram investigados através de métodos farmacológicos, demonstrando que ambos parecem compartilhar mecanismos semelhantes, envolvendo a ativação de receptores adenosinérgicos Também demonstramos que o alopurinol, um derivado das purinas e inibidor da xantina oxidase normalmente utilizado para o tratamento de hiperuricemia, também produziu efeito analgésico em pacientes em pós-operatório imediato de histerectomia abdominal, além de apresentarem aumento de xantina e diminuição de ácido úrico no LCR. Apesar da utilização clínica das purinas ser demasiadamente precoce, podemos inferir que a utilização de alopurinol poderia ser uma excelente estratégia para testar nossas hipóteses, pois demonstra a vantagem de estar aprovado para uso comercial, apresentar boa tolerabilidade e baixo custo. Os resultados apresentados nesta tese ratificam o papel das purinas nos mecanismos de transmissão da dor e um novo papel para a guanina, a inosina e a guanosina é proposto: a modulação da dor. Diversos derivados purinérgicos são alvos para desenvolvimento de novos fármacos e podem ser úteis no tratamento de dor relacionada a hiperestimulação do sistema adenosinérgico e glutamatérgico. / The aim of this thesis was to investigate the role of purines, especially guanine, inosine and guanosine, against the nociception and to understand the mechanisms responsible for the extracellular effects of these compounds. The results are divided into three parts, according to their nature, in review of the literature (part one), experimental, in animals and humans (part two) and discussion (part three). For the development of the first part, an extensive review of the literature regarding the extracellular role of purines in the nociception was performed. In the second part of this thesis, experimental procedures in animals demonstrated that guanine and inosine administered intrathecally are antinociceptive in several models of pain. Additionally, guanosine, administered intraperitoneally, produced antinociceptive effects in a model of neuropathic pain in mice. Intrathecal administration of guanine and inosine caused a significant increase in inosine and oxypurine levels in the cerebrospinal fluid (CSF). The levels of guanine in the CSF were not accurately detected by the present chromatographic methodology. Several behavioral tests have demonstrated the low toxicity potential of intrathecal purines. Furthermore, the mechanisms of action involved in the antinociceptive effects of guanine and inosine have been investigated through pharmacological methods, demonstrating that both seem to share similar mechanisms, involving the activation of adenosinergic receptors We also demonstrated that allopurinol, a purine derivative and xanthine oxidase inhibitor commonly used for the treatment of hyperuricemia, also produced an analgesic effect in patients in the immediate postoperative period of abdominal hysterectomy, in addition to increased xanthine and decreased uric acid in the CSF. Although the clinical use of purines is too premature, we can infer that the use of allopurinol could be an excellent strategy to test our hypotheses, since it demonstrates the advantage of being approved for commercial use, presenting good tolerability and low cost. The results presented in this thesis confirm the role of purines in pain transmission mechanisms and a new role for guanine, inosine and guanosine is proposed: pain modulation. A number of purinergic derivatives are targets for the development of novel drugs and may be useful in the treatment of pain related to hyperstimulation of the adenosinergic and glutamatergic system.

Os transtornos de ansiedade estão entre os mais prevalentes de todos os transtornos mentais no mundo. Estão associados a sofrimento subjetivo e prejuízo na qualidade de vida dos pacientes. Porém os mecanismos fisiopatológicos da ansiedade ainda necessitam de muita investigação. Recentemente, nosso grupo demonstrou que a administração sistêmica de GMP é capaz de induzir um efeito típico ansiolítico em ratos, contudo, o mecanismo de ação deste efeito ainda não foi esclarecido. Assim, no presente estudo buscamos investigar os mecanismos envolvidos no efeito ansiolítico do GMP, além de avaliar o potencial efeito ansiolítico da guanosina (GUO), e explorar o envolvimento do sistema adenosinérgico e glutamatérgico nos efeitos observados. Nossos resultados evidenciam que o GMP é capaz de promover efeito típico ansiolítico quando a administração é central, aumentar os níveis de GUO e adenosina (ADO) no liquor quando sua administração é intraperitoneal (i.p.). Ainda, observamos que a administração i.p. de GUO possui efeito típico ansiolítico, aumentando apenas os níveis de ADO no liquor. Com isso, demonstramos que a administração de GUO foi capaz de diminuir os níveis de glutamato no liquor, sem alterar a captação de glutamato em regiões do cérebro relacionadas com a ansiedade. Por fim, mostramos que o pré-tratamento com cafeína foi capaz de abolir o efeito ansiolítico da GUO e parcialmente bloquear a diminuição dos níveis de glutamato no liquor. Como conclusão, este estudo fornece novas evidências sobre o mecanismo de ação do GMP e da GUO, e mostra que o efeito ansiolítico pode estar relacionado com a modulação do sistema adenosinérgico e glutamatérgico. / Anxiety disorders represent the most common worldwide psychiatric diseases but nowadays there is no satisfactory strategy to their treatment without severe adverse effects. Recently, we demonstrated that a systemic administration of GMP induces anxiolytic-like effect in rats but its mechanism of action remains unclear. In the present study we aimed to investigate the mechanisms insights into how GMP induces anxiolytic-like effects and further explored the anxiolytic potential of guanosine (GUO) and the involvement of the adenosinergic and glutamatergic system on those effects. Our results showed that GMP induces anxiolytic-like behaviors centrally and increases cerebrospinal fluid (CSF) CSF GUO and adenosine (ADO) levels 60 min after a systemic administration. Furthermore, systemic administration of GUO produced anxiolytic-like behaviors but enhance only CSF ADO level 60 min after administration. In addition, GUO treatment decreased CSF glutamate level but did not change glutamate uptake in brain regions related to anxiety. Moreover, the pre administration of CAF abolished GUO anxiolytic-like effects and partially blocked GUO effects on CSF glutamate level. In summary, the present work presents the anxyolitic effects of GMP and GUO and provides new evidence that these effects seem to be related to the modulation of adenosinergic and glutamatergic systems.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina. Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Neurociências. / Made available in DSpace on 2012-10-21T10:29:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 205334.pdf: 2478141 bytes, checksum: 7b5f4918152c54042356e75377a9fd8e (MD5) / Os nucleotídeos e o nucleosídeo derivados da guanina (DG) têm sido implicados em diversas funções extracelulares importantes, como a modulação da transmissão glutamatérgica e efeitos tróficos em neurônios e astrócitos. O glutamato (Glu) é o principal neurotransmissor excitatório do sistema nervoso de mamíferos e a ativação de seus receptores tem importante papel em processos fisiológicos e patológicos. O objetivo deste estudo foi analisar o possível papel neuroprotetor e/ou neurotrófico dos DG em culturas de astrócitos

Os transtornos de ansiedade estão entre os mais prevalentes de todos os transtornos mentais no mundo. Estão associados a sofrimento subjetivo e prejuízo na qualidade de vida dos pacientes. Porém os mecanismos fisiopatológicos da ansiedade ainda necessitam de muita investigação. Recentemente, nosso grupo demonstrou que a administração sistêmica de GMP é capaz de induzir um efeito típico ansiolítico em ratos, contudo, o mecanismo de ação deste efeito ainda não foi esclarecido. Assim, no presente estudo buscamos investigar os mecanismos envolvidos no efeito ansiolítico do GMP, além de avaliar o potencial efeito ansiolítico da guanosina (GUO), e explorar o envolvimento do sistema adenosinérgico e glutamatérgico nos efeitos observados. Nossos resultados evidenciam que o GMP é capaz de promover efeito típico ansiolítico quando a administração é central, aumentar os níveis de GUO e adenosina (ADO) no liquor quando sua administração é intraperitoneal (i.p.). Ainda, observamos que a administração i.p. de GUO possui efeito típico ansiolítico, aumentando apenas os níveis de ADO no liquor. Com isso, demonstramos que a administração de GUO foi capaz de diminuir os níveis de glutamato no liquor, sem alterar a captação de glutamato em regiões do cérebro relacionadas com a ansiedade. Por fim, mostramos que o pré-tratamento com cafeína foi capaz de abolir o efeito ansiolítico da GUO e parcialmente bloquear a diminuição dos níveis de glutamato no liquor. Como conclusão, este estudo fornece novas evidências sobre o mecanismo de ação do GMP e da GUO, e mostra que o efeito ansiolítico pode estar relacionado com a modulação do sistema adenosinérgico e glutamatérgico. / Anxiety disorders represent the most common worldwide psychiatric diseases but nowadays there is no satisfactory strategy to their treatment without severe adverse effects. Recently, we demonstrated that a systemic administration of GMP induces anxiolytic-like effect in rats but its mechanism of action remains unclear. In the present study we aimed to investigate the mechanisms insights into how GMP induces anxiolytic-like effects and further explored the anxiolytic potential of guanosine (GUO) and the involvement of the adenosinergic and glutamatergic system on those effects. Our results showed that GMP induces anxiolytic-like behaviors centrally and increases cerebrospinal fluid (CSF) CSF GUO and adenosine (ADO) levels 60 min after a systemic administration. Furthermore, systemic administration of GUO produced anxiolytic-like behaviors but enhance only CSF ADO level 60 min after administration. In addition, GUO treatment decreased CSF glutamate level but did not change glutamate uptake in brain regions related to anxiety. Moreover, the pre administration of CAF abolished GUO anxiolytic-like effects and partially blocked GUO effects on CSF glutamate level. In summary, the present work presents the anxyolitic effects of GMP and GUO and provides new evidence that these effects seem to be related to the modulation of adenosinergic and glutamatergic systems.