Submitted by Luciana Sebin (lusebin@ufscar.br) on 2016-10-11T12:04:16Z No. of bitstreams: 1 DissACMF.pdf: 2760486 bytes, checksum: 27824647d350872bddb22f28a9206da8 (MD5) / Approved for entry into archive by Marina Freitas (marinapf@ufscar.br) on 2016-10-20T13:38:00Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DissACMF.pdf: 2760486 bytes, checksum: 27824647d350872bddb22f28a9206da8 (MD5) / Approved for entry into archive by Marina Freitas (marinapf@ufscar.br) on 2016-10-20T13:38:07Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DissACMF.pdf: 2760486 bytes, checksum: 27824647d350872bddb22f28a9206da8 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-10-20T13:38:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DissACMF.pdf: 2760486 bytes, checksum: 27824647d350872bddb22f28a9206da8 (MD5) Previous issue date: 2016-02-24 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / The mansoni schistosomiasis is the most important of human helminthiasis. Despite advances in its control this disease continues to spread to new geographical areas. It currently affects more than 250 million people. However, limited options are available for and Praziquantel is the drug of choice. Various authors have been searching new drugs and vaccines to control schistosomiasis. This study aimed to evaluate the effects of a prior immunization with recombinant enzymes of Schistosoma mansoni: Adenosine Kinase (AK) and Hypoxanthine-guanine Phosphoribosyltransferase (HGPRT), which are important for parasite purine metabolism, as well as a MIX of these enzymes, and subsequent challenge with cercariae of the parasite in the control of murine infection. Female Balb/c mice were divided into 5 groups. The groups were enzyme-immunized in three doses and 15 days after the last immunization, animals were infected with S. mansoni. After infection in the 47º day egg count were carried in mice faeces and in the 48º day mice were sacrificed for evaluation of leukocyte numbers (blood and peritoneal cavity), worm burden, antibodies production, cytokines quantification and histopathological analysis of the liver of these animals. Our results strongly suggest that, immunization with a MIX originated in these animals reduction in the number of eggs in faeces by 46% when compared with the animals of the infected group. Animals of the groups immunized with AK, HGPRT and/or MIX seem to induce a reduction in the number of eosinophils in the peritoneal cavity when compared to the animals of the infected group. Concerning worm burden, the animals of the MIX group presented greater reduction (31.27%) when compared to the animals of the infected group. The animals of the immunized groups, AK, HGPRT and/or MIX were capable of producing IgG1 antibodies and IgE anti the enzymes and anti the parasite proteins. The animals of the immunized group MIX showed a slight increase in IL-4 production and observed reduction of IL-10, and in the HGPRT group induced a slight increase on IFN-γ production when in compared with the infected group. In addition, the animals of the AK group showed a decrease in the number of hepatic granulomas in tissue (44,55%) and the eggs present in liver (42,31%). Therefore, it suggests that immunization with these enzymes can contributes to schistosomiasis control, as well as it might helps to modulate experimental infection inducing reduction of physiopathology of this parasitosis. / A esquistossomose mansônica é a mais importante das helmintíases humanas. Apesar dos avanços no seu controle continua se espalhando para novas áreas geográficas. Atualmente afeta mais de 250 milhões de pessoas. Entretanto, opções limitadas estão disponíveis para o tratamento da doença e o único fármaco de escolha é o Praziquantel. Assim, vários estudos têm sido propostos para encontrar novos fármacos e vacinas para combater a esquistossomose. Dessa forma, o presente estudo teve como proposta avaliar os efeitos da imunização prévia com as enzimas recombinantes de Schistosoma mansoni Adenosina Quinase (AK) e Hipoxantina-Guanina Fosforibosiltransferase (HGPRT), que participam do metabolismo de purinas do parasito, bem como com o MIX das duas enzimas, e posterior desafio com cercárias do parasito, para o controle da infecção murina. Camundongos fêmea Balb/c foram divididos em 5 grupos. Os grupos imunizados receberam três doses das enzimas e após 15 dias da última imunização, os animais foram infectados com S. mansoni. Após a infecção, no 47° dia foi realizada a contagem de ovos nas fezes e no 48° dia foi realizada a eutanásia dos animais para avaliação de resposta leucocitária (sangue e lavado da cavidade peritoneal), carga parasitária, produção de anticorpos, quantificação de citocinas e análise histopatológica do fígado desses animais. Os resultados demonstraram que, a imunização com o MIX promoveu nesses animais redução do número de ovos nas fezes de 46% quando comparado com os animais do grupo somente infectado. Os animais dos grupos imunizados com AK, HGPRT e/ou MIX apresentaram diminuição na quantidade de eosinófilos na cavidade peritoneal quando comparados com os animais do grupo somente infectado. Em relação à carga parasitária, os animais do grupo imunizado com o MIX apresentaram maior redução (31,27%) quando comparados aos animais do grupo somente infectado. Os animais dos grupos imunizados com AK, HGPRT e/ou MIX foram capazes de produzir anticorpos IgG1 e IgE anti as enzimas e anti as proteínas do parasito. Os animais do grupo imunizado com o MIX apresentaram aumento discreto de IL-4 e foi observada redução de IL-10, e no grupo imunizado com HGPRT houve aumento discreto de IFN-γ, quando comparados com os animais do grupo somente infectado. Além disso, os animais do grupo imunizado com AK apresentaram redução do número de granulomas hepáticos (44,55%) e de ovos no fígado (42,31%), quando comparados com o grupo somente infectado. Assim, sugere-se que a imunização com essas enzimas pode contribuir para o controle da esquistossomose, bem como auxiliar na modulação da infecção experimental, induzindo redução da fisiopatologia desta parasitose.

O presente trabalho teve como objetivos a clonagem, expressão e purificação da proteína HGPRT de Leishimania tarentolae, para a caracterização e cristalização dessa enzima, a fim do seu estudo estrutural e funcional. O gene da HGPRT foi amplificado a partir de uma biblioteca genômica de Leishmania tarentolae da cepa UC Lambda ZAP Express BamHI-Sal3A I. Esse gene foi clonado no vetor de expressão pET29a(+) e usado na transformação da bactéria Escherichia coli BL21 (DE3). Esse sistema de expressão apresentou uma superexpressão da proteína recombinante, que foi purificada em cromatografia de forma iônica, com o uso da coluna de troca anônica POROS 20HQ. A proteína purificada foi utilizada para sua caracterização, como a determinação das constantes cinéticas (Km, Vmax e Kcat) para os diferentes substratos. A proteína foi encontrada como dímero em solução e o pI de aproximadamente 8,2. Além disso, essa proteína foi utilizada nos ensaios de cristalização pelo método de difusão de vapor em gotas suspensas. Os cristais obtidos foram utilizados nos testes da difração de raios-X sendo coletado um conjunto de dados no Laboratório Nacional de Luz Síncroton. Os dados de difração de raios-X foram processados com o uso do pacote de programa HKL. A resolução da estrutura cristalográfica foi obtida pelo método de substituição molecular através do programa AmoRe. Para o refinamento da estrutura foram utilizados os programas de refinamento automático CNS e REFMAC, e a manipulação na estação gráfica foi realizada através do programa O. A estrutura da HGPRT foi resolvida a 2,1 &#197 de resolução com os fatores de concordância Rwork e Rfree finais de 17,34 e 21,53%, respectivamente. / The aims of this work were the cloning, expression and purification of the protein HGPRT from Leishimania tarentolae, for the characterization and crystallization of the enzyme for it structural and functional study. The full-length hgprt gene was isolated from a leishmania tarentolae UC strain Lambda ZAP Express BamHI-Sal3A I genomic library. This gene was cloned in the expression vector pET29a+, and used in the transformation of the bacteria Escherichia coli BL21(DE3). This expression system presented a super-expression of the recombinant protein, which was purified by ionic change chromatography, utilizing the anionic change column POROS 20HQ. The purified protein was utilized for its characterization, including its kinetics constants (Km, Vmax e Kcat) for different substrates. The protein was found to be a dimmer in solution with pI close to 8.2. Besides, this protein was used in the crystallization assays by the steam diffusion in suspended drop technique. The obtained crystals were utilized in the x-ray diffraction studies. The data collection was performed in the Laboratório Nacional de Luz Síncroton. The X-ray diffraction data were processed utilizing the package program HKL. The crystallographic structure resolution was obtained by the molecular replacement method from the AmoRe program. For the structure refinement, the automatic refinement programs CNS and REFMAC were used, and the graphic manipulation was made through the O program. The structure of the HGPRT was resolved with 2,1 &#197 of resolution and final agreement factors Rwork and Rfree of 17,34% and 21,53%, respectively.

A isquemia cerebral é uma enfermidade grave, de incidência e prevalência global, considerada uma das principais causas de morte e incapacidade no mundo. Ela é decorrente da hipoperfusão ou interrupção sanguínea em uma determinada região encefálica e a falta de oxigênio e glicose leva a falha no metabolismo energético de neurônios e células gliais. A morte destas células libera grande quantidade de glutamato, o principal neurotransmissor excitatório, o que desencadeia a cascata isquêmica, formada por estresse oxidativo, excitotoxicidade e processo inflamatório. Estes insultos causam danos teciduais graves que comprometem, principalmente, o sistema sensorimotor, memória, cognição e as emoções. A guanosina, um derivado da guanina, tem mostrado papel neuroprotetor ao sistema nervoso central, agindo no sistema glutamatérgico. Esses efeitos têm sido demonstrados em ratos machos, mas não em fêmeas, por isso, o objetivo desta tese foi investigar através de testes comportamentais, imunoistoquímico e histológico, a ação da guanosina em ratos Wistar machos e fêmeas induzidos cirurgicamente a um modelo de isquemia focal permanente do córtex cerebral parietal, levando em consideração o ciclo estral das fêmeas imediatamente antes da indução isquêmica. Este trabalho foi aprovado pela Comissão de Ética no Uso de Animais da UFRGS (Nº 29396). Após a verificação do ciclo estral, fêmeas e machos foram anestesiados, posicionados em aparelho estereotáxico e a isquemia focal cortical foi induzida por termocoagulação dos vasos piais. Ao término da cirurgia, os animais foram tratados com solução salina 0,9% ou guanosina 60 mg/kg, ambos por via intraperitoneal, em 4 doses (0, 1, 3 e 6 horas após a indução isquêmica). No teste do cilindro, as fêmeas apresentaram significativamente melhor recuperação sensorimotora a longo prazo comparadas aos machos. No teste do campo aberto, memória de habituação a longo prazo e locomoção em fêmeas foram prejudicadas pela isquemia e os machos não apresentaram prejuízo. No teste do labirinto em cruz elevado não houve diferença significativa entre os grupos. No teste claro/escuro, as fêmeas isquêmicas demonstraram comportamento ansiolítico comparadas aos machos e às fêmeas naïves. A imunoistoquímica de astrócitos e a mensuração do volume de lesão não apresentaram diferença estatística entre os grupos. Com este trabalho demonstrou-se a importância da realização de pesquisas em ambos os gêneros, considerando o ciclo estral, principalmente para enfermidades complexas como a isquemia cerebral. O tratamento com a guanosina é promissor, principalmente na recuperação motora em fêmeas, entretanto, estudos futuros são necessários para melhor compreendimento dos mecanismos envolvidos. / Ischemic stroke is a serious disease of global incidence and prevalence, considered a leading cause of death and disability worldwide. It is due to hypoperfusion or blood disruption in a brain region and the lack of oxygen and glucose leads to failure in energetic metabolism of neurons and glial cells. The death of these cells releases large amount of glutamate, the main excitatory neurotransmitter, which triggers the ischemic cascade, formed by oxidative stress, excitotoxicity and inflammatory processes. These insults cause severe tissue damage that mainly compromise the sensorimotor system, memory, cognition and emotions. Guanosine, a guanine derivative, has shown a neuroprotective role in the central nervous system, acting on the glutamatergic system. These effects have been demonstrated in male rats, but not in females, so the aim of this thesis was to investigate through behavioral, immunohistochemical and histological tests, the action of guanosine in male and female Wistar rats surgically induced to a model of focal permanent cerebral ischemia in the motor cortex, considering the female estrous cycle immediately before the ischemic induction. This work was approved by the UFRGS Ethical Committee on the Use of Animals (No. 29396). After estrous cycle verification, females and males were anesthetized, positioned in a stereotaxic apparatus, and cortical focal ischemia was induced by thermocoagulation of the pial vessels. At the end of the surgery, the animals were treated with 0.9% saline or guanosine 60 mg/kg, both intraperitoneally, in 4 doses (0, 1, 3 and 6 hours after ischemic induction). In the cylinder test, females presented significant long-term sensorimotor recovery compared to males. In the open field test, long-term memory habituation and locomotion/exploratory activity in females were impaired by ischemia and males showed no impairment. In the elevated plus maze test, there was no significant difference between groups. In the light/dark test, the ischemic females showed anxiolytic-like behavior compared to naïve males and females. The immunohistochemistry of astrocytes and the measurement of lesion volume did not show any statistical difference between groups. With this work it was demonstrated the importance of conducting researches in both genders, considering the estrous cycle, mainly for complex diseases such as cerebral ischemia. The treatment with guanosine is promising, especially in motor recovery in females; however, future studies are necessary to better understand the mechanisms involved.

Vias redox são importantes reguladores da homeostase e sinalização celular, mas o entendimento dos mecanismos desses processos é incompleto. Tiol-proteínas como a dissulfeto isomerase proteica (PDI) podem ser moduladores dessas vias. A PDI(PDIA1) é o protótipo da família das PDIs, cuja função canônica é o enovelamento redox de proteínas no retículo endoplasmático. Além disso, PDI exerce regulação de NADPH oxidases, as principais fontes de oxidantes celulares, e é necessária para ativação de RhoGTPases, organização do citoesqueleto e migração de células vasculares. No estudo de mecanismos pelos quais a PDI regula RhoGTPases, mostramos, em redes computacionais e em experimentos de co-imunoprecitação, associação entre PDIA1 e o regulador de RhoGTPases RhoGDIalfa. Além disso, identificamos forte proximidade entre os genes codificando estas proteínas. Neste estudo, caracterizamos o perfil e implicações desta sintenia gênica.A análise bioinformática pelos programs Ensembl, NCBI e UCSC evidencia um padrão de sintenia entre diferentes isoformas destas duas famílias: PDIA1 (P4HB), PDIA2 (PDIP) e PDIA8 (Erp27) são vizinhos, respectivamente, a RhoGDIbeta, RhoGDIy e RHOGDIalfa, com correspondentes regiões intergênicas de 7.1, 2.9 e 0.14 kb em distintos cromossomos em H. sapiens. O padrão dessa sintenia foi fortemente conservado emC. elegans, alguns peixes e uniformemente em anfíbios, répteis, aves e mamíferos. Leveduras expressam no mesmo cromossomo , porém em locais distantes (i.emacrossintenia) ortólogos da PDIA1 e RhoGDI?, mas não expressam outras PDIs e RhoGDIssintênicasnos eucariotos complexos. No entanto, sintenia entre PDI e RhoGDI foi também observada na planta A. thaliana, sem evidência de um ancestral comum. Os pares sintênicos associam-se a blocos vizinhos conservados, porém diversos para cada par, enquanto cada bloco contem um gene codificando um distinto regulador da PP1 (fosfatase proteica-1). Análise filogenética mostrou topologia semelhante entre as duas famílias.Análise dos dados do estudo ENCODE e predição pelo Softberry identificou sítios de ligação a fatores de transcrição comuns entre os distintos pares, cuja ontologia indicou principalmente desenvolvimento, processos metabólicos e resposta imune. O estudo de possíveis implicações funcionais dessa sintenia mostrou que manipulações da expressão proteica de PDIA1 não promovem mudança consistente na expressão proteica de RhoGDIalfa, tanto in vitro (silenciamento da PDI por siRNA e superexpressão por vetor lentiviral induzível) como in vivo (camundongo transgênico com superexpressão constitutiva da PDIA1). No entanto, as mudanças da expressãogênica de ambos os genes na camada íntima de artérias carótidas de camundongo durante remodelamento induzido por fluxo foram fortemente correlacionadas. Experimentos de coimunoprecipitação e co-localização à microscopia confocal sugeriram interação física entre PDIA1 e RhoGDIAalfa. Deste modo, estes dados mostram um intrigante padrão de conservação evolutiva da proximidade gênica entre PDIs e RhoGDIs, não usual em eucariotos. Genes sintênicos frequentemente codificam proteínas que tendem a interagir física e/ou funcionalmente. Com efeito, nosso dados sugerem co-regulação e interação física entre PDIA1 e RhoGDIAalfa, corroborando a convergência entre essas proteínas como possível mecanismo envolvido na regulação redox do citoesqueleto pela PDIA1 / Redox pathways are important regulators of homeostasis and cell signaling, but the understanding of the mechanisms of these processes is incomplete. Thiol proteins such as protein disulfide isomerase (PDI) can be modulators of these pathways. PDI (PDIA1) is the prototype of the family of PDIs whose canonical function is a redox protein folding in the endoplasmic reticulum. In addition, PDI exerts regulatory NADPH oxidase, the main sources of cellular oxidant, and is required for activation RhoGTPases, cytoskeletal organization and migration of vascular cells. In the study of mechanisms by which regulates PDI RhoGTPases, we showed in computer networks and co-imunoprecitation experiments association between PDIA1 and the regulator of RhoGTPases, RhoGDI?. In addition, we identified strong proximity of the genes encoding these proteins. In this study, we characterize the profile and implications of this synteny. .A bioinformatic analysis by programs Ensembl, NCBI and UCSC shows a pattern of synteny between different isoforms of these two families: PDIA1 (P4HB), PDIA2 (PDIP) and PDIA8 (Erp27) are neighbors , respectively RhoGDIalfa, and RhoGDIy RHOGDIbeta with corresponding intergenic regions 7.1, 2.9 and 0:14 kb in different chromosomes of H. sapiens. The pattern of this synteny was strongly maintained in C. elegans, some fish and evenly amphibians, reptiles, birds and mammals. Yeasts express on the same chromosome, but in distant places (i.e macrosintenia) orthologs of PDIA1 and RhoGDI?, but do not express other syntenics PDIs and RhoGDIs in complex eukaryotes. However, synteny between PDI and RhoGDI was also observed in the plant A. thaliana, no evidence of a common ancestor. The syntenic pairs are associated with the stored neighboring blocks, but different for each pair, while each block contains a gene encoding a regulator of distinct PP1 (protein phosphatase-1). Phylogenetic analysis showed similar topology between the two famílias. The identified binding sites common transcription factors between different pairs, which mainly indicated ontology development, metabolic and immune response. The study of possible functional implications of synteny showed that manipulations of PDIA1 protein expression do not promote consistent change in protein expression RhoGDI, both in vitro (silencing of PDI by siRNA and overexpression of inducible lentiviral vector) and in vivo (transgenic mice overexpressing constitutive of PDIA1). The study of possible functional implications of synteny showed that manipulations of PDIA1 protein expression do not promote consistent change in protein expression RhoGDIalfa, both in vitro (silencing of PDI by siRNA and overexpression of inducible lentiviral vector) and in vivo (transgenic mice overexpressing constitutive of PDIA1). However, changes of gene expression of both genes in the intima of mouse carotid arteries during remodeling induced by flow were strongly correlated. Immunoprecipitation experiments and co-location to confocal microscopy suggested physical interaction between PDIA1 and RhoGDIAalfa. Thus, these data show an intriguing pattern of evolutionary conservation of gene proximity between POIs and RhoGDIs not common in eukaryotes. sintênicos genes often encode proteins that tend to interact physically and / or functionally. Indeed, our data suggest co-regulation and physical interaction between PDIA1 and RhoGDIAalfa, supporting the convergence of these proteins as a possible mechanism involved in redox regulation of cytoskeleton by PDIA1

Vias redox são importantes reguladores da homeostase e sinalização celular, mas o entendimento dos mecanismos desses processos é incompleto. Tiol-proteínas como a dissulfeto isomerase proteica (PDI) podem ser moduladores dessas vias. A PDI(PDIA1) é o protótipo da família das PDIs, cuja função canônica é o enovelamento redox de proteínas no retículo endoplasmático. Além disso, PDI exerce regulação de NADPH oxidases, as principais fontes de oxidantes celulares, e é necessária para ativação de RhoGTPases, organização do citoesqueleto e migração de células vasculares. No estudo de mecanismos pelos quais a PDI regula RhoGTPases, mostramos, em redes computacionais e em experimentos de co-imunoprecitação, associação entre PDIA1 e o regulador de RhoGTPases RhoGDIalfa. Além disso, identificamos forte proximidade entre os genes codificando estas proteínas. Neste estudo, caracterizamos o perfil e implicações desta sintenia gênica.A análise bioinformática pelos programs Ensembl, NCBI e UCSC evidencia um padrão de sintenia entre diferentes isoformas destas duas famílias: PDIA1 (P4HB), PDIA2 (PDIP) e PDIA8 (Erp27) são vizinhos, respectivamente, a RhoGDIbeta, RhoGDIy e RHOGDIalfa, com correspondentes regiões intergênicas de 7.1, 2.9 e 0.14 kb em distintos cromossomos em H. sapiens. O padrão dessa sintenia foi fortemente conservado emC. elegans, alguns peixes e uniformemente em anfíbios, répteis, aves e mamíferos. Leveduras expressam no mesmo cromossomo , porém em locais distantes (i.emacrossintenia) ortólogos da PDIA1 e RhoGDI?, mas não expressam outras PDIs e RhoGDIssintênicasnos eucariotos complexos. No entanto, sintenia entre PDI e RhoGDI foi também observada na planta A. thaliana, sem evidência de um ancestral comum. Os pares sintênicos associam-se a blocos vizinhos conservados, porém diversos para cada par, enquanto cada bloco contem um gene codificando um distinto regulador da PP1 (fosfatase proteica-1). Análise filogenética mostrou topologia semelhante entre as duas famílias.Análise dos dados do estudo ENCODE e predição pelo Softberry identificou sítios de ligação a fatores de transcrição comuns entre os distintos pares, cuja ontologia indicou principalmente desenvolvimento, processos metabólicos e resposta imune. O estudo de possíveis implicações funcionais dessa sintenia mostrou que manipulações da expressão proteica de PDIA1 não promovem mudança consistente na expressão proteica de RhoGDIalfa, tanto in vitro (silenciamento da PDI por siRNA e superexpressão por vetor lentiviral induzível) como in vivo (camundongo transgênico com superexpressão constitutiva da PDIA1). No entanto, as mudanças da expressãogênica de ambos os genes na camada íntima de artérias carótidas de camundongo durante remodelamento induzido por fluxo foram fortemente correlacionadas. Experimentos de coimunoprecipitação e co-localização à microscopia confocal sugeriram interação física entre PDIA1 e RhoGDIAalfa. Deste modo, estes dados mostram um intrigante padrão de conservação evolutiva da proximidade gênica entre PDIs e RhoGDIs, não usual em eucariotos. Genes sintênicos frequentemente codificam proteínas que tendem a interagir física e/ou funcionalmente. Com efeito, nosso dados sugerem co-regulação e interação física entre PDIA1 e RhoGDIAalfa, corroborando a convergência entre essas proteínas como possível mecanismo envolvido na regulação redox do citoesqueleto pela PDIA1 / Redox pathways are important regulators of homeostasis and cell signaling, but the understanding of the mechanisms of these processes is incomplete. Thiol proteins such as protein disulfide isomerase (PDI) can be modulators of these pathways. PDI (PDIA1) is the prototype of the family of PDIs whose canonical function is a redox protein folding in the endoplasmic reticulum. In addition, PDI exerts regulatory NADPH oxidase, the main sources of cellular oxidant, and is required for activation RhoGTPases, cytoskeletal organization and migration of vascular cells. In the study of mechanisms by which regulates PDI RhoGTPases, we showed in computer networks and co-imunoprecitation experiments association between PDIA1 and the regulator of RhoGTPases, RhoGDI?. In addition, we identified strong proximity of the genes encoding these proteins. In this study, we characterize the profile and implications of this synteny. .A bioinformatic analysis by programs Ensembl, NCBI and UCSC shows a pattern of synteny between different isoforms of these two families: PDIA1 (P4HB), PDIA2 (PDIP) and PDIA8 (Erp27) are neighbors , respectively RhoGDIalfa, and RhoGDIy RHOGDIbeta with corresponding intergenic regions 7.1, 2.9 and 0:14 kb in different chromosomes of H. sapiens. The pattern of this synteny was strongly maintained in C. elegans, some fish and evenly amphibians, reptiles, birds and mammals. Yeasts express on the same chromosome, but in distant places (i.e macrosintenia) orthologs of PDIA1 and RhoGDI?, but do not express other syntenics PDIs and RhoGDIs in complex eukaryotes. However, synteny between PDI and RhoGDI was also observed in the plant A. thaliana, no evidence of a common ancestor. The syntenic pairs are associated with the stored neighboring blocks, but different for each pair, while each block contains a gene encoding a regulator of distinct PP1 (protein phosphatase-1). Phylogenetic analysis showed similar topology between the two famílias. The identified binding sites common transcription factors between different pairs, which mainly indicated ontology development, metabolic and immune response. The study of possible functional implications of synteny showed that manipulations of PDIA1 protein expression do not promote consistent change in protein expression RhoGDI, both in vitro (silencing of PDI by siRNA and overexpression of inducible lentiviral vector) and in vivo (transgenic mice overexpressing constitutive of PDIA1). The study of possible functional implications of synteny showed that manipulations of PDIA1 protein expression do not promote consistent change in protein expression RhoGDIalfa, both in vitro (silencing of PDI by siRNA and overexpression of inducible lentiviral vector) and in vivo (transgenic mice overexpressing constitutive of PDIA1). However, changes of gene expression of both genes in the intima of mouse carotid arteries during remodeling induced by flow were strongly correlated. Immunoprecipitation experiments and co-location to confocal microscopy suggested physical interaction between PDIA1 and RhoGDIAalfa. Thus, these data show an intriguing pattern of evolutionary conservation of gene proximity between POIs and RhoGDIs not common in eukaryotes. sintênicos genes often encode proteins that tend to interact physically and / or functionally. Indeed, our data suggest co-regulation and physical interaction between PDIA1 and RhoGDIAalfa, supporting the convergence of these proteins as a possible mechanism involved in redox regulation of cytoskeleton by PDIA1

Made available in DSpace on 2016-08-17T18:39:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 5245.pdf: 1568165 bytes, checksum: 9fc25ff9dc83339e50628c08854efd2c (MD5) Previous issue date: 2012-08-29 / Universidade Federal de Sao Carlos / Schistosimiasis mansoni is a neglected chronic parasitic disease that affects thousands of people worldwide, caused by the trematode Schistosoma mansoni. In the infected host the disease is characterized by the presence of granuloma, imunnopathological response of the cellular infiltration against egg antigens. Thus, the host-parasite relation favors hepatosplenomegaly, acite and hepatic fibrosis. Current chemotherapy is based on the use of Praziquantel (PZQ), used against all species of Schistosoma spp for over 30 years. The main issue is that the PZQ is practically inactive against immature schistosomula and favors the resistance growth of the existent lineages, which makes the study for new drugs and vaccines that can contribute to the control of this disease even more urgent. One of the paths on the search for new therapeutic targets is the study of essential enzymes to the S. mansoni. In particular, it is known that the enzymes Adenylate Kinase 1 and 2 (ADK), Uridine cytidine Kinase 1 and 2 (UCK), Hypoxanthine guanine phosphoribosyltransferase (HGPRT) e Purine nucleoside phosphorilase 1 (PNP) are found on the metabolic pathways of the parasite s nucleotide, participating in the metabolism of purines and pyrimidines. Our goals in this study were to assess the immunization with these enzymes, using the S. mansoni cercariae infected murine model, and subsequently analyze the acting in oviposition and growth of adult worms. Our results showed that the immunization in Balb/c mice with the UCK enzyme was capable of inducing a specific immune response, which favored a significant reduction of the parasitic load (adult worms). However, it was not possible to observe significant reduction in the number of eliminated eggs. Regarding the immunization with PNP and HGPRT enzymes, the mice had a reduction in the number of eggs per gram of feces. The data obtained are considered interesting and can be new targets for immunotherapy against schistosomiasis mansoni. Thereby, new assays must be made with different dosages of the enzymes for a better assessment on how these enzymes modulate the parasitic load through the eggs reduction, reduction in the adult worms retrieving, as well as the antibody levels during the murine infection by the S.mansoni. / A esquistossomose mansônica é uma doença parasitária, crônica e negligenciada que afeta milhares de pessoas ao redor do mundo, causada pelo trematódeo Schistosoma mansoni. No hospedeiro infectado a doença é caracterizada pela presença do granuloma, resultado imunopatológico do infiltrado celular contra antígenos dos ovos A quimioterapia atual é baseada no uso do Praziquantel (PZQ), usado contra todas as espécies de Schistosoma spp há mais de 30 anos. O principal problema é que o PZQ é praticamente inativo contra esquistossomulos imaturos e favorece o desenvolvimento de resistência das linhagens existentes. Um dos caminhos na busca por novos alvos terapêuticos é o estudo de enzimas que são essenciais para o S. mansoni. Em especial, sabe-se que as enzimas Adenilato Quinase 1 e 2 (ADK), Uridina Citidina Quinase 1 e 2 (UCK), Hipoxantina-guanina fosforibosiltransferase (HGPRT) e Purina Nucleosídeo Fosforilase 1 (PNP) são encontradas nas vias metabólicas de nucleotídeos do parasito, participando do metabolismo de purinas e pirimidinas. A estratégia de utilizar enzimas do parasito na esquistossomose mansônica murina foi de avaliar uma resposta induzida por estas enzimas quando aplicadas em camundongos BALB/c e desafiados com cercarias de S. mansoni. Desta forma, avaliamos a fase crônica de camundongos imunizados e infectados com S. mansoni, onde foram analisadas amostras parasitológicas, hematológicas, sorológicas e fluidos da cavidade peritoneal. Nosso objetivo neste estudo foi avaliar a imunização com essas enzimas, usando o modelo murino infectado com cercarias de S. mansoni e posteriormente avaliar a ação na oviposição e desenvolvimento de vermes adultos. Nossos resultados demonstraram que a imunização em camundongos Balb∕c com a enzima UCK foi capaz de induzir uma resposta imune específica, a qual favoreceu a diminuição significativa da carga parasitária (vermes adultos). No entanto, não foi possível observar redução significativa no número de ovos eliminados. Em relação à imunização com as enzimas PNP e HGPRT os camundongos que receberam as imunizações com PNP e HGPRT tiveram redução no número de ovos por grama de fezes. Os dados obtidos são considerados interessantes e podem ser considerados novos alvos para a imunoterapia contra a esquistosomose mansônica. Dessa forma, novos ensaios deverão ser realizados com diferentes doses das enzimas para melhor avaliar como essas enzimas modulam a carga parasitária através da redução de ovos, diminuição na recuperação de vermes adultos, assim como os níveis de anticorpos durante a infecção murina pelo S. mansoni.

La preorganització electrostàtica del centre actiu s'ha postulat com el mecanisme genèric de l'acció dels enzims. Així, alguns residus "estratègics" es disposarien per catalitzar reaccions interaccionant en una forma més forta amb l'estat de transició, baixant d'aquesta manera el valor de l'energia dactivació g cat. S'ha proposat que aquesta preorientació electrostática s'hauria de poder mostrar analitzant l'estabilitat electrostàtica de residus individuals en el centre actiu.Ras es una proteïna essencial de senyalització i actúa com un interruptor cel.lular. Les característiques estructurals de Ras en el seu estat actiu (ON) són diferents de les que té a l'estat inactiu (OFF). En aquesta tesi es duu a terme una anàlisi exhaustiva de l'estabilitat dels residus del centre actiu deRas en l'estat actiu i inactiu. / The electrostatic preorganization of the active site has been put forward as the general framework of action of enzymes. Thus, enzymes would position "strategic" residues in such a way to be prepared to catalyze reactions byinteracting in a stronger way with the transition state, in this way decreasing the activation energy g cat for the catalytic process. It has been proposed thatsuch electrostatic preorientation should be shown by analyzing the electrostatic stability of individual residues in the active site.Ras protein is an essential signaling molecule and functions as a switch in thecell. The structural features of the Ras protein in its active state (ON state) are different than those in its inactive state (OFF state). In this thesis, an exhaustive analysis of the stability of residues in the active and inactive Ras active site is performed.