A incorporação de novas ferramentas biotecnológicas aos programas de melhoramento de citros oferece inúmeras possibilidades. Os marcadores DArTTM (Diversity Arrays Technology), combinados à técnica de sequenciamento de última geração, apresentam boa aplicabilidade na construção de mapas genéticos de alta resolução e no mapeamento de QTL (Quantitative Trai Loci). Assim, este estudo teve como objetivo construir um mapa genético integrado de tangor \'Murcott\' e laranja \'Pera\' usando os marcadores moleculares do tipo DArT_seqTM e localizar QTLs para doze caracteres de qualidade de frutos. A partir de um cruzamento controlado entre tangor \'Murcott\' e laranja \'Pera\', realizado no banco de germoplasma de Citros do Centro de Citricultura \"Sylvio Moreira\", Instituto Agronômico de Campinas, localizado em Cordeirópolis-SP, em 1997. Foi obtida uma família de 350 indivíduos híbridos, dos quais 278 foram selecionados para avaliação das características de fruto em 2012. No presente trabalho, esses 278 indivíduos foram genotipados usando os marcadores DArTseqTM. Para construir o mapa integrado foi utilizado o programa OneMap e foram considerados apenas os marcadores que não apresentaram desvio de segregação mendeliana. A razão de verossimilhança foi utilizada para a formação de grupos de ligação, além da informação genômica obtida a partir do genoma sequenciado de Citrus sinensis L. Osbeck disponível em (http://citrus.hzau.edu.cn/orange/index.php). O mapa parcialmente integrado foi composto de 661 marcadores, ligados em 13 grupos, que correspondem ao número haplóide de cromossomos da espécie, com cobertura genômica de 2.774 cM. De acordo com as análises de mapeamento por intervalo composto e os resultados do teste de permutação, um total 19 QTLs foram identificados, tendo em conta as características de fruto analisadas: peso (g), diâmetro (cm), altura (cm), relação diâmetro / altura, espessura da casca (cm), número de gomos, teor de sólidos solúveis (°Brix), acidez titulável (%), rendimento de suco (%), número de sementes, valor do índice tecnológico (IT) e número estimado de frutos por caixa. O mapa genético integrado foi comparado com o genoma (pseudochromosomes) de Citrus sinensis e sintenias foram claramente identificadas. A análise mais aprofundada das regiões genômicas (QTLs) apresentando os maiores valores de LOD score permitiu identificar a presença de genes candidatos que podem estar associados com as características analisadas / The incorporation of new biotechnological tools to citrus breeding programs provides many new possibilities. The DArT markers (Diversity Arrays Technology), combined with Next-Generation Sequencing presents good applicability in the construction of high resolution genetic maps and QTL mapping. This study aimed to construct an integrated genetic map of \'Murcott\' tangor and \'Pera\' sweet orange using the DArTseqTM molecular markers, and localize QTL for twelve fruit quality traits. A controlled cross between \'Murcott\' tangor and \'Pera\' sweet orange was conducted at the Citrus Germplasm Bank at the \"Sylvio Moreira\" Citrus Centre of Agronomic Institute, located in Cordeirópolis-SP in 1997.A family with 350 hybrid individuals was obtained, from which 278 were selected for evaluation of fruit traits in 2012. In this study, the 278 F1 individuals were genotyped using the DArTseqTM markers. To build the integrated map, we used the OneMap program and considered all DArT loci that showed no segregation deviation. The likelihood ratio was used for formation of linkage groups, besides the genomic information obtained from the available Citrus sinensis genome sequence (http://citrus.hzau.edu.cn/orange/index.php). The partially integrated map contained 661 markers linked in 13 linkage groups, with genomic coverage of 2,774 cM, the map is saturated and represent the species haploid chromosome number. According to the analyses using \"Composite Interval Mapping\" (CIM) and the results of the permutation test, a total of 19 QTL were identified for the 12 fruits characteristics analyzed: diameter (cm), height (cm), ratio of H/D, weight (g), rind thickness (cm), segments per fruit, total soluble solids ((°Brix), Acidity (%), Juice content (%), number of seeds, ratio of total soluble solids /acidity and number of fruits per box. The genome sequence (pseudochromosomes) of Citrus sinensis L. Osbeck was compared to the genetic map, and sinteny was clearly identified. Further analysis of the map regions with the highest LOD score enabled the identification of the presence of genes that could be associated with the characteristics. The genome sequences allowed identification of genes that may respond for phenotypic traits in Citrus

Submitted by Amanda Silva (amanda.osilva2@ufpe.br) on 2015-04-08T14:28:46Z No. of bitstreams: 2 TESE_PPGCB_CCB_UFPE_Silvokleio da Costa Silva.pdf: 2416257 bytes, checksum: 816b850e0c404efe1ff888b803d05780 (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-04-08T14:28:46Z (GMT). No. of bitstreams: 2 TESE_PPGCB_CCB_UFPE_Silvokleio da Costa Silva.pdf: 2416257 bytes, checksum: 816b850e0c404efe1ff888b803d05780 (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Previous issue date: 2012 / CNPq / Recentemente, um mapa citogenético estabelecido para Poncirus trifoliata disponibilizou marcadores cromossomo-específicos para estudos evolutivos das espécies cítricas. Objetivando reconhecer as homeologias cromossômicas e entender as alterações cariotípicas existente entre os gêneros Poncirus e Citrus e entre os principais representantes dos citros, os mapas citogenéticos de P. trifoliata cv. Flying Dragon, C. reticulata cv. Cravo (tangerina) e C. maxima cv. Pink (toranja) foram construídos e comparados entre si e com o mapa previamente estabelecido para C. medica var. Etrog (cidra). Os cromossomos marcadores de P. trifoliata também foram mapeados em C. sinensis (L.) cv. Valencia (laranjeira doce), o principal híbrido de interesse econômico do grupo. Metáfases mitóticas destas espécies foram coradas com os fluorocromos CMA e DAPI e submetidas a hibridização in situ fluorescente (FISH) empregando sondas de cromossomos artificiais de bactérias (BACs) e de DNAr 5S e 45S. As fórmulas cariotípicas encontradas para as cultivares analisadas de P. trifoliata (4B+8D+6F), C. reticulata (2C+10D+6F), C. maxima (4A+2C+4D+8F) e C. sinensis (2B+2C+7D+7F) corroboram com as anteriormente reportadas na literatura, entretanto, um pequeno sítio proximal adicional de DNAr 45S foi detectado em C. reticulata. Apenas os cromossomos 1, 4 e 8 foram conservados quanto ao tipo cromossômico e localização dos BACs entre as espécies estudadas. Nos demais casos, as posições dos BACs foram conservadas, mas não os tipos cromossômicos. Quebra de colinearidade foi observada apenas no par 3, entre BACs e um sítio de DNAr 45S, sugerindo que inversões ou transposições também podem ter ocorrido. Os resultados aqui reportados indicam uma alta sintenia no grupo. As principais divergências cariotípicas observadas provavelmente estão relacionadas a eventos de amplificação e/ou desamplificação de sequências repetitivas que compõem os blocos CMA+. Essas alterações foram mais frequentes em C. medica que nas demais espécies, porém, considerando a variabilidade encontrada, as semelhanças cariotípicas observadas entre espécies filogeneticamente distantes podem ser fruto de reversões e não da conservação de um cariótipo ancestral. Os dados de mapeamento dos BACs nos pares cromossômicos 2 e 3 de C. sinensis, associados aos seus tipos cromossômicos, corroboram toranja e tangerina como os prováveis parentais deste híbrido.

A incorporação de novas ferramentas biotecnológicas aos programas de melhoramento de citros oferece inúmeras possibilidades. Os marcadores DArTTM (Diversity Arrays Technology), combinados à técnica de sequenciamento de última geração, apresentam boa aplicabilidade na construção de mapas genéticos de alta resolução e no mapeamento de QTL (Quantitative Trai Loci). Assim, este estudo teve como objetivo construir um mapa genético integrado de tangor \'Murcott\' e laranja \'Pera\' usando os marcadores moleculares do tipo DArT_seqTM e localizar QTLs para doze caracteres de qualidade de frutos. A partir de um cruzamento controlado entre tangor \'Murcott\' e laranja \'Pera\', realizado no banco de germoplasma de Citros do Centro de Citricultura \"Sylvio Moreira\", Instituto Agronômico de Campinas, localizado em Cordeirópolis-SP, em 1997. Foi obtida uma família de 350 indivíduos híbridos, dos quais 278 foram selecionados para avaliação das características de fruto em 2012. No presente trabalho, esses 278 indivíduos foram genotipados usando os marcadores DArTseqTM. Para construir o mapa integrado foi utilizado o programa OneMap e foram considerados apenas os marcadores que não apresentaram desvio de segregação mendeliana. A razão de verossimilhança foi utilizada para a formação de grupos de ligação, além da informação genômica obtida a partir do genoma sequenciado de Citrus sinensis L. Osbeck disponível em (http://citrus.hzau.edu.cn/orange/index.php). O mapa parcialmente integrado foi composto de 661 marcadores, ligados em 13 grupos, que correspondem ao número haplóide de cromossomos da espécie, com cobertura genômica de 2.774 cM. De acordo com as análises de mapeamento por intervalo composto e os resultados do teste de permutação, um total 19 QTLs foram identificados, tendo em conta as características de fruto analisadas: peso (g), diâmetro (cm), altura (cm), relação diâmetro / altura, espessura da casca (cm), número de gomos, teor de sólidos solúveis (°Brix), acidez titulável (%), rendimento de suco (%), número de sementes, valor do índice tecnológico (IT) e número estimado de frutos por caixa. O mapa genético integrado foi comparado com o genoma (pseudochromosomes) de Citrus sinensis e sintenias foram claramente identificadas. A análise mais aprofundada das regiões genômicas (QTLs) apresentando os maiores valores de LOD score permitiu identificar a presença de genes candidatos que podem estar associados com as características analisadas / The incorporation of new biotechnological tools to citrus breeding programs provides many new possibilities. The DArT markers (Diversity Arrays Technology), combined with Next-Generation Sequencing presents good applicability in the construction of high resolution genetic maps and QTL mapping. This study aimed to construct an integrated genetic map of \'Murcott\' tangor and \'Pera\' sweet orange using the DArTseqTM molecular markers, and localize QTL for twelve fruit quality traits. A controlled cross between \'Murcott\' tangor and \'Pera\' sweet orange was conducted at the Citrus Germplasm Bank at the \"Sylvio Moreira\" Citrus Centre of Agronomic Institute, located in Cordeirópolis-SP in 1997.A family with 350 hybrid individuals was obtained, from which 278 were selected for evaluation of fruit traits in 2012. In this study, the 278 F1 individuals were genotyped using the DArTseqTM markers. To build the integrated map, we used the OneMap program and considered all DArT loci that showed no segregation deviation. The likelihood ratio was used for formation of linkage groups, besides the genomic information obtained from the available Citrus sinensis genome sequence (http://citrus.hzau.edu.cn/orange/index.php). The partially integrated map contained 661 markers linked in 13 linkage groups, with genomic coverage of 2,774 cM, the map is saturated and represent the species haploid chromosome number. According to the analyses using \"Composite Interval Mapping\" (CIM) and the results of the permutation test, a total of 19 QTL were identified for the 12 fruits characteristics analyzed: diameter (cm), height (cm), ratio of H/D, weight (g), rind thickness (cm), segments per fruit, total soluble solids ((°Brix), Acidity (%), Juice content (%), number of seeds, ratio of total soluble solids /acidity and number of fruits per box. The genome sequence (pseudochromosomes) of Citrus sinensis L. Osbeck was compared to the genetic map, and sinteny was clearly identified. Further analysis of the map regions with the highest LOD score enabled the identification of the presence of genes that could be associated with the characteristics. The genome sequences allowed identification of genes that may respond for phenotypic traits in Citrus

Sorgo sacarino e cana-de-açúcar são duas importantes gramíneas com fins potencialmente bioenergéticos. No entanto, apesar do conhecido relacionamento evolutivo, os genomas dessas espécies diferem em complexidade e tamanho. O sorgo, Sorghum bicolor, é diploide, com número básico de cromossomos igual a dez, os quais totalizam ~ 726 Mb já sequenciadas. Já a cana cultivada, Saccharum × officinarum, é um autopoliploide com frequente aneuploidia, e apresenta genoma monoploide estimado em ~ 1 Gb. Provavelmente, decorre deste fato, e dos cruzamentos interespecíficos que originaram as variedades atuais, a relativa dificuldade em se realizar estudos genéticos em cana, e, como consequência, em se incrementar os trabalhos de melhoramento na espécie. Nesse contexto, a possibilidade de integrar estudos de mapeamento entre sorgo e cana torna-se viável dado o emprego de metodologias apropriadas. O presente trabalho objetivou mapear e comparar QTLs para caracteres agro-industriais nos genomas de ambas as espécies, baseando-se no relacionamento evolutivo existente entre elas. Para tanto, foram utilizadas duas populações de mapeamento. A população de sorgo sacarino foi constituída por 223 RILs genotipadas por mais de cem mil marcadores baseados em GBS fisicamente mapeados contra o genoma da espécie. A população de cana-de-açúcar constituiu-se de uma progênie F1 segregante com 153 indivíduos genotipados por 500 marcadores baseados em géis (SSR e TRAP) e 7.049 marcadores baseados em GBS, segregando em dose única. Esses marcadores possibilitaram a construção de um mapa genético informativo e saturado, com 993 marcadores distribuídos ao longo de 223 grupos de ligação, totalizando 3.682,05 cM. Ambas as populações foram avaliadas para quatro caracteres de interesse bioenergético: altura de colmos, toneladas de colmos ou de massa verde por hectare, e porcentagens de pol de caldo e de fibra. Modelos mistos foram utilizados para a análise dos dados fenotípicos, evidenciando a existência de interação genótipo-ambiente a partir da estruturação de matrizes de variâncias-covariâncias genéticas. As médias ajustadas conjunta e marginalmente foram utilizadas na descoberta de QTLs. Para este fim, modelos de mapeamento de múltiplos intervalos uni- e multivariados foram utilizados e determinaram a descoberta de 53 e 36 regiões contendo QTLs para as populações de sorgo e cana, respectivamente, para o conjunto dos quatro caracteres. Os genomas foram comparados utilizando os marcadores baseados em GBS de cana com informação posicional em relação ao genoma do sorgo. Um total de 16 regiões sintênicas identificadas entre as espécies possibilitaram inferências a respeito do controle evolutivamente conservado dos caracteres relacionados. Mais oito regiões foram adicionadas a estas após análise de marcadores individualmente para a população de cana. A descoberta dessas regiões subjacente à variação de caracteres bioenergéticos sugere aplicações na clonagem de genes e na seleção assistida por marcadores, beneficiando os programas de melhoramento de ambas as espécies. / Sweet sorghum and sugarcane are two important grasses for bioenergy purposes. However, despite their known evolutionary relationship, the genomes of these species differ in complexity and size. Sorghum bicolor is a diploid species, with basic chromosome number of ten and ~ 726 Mb completely sequenced, whereas Saccharum × officinarum has a autopolyploid genome with frequent aneuploidy and monoploid size estimated at ~ 1 Gb. Therefore, genetic studies and breeding in sugarcane is challenging. In this context, the possibility of integrating mapping studies between sorghum and sugarcane becomes feasible given the recent development of appropriate methodologies. In this work, we aimed to map and compare QTLs for bioenergy traits in both species. To do this, two mapping populations were used. The population of sorghum consisted of 223 RILs genotyped by more than one hundred thousand GBS-based markers, which were physically mapped against the species genome. The population of sugarcane is an F1 segregating progeny with 153 individuals genotyped by 500 gel-based (SSR and TRAP) and 7,049 GBS-based single-dose markers. These markers allowed the construction of an informative and dense genetic map with 993 markers belonging to 223 linkage groups and spanning 3,682.05 cM. Both populations were evaluated for four bioenergy traits: stalk height, prodution in tons per hectare, and percentages of pol and fiber. Mixed models were used to analyze phenotypic data and showed genotype-by-environment interaction on their genetic variance-covariance structures. Joint and marginal adjusted means were used for QTL discovery. Toward this end, univariate and multivariate multiple interval mapping models were used, and a total of 53 and 36 QTLs were found for sorghum and sugarcane, respectively. Comparison of the genomes were based on GBS markers in sugarcane with relative sorghum chromosome information. A total of 16 syntenic regions were identified between the species, allowing inferences in relation to evolutionary conserved control of the related traits. In addition, eight regions were also identified by considering single marker analyses. The discovery of QTLs underlying such bioenergy traits may suggest further applications in gene cloning and marker assisted selection for both sweet sorghum and sugarcane species.

PipX es una proteína única de cianobacterias identificada por su habilidad para interactuar de forma excluyente con PII y NtcA, dos reguladores clave implicados en la integración de señales de nitrógeno/carbono y energía, estableciendo un vínculo mecanístico entre ambos. Sin embargo, los datos recabados indican que el papel de PipX no se limita únicamente a esto, sino que parece formar parte de una red de señalización más amplia exclusiva de cianobacterias. La formación de los complejos PII-PipX no solo permite el secuestro de PipX, impidiendo la co-activación de NtcA, sino que favorece la formación de los complejos con el regulador transcripcional cianobacteriano PlmA. Esta interacción con PII afecta a la localización dinámica de PipX en respuesta al estado energético de la célula, limitando su actividad a condiciones de alta energía. Además, PipX está funcionalmente conectado con pipY, el gen aguas abajo que codifica a un miembro de la familia de proteínas PLPBP, universalmente distribuidas e implicadas en la homeostasis de la vitamina B6 y amino ácidos y, en humanos, epilepsia dependiente de vitamina B6. No solo PipX sería capaz de controlar a nivel traduccional la expresión de PipY, sino que ambos participarían en el control de la expresión génica y vías metabólicas comunes. Por último, el análisis de genomas cianobacterianos posiciona a PipX en una red de interacción con PipY y otras 4 proteínas con las que PipX podría tener una relación funcional.

Vias redox são importantes reguladores da homeostase e sinalização celular, mas o entendimento dos mecanismos desses processos é incompleto. Tiol-proteínas como a dissulfeto isomerase proteica (PDI) podem ser moduladores dessas vias. A PDI(PDIA1) é o protótipo da família das PDIs, cuja função canônica é o enovelamento redox de proteínas no retículo endoplasmático. Além disso, PDI exerce regulação de NADPH oxidases, as principais fontes de oxidantes celulares, e é necessária para ativação de RhoGTPases, organização do citoesqueleto e migração de células vasculares. No estudo de mecanismos pelos quais a PDI regula RhoGTPases, mostramos, em redes computacionais e em experimentos de co-imunoprecitação, associação entre PDIA1 e o regulador de RhoGTPases RhoGDIalfa. Além disso, identificamos forte proximidade entre os genes codificando estas proteínas. Neste estudo, caracterizamos o perfil e implicações desta sintenia gênica.A análise bioinformática pelos programs Ensembl, NCBI e UCSC evidencia um padrão de sintenia entre diferentes isoformas destas duas famílias: PDIA1 (P4HB), PDIA2 (PDIP) e PDIA8 (Erp27) são vizinhos, respectivamente, a RhoGDIbeta, RhoGDIy e RHOGDIalfa, com correspondentes regiões intergênicas de 7.1, 2.9 e 0.14 kb em distintos cromossomos em H. sapiens. O padrão dessa sintenia foi fortemente conservado emC. elegans, alguns peixes e uniformemente em anfíbios, répteis, aves e mamíferos. Leveduras expressam no mesmo cromossomo , porém em locais distantes (i.emacrossintenia) ortólogos da PDIA1 e RhoGDI?, mas não expressam outras PDIs e RhoGDIssintênicasnos eucariotos complexos. No entanto, sintenia entre PDI e RhoGDI foi também observada na planta A. thaliana, sem evidência de um ancestral comum. Os pares sintênicos associam-se a blocos vizinhos conservados, porém diversos para cada par, enquanto cada bloco contem um gene codificando um distinto regulador da PP1 (fosfatase proteica-1). Análise filogenética mostrou topologia semelhante entre as duas famílias.Análise dos dados do estudo ENCODE e predição pelo Softberry identificou sítios de ligação a fatores de transcrição comuns entre os distintos pares, cuja ontologia indicou principalmente desenvolvimento, processos metabólicos e resposta imune. O estudo de possíveis implicações funcionais dessa sintenia mostrou que manipulações da expressão proteica de PDIA1 não promovem mudança consistente na expressão proteica de RhoGDIalfa, tanto in vitro (silenciamento da PDI por siRNA e superexpressão por vetor lentiviral induzível) como in vivo (camundongo transgênico com superexpressão constitutiva da PDIA1). No entanto, as mudanças da expressãogênica de ambos os genes na camada íntima de artérias carótidas de camundongo durante remodelamento induzido por fluxo foram fortemente correlacionadas. Experimentos de coimunoprecipitação e co-localização à microscopia confocal sugeriram interação física entre PDIA1 e RhoGDIAalfa. Deste modo, estes dados mostram um intrigante padrão de conservação evolutiva da proximidade gênica entre PDIs e RhoGDIs, não usual em eucariotos. Genes sintênicos frequentemente codificam proteínas que tendem a interagir física e/ou funcionalmente. Com efeito, nosso dados sugerem co-regulação e interação física entre PDIA1 e RhoGDIAalfa, corroborando a convergência entre essas proteínas como possível mecanismo envolvido na regulação redox do citoesqueleto pela PDIA1 / Redox pathways are important regulators of homeostasis and cell signaling, but the understanding of the mechanisms of these processes is incomplete. Thiol proteins such as protein disulfide isomerase (PDI) can be modulators of these pathways. PDI (PDIA1) is the prototype of the family of PDIs whose canonical function is a redox protein folding in the endoplasmic reticulum. In addition, PDI exerts regulatory NADPH oxidase, the main sources of cellular oxidant, and is required for activation RhoGTPases, cytoskeletal organization and migration of vascular cells. In the study of mechanisms by which regulates PDI RhoGTPases, we showed in computer networks and co-imunoprecitation experiments association between PDIA1 and the regulator of RhoGTPases, RhoGDI?. In addition, we identified strong proximity of the genes encoding these proteins. In this study, we characterize the profile and implications of this synteny. .A bioinformatic analysis by programs Ensembl, NCBI and UCSC shows a pattern of synteny between different isoforms of these two families: PDIA1 (P4HB), PDIA2 (PDIP) and PDIA8 (Erp27) are neighbors , respectively RhoGDIalfa, and RhoGDIy RHOGDIbeta with corresponding intergenic regions 7.1, 2.9 and 0:14 kb in different chromosomes of H. sapiens. The pattern of this synteny was strongly maintained in C. elegans, some fish and evenly amphibians, reptiles, birds and mammals. Yeasts express on the same chromosome, but in distant places (i.e macrosintenia) orthologs of PDIA1 and RhoGDI?, but do not express other syntenics PDIs and RhoGDIs in complex eukaryotes. However, synteny between PDI and RhoGDI was also observed in the plant A. thaliana, no evidence of a common ancestor. The syntenic pairs are associated with the stored neighboring blocks, but different for each pair, while each block contains a gene encoding a regulator of distinct PP1 (protein phosphatase-1). Phylogenetic analysis showed similar topology between the two famílias. The identified binding sites common transcription factors between different pairs, which mainly indicated ontology development, metabolic and immune response. The study of possible functional implications of synteny showed that manipulations of PDIA1 protein expression do not promote consistent change in protein expression RhoGDI, both in vitro (silencing of PDI by siRNA and overexpression of inducible lentiviral vector) and in vivo (transgenic mice overexpressing constitutive of PDIA1). The study of possible functional implications of synteny showed that manipulations of PDIA1 protein expression do not promote consistent change in protein expression RhoGDIalfa, both in vitro (silencing of PDI by siRNA and overexpression of inducible lentiviral vector) and in vivo (transgenic mice overexpressing constitutive of PDIA1). However, changes of gene expression of both genes in the intima of mouse carotid arteries during remodeling induced by flow were strongly correlated. Immunoprecipitation experiments and co-location to confocal microscopy suggested physical interaction between PDIA1 and RhoGDIAalfa. Thus, these data show an intriguing pattern of evolutionary conservation of gene proximity between POIs and RhoGDIs not common in eukaryotes. sintênicos genes often encode proteins that tend to interact physically and / or functionally. Indeed, our data suggest co-regulation and physical interaction between PDIA1 and RhoGDIAalfa, supporting the convergence of these proteins as a possible mechanism involved in redox regulation of cytoskeleton by PDIA1

HMMs de perfil são um método poderoso para modelar a diversidade de sequências biológicas e constituem uma abordagem muito sensível para a detecção de ortólogos remotos. Uma potencial aplicação de tais modelos é a detecção de vírus emergentes e novos elementos genéticos móveis. Nosso grupo desenvolveu recentemente o GenSeed-HMM, um programa que emprega HMMs de perfil como sementes para montagem progressiva de genes-alvo, utilizando tanto dados genômicos como metagenômicos. No presente trabalho foi desenvolvido o TABAJARA, um programa para o desenho racional de HMMs de perfil. Partindo de um alinhamento de múltiplas sequências, o TABAJARA é capaz de encontrar blocos que são (1) conservados ou (2) discriminativos para dois ou mais grupos de sequências. O programa utiliza diferentes métricas para atribuir pontuações posição-específicas ao longo de todo o alinhamento e utiliza então uma janela deslizante para encontrar as regiões com maiores pontuações. Blocos de alinhamento selecionados são então extraídos e utilizados para construir HMMs de perfil. Para validar o método, o programa TABAJARA foi empregado para a construção de modelos para vírus do gênero Flavivirus e para fagos da família Microviridae. Em ambos os grupos virais foi possível se obter modelos de ampla abrangência, capazes de detectar todos os membros de um respectivo grupo taxonômico, e modelos de abrangência mais restrita, específicos para espécies distintas de Flavivirus (ex. DENV, ZIKV ou YFV) ou subfamílias de Microviridae (ex. Alpavirinae, Gokushovirinae e Pichovirinae). Em outra validação, foram utilizadas sequências da endonuclease Cas1 para se obter modelos capazes de diferenciar CRISPRs de casposons, esses últimos representando uma superfamília de transposons de DNA autossintetizantes, os quais originaram o sistema de imunidade CRISPR-Cas de procariotos. O TABAJARA conseguiu gerar modelos específicos de Cas1 derivada de casposons, permitindo sua diferenciação em relação aos seus ortólogos de CRISPRs. No presente trabalho foi desenvolvido ainda o HMM-Prospector, uma ferramenta que utiliza um conjunto de HMMs de perfil para a triagem de dados de sequenciamento genômico ou metagenômico. O programa informa quais são os modelos mais reconhecidos pelas leituras, sob valores de corte de pontuação definidos pelo usuário, assim como quantas leituras são detectadas por cada modelo. Com esta informação, os modelos mais relevantes podem ser utilizados como sementes em montagens progressivas com o programa GenSeed-HMM, dentro de uma abordagem integrada para a construção de modelos e sua aplicação. Finamente, foi desenvolvido o e-Finder, um aplicativo genérico para a detecção e extração de elementos multigênicos a partir de genomas ou metagenomas montados utilizando HMMs de perfil. O e-Finder executa buscas de similaridade entre os HMMs de perfil e as sequências traduzidas dos dados montados e checa, em seguida, se os critérios de sintenia pré-definidos foram atendidos, incluindo o número mínimo de genes, a ordem dos genes e as distâncias intergênicas. As sequências dos elementos são então extraídas, as regiões codificantes (ORFs) identificadas e traduzidas conceitualmente em sequências completas de proteínas. Para validar esta ferramenta, foram empegados dois estudos de caso, profagos da família Microviridae e casposons, utilizando-se HMMs de perfil específicos, construídos com o programa TABAJARA. Em ambos os casos, o e-Finder foi executado usando-se a base de dados PATRIC, um repositório com mais de 135.000 genomas de bactérias e arqueias. Foram identificados um total de 91 contigs positivos para casposons a partir de 79 genomas distintos. No caso dos Microviridae, foram encontrados 104 profagos candidatos, estendendo o conhecimento da gama de hospedeiros bacterianos. Em ambos os casos, análises filogenéticas confirmaram a correta atribuição taxonômica das sequências positivas. Os programas desenvolvidos neste trabalho podem ser utilizados isoladamente ou em combinação para detectar e discriminar sequências conhecidas ou remotamente relacionadas. Juntamente com o GenSeed-HMM, estes programas constituem um conjunto integrado de ferramentas com potencial aplicação na busca de novos vírus e elementos genéticos móveis, bem como em qualquer outra tarefa relacionada à detecção e/ou discriminação de subgrupos de famílias de sequências nucleotídicas ou proteicas / Profile HMMs are a powerful way of modeling sequence diversity and constitute a very sensitive approach to detect remote orthologs. A potential application of such models is the detection of emerging viruses and novel mobile genetic elements. Our group has recently developed GenSeed-HMM, a tool that employs profile HMMs as seeds for gene-targeted progressive assembly using either genomic or metagenomic data. In this work we developed TABAJARA, a program for the rational design of profile HMMs. Starting from a multiple sequence alignment, TABAJARA is able to find blocks that are either (1) conserved across all sequences or (2) discriminative for two or more specific groups of sequences. The program uses different metrics to ascribe position-specific scores along the whole alignment and then uses a sliding-window to find top-scoring regions. Selected alignment blocks are then extracted and used to build profile HMMs. To validate the method, we employed TABAJARA to construct models for viruses of the Flavivirus genus and phages of the Microviridae family. In both viral groups we were able to obtain wide-range models, able to detect all members of the respective taxonomic group, and models that are specific to particular Flavivirus species (e.g. DENV, ZIKV or YFV) or Microviridae subfamilies (e.g. Alpavirinae, Gokushovirinae and Pichovirinae). In another validation, we used sequences of the endonuclease Cas1 to obtain models capable of differentiating CRISPRs from casposons, the latter elements representing a superfamily of self-synthesizing DNA transposons that originated the prokaryotic CRISPR-Cas immunity. TABAJARA succeeded to generate models specific to casposon-derived Cas1, enabling their differentiation from CRISPR orthologs. We also developed HMM-Prospector, a tool that can use a batch of profile HMMs to screen genomic or metagenomic sequencing data, reporting which profile HMMs are mostly recognized under user-defined score cutoff values, and how many reads are detected by each model. With this information, the most relevant models can be used as seeds in progressive assemblies with GenSeed-HMM program, providing an integrated approach for model construction and application. Finally, we developed e-Finder, a generic application for detecting and extracting multigene elements from assembled genomes or metagenomes using profile HMMs. e-Finder runs similarity searches of profile HMMs against translated sequences of the assembled data and then checks if pre-defined syntenic criteria have been fulfilled, including minimum number of genes, gene order and intergenic distances. Element sequences are then extracted, their ORFs identified and conceptually translated into full-length protein sequences. To validate the tool, we employed two distinct case studies, prophages of the Microviridae family and casposons, using specific profile HMMs constructed by TABAJARA. In both cases, we executed e-Finder using the PATRIC database, a repository with over 135,000 bacterial and archaeal genomes. We identified in total 91 casposon-positive contigs from 79 distinct genomes. In the case of Microviridae, we found a total of 104 provirus candidates, extending the known range of bacterial hosts. In both cases, phylogenetic analyses confirmed the correct taxonomic assignment of the positive sequences. The programs developed in this work can be used alone or in combination to detect and discriminate known or distantly related sequences. Together with GenSeed-HMM, these programs provide an integrated toolbox with potential application in the search of novel viruses and mobile genetic elements, as well as in any other task related to the detection and/or discrimination of subgroups of DNA or protein sequences.

Vias redox são importantes reguladores da homeostase e sinalização celular, mas o entendimento dos mecanismos desses processos é incompleto. Tiol-proteínas como a dissulfeto isomerase proteica (PDI) podem ser moduladores dessas vias. A PDI(PDIA1) é o protótipo da família das PDIs, cuja função canônica é o enovelamento redox de proteínas no retículo endoplasmático. Além disso, PDI exerce regulação de NADPH oxidases, as principais fontes de oxidantes celulares, e é necessária para ativação de RhoGTPases, organização do citoesqueleto e migração de células vasculares. No estudo de mecanismos pelos quais a PDI regula RhoGTPases, mostramos, em redes computacionais e em experimentos de co-imunoprecitação, associação entre PDIA1 e o regulador de RhoGTPases RhoGDIalfa. Além disso, identificamos forte proximidade entre os genes codificando estas proteínas. Neste estudo, caracterizamos o perfil e implicações desta sintenia gênica.A análise bioinformática pelos programs Ensembl, NCBI e UCSC evidencia um padrão de sintenia entre diferentes isoformas destas duas famílias: PDIA1 (P4HB), PDIA2 (PDIP) e PDIA8 (Erp27) são vizinhos, respectivamente, a RhoGDIbeta, RhoGDIy e RHOGDIalfa, com correspondentes regiões intergênicas de 7.1, 2.9 e 0.14 kb em distintos cromossomos em H. sapiens. O padrão dessa sintenia foi fortemente conservado emC. elegans, alguns peixes e uniformemente em anfíbios, répteis, aves e mamíferos. Leveduras expressam no mesmo cromossomo , porém em locais distantes (i.emacrossintenia) ortólogos da PDIA1 e RhoGDI?, mas não expressam outras PDIs e RhoGDIssintênicasnos eucariotos complexos. No entanto, sintenia entre PDI e RhoGDI foi também observada na planta A. thaliana, sem evidência de um ancestral comum. Os pares sintênicos associam-se a blocos vizinhos conservados, porém diversos para cada par, enquanto cada bloco contem um gene codificando um distinto regulador da PP1 (fosfatase proteica-1). Análise filogenética mostrou topologia semelhante entre as duas famílias.Análise dos dados do estudo ENCODE e predição pelo Softberry identificou sítios de ligação a fatores de transcrição comuns entre os distintos pares, cuja ontologia indicou principalmente desenvolvimento, processos metabólicos e resposta imune. O estudo de possíveis implicações funcionais dessa sintenia mostrou que manipulações da expressão proteica de PDIA1 não promovem mudança consistente na expressão proteica de RhoGDIalfa, tanto in vitro (silenciamento da PDI por siRNA e superexpressão por vetor lentiviral induzível) como in vivo (camundongo transgênico com superexpressão constitutiva da PDIA1). No entanto, as mudanças da expressãogênica de ambos os genes na camada íntima de artérias carótidas de camundongo durante remodelamento induzido por fluxo foram fortemente correlacionadas. Experimentos de coimunoprecipitação e co-localização à microscopia confocal sugeriram interação física entre PDIA1 e RhoGDIAalfa. Deste modo, estes dados mostram um intrigante padrão de conservação evolutiva da proximidade gênica entre PDIs e RhoGDIs, não usual em eucariotos. Genes sintênicos frequentemente codificam proteínas que tendem a interagir física e/ou funcionalmente. Com efeito, nosso dados sugerem co-regulação e interação física entre PDIA1 e RhoGDIAalfa, corroborando a convergência entre essas proteínas como possível mecanismo envolvido na regulação redox do citoesqueleto pela PDIA1 / Redox pathways are important regulators of homeostasis and cell signaling, but the understanding of the mechanisms of these processes is incomplete. Thiol proteins such as protein disulfide isomerase (PDI) can be modulators of these pathways. PDI (PDIA1) is the prototype of the family of PDIs whose canonical function is a redox protein folding in the endoplasmic reticulum. In addition, PDI exerts regulatory NADPH oxidase, the main sources of cellular oxidant, and is required for activation RhoGTPases, cytoskeletal organization and migration of vascular cells. In the study of mechanisms by which regulates PDI RhoGTPases, we showed in computer networks and co-imunoprecitation experiments association between PDIA1 and the regulator of RhoGTPases, RhoGDI?. In addition, we identified strong proximity of the genes encoding these proteins. In this study, we characterize the profile and implications of this synteny. .A bioinformatic analysis by programs Ensembl, NCBI and UCSC shows a pattern of synteny between different isoforms of these two families: PDIA1 (P4HB), PDIA2 (PDIP) and PDIA8 (Erp27) are neighbors , respectively RhoGDIalfa, and RhoGDIy RHOGDIbeta with corresponding intergenic regions 7.1, 2.9 and 0:14 kb in different chromosomes of H. sapiens. The pattern of this synteny was strongly maintained in C. elegans, some fish and evenly amphibians, reptiles, birds and mammals. Yeasts express on the same chromosome, but in distant places (i.e macrosintenia) orthologs of PDIA1 and RhoGDI?, but do not express other syntenics PDIs and RhoGDIs in complex eukaryotes. However, synteny between PDI and RhoGDI was also observed in the plant A. thaliana, no evidence of a common ancestor. The syntenic pairs are associated with the stored neighboring blocks, but different for each pair, while each block contains a gene encoding a regulator of distinct PP1 (protein phosphatase-1). Phylogenetic analysis showed similar topology between the two famílias. The identified binding sites common transcription factors between different pairs, which mainly indicated ontology development, metabolic and immune response. The study of possible functional implications of synteny showed that manipulations of PDIA1 protein expression do not promote consistent change in protein expression RhoGDI, both in vitro (silencing of PDI by siRNA and overexpression of inducible lentiviral vector) and in vivo (transgenic mice overexpressing constitutive of PDIA1). The study of possible functional implications of synteny showed that manipulations of PDIA1 protein expression do not promote consistent change in protein expression RhoGDIalfa, both in vitro (silencing of PDI by siRNA and overexpression of inducible lentiviral vector) and in vivo (transgenic mice overexpressing constitutive of PDIA1). However, changes of gene expression of both genes in the intima of mouse carotid arteries during remodeling induced by flow were strongly correlated. Immunoprecipitation experiments and co-location to confocal microscopy suggested physical interaction between PDIA1 and RhoGDIAalfa. Thus, these data show an intriguing pattern of evolutionary conservation of gene proximity between POIs and RhoGDIs not common in eukaryotes. sintênicos genes often encode proteins that tend to interact physically and / or functionally. Indeed, our data suggest co-regulation and physical interaction between PDIA1 and RhoGDIAalfa, supporting the convergence of these proteins as a possible mechanism involved in redox regulation of cytoskeleton by PDIA1