Os vírus são as entidades biológicas mais abundantes encontradas na natureza. O método clássico de estudo dos vírus requerem seu isolamento e propagação in vitro. Contudo, necessita-se ter um conhecimento prévio sobre as condições necessárias para seu cultivo em células, sendo assim a maior parte dos vírus existentes não é conhecida. Análises metagenômicas são uma alternativa para a detecção e caracterização de novos vírus, uma vez que não requerem um cultivo prévio e as amostras podem conter material genético de múltiplos organismos. Uma vez obtidas as sequências montadas a partir das leituras metagenômicas, o método mais utilizado para a identificação e classificação dos organismos é a busca de similaridade com o programa BLAST contra bancos de sequências conhecidas. Contudo, métodos de alinhamento pareado são capazes de identificar apenas sequências com identidade superior a 20-30%. Uma alternativa a essa limitação é o uso de métodos baseados no uso de perfis, que podem aumentar a sensibilidade de detecção de homólogos filogeneticamente distantes. HMMs de perfil são modelos probabilísticos capazes de representar a diversidade de caracteres em posições-específicas de um alinhamento de múltiplas sequências. Nosso grupo desenvolveu a ferramenta TABAJARA, utilizada neste projeto, para a identificação de blocos que podem ser conservados em todas as sequências do alinhamento ou discriminativos entre grupos de sequências. Esses blocos são utilizados para a geração de HMMs de perfil, os quais podem ser usados, no contexto da virologia, para a identificação de grupos taxonômicos amplos como famílias virais ou, ainda, taxa mais restritos como gêneros ou mesmo espécies de vírus. O presente projeto teve como objetivos aplicar e otimizar o programa TABAJARA em diferentes grupos taxonômicos de vírus, construir modelos específicos para cada um desses grupos e validar esses modelos em dados metagenômicos. O primeiro modelo de estudo escolhido foi a ordem Bunyavirales, composta de vírus de ssRNA (-) majoritariamente envelopados e esféricos, com genoma segmentado e pertencentes ao grupo 5 da classificação de Baltimore. Este grupo inclui vírus causadores de várias doenças em humanos, animais e plantas. O segundo modelo de estudo escolhido foi a família Togaviridae, composta de vírus de ssRNA (+) envelopados e esféricos, cujo genoma expressa uma poliproteína e pertencem ao grupo 4 da classificação de Baltimore. Este grupo inclui o vírus Chikungunya e outras espécies que causam diversas patologias ao homem. O terceiro modelo de estudo escolhido foi a subfamília Spounavirinae, compreendendo bacteriófagos que infectam vários hospedeiros bacterianos e em alguns casos possuem potencial terapêutico comprovado contra infecções bacterianas que afetam o homem. Estes fagos apresentam partículas virais com estrutura cabeça-cauda, não são envelopados, apresentam genoma de dsDNA e pertencem ao grupo 1 da classificação de Baltimore. Todos os modelos construídos foram validados quanto à sensibilidade e especificidade de detecção e, ao final, foram utilizados em análises de prospecção de vírus em dados metagenômicos obtidos na base SRA do NCBI. Os HMMs de perfil apresentaram excelente desempenho, comprovando a viabilidade da metodologia proposta neste projeto. Os resultados apresentados neste trabalho abrem a perspectiva da ampla utilização de HMMs de perfil como ferramentas universais para a detecção e classificação de vírus em dados metagenômicos. / Viruses are the most widely biological entities found in nature. Most of the information that can be obtained from these organisms requires viral in vitro isolation and cultivation. However, most of the existing viruses are still unknown because the biological requirements for their successful propagation have not been identified so far. Metagenomic analyses offer an interesting alternative for the detection and characterization of novel viruses, since previous cultivation is not required, and the samples may contain genetic material of multiple organisms. Once assembled sequences are obtained from individual reads, the most widely used method for viral identification and classification is the use of BLAST similarity searches against databases of known sequences. However, pairwise alignment methods are only able to identify sequences that present identity greater than 20-30%. Profile-based methods may increase the sensitivity of detection of remote homologues. Profile HMMs are probabilistic models capable of representing the diversity of amino acid residues at specific positions of a multiple sequence alignment. Our group is developing TABAJARA, a tool for the identification of alignment blocks that are conserved across all sequences of the alignment or discriminative between groups of sequences. These blocks are used to generate profile HMMs, which can in turn be used, in the context of virology, to identify broad taxonomic groups, such as viral families, or narrower taxa as genera or viral species. The present project aimed to apply and standardize the use of TABAJARA in different taxonomic groups of viruses, to build specific models for each of these groups and to validate these models in metagenomic data. We used three viral models for this study. The first chosen model was the Bunyavirales order, composed of mostly enveloped and spherical ssRNA(-) viruses with a segmented genome belonging to group 5 of the Baltimore classification. This group includes viruses that cause several important diseases in humans, animals and plants. The second chosen model was the Togaviridae family, composed of enveloped and spherical ssRNA(+) viruses, with a genome coding for a polyprotein, and belonging to group 4 of the Baltimore classification. This group includes the Chikungunya virus and some other viral species that cause relevant pathologies to humans and animals. Finally, we used the Spounavirinae subfamily, comprising viruses that infect a variety of bacterial hosts and that can potentially be used for phage therapy of some human bacterial diseases. These phages present non-enveloped virions with a head-to-tail structure, a dsDNA genome, and belong to group 1 of the Baltimore classification. All constructed profile HMMs were evaluated in regard to their sensitivity and specificity of detection, as well as tested in viral surveys using metagenomic data from the SRA database. The profile HMMs presented excellent performance, proving the viability of the methodology proposed in this project. The results presented in this work open the perspective of the wide use of profile HMMs as universal tools for the detection and classification of viruses in metagenomic data.

HMMs de perfil são um método poderoso para modelar a diversidade de sequências biológicas e constituem uma abordagem muito sensível para a detecção de ortólogos remotos. Uma potencial aplicação de tais modelos é a detecção de vírus emergentes e novos elementos genéticos móveis. Nosso grupo desenvolveu recentemente o GenSeed-HMM, um programa que emprega HMMs de perfil como sementes para montagem progressiva de genes-alvo, utilizando tanto dados genômicos como metagenômicos. No presente trabalho foi desenvolvido o TABAJARA, um programa para o desenho racional de HMMs de perfil. Partindo de um alinhamento de múltiplas sequências, o TABAJARA é capaz de encontrar blocos que são (1) conservados ou (2) discriminativos para dois ou mais grupos de sequências. O programa utiliza diferentes métricas para atribuir pontuações posição-específicas ao longo de todo o alinhamento e utiliza então uma janela deslizante para encontrar as regiões com maiores pontuações. Blocos de alinhamento selecionados são então extraídos e utilizados para construir HMMs de perfil. Para validar o método, o programa TABAJARA foi empregado para a construção de modelos para vírus do gênero Flavivirus e para fagos da família Microviridae. Em ambos os grupos virais foi possível se obter modelos de ampla abrangência, capazes de detectar todos os membros de um respectivo grupo taxonômico, e modelos de abrangência mais restrita, específicos para espécies distintas de Flavivirus (ex. DENV, ZIKV ou YFV) ou subfamílias de Microviridae (ex. Alpavirinae, Gokushovirinae e Pichovirinae). Em outra validação, foram utilizadas sequências da endonuclease Cas1 para se obter modelos capazes de diferenciar CRISPRs de casposons, esses últimos representando uma superfamília de transposons de DNA autossintetizantes, os quais originaram o sistema de imunidade CRISPR-Cas de procariotos. O TABAJARA conseguiu gerar modelos específicos de Cas1 derivada de casposons, permitindo sua diferenciação em relação aos seus ortólogos de CRISPRs. No presente trabalho foi desenvolvido ainda o HMM-Prospector, uma ferramenta que utiliza um conjunto de HMMs de perfil para a triagem de dados de sequenciamento genômico ou metagenômico. O programa informa quais são os modelos mais reconhecidos pelas leituras, sob valores de corte de pontuação definidos pelo usuário, assim como quantas leituras são detectadas por cada modelo. Com esta informação, os modelos mais relevantes podem ser utilizados como sementes em montagens progressivas com o programa GenSeed-HMM, dentro de uma abordagem integrada para a construção de modelos e sua aplicação. Finamente, foi desenvolvido o e-Finder, um aplicativo genérico para a detecção e extração de elementos multigênicos a partir de genomas ou metagenomas montados utilizando HMMs de perfil. O e-Finder executa buscas de similaridade entre os HMMs de perfil e as sequências traduzidas dos dados montados e checa, em seguida, se os critérios de sintenia pré-definidos foram atendidos, incluindo o número mínimo de genes, a ordem dos genes e as distâncias intergênicas. As sequências dos elementos são então extraídas, as regiões codificantes (ORFs) identificadas e traduzidas conceitualmente em sequências completas de proteínas. Para validar esta ferramenta, foram empegados dois estudos de caso, profagos da família Microviridae e casposons, utilizando-se HMMs de perfil específicos, construídos com o programa TABAJARA. Em ambos os casos, o e-Finder foi executado usando-se a base de dados PATRIC, um repositório com mais de 135.000 genomas de bactérias e arqueias. Foram identificados um total de 91 contigs positivos para casposons a partir de 79 genomas distintos. No caso dos Microviridae, foram encontrados 104 profagos candidatos, estendendo o conhecimento da gama de hospedeiros bacterianos. Em ambos os casos, análises filogenéticas confirmaram a correta atribuição taxonômica das sequências positivas. Os programas desenvolvidos neste trabalho podem ser utilizados isoladamente ou em combinação para detectar e discriminar sequências conhecidas ou remotamente relacionadas. Juntamente com o GenSeed-HMM, estes programas constituem um conjunto integrado de ferramentas com potencial aplicação na busca de novos vírus e elementos genéticos móveis, bem como em qualquer outra tarefa relacionada à detecção e/ou discriminação de subgrupos de famílias de sequências nucleotídicas ou proteicas / Profile HMMs are a powerful way of modeling sequence diversity and constitute a very sensitive approach to detect remote orthologs. A potential application of such models is the detection of emerging viruses and novel mobile genetic elements. Our group has recently developed GenSeed-HMM, a tool that employs profile HMMs as seeds for gene-targeted progressive assembly using either genomic or metagenomic data. In this work we developed TABAJARA, a program for the rational design of profile HMMs. Starting from a multiple sequence alignment, TABAJARA is able to find blocks that are either (1) conserved across all sequences or (2) discriminative for two or more specific groups of sequences. The program uses different metrics to ascribe position-specific scores along the whole alignment and then uses a sliding-window to find top-scoring regions. Selected alignment blocks are then extracted and used to build profile HMMs. To validate the method, we employed TABAJARA to construct models for viruses of the Flavivirus genus and phages of the Microviridae family. In both viral groups we were able to obtain wide-range models, able to detect all members of the respective taxonomic group, and models that are specific to particular Flavivirus species (e.g. DENV, ZIKV or YFV) or Microviridae subfamilies (e.g. Alpavirinae, Gokushovirinae and Pichovirinae). In another validation, we used sequences of the endonuclease Cas1 to obtain models capable of differentiating CRISPRs from casposons, the latter elements representing a superfamily of self-synthesizing DNA transposons that originated the prokaryotic CRISPR-Cas immunity. TABAJARA succeeded to generate models specific to casposon-derived Cas1, enabling their differentiation from CRISPR orthologs. We also developed HMM-Prospector, a tool that can use a batch of profile HMMs to screen genomic or metagenomic sequencing data, reporting which profile HMMs are mostly recognized under user-defined score cutoff values, and how many reads are detected by each model. With this information, the most relevant models can be used as seeds in progressive assemblies with GenSeed-HMM program, providing an integrated approach for model construction and application. Finally, we developed e-Finder, a generic application for detecting and extracting multigene elements from assembled genomes or metagenomes using profile HMMs. e-Finder runs similarity searches of profile HMMs against translated sequences of the assembled data and then checks if pre-defined syntenic criteria have been fulfilled, including minimum number of genes, gene order and intergenic distances. Element sequences are then extracted, their ORFs identified and conceptually translated into full-length protein sequences. To validate the tool, we employed two distinct case studies, prophages of the Microviridae family and casposons, using specific profile HMMs constructed by TABAJARA. In both cases, we executed e-Finder using the PATRIC database, a repository with over 135,000 bacterial and archaeal genomes. We identified in total 91 casposon-positive contigs from 79 distinct genomes. In the case of Microviridae, we found a total of 104 provirus candidates, extending the known range of bacterial hosts. In both cases, phylogenetic analyses confirmed the correct taxonomic assignment of the positive sequences. The programs developed in this work can be used alone or in combination to detect and discriminate known or distantly related sequences. Together with GenSeed-HMM, these programs provide an integrated toolbox with potential application in the search of novel viruses and mobile genetic elements, as well as in any other task related to the detection and/or discrimination of subgroups of DNA or protein sequences.