Os ritmos circadianos estão presentes em um grande número de organismos, proporcionando uma organização temporal de processos fisiológicos e comportamentais a fim de promover uma efetiva adaptação do organismo às mudanças ambientais. O ATP e seus produtos de degradação, o ADP, o AMP e a adenosina podem atuar como mensageiros extracelulares em uma série de processos biológicos, e estão envolvidos em uma variedade de condições patológicas, incluindo isquemia, doenças neurodegenerativas e cardiovasculares, depressão e câncer. O ATP extracelular, bem como os demais nucleotídeos de adenina, podem ser hidrolisados pela ação das enzimas nucleotidases incluindo as NTPDases e a 5'- nucleotidase, que são consideradas as principais reguladoras da sinalização purinérgica no sangue. O presente trabalho avaliou a possível existência de um padrão temporal nas atividades das enzimas responsáveis pela metabolização destes nucleotídeos, e se estas enzimas poderiam estar sendo moduladas pela melatonina, corticosterona ou norepinefrina, que claramente apresentam robustos padrões circadianos. A hidrólise dos nucleotídeos ATP e ADP foram significativamente maiores durante o ciclo escuro quando comparada com o ciclo claro. Além disso, nós demonstramos que as atividades ATPásica e ADPásica são sensíveis a uma concentração fisiológica de norepinefrina em experimentos in vitro e in vivo em soro de ratos. Este estudo sugere a existência de um padrão temporal na hidrólise do ATP e do ADP, que pode ser fisiologicamente importante para o funcionamento normal do organismo. Além disso, a norepinefrina pode modular estas atividades enzimáticas, provocando uma diminuição das concentrações de ATP e ADP circulantes. / Circadian rhythms are present in a large number of organisms, representing an important mechanism for preparing the organism to environmental changes. ATP and its breakdown products, ADP, AMP and adenosine can act as extracellular messengers in a range of biological processes through the binding to purinergic receptors, and are involved in a variety of pathological conditions including ischaemia, neurodegenerative, depression, cardiovascular and cancer diseases. Extracellular adenine nucleotides are metabolized to adenosine by a number of enzymes including NTPDases and 5’-nucleotidase that are considered to be the major regulators of purinergic signaling in blood. This study evaluated the possible existence of a temporal pattern of enzymatic activities responsible for metabolism of these nucleotides, and its possible modulation by melatonin, corticosterone or norepinephrine, which clearly show robust circadian patterns. The hydrolysis of ATP and ADP nucleotides were significantly higher during the dark cycle when compared with light cycle. Furthermore, we demonstrated that ATPase and ADPase activities are sensitive to a physiological concentration of norepinephrine in in vitro and in vivo experiments in rat blood serum. This study suggests the existence of a temporal pattern of ATP and ADP hydrolysis, which may be physiologically important for normal functioning of the body. Moreover, the norepinephrine may modulate these enzymatic activities, causing a decrease in the circulating levels of ATP and ADP.

As doenças infecciosas estão entre as principais causas de morte no mundo. Nas infecções bacterianas, os componentes das paredes destes organismos são descritos como os principais antígenos. Os macrófagos estão diretamente envolvidos no reconhecimento e ataque de agentes patogênicos, além de atuarem como moduladores da resposta imunológica. Os macrófagos participam do combate às infecções bacterianas através da fagocitose dos agentes patogênicos e da produção de diversos mediadores inflamatórios como citocinas, metaloproteinases (MMP), espécies reativas de oxigênio (ROS) e óxido nítrico(NO). Estes mediadores são importantes na resposta inflamatória, contribuindo para o controle da infecção. Entretanto, a produção exacerbada destas moléculas contribui na patogênese das complicações associadas à inflamação, como a sepse e a falência múltipla de órgão. A maior parte dos estudos tem focado a resposta das células imunes a infecções por bactérias gram-negativas ou ao seu principal antígeno, o lipopolisacarídeo (LPS). No entanto, as infecções por bactérias gram-positivas são freqüentes e resultam em grande taxa de mortalidade. As doenças infecciosas estão entre as principais causas de morte no mundo. Nas infecções bacterianas, os componentes das paredes destes organismos são descritos como os principais antígenos. Os macrófagos estão diretamente envolvidos no reconhecimento e ataque de agentes patogênicos, além de atuarem como moduladores da resposta imunológica. Os macrófagos participam do combate às infecções bacterianas através da fagocitose dos agentes patogênicos e da produção de diversos mediadores inflamatórios como citocinas, metaloproteinases (MMP), espécies reativas de oxigênio (ROS) e óxido nítrico(NO). Estes mediadores são importantes na resposta inflamatória, contribuindo para o controle da infecção. Entretanto, a produção exacerbada destas moléculas contribui na patogênese das complicações associadas à inflamação, como a sepse e a falência múltipla de órgão. A maior parte dos estudos tem focado a resposta das células imunes a infecções por bactérias gram-negativas ou ao seu principal antígeno, o lipopolisacarídeo (LPS). No entanto, as infecções por bactérias gram-positivas são freqüentes e resultam em grande taxa de mortalidade. Os receptores de adenosina, em macrófagos, possuem função antiinflamatória em modelos de infecções por bactérias gram-negativas, no entanto, pouco se investigou a ação destes receptores em infecções por bactérias gram-positivas. O diabetes é uma doença metabólica comum que apresenta diversas complicações secundárias, muitas delas associadas aos níveis elevados de glicose. Os pacientes diabéticos apresentam uma ocorrência aumentada de infecções bacterianas, além de o diabetes tipo 2 estar associado com uma inflamação crônica, caracterizada por níveis plasmáticos aumentados de citocinas pró-inflamatórias. Adicionalmente, estes pacientes possuem maior risco de desenvolver doenças cardiovasculares e aterosclerose, o que tem sido relacionado à hiperglicemia e à inflamação crônica. A regulação, pela glicose, da resposta inflamatória em macrófagos expostos a bactérias gram-negativas ou ao seu antígeno principal, o LPS, é descrita, entretanto, a ação da glicose em modelos de infecções por bactérias gram-positivas não é conhecida. O tratamento dos macrófagos RAW 264.7 com concentrações elevadas de glicose aumentaram a resposta inflamatória ao LTA, com o aumento da produção de NO, TNF-a e MMP-9. Estes resultados mostram que tanto os receptores de adenosina como concentrações elevadas de glicose modulam a resposta inflamatória a S. aureus. Os receptores de adenosina parecem atuar num mecanismo autócrino de modulação da resposta inflamatória, apontando um possível alvo terapêutico. Já a modulação da resposta inflamatória dos macrófagos por concentrações aumentadas de glicose pode contribuir para complicações associadas ao diabetes, como a aterosclerose e a inflamação crônica. / Infectious diseases are among the majors causes of mortality around the world. In bacterial infections, the bacterial cell wall components are described as the main antigens. The macrophages are key mediators of inflammatory response, acting in the attack to the pathogens and in the regulation of immune response. These cells act in the phagocytosis of pathogenic agents and in the production of inflammatory mediators, like cytokines, matrix-metalloproteinases (MMP), reactive oxygen species (ROS) and nitric oxide (NO). These mediators participate of inflammatory response, acting in infection control, notwithstanding, exacerbated production of these molecules could contribute to inflammatory complications, like sepsis and multiple organ failure. Several studies has addressed the inflammatory response to gram-negative bacterial infections or lipopolysaccharide (LPS), the main antigen of these microorganisms, however grampositive bacterial infections are prevalent and associated to high mortality. The adenosine receptors are described to possess anti-inflammatory properties in macrophages in gram-negative bacterial infections models but the role of these receptors in gram-positive bacterial infections is unknown. Diabetes is a prevalent metabolic disorder which presents several associated complications; much of them associated to increased glucose levels. Diabetic patients shown increased occurrence of bacterial infections and type 2 diabetes is associated to a chronic inflammatory state, with increased circulatory levels of pro-inflammatory cytokines. Type 2 diabetic patients possess increased risk of cardiovascular diseases and atherogenesis, which has been associated to hyperglycemia and chronic inflammation. The regulation of macrophages inflammatory response to gram-negative bacterial infections or to its antigen LPS by increased levels of glucose is described, however, the role of increased glucose in gram-positive bacterial infections is unknown. For this reasons, we studied the role of adenosine receptors and increased glucose in macrophages activation by Staphylococcus aureus antigens, considering that this bacteria is the major organism in hospital infections. The treatment of RAW 264.7 macrophages with S. aureus antigens lipoteichoic acid (LTA) and peptidoglycan (PEG) resulted in the production of proinflammatory mediators. Diabetes is a prevalent metabolic disorder which presents several associated complications; much of them associated to increased glucose levels. Diabetic patients shown increased occurrence of bacterial infections and type 2 diabetes is associated to a chronic inflammatory state, with increased circulatory levels of pro-inflammatory cytokines. Type 2 diabetic patients possess increased risk of cardiovascular diseases and atherogenesis, which has been associated to hyperglycemia and chronic inflammation. The regulation of macrophages inflammatory response to gram-negative bacterial infections or to its antigen LPS by increased levels of glucose is described, however, the role of increased glucose in gram-positive bacterial infections is unknown. For this reasons, we studied the role of adenosine receptors and increased glucose in macrophages activation by Staphylococcus aureus antigens, considering that this bacteria is the major organism in hospital infections. The treatment of RAW 264.7 macrophages with S. aureus antigens lipoteichoic acid (LTA) and peptidoglycan (PEG) resulted in the production of proinflammatory mediators.

Made available in DSpace on 2015-12-06T23:44:34Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2006 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / A pilocarpina é um agonista colinérgico que, quando injetada em altas doses (i.p.) a ratos, reproduz as principais características da epilepsia do lobo temporal (ELT) humana. O animal exibe diferentes padrões de comportamentos, incluindo status epilepticus (fase aguda), normalização comportamental (fase latente) e finalmente crises espontâneas e recorrentes (fase crônica). Os objetivos desse estudo foram analisar por microdiálise e HPLC a concentração de ATP e seus metabólitos na formação hipocampal de ratos que se encontram nas fases aguda e crônica do modelo experimental de ELT induzida por pilocarpina, e avaliar através de imunoblot e imuno-histoquímica, os receptores P2X2,4,7 na formação hipocampal desses animais, incluindo o grupo latente. O procedimento de microdiálise foi aplicado para determinação da concentração de purinas liberadas durante o status epilepticus (SE) em amostras coletadas nos seguintes tempos: Basal (3 amostras antes de qualquer tratamento), após a administração de metilescopolamina (usada para minimizar os efeitos periféricos da pilocarpina) e 30 min. 1H, 2H, 3H e 4H após a aplicação da pilocarpina. Os animais crônicos foram estudados nos períodos interictal e ictal. As amostras foram analisadas por HPLC com detecção por fluorescência. Animais de três grupos experimentais (G12H; GLat; GCro) e respectivos controles, foram empregados para o estudo dos receptores P2X2,4,7, através de imunoblot e imuno-histoquímica. O imunoblot foi revelado por quimiluminescência. A imuno-histoquímica foi feita com cortes fixados e flutuantes em tampão, usando anticorpo biotinilado e kit ABC e revelação com diaminobenzidina. O estudo bioquímico revelou um aumento de ADP, AMP e adenosina durante o SE. Na fase crônica, evidenciou-se uma redução de todas as purinas no período interictal, e um aumento das mesmas no período ictal, sendo significante para o ATP e adenosina. Em relação aos receptores estudados por imuno-histoquímica e imunoblot, observou-se uma intensa redução dos P2X4 versus CT no período crônico (35%, p<0.001, ANOVA), um aumento do P2X7 nas fases aguda e crônica (G12H: 20%, p<0,05; GCRO: 18% p<0,05, ANOVA).Com base nos resultados, conclui-se que o metabolismo das purinas está alterado na fisiopatologia da ELT induzida por pilocarpina, por exemplo, na fase aguda o aumento na concentração de ADP, AMP e de adenosina, pode estar refletindo um aumento na taxa metabólica do ATP pelas ectonucleotidases, como um mecanismo compensatório inibitório. No entanto, o ATP antes de ser metabolizado pode estar ativando receptores P2X7, e exercendo um papel importante na citotoxicidade. Já na fase crônica, a redução das purinas, infere principalmente um comprometimento na atividade inibitória mediada pela adenosina, que por sua vez pode facilitar a susceptibilidade às crises epilépticas. / Pilocarpine, a muscarinic cholinergic agonist when inject at high doses (i.p.) in rats, reproduces the main characteristics of Human Temporal Lobe Epilepsy (TLE). The animal exhibits different patterns of behavior, including status epilepticus (acute phase), electrophysiological and behavioral normalization (latent phase) and spontaneous recurrent seizures (chronic phase). The objectives of this study were to analyze by means of microdyalysis and HPLC, the concentration of ATP and its metabolites ADP, AMP and adenosine in the hippocampal formation of rats during the acute and chronic phases of pilocarpine model, and evaluating by western blotting and immunohistochemistry, the receptors P2X2,4,7 in the hippocampal formation of these animals. The microdyalysis procedure used to determine the purines concentration in the acute period, was taken according to the following periods of time: Basal (three samples before treatment onset), after methylscopolamine injection (used in order to minimize the peripheral effects of pilocarpine) and 30 min. 1h, 2h, 3h and 4h after pilocarpine injection. Chronic animals were studied during the interictal and ictal period. The samples were analyzed by a fluorescence detector coupled to HPLC. Animals from three different experimental groups (Group 12h = G 12h, Latent Group = G Lat, Chronic Group = G Cro) and their respective controls were utilized to analyze the purinergic receptors P2X2,4,7, by means of western blotting and immunohistochemistry. The immunohistochemistry was achieved with fixated slices floating on buffer solution, using biotinylated antibody, ABC kit and development with diaminobenzidine. The biochemical study revealed an increase of ADP, AMP and adenosine concentrations during the SE. In contrast, a reduction of all purines was detected in the hippocampal formation during the interictal period of chronic rats. Rats studied during the ictal phase, exhibited high concentrations of ATP and adenosine. The immunohistochemistry and western blotting analysis showed a great reduction of P2X4, versus CT in the chronic period (35%, p<0.001, ANOVA), and an increase of P2X7, in the acute and chronic phases (G12H: 20%, p<0.05; GCRO: 18% p<0.05, ANOVA). According to these findings, we can conclude that the metabolism of purines is altered in the hippocampal formation of rats in pilocarpine-induced epilepsy. In the acute phase, the increase of ATP metabolites may reflect an increase in the metabolism rates of ATP by the ectonucleotidases, possibly as a compensatory inhibitory mechanism. On the other hand, before ATP is hydrolyzed, it may activate P2X7 purinoceptor, and consequently, intensify hyperexcitability and cytotoxicity cascades. A decrease in all purines analyzed in the chronic phase could suggest an energy metabolism dysfunction in the epileptic hippocampus. The decrease in the adenosine concentrations might facilitate the onset of spontaneous and recurrent seizures. / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Neurociências. / Made available in DSpace on 2012-10-23T21:50:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 256093.pdf: 7992645 bytes, checksum: 93cf02c4018b2c6015bfcdfcbbef039d (MD5) / A adenosina é um nucleosídeo endógeno que age como neuromodulador controlando sistemas de neurotransmissores intimamente envolvidos no estresse e na patofisiologia dos distúrbios de humor. A fim de contribuir para o entendimento das bases neurobiológicas da depressão e possivelmente para o desenvolvimento de novas alternativas terapêuticas, investigamos alguns dos possíveis mecanismos relacionados à manipulação aguda e crônica de receptores adenosinérgicos no teste do nado forçado (TNF) e no modelo de depressão induzida pelo estresse crônico imprevisível (ECI). A administração de adenosina (10 mg/kg, i.p.) ou dipiridamol (1-2 µg/sítio) reduziu o tempo de imobilidade dos animais no TNF. Por outro lado, o tratamento com adenosina (5 ou 10 mg/kg, i.p.) por 14 dias não produziu um efeito antidepressivo no TNF. Na avaliação do mecanismo de ação antidepressiva da adenosina no TNF, investigamos a possível participação dos receptores NMDA, via da L-arginina-NO, canais de potássio (K+) e dos sistemas serotoninérgico e opióide. O efeito da adenosina (10 mg/kg, i.p.) no TNF foi prevenido pelo pré-tratamento dos animais com NMDA (0,1 pmol/sítio, i.c.v.), D-serina (30 µg/sítio, i.c.v.), L-arginina (750 mg/kg, i.p.), SNAP (25 µg/sítio, i.c.v), sildenafil (5 mg/kg, i.p.), cromacalim (10 µg/site, i.c.v.), PCPA (100 mg/kg, i.p., 4 dias consecutivos), WAY100635 (0,1 and 0,3 mg/kg, s.c.), naloxona (1 mg/kg, i.p.), naltrindol (3 mg/kg, i.p.), clocinamox (1 mg/kg, i.p.) e DIPPA (1 mg/kg, i.p.), mas não com D-arginina (750 mg/kg, i.p.), cetanserina (5 mg/kg, i.p.) ou naloxona metiodida (1 mg/kg, s.c.). Além disso, quando administrada em uma dose sub-ativa, a adenosina (1 mg/kg, i.p.) produziu um efeito sinérgico com MK-801 (0,001 mg/kg, i.p.), cetamina (0,1 mg/kg, i.p.), cloreto de zinco (5 mg/kg, i.p.), L-NNA (0,3 mg/kg, i.p.), azul de metileno (9 -18 mg/kg, i.p.), ODQ (30 pmol/sítio, i.c.v.), TEA (25 pg/sítio, i.c.v.), glibenclamida (0,5 pg/sítio, i.c.v.), caribdotoxina (25 pg/sítio, i.c.v.), apamina (10 pg/sítio, i.c.v.), 8-OH-DPAT (1 mg/kg, i.p.), WAY100635 (0,1 mg/kg, s.c.), morfina (1 mg/kg, s.c.), mas não com DOI (1 mg/kg, i.p.) ou cetanserina. Além disso, não foi observado efeito aditivo da administração combinada de doses ativas de morfina (5 mg/kg, s.c.) e adenosina (10 mg/kg, i.p.). Nossos resultados indicam que o efeito da adenosina no TNF é mediado, pelo menos em parte, por uma inibição de: receptores NMDA, síntese de óxido nítrico e cGMP, canais de K+ e interação com os sistemas serotoninérgico e opióide. Com base no efeito diferencial da manipulação aguda e crônica de receptores de adenosina, em uma outra fase deste estudo, investigamos o efeito do tratamento crônico com um antagonista adenosinérgico, sobre as modificações neuroquímicas e comportamentais induzidas pelo ECI. O consumo crônico do antagonista não-seletivo de receptores de adenosina, cafeína (1g/l na água de beber, 4 semanas antes do ECI e durante o ECI) preveniu o comportamento tipo depressivo e o déficit de memória na tarefa do Labirinto em Y induzidos pelo ECI, sem afetar a atividade locomotora avaliada no campo aberto e o efeito ansiogênico do estresse no labirinto em cruz elevado. Além disso, o ECI causou uma redução na imunorreatividade da proteína de exocitose SNAP-25 no hipocampo, um efeito que foi prevenido pela ingestão de cafeína. Esta também preveniu o aumento da imunorreatividade para GFAP nas regiões CA1 e CA3 do hipocampo. Os resultados em conjunto mostram o envolvimento do sistema adenosinérgico na modulação do estresse e depressão. A administração aguda de adenosina produz um efeito antidepressivo no TNF, por interagir com múltiplos sistemas de neurotransmissores, mas não apresenta efeito no TNF quando administrada por 14 dias. Contudo, o tratamento crônico com um antagonista de receptores de adenosina confere neuroproteção contra algumas alterações neuroquímicas e comportamentais (incluindo o comportamento tipo-depressivo) induzidas pelo ECI.

O transplante renal representa atualmente a melhor opção terapêutica e de reabilitação para o paciente com insuficiência renal crônica terminal. As rejeições são as principais causas de perda dos rins transplantados e, entre essas, as rejeições agudas são as que apresentam maior relevância clínica. Desta maneira, a monitorização do transplante renal com vistas ao diagnóstico precoce da rejeição e seu rápido tratamento é de grande relevância no manejo adequado desses pacientes. Como a rejeição celular aguda é mediada predominantemente por linfócitos T e, visto que, a enzima adenosina deaminase (ADA) é encontrada principalmente, a nível de sangue periférico, em linfócitos, objetivou-se com esse estudo, verificar a possível associação entre atividade sérica da ADA e a rejeição aguda do enxerto renal. Buscou-se, também, determinar a sua utilidade como método diagnóstico de rejeição celular aguda. Foram acompanhados até 1 mês de internação 35 pacientes transplantados renais. Dosagens da atividade de ADA sérica foram feitas cinco vezes por semana e sempre que houvesse suspeita clínica de rejeição aguda. O diagnóstico de rejeição aguda foi estabelecido por 2 nefrologistas, aos quais foram omitidos os resultados dos níveis séricos ADA. Estes médicos tinham todas informações clínicas e laboratoriais, incluindo valores séricos de creatinina e ciclosporina, cintilografias, ecografias, citologia aspirativa, punção biópsia renal quando esta era realizada e resposta aos diferentes tratamentos imunossupressores usados. A análise estatística foi feita utilizando-se testes de Mann-Whitney e Qui-quadrado. O nível p menor do que 0,05 foi considerado como significativo. A mediana dos episódios de rejeição celular aguda ficou entre o sexto e sétimo dia pós-transplante, havendo diferença estatisticamente significativa nos valores de ADA no sexto dia de seguimento entre os pacientes com rejeição (60.16), em relação aos que não tiveram rejeição celular aguda (24,55) (p=0,021 MW). Para se avaliar a eficácia da atividade sérica de ADA com método diagnóstico de rejeição aguda, empregou-se pontos de corte de valores de ADA>35,>40,>45, >50 e > que 30% dos valores do período pré-rejeição. Houve associação estatisticamente significativa entre ADA>30% e rejeição celular aguda (p=0.035 MW). Verificou-se, também, aumento significativos da atividade sérica de ADA em pacientes anti-HCV positivos e com necrose tubular aguda, sem interferência sobre os resultados dos episódios de rejeição celular aguda. Usando esses pontos de corte como parâmetros de diagnóstico para rejeição aguda observou-se: sensibilidade = 55,5%, especificidade = 82,3%, valor preditivo positivo = 76,9%, valor preditivo negativo = 63,6% e acurácia = 69,0%. Conclui-se que há um aumento significativo da atividade sérica da ADA durante os episódios de rejeição aguda de enxertos renais humanos, encontrando-se associação significativa entre o aumento de 30% dos valores de ADA pré-rejeição e o diagnóstico de rejeição celular aguda.

Os transtornos de ansiedade estão entre os mais prevalentes de todos os transtornos mentais no mundo. Estão associados a sofrimento subjetivo e prejuízo na qualidade de vida dos pacientes. Porém os mecanismos fisiopatológicos da ansiedade ainda necessitam de muita investigação. Recentemente, nosso grupo demonstrou que a administração sistêmica de GMP é capaz de induzir um efeito típico ansiolítico em ratos, contudo, o mecanismo de ação deste efeito ainda não foi esclarecido. Assim, no presente estudo buscamos investigar os mecanismos envolvidos no efeito ansiolítico do GMP, além de avaliar o potencial efeito ansiolítico da guanosina (GUO), e explorar o envolvimento do sistema adenosinérgico e glutamatérgico nos efeitos observados. Nossos resultados evidenciam que o GMP é capaz de promover efeito típico ansiolítico quando a administração é central, aumentar os níveis de GUO e adenosina (ADO) no liquor quando sua administração é intraperitoneal (i.p.). Ainda, observamos que a administração i.p. de GUO possui efeito típico ansiolítico, aumentando apenas os níveis de ADO no liquor. Com isso, demonstramos que a administração de GUO foi capaz de diminuir os níveis de glutamato no liquor, sem alterar a captação de glutamato em regiões do cérebro relacionadas com a ansiedade. Por fim, mostramos que o pré-tratamento com cafeína foi capaz de abolir o efeito ansiolítico da GUO e parcialmente bloquear a diminuição dos níveis de glutamato no liquor. Como conclusão, este estudo fornece novas evidências sobre o mecanismo de ação do GMP e da GUO, e mostra que o efeito ansiolítico pode estar relacionado com a modulação do sistema adenosinérgico e glutamatérgico. / Anxiety disorders represent the most common worldwide psychiatric diseases but nowadays there is no satisfactory strategy to their treatment without severe adverse effects. Recently, we demonstrated that a systemic administration of GMP induces anxiolytic-like effect in rats but its mechanism of action remains unclear. In the present study we aimed to investigate the mechanisms insights into how GMP induces anxiolytic-like effects and further explored the anxiolytic potential of guanosine (GUO) and the involvement of the adenosinergic and glutamatergic system on those effects. Our results showed that GMP induces anxiolytic-like behaviors centrally and increases cerebrospinal fluid (CSF) CSF GUO and adenosine (ADO) levels 60 min after a systemic administration. Furthermore, systemic administration of GUO produced anxiolytic-like behaviors but enhance only CSF ADO level 60 min after administration. In addition, GUO treatment decreased CSF glutamate level but did not change glutamate uptake in brain regions related to anxiety. Moreover, the pre administration of CAF abolished GUO anxiolytic-like effects and partially blocked GUO effects on CSF glutamate level. In summary, the present work presents the anxyolitic effects of GMP and GUO and provides new evidence that these effects seem to be related to the modulation of adenosinergic and glutamatergic systems.

O zebrafish é um modelo experimental consolidado em diversas áreas, tais como genética e neurociências. Estudos têm demonstrado que muitos genes deste peixe são evolutivamente conservados e similares aos de mamíferos, incluindo a espécie humana. Com relação ao sistema purinérgico, já foi demonstrado que o zebrafish apresenta diferentes membros da família das NTPDases (nucleosídeo trifosfato difosfoidrolases) e uma ecto-5’-nucleotidase, capazes de clivar o ATP até adenosina, que atua através de purinoreceptores P1. A adenosina deaminase (ADA) é responsável pela clivagem da adenosina à inosina. Dois membros da família da ADA, conhecidos como ADA1 e ADA2, foram descritos e evidências recentes demonstraram a existência de um outro grupo similar de proteína, denominado ADAL (adenosina deaminase “like”). Portanto, no primeiro capítulo desta Dissertação, foram identificados distintos genes relacionados à ADA (ADA1, ADAL e dois genes ortólogos da ADA2) através de uma análise filogenética. Primers específicos para cada membro da ADA foram desenhados, experimentos otimizados de RT-PCR foram conduzidos e a quantidade relativa de transcritos determinada em diversos tecidos. Os resultados demonstraram que os genes da ADA1, ADAL, ADA2-1 e ADA2-2 podem ser diferentemente expressos nos tecidos de zebrafish. Além disso, a estratégia adotada também permitiu a identificação de uma isoforma truncada de ADA2-1 de splicing alternativo (ADA2-1/T), a qual foi expressa em diferentes intensidades nos tecidos analisados. Considerando que distintos membros da adenosina deaminase foram identificados, o segundo capítulo teve por objetivo caracterizar a atividade de desaminação de adenosina em frações solúvel e de membrana do cérebro de zebrafish. A atividade enzimática foi determinada pelo ensaio colorimétrico da amônia liberada. Foi verificado que em ambas as frações celulares estudadas a atividade de desaminação da adenosina foi linear quando utilizada uma concentração final de substrato de 1,5 mM. A curva de proteína, após incubação a 37ºC por 75 min (pH 7,0) e 120 min (pH 5,0) para as frações solúvel e de membrana, respectivamente, foi linear quando utilizada uma quantidade de proteína na faixa de 5–20 μg. A adição de 5 mM de Zn2+ promoveu uma queda significativa na desaminação de adenosina em membranas, a qual foi prevenida com 5 mM de EDTA. Utilizando adenosina como substrato, o KM aparente para ambas as frações celulares foi de aproximadamente 0,2 mM, enquanto que o Vmax foi de 12,3 + 0,73 e 17,5 + 0,51 (média + EP) nmol NH3.min-1.mg-1 de proteína para as frações solúvel e de membrana, respectivamente. Os resultados também demonstraram uma preferência para a desaminação de nucleosídeos da adenina em relação aos da guanina. Além disso, a incubação com 0,1 mM de EHNA (hidrocloreto de eritro-9-(2-hidróxi-3-nonil) adenina), um inibidor clássico da ADA1, promoveu uma inibição significativa da atividade enzimática em ambas as frações celulares. Estes achados sugerem que a existência de diferentes genes associados à ADA, bem como seus distintos padrões de expressão podem contribuir para a atividade de desaminação de adenosina em zebrafish. / Zebrafish (Danio rerio) is a consolidated experimental model in several areas, such as genetics and neuroscience. Studies have shown that many genes of this fish are evolutionary conserved and that share similarities to mammals genes, including humans. In relation to the purinergic system, it was demonstrated that zebrafish presents distinct members of the NTPDase (nucleoside triphosphate diphosphohydrolase) family and an ecto- 5'-nucleotidase, able to cleave ATP to adenosine, which acts via P1 purinoreceptors. Adenosine deaminase (ADA) is responsible for cleaving the adenosine to inosine. Two members of ADA family, known as ADA1 and ADA2, were described and recent evidence demonstrated the existence of another similar protein group named ADAL (adenosine deaminase “like”). Therefore, in the first chapter of this Dissertation, distinct ADA-related genes were identified (ADA1, ADAL e two ADA2 orthologous genes) by a phylogenetic analysis. Specific primers for each ADA members were designed, optimized semi-quantitative RT-PCR experiments were conducted and the relative amount of transcripts was determined in several tissues. The results demonstrated that ADA1, ADAL, ADA2-1 e ADA2-2 genes may be expressed differently in zebrafish tissues. In addition, the strategy adopted also allowed the identification of a truncated alternative splice isoform of ADA2-1, which was expressed in the analyzed tissues with different intensities. Considering that distinct adenosine deaminase members were identified, the objective of the second chapter was to characterize the adenosine deaminase activity in soluble and membrane fractions of zebrafish brain. The enzyme activity was measured by the colorimetric assay from the ammonia released. It was verified that in both cellular fractions, the adenosine deaminase activity was linear when it was used a final substrate concentration of 1.5 mM. The protein curve was linear using an amount of 5–20 μg of protein in the incubation at 37ºC for 75 min (pH 7.0) and 120 min (pH 5.0) for soluble and membrane fractions, respectively. The addition of 5 mM Zn2+ promoted a significant decrease on adenosine deamination in membranes, which was prevented by 5 mM EDTA. Using adenosine as substrate, the apparent KM for both cellular fractions was around of 0.2 mM, whereas the calculated Vmax were 12.3 + 0.73 and 17.5 + 0.51 (mean + SEM) nmol NH3.min-1.mg-1 of protein for the soluble and membrane fractions, respectively. The results also demonstrated a preference for the deamination of adenine nucleosides in relation to guanine derivates. In addition, the incubation with 0.1 mM EHNA (erythro-9-(2- hydroxy-3-nonyl)-adenine, a classical inhibitor of ADA1, promoted a significant inhibition on the enzyme activity in both cellular fractions. These findings suggest that the existence of different ADA-related genes and their distinct expression patterns may contribute for the adenosine deamination activity in zebrafish.

As doenças infecciosas estão entre as principais causas de morte no mundo. Nas infecções bacterianas, os componentes das paredes destes organismos são descritos como os principais antígenos. Os macrófagos estão diretamente envolvidos no reconhecimento e ataque de agentes patogênicos, além de atuarem como moduladores da resposta imunológica. Os macrófagos participam do combate às infecções bacterianas através da fagocitose dos agentes patogênicos e da produção de diversos mediadores inflamatórios como citocinas, metaloproteinases (MMP), espécies reativas de oxigênio (ROS) e óxido nítrico(NO). Estes mediadores são importantes na resposta inflamatória, contribuindo para o controle da infecção. Entretanto, a produção exacerbada destas moléculas contribui na patogênese das complicações associadas à inflamação, como a sepse e a falência múltipla de órgão. A maior parte dos estudos tem focado a resposta das células imunes a infecções por bactérias gram-negativas ou ao seu principal antígeno, o lipopolisacarídeo (LPS). No entanto, as infecções por bactérias gram-positivas são freqüentes e resultam em grande taxa de mortalidade. As doenças infecciosas estão entre as principais causas de morte no mundo. Nas infecções bacterianas, os componentes das paredes destes organismos são descritos como os principais antígenos. Os macrófagos estão diretamente envolvidos no reconhecimento e ataque de agentes patogênicos, além de atuarem como moduladores da resposta imunológica. Os macrófagos participam do combate às infecções bacterianas através da fagocitose dos agentes patogênicos e da produção de diversos mediadores inflamatórios como citocinas, metaloproteinases (MMP), espécies reativas de oxigênio (ROS) e óxido nítrico(NO). Estes mediadores são importantes na resposta inflamatória, contribuindo para o controle da infecção. Entretanto, a produção exacerbada destas moléculas contribui na patogênese das complicações associadas à inflamação, como a sepse e a falência múltipla de órgão. A maior parte dos estudos tem focado a resposta das células imunes a infecções por bactérias gram-negativas ou ao seu principal antígeno, o lipopolisacarídeo (LPS). No entanto, as infecções por bactérias gram-positivas são freqüentes e resultam em grande taxa de mortalidade. Os receptores de adenosina, em macrófagos, possuem função antiinflamatória em modelos de infecções por bactérias gram-negativas, no entanto, pouco se investigou a ação destes receptores em infecções por bactérias gram-positivas. O diabetes é uma doença metabólica comum que apresenta diversas complicações secundárias, muitas delas associadas aos níveis elevados de glicose. Os pacientes diabéticos apresentam uma ocorrência aumentada de infecções bacterianas, além de o diabetes tipo 2 estar associado com uma inflamação crônica, caracterizada por níveis plasmáticos aumentados de citocinas pró-inflamatórias. Adicionalmente, estes pacientes possuem maior risco de desenvolver doenças cardiovasculares e aterosclerose, o que tem sido relacionado à hiperglicemia e à inflamação crônica. A regulação, pela glicose, da resposta inflamatória em macrófagos expostos a bactérias gram-negativas ou ao seu antígeno principal, o LPS, é descrita, entretanto, a ação da glicose em modelos de infecções por bactérias gram-positivas não é conhecida. O tratamento dos macrófagos RAW 264.7 com concentrações elevadas de glicose aumentaram a resposta inflamatória ao LTA, com o aumento da produção de NO, TNF-a e MMP-9. Estes resultados mostram que tanto os receptores de adenosina como concentrações elevadas de glicose modulam a resposta inflamatória a S. aureus. Os receptores de adenosina parecem atuar num mecanismo autócrino de modulação da resposta inflamatória, apontando um possível alvo terapêutico. Já a modulação da resposta inflamatória dos macrófagos por concentrações aumentadas de glicose pode contribuir para complicações associadas ao diabetes, como a aterosclerose e a inflamação crônica. / Infectious diseases are among the majors causes of mortality around the world. In bacterial infections, the bacterial cell wall components are described as the main antigens. The macrophages are key mediators of inflammatory response, acting in the attack to the pathogens and in the regulation of immune response. These cells act in the phagocytosis of pathogenic agents and in the production of inflammatory mediators, like cytokines, matrix-metalloproteinases (MMP), reactive oxygen species (ROS) and nitric oxide (NO). These mediators participate of inflammatory response, acting in infection control, notwithstanding, exacerbated production of these molecules could contribute to inflammatory complications, like sepsis and multiple organ failure. Several studies has addressed the inflammatory response to gram-negative bacterial infections or lipopolysaccharide (LPS), the main antigen of these microorganisms, however grampositive bacterial infections are prevalent and associated to high mortality. The adenosine receptors are described to possess anti-inflammatory properties in macrophages in gram-negative bacterial infections models but the role of these receptors in gram-positive bacterial infections is unknown. Diabetes is a prevalent metabolic disorder which presents several associated complications; much of them associated to increased glucose levels. Diabetic patients shown increased occurrence of bacterial infections and type 2 diabetes is associated to a chronic inflammatory state, with increased circulatory levels of pro-inflammatory cytokines. Type 2 diabetic patients possess increased risk of cardiovascular diseases and atherogenesis, which has been associated to hyperglycemia and chronic inflammation. The regulation of macrophages inflammatory response to gram-negative bacterial infections or to its antigen LPS by increased levels of glucose is described, however, the role of increased glucose in gram-positive bacterial infections is unknown. For this reasons, we studied the role of adenosine receptors and increased glucose in macrophages activation by Staphylococcus aureus antigens, considering that this bacteria is the major organism in hospital infections. The treatment of RAW 264.7 macrophages with S. aureus antigens lipoteichoic acid (LTA) and peptidoglycan (PEG) resulted in the production of proinflammatory mediators. Diabetes is a prevalent metabolic disorder which presents several associated complications; much of them associated to increased glucose levels. Diabetic patients shown increased occurrence of bacterial infections and type 2 diabetes is associated to a chronic inflammatory state, with increased circulatory levels of pro-inflammatory cytokines. Type 2 diabetic patients possess increased risk of cardiovascular diseases and atherogenesis, which has been associated to hyperglycemia and chronic inflammation. The regulation of macrophages inflammatory response to gram-negative bacterial infections or to its antigen LPS by increased levels of glucose is described, however, the role of increased glucose in gram-positive bacterial infections is unknown. For this reasons, we studied the role of adenosine receptors and increased glucose in macrophages activation by Staphylococcus aureus antigens, considering that this bacteria is the major organism in hospital infections. The treatment of RAW 264.7 macrophages with S. aureus antigens lipoteichoic acid (LTA) and peptidoglycan (PEG) resulted in the production of proinflammatory mediators.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Neurociências, Florianópolis, 2014. / Made available in DSpace on 2015-02-05T20:18:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 327701.pdf: 5636430 bytes, checksum: f6b32fbdb2d828adaa67c1e5abbc2f65 (MD5) Previous issue date: 2014 / O pré-condicionamento cerebral é caracterizado por um estado de tolerância transitória do tecido nervoso a um estímulo letal e/ou tóxico evocado por um dano moderado prévio. Estudos têm demonstrado que este estado de tolerância cerebral pode ser obtido através do pré-condicionamento químico com N-metil-D-aspartato (NMDA), o agonista sintético seletivo dos receptores NMDA e pode ser promovido in vivo pela administração de dose subtóxica deste agente. Contudo, as vias de sinalização e receptores ou canais iônicos associados ao processo de neuroproteção ativado pelo pré-condicionamento químico ainda precisam ser elucidados. Desta forma, investigou-se o envolvimento dos receptores de adenosina (A1R e A2AR) e as vias de sinalização celular no mecanismo de neuroproteção pelo pré-condicionamento com NMDA in vivo (em camundongos) e in vitro (em cultura primária de neurônios e em fatias hipocampais). Os resultados demonstraram que o pré-condicionamento com NMDA aumenta a afinidade de união do A1R ao ligante, sem alterar seus níveis proteicos no hipocampo de camundongos. Além disso, a ativação do A1R reverte o efeito antinociceptivo mediado pelo pré-condicionamento com NMDA, sugerindo que a pós-ativação do A1R pode interferir com o pré-condicionamento. Ainda o pré-condicionamento com NMDA não altera a funcionalidade do A1R no teste do condicionamento ao medo contextual em camundongos, mas parece promover uma dessensibilização de A2AR. E a ativação de ambos A1R e A2AR reverte o aumento da captação de glutamato em fatias de hipocampo, mediado pelo pré-condicionamento com NMDA. Em relação às vias de sinalização celular analisadas, observou-se o pré-condicionamento com NMDA depende da via da PI3K para a proteção contra as convulsões induzidas por ácido quinolínico (AQ) em camundongos, embora a inibição desta via não parece estar diretamente relacionada com a proteção contra a morte celular. Em estudos in vitro, o pré-condicionamento com NMDA também foi eficaz na proteção contra o dano induzido por AQ em cultura primária de neurônios hipocampais e em fatias hipocampais de camundongos contra o dano induzido por glutamato. Os mecanismos envolvidos na neuroproteção pelo pré-condicionamento em fatias, envolve a participação de A1R e parcialmente dos canais de potássio ativados por cálcio (BKCa). Além disso, o pré-condicionamento com NMDA é mais eficaz com a ativação de receptores que usam a glicina como co-agonista preferencial. Desta forma, este trabalho contribui para demonstrar alguns mecanismos celulares evocados por uma possível estratégia neuroprotetora, o pré-condicionamento químico.<br> / Abstract : Brain preconditioning is characterized by a state of transient tolerance in the nervous tissue to a lethal and/or toxic stimulus evoked by prior moderate damage. Studies have demonstrated that this state of brain tolerance can be obtained by chemical preconditioning with N-methyl-D-aspartate (NMDA), the synthetic selective agonist of NMDA receptors, and can be promoted by in vivo administration of subtoxic doses of this agent. However, the signaling pathways and receptors or ion channels associated with the neuroprotection process activated by chemical preconditioning remain to be elucidated. Thus, we investigated the involvement of adenosine receptors (A1R and A2AR) and cell signaling pathways in the mechanism of neuroprotection evoked by NMDA preconditioning in vivo (in mice) and in vitro (in primary cultured neurons and hippocampal slices). NMDA preconditioning increases binding affinity of the A1R to ligand, without changing its protein levels in hippocampus of mice. Furthermore, activation of A1R reverses the antinociceptive effect mediated by NMDA preconditioning, suggesting that post-activation of A1R can interfere with preconditioning. NMDA preconditioning does not alter the functionality of A1R in contextual fear conditioning test in mice, although it seems to promote a desensitization of A2AR response. The activation of both A1R and A2AR reversed the increase in glutamate uptake into hippocampal slices mediated by NMDA preconditioning. Regarding the signaling pathways analyzed, we observed that NMDA preconditioning is dependent on PI3K pathway for protection against quinolinic acid (QA)-induced seizures in mice, although inhibition of this signaling pathway is not directly related to protection against cell damage. In in vitro studies, NMDA preconditioning was also effective in protecting against QA-induced damage in primary cultured hippocampal neurons and against glutamate-induced damage in mice hippocampal slices. The mechanisms of neuroprotection exerted by preconditioning in slices, involve the participation of A1R and partially the calcium-activated potassium channels (BKCa). Moreover, NMDA preconditioning is more effective when glycine is used as the preferential co-agonist of NMDA receptor. Therefore, this study contributes to demonstrate cellular mechanisms evoked by a putative neuroprotective strategy, the chemical preconditioning.

CARMO, Marta Regina Santos do. Efeito neuroprotetor do antagonismo do receptor P2X7 no Parkinsonismo experimental induzido por 6-OHDA. 2015. 110 f. Tese (Doutorado em Farmacologia) - Faculdade de Medicina, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2015. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2015-04-17T13:13:51Z No. of bitstreams: 1 2015_tese_mrscarmo.pdf: 2518438 bytes, checksum: 237c71b94e431515b74c222c224d8c8e (MD5) / Approved for entry into archive by denise santos(denise.santos@ufc.br) on 2015-04-17T13:14:18Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015_tese_mrscarmo.pdf: 2518438 bytes, checksum: 237c71b94e431515b74c222c224d8c8e (MD5) / Made available in DSpace on 2015-04-17T13:14:18Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015_tese_mrscarmo.pdf: 2518438 bytes, checksum: 237c71b94e431515b74c222c224d8c8e (MD5) Previous issue date: 2015 / Parkinson’s disease (PD) is characterized by a progressive degeneration of dopaminergic neurons in the substantia nigra (SN) and a concomitant decrease of dopamine (DA) in the striatum, which can be modeled by 6-OHDA administration. Since ATP released from damaged cells can exert noxious effects on neurons, acting through its P2X7 receptors (P2X7R), the aim of the present study was to investigate the effects of a P2X7R antagonist, Brilliant Blue G (BBG) on 6-OHDA-induced neurotoxicity. Male Wistar rats received stereotaxic injections of 6-OHDA (18 µg/3µl) into the right striatum and were treated with BBG (45 mg/kg, i.p. 48/48 h) for two weeks. In an additional experiment, animals were treated with the selective antagonist A-438079 (10 µM i.c.v.) for two weeks. BBG decreased the number of contralateral rotations in the apomorphine test, an effect mimicked by the selective P2X7R antagonist A438079. BBG has also improved the animals’ performance in the passive avoidance test (short-term memory) and in the cued version of the Morris Water maze. The antagonism of P2X7R by BBG has also prevented the reduction of dopamine content in the striatum and SN as well as the loss of dopaminergic neurons, and microgliosis and astrogliosis in the striatum. BBG treatment also decreased the IL-1β levels in striatum, despite the observed effect not being statistically significant. To grasp the mechanism of action of BBG, we used in vitro models exploring synaptotoxicity (striatal synaptosomes) and neurotoxicity (dopamine-differentiated SH-SY5Y cells). Besides showing that P2X7R are present in striatal dopaminergic terminals, we observed that BBG 100 nM prevented the 6-OHDA-induced synaptosomal dysfunction. Furthermore, we have shown the presence of P2X7 receptors in SH-SY5Y cells, their co-localization with tyrosine hydroxilase, and that BBG attenuates the cell damage, evaluated through lactate dehydrogenase release. The present results suggests that P2X7R contribute to PD pathogenesis through a triple impact on synaptotoxicity, gliosis and neurotoxicity, highlighting the therapeutic potential of P2X7R antagonists in the disease. / A doença de Parkinson (DP) é caracterizada por uma degeneração progressiva dos neurônios da substância negra (SN) e uma concomitante diminuição do conteúdo de dopamina no estriado, que pode ser mimetizada pela administração de 6-OHDA. Visto que o ATP liberado das células danificadas exerce efeitos deletérios diretos sobre os neurônios, agindo através de receptores P2X7, o objetivo do presente trabalho foi estudar os efeitos do Brilliant Blue G (BBG), um antagonista dos receptores P2X7, sobre a neurotoxicidade induzida por 6-OHDA. Ratos Wistar machos receberam injeções estereotáxicas de 6-OHDA (18 µg/3µl) no estriado direito e foram tratados com BBG (45 mg/kg, i.p. 48/48hs) durante 14 dias. Em uma série adicional de experimentos, os animais receberam o antagonista seletivo A-438079 (10 µM i.c.v.) por 14 dias. O tratamento com BBG diminuiu o número de rotações contralaterais no teste da apomorfina, efeito que foi mimetizado pelo antagonista seletivo A-438079. O BBG também melhorou o desempenho dos animais no teste da esquiva passiva (memória de curta duração), assim como na versão com plataforma sinalizada do labirinto aquático. O antagonismo dos receptores P2X7 pelo BBG preveniu ainda a redução do conteúdo de dopamina no estriado e SN, assim como a perda de neurônios dopaminérgicos, a microgliose e astrogliose no estriado. O tratamento com BBG também diminuiu os níveis de IL-1β no estriado, apesar das diferenças observadas entre os grupos não serem estatisticamente diferentes. Com o objetivo de entender melhor o mecanismo de ação do BBG, foram utilizados modelos in vitro explorando a sinaptotoxicidade (sinaptossomas estriatais) e neurotoxicidade (células SH-SY5Y dopaminérgicas diferenciadas). Além da demonstração da presença dos receptores P2X7 nos terminais nervosos estriatais, foi observado que o BBG 100 nM preveniu a disfunção sinaptossomal. Também demonstramos a presença dos receptores P2X7 nas células SH-SY5Y, assim como sua co-localização com tirosina hidroxilase, onde o pré-tratamento com BBG 100 nM diminuiu o dano celular, avaliado através da liberação de lactato desidrogenase. Os resultados obtidos no presente estudo sugerem que os receptores P2X7 contribuem para a patogênese da DP através de um triplo mecanismo sobre a sinaptotoxicidade, gliose e neurotoxicidade, ressaltando o potencial terapêutico dos antagonistas desses receptores na doença.