Glioblastoma multiforme é o tumor maligno mais comum do sistema nervoso central em adultos e a sobrevida média é de apenas 12 a 15 meses após o diagnóstico. Por isso, é extremamente importante desenvolver tratamentos mais eficazes e específicos contra essa neoplasia. A presença do sistema imune, incluindo macrófagos associados ao tumor, promove a proliferação tumoral e está associada com um pior prognóstico em pacientes com essa doença maligna. A sinalização purinérgica e o receptor purinérgico P2X7, um canal iônico, têm sido implicados na progressão de diferentes tipos de tumores tanto in vitro como in vivo. A ciclooxigenase 2 (COX-2) desempenha um papel importante na regulação da proliferação celular, diferenciação e na tumorigênese. O ácido ursólico é um triterpeno pentacíclico encontrado em uma variedade de plantas e exibe diversas atividades biológicas e farmacológicas. O objetivo dessa tese é verificar a participação do sistema purinérgico, sistema imune e COX-2 no desenvolvimento e progressão do glioblastoma multiforme, e também investigar os efeitos citotóxicos do ácido ursólico. Primeiramente, verificamos que macrófagos expostos ao meio condicionado de glioma (GL-CM) foram modulados para um fenótipo do tipo M2 e houve um aumento da liberação de IL-10, IL-6 e MCP-1. Esses efeitos foram diminuídos na presença de antagonistas dos receptores P2X7 e A2A. Portanto, os resultados apresentados contribuem para o melhor entendimento da interação entre inflamação e câncer e demonstram que os receptores purinérgicos são importantes para a progressão do glioma. Após, analisamos o papel do receptor P2X7 na proliferação de células de glioma. Surpreendentemente, in vitro, não se observou nenhuma diferença no crescimento das células quando houve a transfecção com o P2X7. Entretanto, in vivo, essas células geraram tumores maiores quando comparado com o controle. Os nossos resultados demonstram que, como em outros tipos de cânceres, o P2X7 tem um papel importante no desenvolvimento e progressão tumoral. Uma vez verificado o importante papel do receptor P2X7 nos macrófagos associados ao tumor e nas células de glioma, investigamos se esse receptor poderia interagir com a enzima COX-2 em células de glioma. Porém, não houve diferença na expressão do P2X7 ou da COX-2 tanto in vitro como in vivo. E também não houve nenhum efeito adicional entre o antagonista de P2X7 e o inibidor seletivo de COX-2. Esse trabalho fornece evidências de que não há relação entre o P2X7 e COX-2 em células de glioma. Em conclusão, todos esses resultados reforçam a hipótese do envolvimento da sinalização purinérgica na progressão do glioblastoma multiforme e tornam o P2X7 como um interessante alvo terapêutico. Finalmente, também investigamos a possível atividade anticâncer do ácido ursólico contra as células de glioma. Essa molécula foi capaz de diminuir o número de células e induziu parada no ciclo celular. In vivo, o ácido ursólico reduziu ligeiramente o tamanho do tumor, mas não alterou as características malignas. Em conclusão, o ácido ursólico pode ser um potencial candidato como adjuvante para o tratamento do glioblastoma multiforme. Em conjunto, todos os resultados apresentados nessa tese indicam possíveis novas abordagens terapêuticas no tratamento e novos conhecimentos em relação a esse maligno câncer cerebral. / Glioblastoma multiforme is the most common malignant tumor of central nervous system in adults and the median survival is only 12 to 15 months after diagnosis. Therefore, it is extremely important to develop more effective and specific treatments. The presence of an inflammatory environment, including tumor-associated macrophages, promotes tumor proliferation and is associated with a poor prognosis in patients with this malignancy. Disruption of purinergic signaling has also been implicated in cancer progression. P2X7R is an ion channel receptor, whose participation in tumor progression has been demonstrated in in vitro and in vivo studies. Cyclooxygenase 2 (COX-2) plays an important role in regulating cell proliferation, differentiation, and tumorigenesis. Ursolic acid is a pentacyclic triterpenoid found in a variety of plants that exhibits several biological and pharmacological activities. The aim of this study is to verify the participation of the purinergic system, immune system and COX-2 in the glioblastoma multiforme development and progression, and also to investigate the anti-proliferative effects of ursolic acid. We first verified that macrophages exposed to glioma conditioned medium (GL-CM) were modulated to an M2-like phenotype and there was an increased IL-10, IL-6 and MCP-1 secretion and these effects were diminished by P2X7 and A2A receptors antagonists. Therefore, the results presented contribute to advancing in the field of cancer-related inflammation and point specific purinergic receptors as targets for glioma progression. After that, we analyzed the role of P2X7 receptor in glioma cell proliferation. Surprisingly, in vitro, no difference in cell growth was observed when the cells were transfected with P2X7R but in vivo these cells generated larger tumors when compared to the control. Our data demonstrate that, as in other type of cancers, P2X7R has an important role in sustaining the development of glioma. Once verified the important role of P2X7 receptor in tumorassociated macrophages and glioma cells, we verified whether this receptor could interact with the COX-2 enzyme in glioma cells. No differences in mRNA expression of P2X7R or COX-2 were verified both in vitro and in vivo experiments. And any additional effect with selective P2X7R antagonist and COX-2 inhibitor were observed in in vitro and in vivo experiments. This work provides evidence that there is no relationship between the P2X7R and COX-2 in glioma. In conclusion, all these results reinforce the hypothesis of purinergic signaling involvement in glioma progression and point to P2X7R as an interesting target for glioma treatment. Finally, we also investigated the potential anticancer activity of ursolic acid against to glioma cells. Ursolic acid decreased the cell number and induced an arrest in the cell cycle in glioma cells. In vivo, ursolic acid slightly reduced the glioma tumor size but did not alter the malignant features. In conclusion, the ursolic acid may be a potential candidate as adjuvant for glioblastoma therapy. Taken together, the results presented herein indicate new adjuvant treatment approaches and new knowledge regarding to this deadliest brain tumor.

O peixe-zebra (Danio rerio) é um pequeno teleósteo pertencente à família Cyprinidae, o qual vem sendo estudado em diferentes áreas científicas. Essa espécie apresenta genes evolutivamente conservados, diversos sistemas de neurotransmissão já caracterizados e um amplo repertório comportamental , os quais podem ser modulados por diversas drogas. Portanto, a presente tese tem por objetivo estudar parâmetros bioquímicos em peixe-zebra com ênfase nos sistemas de sinalização purinérgico e colinérgico, bem como avaliar o comportamento de animais submetidos à tarefa do open tank e investigar os efeitos promovidos pelo tratamento com taurina no modelo de exposição aguda ao etanol. Nós demonstramos que o tratamento agudo (1h) com taurina nas concentrações de 150 e 400 mg/L aumentou a hidrólise de AMP e levou a uma diminuição significativa na desaminação de adenosina em membranas cerebrais, sendo que o último efeito também foi observado nos ensaios in vitro. Entretanto, não foram observados efeitos sobre a hidrólise dos nucleotídeos tri e difosfatados, promovida pelas NTPDases. Estudos relacionados à hidrólise dos nucleotídeos ATP e ADP em cérebro, fígado e coração de peixe-zebra demonstraram um perfil diferencial nos respectivos tecidos. O efeito distinto promovido por inibidores apontou que diferentes membros das NTPDases poderiam estar contribuindo para a atividade enzimática detectada, o que foi sugerido por estudos de bioinformática e ensaios de expressão gênica. Além disso, verificamos que, no modelo de exposição aguda ao etanol, a taurina foi capaz de prevenir as alterações promovidas pelo álcool sobre a atividade da AChE e das defesas antioxidantes enzimáticas. Contudo, o pré-tratamento com taurina demonstrou ser mais efetivo na prevenção do estresse oxidativo, visto que, diferentemente do co-tratamento, aumentou o conteúdo total de tióis reduzidos cerebral e diminuiu o dano lipídico. A fim de caracterizar o repertório comportamental espaço-temporal dos animais no teste do open tank, nós elaboramos um protocolo que avaliava o efeito do confinamento prévio a estímulos naturalísticos (ambientes claro, escuro e transparente). Os resultados demonstraram que os peixes previamente confinados em um ambiente naturalmente aversivo (claro) apresentaram uma habituação intrasessão mais rápida em comparação aos grupos escuro e transparente, avaliada pelas transições e tempo de permanência na região superior do aparato. O perfil exploratório espaço-temporal foi analisado através de plots representativos, sendo proposto um etograma descritivo para a tarefa do open tank. A partir do repertório comportamental determinado, o efeito promovido pelo pré-tratamento com taurina nas alterações comportamentais induzidas pelo etanol foi investigado. Nossos achados demonstraram que o etanol diminuiu a atividade locomotora dos animais, sendo que as concentrações de taurina testadas (42, 150 e 400 mg/L) preveniram essa modificação. Contudo, o pré-tratamento com 150 mg/L de taurina não preveniu as alterações na exploração da área superior do aparato, sugerindo que diferentes mecanismos poderiam estar envolvidos na resposta comportamental observada. Em suma, nossos resultados possibilitam uma maior compreensão das respostas neuroquímicas e comportamentais em peixe-zebra, contribuindo para novas estratégias relacionadas a estudos translacionais. / The zebrafish (Danio rerio) is a small teleost fish that belongs to the Cyprinidae family, which has been studied in different scientific areas. This species has evolutively conserved genes, several neurotransmitter systems characterized, and a wide behavioral repertoire, which may be modulated by distinct drugs. Thus, this thesis aims to study biochemical parameters in zebrafish, emphasizing the purinergic and cholinergic signaling, as well as to evaluate the behavior of animals in the open tank task and to investigate the effects of taurine treatment in the acute ethanol exposure model. We showed that acute taurine treatment (1h) at 150 and 400 mg/L increased the AMP hydrolysis and significantly decreased the adenosine deamination in brain membranes. The latter effect was also observed in the enzyme assays performed in vitro. However, the tri and diphosphonucleoside hydrolysis promoted by NTPDases was unaffected by taurine. Studies related to ATP and ADP hydrolysis in zebrafish brain, liver, and heart demonstrated a differential profile in the respective tissues. The distinct effect promoted by inhibitors pointed that different NTPDase members could play a role in the enzyme activity detected, as suggested by bioinformatic analysis and gene expression assays. Moreover, we observed that, in the acute ethanol exposure model, taurine prevents the alterations induced by ethanol in AChE and in enzymatic antioxidant defenses activities. However, taurine pretreatment has shown to be more effective in the prevention of oxidative stress, considering that, differently from the cotreatment, it increased the total reduced thiol content and decreased lipid peroxidation in zebrafish brain. To characterize the spatio-temporal behavioral repertoire of animals subjected to the open tank task, we described a protocol which evaluated the effect promoted by the previous confinement using natural stimuli (bright, dark, and transparent environments). The results showed that fish previously confined into an aversive environment (brightly one) presented a faster intra-session habituation response when compared to dark and transparent groups, evaluated by transitions and time spent in the top area of the tank. The spatio-temporal exploratory profile was assessed by representative plots with the proposal of a descriptive ethogram to the behavioral task. Considering these behaviors, the effect promoted by taurine pretreatment on the behavioral changes induced by ethanol was investigated. Our findings demonstrated that ethanol significantly decreased the locomotor activity and that the taurine concentrations tested (42, 150, and 400 mg/L) prevented this modification. Nevertheless, the pretreatment with 150 mg/L taurine did not prevent the alterations on the exploratory profile for the top area of apparatus, suggesting that different mechanisms could be involved in the behavioral response observed. In conclusion, our data help to a better understanding of the neurochemical and behavioral responses in zebrafish, contributing for new strategies related to translational studies.

O peixe-zebra (Danio rerio) é um pequeno teleósteo pertencente à família Cyprinidae, o qual vem sendo estudado em diferentes áreas científicas. Essa espécie apresenta genes evolutivamente conservados, diversos sistemas de neurotransmissão já caracterizados e um amplo repertório comportamental , os quais podem ser modulados por diversas drogas. Portanto, a presente tese tem por objetivo estudar parâmetros bioquímicos em peixe-zebra com ênfase nos sistemas de sinalização purinérgico e colinérgico, bem como avaliar o comportamento de animais submetidos à tarefa do open tank e investigar os efeitos promovidos pelo tratamento com taurina no modelo de exposição aguda ao etanol. Nós demonstramos que o tratamento agudo (1h) com taurina nas concentrações de 150 e 400 mg/L aumentou a hidrólise de AMP e levou a uma diminuição significativa na desaminação de adenosina em membranas cerebrais, sendo que o último efeito também foi observado nos ensaios in vitro. Entretanto, não foram observados efeitos sobre a hidrólise dos nucleotídeos tri e difosfatados, promovida pelas NTPDases. Estudos relacionados à hidrólise dos nucleotídeos ATP e ADP em cérebro, fígado e coração de peixe-zebra demonstraram um perfil diferencial nos respectivos tecidos. O efeito distinto promovido por inibidores apontou que diferentes membros das NTPDases poderiam estar contribuindo para a atividade enzimática detectada, o que foi sugerido por estudos de bioinformática e ensaios de expressão gênica. Além disso, verificamos que, no modelo de exposição aguda ao etanol, a taurina foi capaz de prevenir as alterações promovidas pelo álcool sobre a atividade da AChE e das defesas antioxidantes enzimáticas. Contudo, o pré-tratamento com taurina demonstrou ser mais efetivo na prevenção do estresse oxidativo, visto que, diferentemente do co-tratamento, aumentou o conteúdo total de tióis reduzidos cerebral e diminuiu o dano lipídico. A fim de caracterizar o repertório comportamental espaço-temporal dos animais no teste do open tank, nós elaboramos um protocolo que avaliava o efeito do confinamento prévio a estímulos naturalísticos (ambientes claro, escuro e transparente). Os resultados demonstraram que os peixes previamente confinados em um ambiente naturalmente aversivo (claro) apresentaram uma habituação intrasessão mais rápida em comparação aos grupos escuro e transparente, avaliada pelas transições e tempo de permanência na região superior do aparato. O perfil exploratório espaço-temporal foi analisado através de plots representativos, sendo proposto um etograma descritivo para a tarefa do open tank. A partir do repertório comportamental determinado, o efeito promovido pelo pré-tratamento com taurina nas alterações comportamentais induzidas pelo etanol foi investigado. Nossos achados demonstraram que o etanol diminuiu a atividade locomotora dos animais, sendo que as concentrações de taurina testadas (42, 150 e 400 mg/L) preveniram essa modificação. Contudo, o pré-tratamento com 150 mg/L de taurina não preveniu as alterações na exploração da área superior do aparato, sugerindo que diferentes mecanismos poderiam estar envolvidos na resposta comportamental observada. Em suma, nossos resultados possibilitam uma maior compreensão das respostas neuroquímicas e comportamentais em peixe-zebra, contribuindo para novas estratégias relacionadas a estudos translacionais. / The zebrafish (Danio rerio) is a small teleost fish that belongs to the Cyprinidae family, which has been studied in different scientific areas. This species has evolutively conserved genes, several neurotransmitter systems characterized, and a wide behavioral repertoire, which may be modulated by distinct drugs. Thus, this thesis aims to study biochemical parameters in zebrafish, emphasizing the purinergic and cholinergic signaling, as well as to evaluate the behavior of animals in the open tank task and to investigate the effects of taurine treatment in the acute ethanol exposure model. We showed that acute taurine treatment (1h) at 150 and 400 mg/L increased the AMP hydrolysis and significantly decreased the adenosine deamination in brain membranes. The latter effect was also observed in the enzyme assays performed in vitro. However, the tri and diphosphonucleoside hydrolysis promoted by NTPDases was unaffected by taurine. Studies related to ATP and ADP hydrolysis in zebrafish brain, liver, and heart demonstrated a differential profile in the respective tissues. The distinct effect promoted by inhibitors pointed that different NTPDase members could play a role in the enzyme activity detected, as suggested by bioinformatic analysis and gene expression assays. Moreover, we observed that, in the acute ethanol exposure model, taurine prevents the alterations induced by ethanol in AChE and in enzymatic antioxidant defenses activities. However, taurine pretreatment has shown to be more effective in the prevention of oxidative stress, considering that, differently from the cotreatment, it increased the total reduced thiol content and decreased lipid peroxidation in zebrafish brain. To characterize the spatio-temporal behavioral repertoire of animals subjected to the open tank task, we described a protocol which evaluated the effect promoted by the previous confinement using natural stimuli (bright, dark, and transparent environments). The results showed that fish previously confined into an aversive environment (brightly one) presented a faster intra-session habituation response when compared to dark and transparent groups, evaluated by transitions and time spent in the top area of the tank. The spatio-temporal exploratory profile was assessed by representative plots with the proposal of a descriptive ethogram to the behavioral task. Considering these behaviors, the effect promoted by taurine pretreatment on the behavioral changes induced by ethanol was investigated. Our findings demonstrated that ethanol significantly decreased the locomotor activity and that the taurine concentrations tested (42, 150, and 400 mg/L) prevented this modification. Nevertheless, the pretreatment with 150 mg/L taurine did not prevent the alterations on the exploratory profile for the top area of apparatus, suggesting that different mechanisms could be involved in the behavioral response observed. In conclusion, our data help to a better understanding of the neurochemical and behavioral responses in zebrafish, contributing for new strategies related to translational studies.

Vários estudos têm apontado a sinalização e os receptores purinérgicos, representados em mamíferos pelos receptores ionotrópicos (P2X1 P2X7) e metabotrópicos (P2Y1,2,4,6, 11,12,14), como um sistema primitivo, envolvido não somente na sinalização neuronal, mas também em muitos outros processos vitais incluindo resposta imune, inflamação, dor, agregação plaquetária e nos processos de diferenciação, proliferação e morte celular, que ocorrem no desenvolvimento e na regeneração tecidual. Condizente com as descrições da literatura, dados do nosso laboratório, baseados na farmacologia dos receptores purinérgicos, sugeriram o envolvimento do subtipo P2Y2 na proliferação e na neurogênese in vitro de células de carcinoma embrionário P19. Tendo em vista a ausência de agonistas e antagonistas específicos para a maioria dos subtipos de receptores purinérgicos, o que vem dificultando a elucidação das funções exatas desses receptores em processos fisiológicos e patológicos, optamos para o screening de uma biblioteca combinatória de oligonucleotídeos para a identificação de ligantes de alta afinidade e especificidade para o receptor P2Y2 (procedimento de SELEX, Evolução Sistemática de Ligantes por Enriquecimento Exponencial). Essa abordagem envolve passos reiterativos de seleção in vitro de moléculas de RNA, estabilizadas por substituição do grupo 2´OH das pirimidinas por um átomo de flúor, que possuem afinidade pelo receptor, até que a mistura de RNAs, originalmente de 1013 diferentes seqüências que adotam uma gama de estruturas secundárias e terciárias, esteja purificada para uma população homogênea de ligantes de alta afinidade pelo receptor P2Y2. O processo envolve a transcrição in vitro da biblioteca de DNA para RNA, a apresentação desta ao alvo, a eluição dos ligantes específicos, denominados aptâmeros, e a regeneração da biblioteca de DNA por RT-PCR, a qual, após uma reação de transcrição in vitro, gera a mistura de RNAs para o próximo ciclo de seleção. Neste trabalho, nós utilizamos como alvo o receptor P2Y2 recombinante humano expresso na linhagem de células de astroglioma humano 1321N1. Ao final de nove ciclos de SELEX, nós isolamos 46 sequências que foram agrupadas em três classes estruturais, de acordo com a presença de regiões consensos. A mistura destas moléculas se ligou ao receptor P2Y2 humano com uma constante de dissociação de 164 nM. Um dos clones isolados, o aptâmero B7, se ligou preferencialmente ao receptor P2Y2 (Kd 184 nM), em relação aos receptores P2Y1 e P2Y4 recombinantes expressos em células 1321N1. A interação deste aptâmero não foi dependente da espécie, uma vez que ele foi capaz de se ligar tanto ao receptor P2Y2 de origem humana como murina. A atividade biológica do aptâmero foi avaliada em células P19 (sabidamente expressando receptores P2Y2 endógenos), na qual a proteção do ATP contra a apoptose, provavelmente interagindo com o receptor P2Y2, foi anulada na presença deste aptâmero em uma concentração mil vezes menor do que a do ATP. Além de confirmar a viabilidade da técnica SELEX para identificar ligantes subtipos-específicos dos receptores purinérgicos, o aptâmero anti-P2Y2 serve como ferramenta fundamental para definir demais funções fisiológicas deste receptor. Passos de otimização das suas propriedades como ligante e biodisponibilidade tornarão este aptâmero um composto de alta relevância farmacêutica. / Many published studies have focused on purinergic signaling and receptors, represented by ionotropic (P2X1 P2X7) and metabotropic (P2Y1,2,4,6,11,12,14) subtypes as a universal system which is not only involved in neuronal signaling, but also in various other vital processes including immune response, inflammation, platelet aggregation as well as differentiation, proliferation and cell death occurring during development and tissue regeneration. In agreement with other published reports, results of our laboratory based on overlapping purinergic receptor pharmacology suggest the participation of the P2Y2 subtype in proliferation and in vitro neurogenesis of P19 embryonal carcinoma cells. In view of the lack of availability of specific agonists and antagonists for most purinergic receptors making the elucidation of exact functions of these receptors in their cellular context almost impossible, we used a combinatorial oligonucleotide library approach, denominated SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment) for the development of high-affinity and specificity ligands for the P2Y2 receptor. This approach is based on re-iterative steps of in vitro selection of 2´-fluoro-pyrimidine-modified RNA molecules for receptor-binding affinity from an RNA pool containing 1013 different sequences and secondary and tertiary structures until this pool is purified to a homogeneous population of ligands with high affinity to the P2Y2 receptor. The combinatorial DNA library is in vitro transcribed into RNA followed by target presentation of the RNA library and elution of the target-binders, denominated aptamers, and RT-PCR amplification in order to restore the DNA library used for in vitro transcription for next SELEX cycle. Following nine SELEX cycles using 1321N1 human astroglial cells expressing recombinant human P2Y2 receptors as target, we isolated 46 aptamer sequences which, based on consensus sequence motifs, were grouped in three structural groups. The mixture of the isolated sequences bound themselves to human P2Y2 receptors with a dissociation constant (Kd) of 164 nM. One of the isolated clones, the aptamer denominated B7, bound itself to P2Y2 receptors in preference to P2Y1 and P2Y4 recombinant receptors expressed in 1321N1 cells. The binding activity of the aptamer was not limited to P2Y2 receptors of human origin, as the aptamer also interacted with mouse P2Y2 receptors. The capability of the aptamer of affecting the biological activity of P2Y2 receptors was verified in P19 cells in which ATP-induced protection against apoptosis, mediated by P2Y2 receptors, was abolished in the presence of the aptamer. In addition to providing a proof of principle for the feasibility of developing purinergic subtype-specific ligands by using the SELEX technique, the anti-P2Y aptamer provides a fundamental tool for gaining insights of physiological functions of this receptor in various cellular contexts. Moreover, steps of optimization of receptor binding properties and aptamer half-life in vivo will turn this aptamer into a compound of high pharmaceutical relevance.

Receptores purinérgicos são expressos em neurônios e glia e, por certo, participam dos processos de sinalização entre estes células. Nos gânglios da raiz dorsal o soma dos neurônios sensoriais é envolto por uma camada de células satélites (CSt), que são células de glia, cuja função é desconhecida. Até o momento a natureza dos receptores purinérgicos presentes nas células satélites foi pouco investigada. No presente trabalho demonstra-se a presença dos receptores P2Y1, P2Y2 e/ou P2Y4 e P2Y6 nas CSt de gânglios da raiz dorsal de ratos recém-nascidos. A prova da existência dos receptores foi a elevação na concentração intracelular do Ca2+, induzida pela aplicação de um agonista dos receptores. Nas culturas de mais de 24 horas, estimuladas por soro bovino fetal, proliferam de forma notável células de glia de aspecto predominantemente fusiforme. Determinou-se que as células fusiformes expressam receptores P2Y1, P2Y2 e/ou P2Y4 e P2Y6. As informações obtidas contribuem para o esclarecimento da sinalização entre neurônios e glia nos gânglios sensoriais da raiz dorsal. / Purinergic receptors are expressed and play role in the sinalization between neurons and glia. In dorsal root ganglia the soma of the sensory neurons is surrounded by a layer of satellite glial cells, whose function is unclear. There are evidences that ATP is released by neurons to act on receptors in satellite cells. So far, the nature of the purinergic receptors of satellite cells was not fully investigated. This study shows the presence of metabotropics purinergic receptors P2Y1, P2Y2 and/or P2Y4, e P2Y6 in satellite cells from dorsal root ganglia of newborn rats. The demonstration was carried on following the transient increases in intracellular calcium concentration induced by a purinergic agonist. As time goes by, in the presence of fetal bovine serum, there is a remarkable proliferation of glial cells, with predominant fusiform shapes. The fusiform cells also express P2Y1, P2Y2 and/or P2Y4, e P2Y6 receptors. These informations add on the understanding of the complex phenomena of neuron-glia interaction.

Os receptores purinérgicos são divididos em receptores P1 e P2 de acordo com o seu agonista endógeno, os receptores metabotrópicos P1 são ativados por adenosina, enquanto os metabotrópicos P2Y e ionotrópicos P2X são estimulados através do ATP e outros nucleotídeos. Além de sua função bem estabelecida na neurotransmissão, a sinalização purinérgica tem despertado crescente interesse científico devido à sua importância nas funções no metabolismo celular, incluindo os processos de desenvolvimento embrionário e reparação de tecidos. Isso ocorre especialmente no sistema nervoso central, onde eles controlam a proliferação, diferenciação, apoptose e a liberação de fatores neurotróficos. Nesse trabalho nós focamos nas ações sinérgicas entre a sinalização purinérgica e o fator de crescimento de nervos (NGF), tendo em vista três formas conhecidas de interação entre o NGF e os receptores purinérgicos, a potencialização dos efeitos do NGF através de uma ligação cruzada entre as vias, a regulação da expressão dos receptores purinérgicos pelo NGF e regulação da liberação de NGF pela adenosina. Com o objetivo de investigar estes processos sinérgicos na regulação da proliferação, migração e determinação fenotípica, células precursoras neurais foram obtidas do telencéfalo de embriões de rato e cultivadas na forma de neuroesferas, sendo então submetidas a tratamentos com agonistas e antagonistas dos receptores purinérgicos, em associação com o NGF, ao longo da diferenciação. Os efeitos desses tratamentos foram analisados por citometria de fluxo. Nós mostramos que o NGF age sobre as células aumentando a proliferação, migração e população de células indiferenciadas e diminuindo a apoptose. A ativação dos receptores P1 levou à diminuição da gliogênese e ao aumento da proliferação e da migração. A estimulação de receptores P2 resultou em aumento da proliferação e redução da taxa de apoptose. Os receptores purinérgicos potenciaram a proliferação mediada por NGF, resultando assim num aumento da população de células indiferenciadas. Neste último efeito percebemos a participação do receptor P2Y2 na sinergia. Os resultados aqui apresentados revelam novos mecanismos para a interação entre o NGF e a sinalização purinérgica na biologia de células tronco neurais / Purinergic receptors are divided into P1 and P2 receptors according to agonist selectivity, G-protein- coupled P1 receptors are activated by adenosine, while metabotropic P2Y and ionotropic P2X subtypes are stimulated by ATP and other nucleotides. In addition to its well-established function in neurotransmission, purinergic signaling has raised increasing scientific interest due to its importance in essential cellular functions and metabolism including embryonic developmental processes and tissue repair, specially in the central nervous system, where they control proliferation, differentiation, apoptosis and the release of neurotrophic factors. Here we focus on synergistic actions between purinergic P1 and P2 receptor-mediated signaling and the nerve growth factor (NGF), in view of three recognized forms of interaction between NGF and purinergic signaling, the potencialization of NGF-mediated effects through a crosstalk, the regulation of purinergic receptor expression by NGF and the regulation of NGF release by adenosine. With the objective to investigate such synergistic processes in regulating proliferation, neural migration and phenotype determination, neurospheres obtained as proliferating neural stem and progenitor from rat embryonic telencephalon were subjected to treatments with purinergic receptor agonists and antagonists in association with NGF along differentiation. Effects of these treatments were analyzed by flow cytometry. We show that NGF acted on cells by increasing the population of undifferentiated cells, proliferation, migration and reducing apoptosis. P1 receptor activation led to decreased gliogenesis, increased proliferation and migration. Stimulation of P2 receptors resulted in increased proliferation and decreased apoptosis rates. Purinergic receptors potentiated NGF-mediated proliferation, thereby resulting in increased population of undifferentiated cells, in this latter effect, the P2Y2 receptor subtype participated in synergistic processes. The herein presented results reveal novel mechanisms for the interaction of NGF and purinergic signaling in neural stem cell biology

O Transtorno Bipolar é uma doença crônica e grave que apresenta curso episódico e alto impacto sobre a funcionalidade do paciente. Possui potencial para alto grau de severidade, recorrência e intensidade e estima-se que sua prevalência ao longo da vida seja de 2,4% da população mundial. A fisiopatologia deste transtorno ainda não é bem compreendida e ainda o fármaco de primeira escolha é o lítio, embora tampouco seja claro seu mecanismo de ação. O sistema purinérgico principalmente devido a suas ações sobre neuroproteção, inflamação e ativação microglial se destaca como uma via promissora de novos alvos terapêuticos, especialmente o receptor purinérgico P2X7 (P2X7R). Dessa maneira, o objetivo desta tese é caracterizar o envolvimento do sistema purinérgico na fisiopatologia do transtorno bipolar. De maneira geral, avaliamos metabólitos do sistema purinérgico em soro de pacientes e controles, correlacionando com dados clínicos. Avaliamos a frequência do polimorfismo do P2RX7 1513A>C em pacientes e controles. Realizamos um modelo animal farmacológico de mania e investigamos o envolvimento do P2X7R neste modelo e por último buscamos melhor compreender a ação neuroprotetora do lítio verificando a participação purinérgica. Nossos resultados primeiramente nos mostraram uma diminuição nos níveis de adenosina em pacientes em comparação a controles e uma importante correlação inversa entre os níveis de adenosina e a piora dos sintomas. Demonstramos ainda que pacientes com transtorno bipolar apresentam diminuição na frequência do alelo 1513C e o potencial aumento na frequência do genótipo 1513AA e 1513AA/AC em relação aos controles configurando um pior prognóstico de aumento da forma mais ativa do receptor. Também mostramos que o P2X7R possui um papel importante no estabelecimento do modelo de mania, modulando principalmente a via dopaminérgica que é refletida na mudança comportamental observada pelo modelo e por último, o lítio foi capaz de prevenir a resposta de insulto nas células neuronais (linhagem PC-12) e não foi capaz de prevenir a ativação mediada pelo P2X7R em células microgliais (linhagem N9), indicando uma resposta celular diferenciada. Podemos concluir que de maneira translacional conseguimos demonstrar a participação do sistema purinérgico na fisiopatologia do transtorno bipolar, sugerindo ainda um possível biomarcador tanto para diagnóstico como para progressão da doença, os níveis séricos de adenosina, e ainda um potencial biomarcador genético de predição e diagnóstico da doença, o polimorfismo do P2X7R 1513A>C, assim como contribuímos para o entendimento do mecanismo de ação do lítio e definimos um potencial novo alvo terapêutico para o transtorno, o receptor P2X7. / Bipolar Disorder is a severe and chronic psychiatric disorder that presents an episodic course and high impact on the patient's functionality. It has potential for a high degree of severity, recurrence and intensity. The prevalence throughout life of bipolar disorder is 2.4% of the world population. The pathophysiology of this disorder is still not well understood and the drug of first choice is lithium, although its mechanism of action is not clear. The purinergic system mainly due to its actions on neuroprotection, inflammation and microglial activation stands out as a promising pathway for new therapeutic targets, especially the purinergic receptor P2X7 (P2X7R). Thus, the purpose of this thesis is to characterize the involvement of the purinergic system in the pathophysiology of bipolar disorder. In general, we evaluated purinergic system metabolites in serum from bipolar disorder patients and healthy controls, correlating with clinical data. We evaluated the frequency of P2RX7 1513A>C polymorphism in bipolar disorder patients and in healthy subjects. We performed a pharmacological animal model of mania and investigated the involvement of the P2X7 purinergic receptor in this model and finally we sought to better understand the neuroprotective action of lithium by verifying the purinergic participation. Our results primarily showed a decrease in adenosine levels in patients compared to controls and a significant inverse correlation between adenosine levels and worsening of symptoms. We also demonstrated that patients with bipolar disorder present a decrease in the frequency of the 1513C allele and the potential increase in the frequency of genotype 1513AA and 1513AA/AC in relation to controls, setting a worse prognosis of the most active form of the receptor. We also showed that P2X7R plays an important role in the establishment of the mania model, modulating mainly the dopaminergic pathway that is reflected in the behavioral change observed by the model. Finally, lithium was able to prevent the insult response in neuronal cells (PC-12 lineage) and was not capable of preventing P2X7R-mediated activation in microglial cells (N9 lineage), indicating a differentiated cellular response. We can conclude that in a translational way we could demonstrate the participation of the purinergic system in the pathophysiology of bipolar disorder. We also suggested a possible biomarker for both diagnosis and progression of the disorder, the serum adenosine levels, and a potential genetic marker for prediction and diagnosis, the polymorphism of P2X7R 1513A>C. Lastly we contributed to the understanding of lithium action mechanism and defined a potential new therapeutic target for the disorder, the P2X7 receptor.

Magíster en fisiología / La hipertensión arterial pulmonar (HAP) es una enfermedad crónica, progresiva y fatal. A pesar del desarrollo de nuevas drogas, continúa siendo incurable. Las tres vías de tratamiento farmacológico actual apuntan a la regulación del tono vascular pulmonar, sin embargo, no se ha considerado la posible participación del sistema de regulación purinérgica del tono, el cual ya es conocido por su contribución a la regulación de la vaso-actividad a nivel sistémico. La escasa bibliografía disponible que ha permitido iniciar la caracterización del sistema purinérgico a nivel pulmonar se refiere solo al nivel arterial, sin embargo, los vasos venosos intrapulmonares pequeños dan cuenta de cerca de un 20% de la resistencia vascular pulmonar, lo que hace de este un componente importante en HAP. Es por esto que nuestro objetivo fue evaluar la contracción de venas intrapulmonares pequeñas inducida por UDP y buscar el receptor sensible a UDP involucrado (P2Y6 o P2Y14 ). Registramos la contracción de venas intrapulmonares pequeñas (VIP) inducida por dosis crecientes de UDP en rebanadas de pulmón de ratas con HAP y ratas sanas; luego desarrollamos ensayos funcionales con agonistas y antagonistas específicos para los receptores P2Y6 y P2Y14 y finalmente evaluamos la expresión de dichos receptores a través de Inmunofluorescencia Indirecta (IFI). Nuestros resultados muestran por primera vez que el UDP es un agonista capaz de inducir contracción dependiente de concentración en VIP tanto en ratas sanas como HAP, en este último grupo se observa una contracción mediada por UDP de una magnitud mayor a la lograda en ratas sanas. Los estudios funcionales con agonistas específicos para cada receptor muestran contracción mediada por el receptor P2Y6 y en muy menor medida por el receptor P2Y14 en ratas sanas e interesantemente demostramos una hipercontractilidad mediada por UDP-Glucosa a través de su único receptor P2Y14 en ratas HAP. La IFI ratifica la presencia del receptor P2Y6 en músculo liso de ratas controles e hipertensas y consecuentemente con los estudios funcionales se demostró una mayor presencia del receptor P2Y14 en músculo liso de VIP de ratas con HAP en comparación a ratas sanas. Nosotros concluimos que es el receptor P2Y14 el que presenta una destacada participación en la fisiopatología de la HAP; esto debido a que su activación específica induce una respuesta hipercontráctil de las VIP en ratas enfermas, lo cual se ve respaldado por su mayor colocalización a nivel del músculo liso en la pared de VIP de ratas HAP. Esto nos permite pensar en el receptor P2Y14 como un nuevo target de acción farmacológica para el tratamiento de la enfermedad.

A Doença de Parkinson é uma doença altamente incapacitante e de grande prevalência. Pouco se sabe sobre sua etiologia e os tratamentos atuais consistem na diminuição dos sintomas, uma vez que ainda não foi encontrada uma maneira de reverter o déficit de neurônios dopaminérgicos observados nos pacientes acometidos. Sabe-se que os receptores purinérgicos são encontrados por todo o sistema nervoso central, não só no indivíduo adulto como também em diferentes estágios do desenvolvimento embrionário e estão envolvidos com proliferação e diferenciação celular. Este trabalho estudou a participação dos receptores purinérgicos em modelo animal de doença de Parkinson por lesão dos neurônios dopaminérgicos da via nigroestriatal com 6-OH dopamina (6-OHDA). Realizamos a análise do perfil de expressão gênica dos diferentes receptores após a lesão e subsequente modulação. Observamos expressão gênica alterada dos receptores P2X7 e P2Y6 até 5 semanas após a lesão. O uso do antagonista do receptor P2X7 Brilliant Blue G (BBG) induziu a regeneração da via nigroestriatal e o uso do antagonista do receptor P2Y6 MRS2578 preveniu a morte dos neurônios. Como esses efeitos foram acompanhados pela inativação de células microgliais, supõe-se que o controle do microambiente neuroinflamatório causado pela injeção de 6-OHDA seja a principal causa do efeito antiparkinsoniano observado pelo tratamento com BBG e MRS2578. Além disso, o transplante celular com células precursoras neuraisnão foi capaz de reverter o comportamento hemiparkinsoniano dos animais lesionados. Apesar do uso concomitante com BBG reduzir o comportamento, parece que esse efeito deve-se ao BBG per se, uma vez que o tratamento somente com o antagonista de P2X7 foi mais eficaz. De maneira geral, a modulação da atividade dos receptores purinérgicos se mostrou uma ferramenta promissora na pesquisa de cura e compreensão das bases moleculares da Doença de Parkinson / Parkinson\'s disease is a highly disabling and prevalent disease. Little is known about its etiology and the current treatments consist in the reduction of the symptoms, since there is no known method to reverse the dopaminergic neurons deficit observed in patients. Purinergic receptors are found throughout the central nervous system, not only in the adult individual but also at different stages of embryonic development, and are involved in proliferation and differentiation. This work investigated the role of purinergic receptors in the animal model of Parkinson\'s disease induced by 6-OH dopamine (6-OHDA) injection and consequent death of dopaminergic neurons of the nigrostriatal pathway. Patterns of purinergic receptors gene expression after the lesion and subsequent modulation were analyzed. We observed altered gene expression of P2X7 and P2Y6 receptors within 5 weeks of injury. The use of the P2X7 receptor antagonist Brilliant Blue G (BBG) induced the regeneration of the nigrostriatal pathway and treatment with P2Y6 receptor antagonist MRS2578 prevented the death of the neurons. Since these effects were accompanied by the inactivation of microglial cells, it is assumed that the control of neuroinflammatory milieu caused by the 6-OHDA injection is the main cause of the antiparkinsonian effect observed by the treatment with BBG and MRS2578. In addition, transplantation with neural precursor cells was not able to reverse the hemiparkinsonian behavior of injured animals. Although concomitant use with BBG improved cell engraftment, it appears that this effect is due to BBG per se, since treatment with only this P2X7receptor antagonist was more effective. In general, modulation of purinergic receptor activity showed to be a promising tool in the research of cure and understanding of the molecular bases of Parkinson\'s Disease.

Neste trabalho foram analisados os efeitos do BBG nos neurônios mioentéricos imunorreativos ao receptor P2X7 no íleo de ratos submetidos à isquemia e reperfusão (I/R). A isquemia intestinal foi obtida pela oclusão dos vasos ileais por 45 minutos, com reperfusão de 0 hora (h), 24 h e 14 dias. O BBG foi aplicado nos grupos I/R 24 h e I/R 14 dias nas dosagens de 50 e 100 mg/Kg. O grupo I/R 0 h é o grupo sem reperfusão. Os tecidos foram preparados para análises de duplas marcações, western blotting, histoquímica da mieloperoxidase, histologia e motilidade intestinal. Os resultados demonstraram a presença do receptor P2X7 nos neurônios mioentéricos. Houve uma diminuição da densidade e da área do perfil dos neurônios mioentéricos nos grupos I/R e nos grupos com o BBG houve uma recuperação dos neurônios. Nos grupos I/R houve aumento na expressão do receptor P2X7 e no número de neutrófilos e diminuição da motilidade. Os resultados sugerem que a I/R afetou os neurônios mioentéricos e que o BBG possa ter atenuado os efeitos da I/R, demonstrando uma provável neuroproteção. / We analyzed the effects of BBG antagonist on the P2X7 receptor and rats ileum enteric neurons subjected to I/R. Intestinal ischemia was obtained by ileal vessels obstruction for 45 minutes, followed by reperfusion of 0 h, 24 h and 14 days. The BBG was applied in I/R 24 h and 14 days groups in dosages of 50 and 100 mg/kg. The I/R 0 h is the group without reperfusion. Tissues were prepared by double labeling, western blotting, myeloperoxidase reaction, histology and intestinal motility analyzes. Our results demonstrated the presence of the P2X7 receptor in myenteric neurons. There was a decrease in density and in the area of the cell body profile of the myenteric neurons in the I/R groups and recovery in the BBG groups. In I/R groups there was an increase in the expression of P2X7 receptor and in the number of neutrophils and there was a decrease in intestinal motility and recover in the BBG groups. The results suggest that I/R affect the myenteric neurons and that the BBG may have attenuated the effects of ischemia, thus demonstrating a possible neuroprotection.