The purinergic P2X7 receptor (P2X7R) is an ionotropic adenosine triphosphate(ATP) receptor which is closely linked with pathological conditions in the central nervous system (CNS). Gliomas are the most common primary brain tumors with presently no cures. The roles of the P2X7R in these diseases have not been previously studied and in this work, I have used the rat C6 glioma as an experimental model system to investigate expression and function of the P2X7R in vitro and in vivo. The in vitro study has examined expression of the P2X7R in C6 cells and the involvement of this receptor in mediating cell functional responses. C6 glioma cells were found to express the P2X7R at both mRNA and protein levels. The P2X7Ragonist, 2', 3 '-(benzoy1-4-benzoy1)-ATP (BzATP) induced an increase in intracellularCa2+ concentration, an effect which was largely inhibited by periodate-oxidized ATP(OxATP), an irreversible P2X7R antagonist. BzATP treatment of C6 cells also resulted in ethidium bromide dye uptake indicating pore formation was induced byP2X7R activation. Chronic exposure of C6 cells to BzATP showed up-regulation of several pro-inflammatory factors including the chemokines monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1) and interleukin-8 (IL-8) and the angiogenic factor vascular endothelial growth factor (VEGF) suggesting the P2X7R in C6 cells is involved in mediating inflammation in tumors. In addition, BzATP treatment was found to enhance wound-induced cell migration, an effect which was inhibited in the presence of OxATP, or another P2X7R antagonist, Brilliant Blue G (BBG). The in vivo study examined whether pharmacological modulation of P2X7R with BBG altered tumor growth. C6 glioma cells were implanted into the striatum of rat brain and in situ P2X7R expression was shown to be associated with glioma cells and resident microglia. Preliminary results have indicated that inhibition of P2X7R leads to a reduced volume of brain tumors formed by transplanted C6 cells. The overall results from this study demonstrate the novel finding that C6 glioma cells express functional P2X7R and suggest pharmacological modulation of theP2X7R could serve as an effective strategy to inhibit the development and progression of brain tumors.

The purinergic P2X7 receptor (P2X7R) is an ionotropic adenosine triphosphate(ATP) receptor which is closely linked with pathological conditions in the central nervous system (CNS). Gliomas are the most common primary brain tumors with presently no cures. The roles of the P2X7R in these diseases have not been previously studied and in this work, I have used the rat C6 glioma as an experimental model system to investigate expression and function of the P2X7R in vitro and in vivo. The in vitro study has examined expression of the P2X7R in C6 cells and the involvement of this receptor in mediating cell functional responses. C6 glioma cells were found to express the P2X7R at both mRNA and protein levels. The P2X7Ragonist, 2', 3 '-(benzoy1-4-benzoy1)-ATP (BzATP) induced an increase in intracellularCa2+ concentration, an effect which was largely inhibited by periodate-oxidized ATP(OxATP), an irreversible P2X7R antagonist. BzATP treatment of C6 cells also resulted in ethidium bromide dye uptake indicating pore formation was induced byP2X7R activation. Chronic exposure of C6 cells to BzATP showed up-regulation of several pro-inflammatory factors including the chemokines monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1) and interleukin-8 (IL-8) and the angiogenic factor vascular endothelial growth factor (VEGF) suggesting the P2X7R in C6 cells is involved in mediating inflammation in tumors. In addition, BzATP treatment was found to enhance wound-induced cell migration, an effect which was inhibited in the presence of OxATP, or another P2X7R antagonist, Brilliant Blue G (BBG). The in vivo study examined whether pharmacological modulation of P2X7R with BBG altered tumor growth. C6 glioma cells were implanted into the striatum of rat brain and in situ P2X7R expression was shown to be associated with glioma cells and resident microglia. Preliminary results have indicated that inhibition of P2X7R leads to a reduced volume of brain tumors formed by transplanted C6 cells. The overall results from this study demonstrate the novel finding that C6 glioma cells express functional P2X7R and suggest pharmacological modulation of theP2X7R could serve as an effective strategy to inhibit the development and progression of brain tumors.

The purinergic P2X7 receptor (P2X7R) is an ionotropic adenosine triphosphate(ATP) receptor which is closely linked with pathological conditions in the central nervous system (CNS). Gliomas are the most common primary brain tumors with presently no cures. The roles of the P2X7R in these diseases have not been previously studied and in this work, I have used the rat C6 glioma as an experimental model system to investigate expression and function of the P2X7R in vitro and in vivo. The in vitro study has examined expression of the P2X7R in C6 cells and the involvement of this receptor in mediating cell functional responses. C6 glioma cells were found to express the P2X7R at both mRNA and protein levels. The P2X7Ragonist, 2', 3 '-(benzoy1-4-benzoy1)-ATP (BzATP) induced an increase in intracellularCa2+ concentration, an effect which was largely inhibited by periodate-oxidized ATP(OxATP), an irreversible P2X7R antagonist. BzATP treatment of C6 cells also resulted in ethidium bromide dye uptake indicating pore formation was induced byP2X7R activation. Chronic exposure of C6 cells to BzATP showed up-regulation of several pro-inflammatory factors including the chemokines monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1) and interleukin-8 (IL-8) and the angiogenic factor vascular endothelial growth factor (VEGF) suggesting the P2X7R in C6 cells is involved in mediating inflammation in tumors. In addition, BzATP treatment was found to enhance wound-induced cell migration, an effect which was inhibited in the presence of OxATP, or another P2X7R antagonist, Brilliant Blue G (BBG). The in vivo study examined whether pharmacological modulation of P2X7R with BBG altered tumor growth. C6 glioma cells were implanted into the striatum of rat brain and in situ P2X7R expression was shown to be associated with glioma cells and resident microglia. Preliminary results have indicated that inhibition of P2X7R leads to a reduced volume of brain tumors formed by transplanted C6 cells. The overall results from this study demonstrate the novel finding that C6 glioma cells express functional P2X7R and suggest pharmacological modulation of theP2X7R could serve as an effective strategy to inhibit the development and progression of brain tumors. / Medicine, Faculty of / Anesthesiology, Pharmacology and Therapeutics, Department of / Graduate

Zusammenfassung der Arbeit Beteiligung purinerger Rezeptoren am Schmerzgeschehen und an der neuronalen Entwicklung Patrizia Rubini Illes Rudolf-Boehm-Institut für Pharmakologie und Toxikologie, Universität Leipzig Diese kumulative Arbeit umfasst neun Publikationen, welche die Beteiligung purinerger P2-Rezeptoren (P2R) am Schmerzgeschehen sowie der neuronalen Entwicklung belegen. Im Fokus stehen zwei ATP-aktivierte Rezeptor-Kanäle (P2X3R, P2X7R) und ein G-Protein-gekoppelter, ATP-empfindlicher Rezeptor (P2Y1R). (1) Da sich humane P2X3R an peripheren und zentralen Endigungen primärer-sensorischer Afferenzen befinden, ist die Entschlüsselung der Agonisten-Bindungsstelle für die Entwicklung potenziell analgetisch wirkender, kompetitiver Antagonisten von großer Bedeutung. Wir identifizierten Gruppen konservierter und nicht-konservierter Aminosäure-Reste, die an der Schnittstelle zweier benachbarter Untereinheiten, die Agonisten-Bindungstasche auskleiden. Abhängig vom Mengenverhältnis der zur Transfektion verwendeten cDNA, bilden P2X2-, P2X3- und P2X6-Untereinheiten heteromere Rezeptoren (P2X2/3R, P2X2/6R) in einer variablen Stöchiometrie. (2) Adulte neurale Progenitorzellen (NPZ) der Subventrikulärzone der Maus besitzen Apoptose- bzw. Nekrose-vermittelnde P2X7R. Diese kommen in Assoziation mit P2X4R vor, bilden jedoch wahrscheinlich keinen heteromeren P2X4/7R. P2X7R könnten zum Absterben der, nach metabolischen Schäden im Überschuss gebildeten, NPZ beitragen. Im Laufe der neuronalen Entwicklung verlieren die NPZ ihre P2X7R. Im Gegensatz hierzu bleiben diese bei ihren astrozytären Nachkommen erhalten. (3) Humane mesencephale embryonale NPZ sind mit P2Y1R ausgestattet, die über eine Ca2+-Wellenaktivität die Proliferation der NPZ beschleunigen und in Differenzierungsvorgänge eingreifen. De-differenzierte, kultivierte Neurone des Ratten-Striatum enthalten ebenfalls P2Y1R. Diese setzen Ca2+ aus seinen intrazellulären Speichern frei und öffnen somit Ca2+-selektive „store-operated channels“ in der Zellmembran. Wir konnten zeigen, dass der P2Y1R-stimulierte Anstieg der intrazellulären Ca2+-Konzentration in den striatalen Neuronen durch die Aktivierung von Dopamin D1- und D2R inhibiert wurde. Die vorliegende Arbeit belegt die Bedeutung einiger P2R für zahlreiche, auch potentiell therapeutisch bedeutsame Funktionen des menschlichen und tierischen Organismus.

A morte celular necrótica é conhecida pelo seu caráter inflamatório, conferido pela grande quantidade de sinais de dano liberados. Durante a tuberculose primária progressiva é observada intensa lesão necrótica nos pulmões e disseminação do bacilo para outros órgãos. Neste estudo, nós hipotetizamos que a amplificação da necrose pulmonar, via reconhecimento de sinais de dano tecidual pelo receptor purinérgico P2X7 (P2X7R), poderia favorecer a progressão da doença, bem como a potencialização da resposta inflamatória. Vimos que o reconhecimento de extracelular ATP (eATP) via o receptor P2X7 é de suma importância para o desenvolvimento da doença grave, por favorecer a indução de necrose dos macrófagos infectados, o que facilitou o escape do bacilo. A adenosina, resultante da hidrólise do eATP, impactou na ativação da resposta imune adquirida. Nosso estudo provê uma nova perspectiva para o desenvolvimento de protocolos terapêuticos baseados na inibição do P2X7R e dos receptores de adenosina para evitar a indução de formas graves da doença. / Necrosis cell death is known as an inflammatory process due to the large amount of damage signals released. During the progressive primary tuberculosis, extensive necrotic lesions in the lung and intensive bacterial dissemination are observed. In this study, we hypothesized that the amplification of pulmonary necrosis through damage signals recognition by a purinergic receptor called P2X7 (P2X7R) could favor the progression of disease, as well as the augmentation of the inflammatory response. We found that the recognition of extracellular ATP (eATP) through P2X7R is crucial to the outcome of fatal tuberculosis by favoring the induction of necrosis of infected macrophages, which facilitated the bacterial escape. The adenosine, resulted from eATP hydrolyzation, impacted to the acquired immune response activation. Our study provides a new perspective to the development of therapeutic protocols based on the inhibition of P2X7R and adenosine receptor to avoid the induction of aggressive forms of tuberculosis.

The P2X7R is a functionally distinct member of the P2X non-selective cation channels and has been implicated in the initiation of immune responses. One of the most extensively characterised immune responses of the receptor is to signal the rapid aggregation of the inflammasome complex and signal the release of IL-1β. These investigations have focused in providing direct comparisons of P2X7R-driven IL-1 responses between DC and mouse macrophages (peritoneal macrophages [PMΦ] and bone marrow derived macrophages [BM-MΦ]). Expression of the P2X7R has been identified in all three populations both at the transcriptional (P2X7A variant) and protein levels. Activation with lipopolysaccharide (LPS) (2h) induced a rapid dose dependent release of IL-6 but not of IL-1β in BM-DC. Rapid (2h) IL-1β release required both LPS priming and ATP activation. Both signals were also required for IL- 1β release in mouse ΒΜ-ΜΦ and PMΦ, however, at comparatively markedly lower levels. Furthermore, like with IL-1β, LPS did not induce IL-1α release in BM-DC. Interestingly, subsequent challenge with ATP evoked IL-1α release in BM-DC alone, with little or no detectable levels observed in activated BM-MΦ. This rapid IL-1β release (but not IL-6) was potently inhibited in both macrophages and DC with a P2X7R-specific inhibitor (A-740003) providing evidence that is predominantly a P2X7R-driven process. Treatment with A-740003 also potently inhibited IL-1α release from BM-DC suggesting that the ATP-P2X7R and caspase-1 activation might have a role in the release of the cytokine. Expression of gain-of-function P2X7K and loss-of- function P2X7J splice variants has been identified in both BM-DC and BM-MΦ, at the level of transcription. The possibility that a differential baseline or LPS-induced expression (at the transcriptional level) of P2X7J and P2X7K variants accounts for the diverse cytokine responses observed in BM-DC and BM-MΦ was also explored. However, the levels of expression for the various splice variants of interest (P2X7K and P2X7J) were found to be similar between the two cell types. The results of these investigations identify some subtle but intriguing differences in the mechanism of P2X7R activation and IL-1 release between DCs and macrophages. Purinergic signalling is increasing being implicated in the regulation of immune responses both in potentiating or suppressing inflammation. However, further work is required to decipher how the dynamic interplay between different purines can influence the immune activation of different cell types and indeed different cell subsets.

Zusammenfassung der Arbeit Beteiligung purinerger Rezeptoren am Schmerzgeschehen und an der neuronalen Entwicklung Patrizia Rubini Illes Rudolf-Boehm-Institut für Pharmakologie und Toxikologie, Universität Leipzig Diese kumulative Arbeit umfasst neun Publikationen, welche die Beteiligung purinerger P2-Rezeptoren (P2R) am Schmerzgeschehen sowie der neuronalen Entwicklung belegen. Im Fokus stehen zwei ATP-aktivierte Rezeptor-Kanäle (P2X3R, P2X7R) und ein G-Protein-gekoppelter, ATP-empfindlicher Rezeptor (P2Y1R). (1) Da sich humane P2X3R an peripheren und zentralen Endigungen primärer-sensorischer Afferenzen befinden, ist die Entschlüsselung der Agonisten-Bindungsstelle für die Entwicklung potenziell analgetisch wirkender, kompetitiver Antagonisten von großer Bedeutung. Wir identifizierten Gruppen konservierter und nicht-konservierter Aminosäure-Reste, die an der Schnittstelle zweier benachbarter Untereinheiten, die Agonisten-Bindungstasche auskleiden. Abhängig vom Mengenverhältnis der zur Transfektion verwendeten cDNA, bilden P2X2-, P2X3- und P2X6-Untereinheiten heteromere Rezeptoren (P2X2/3R, P2X2/6R) in einer variablen Stöchiometrie. (2) Adulte neurale Progenitorzellen (NPZ) der Subventrikulärzone der Maus besitzen Apoptose- bzw. Nekrose-vermittelnde P2X7R. Diese kommen in Assoziation mit P2X4R vor, bilden jedoch wahrscheinlich keinen heteromeren P2X4/7R. P2X7R könnten zum Absterben der, nach metabolischen Schäden im Überschuss gebildeten, NPZ beitragen. Im Laufe der neuronalen Entwicklung verlieren die NPZ ihre P2X7R. Im Gegensatz hierzu bleiben diese bei ihren astrozytären Nachkommen erhalten. (3) Humane mesencephale embryonale NPZ sind mit P2Y1R ausgestattet, die über eine Ca2+-Wellenaktivität die Proliferation der NPZ beschleunigen und in Differenzierungsvorgänge eingreifen. De-differenzierte, kultivierte Neurone des Ratten-Striatum enthalten ebenfalls P2Y1R. Diese setzen Ca2+ aus seinen intrazellulären Speichern frei und öffnen somit Ca2+-selektive „store-operated channels“ in der Zellmembran. Wir konnten zeigen, dass der P2Y1R-stimulierte Anstieg der intrazellulären Ca2+-Konzentration in den striatalen Neuronen durch die Aktivierung von Dopamin D1- und D2R inhibiert wurde. Die vorliegende Arbeit belegt die Bedeutung einiger P2R für zahlreiche, auch potentiell therapeutisch bedeutsame Funktionen des menschlichen und tierischen Organismus.:Inhaltsverzeichnis Kapitel Seite Abkürzungen …………………………………………………………………………………. 5 1. Einführung in die Thematik.......................................................................... 7 1.1. Freisetzung von Nukleotiden und ihre Metabolisierung im Extrazellulärraum …7………………………………… 1.2. P2X-Rezeptoren…………………………………………………………………….. 9 1.3. P2Y-Rezeptoren……………………………………………………………………. 12 1.4. P2-Rezeptoren und Schmerz……………………………………………………... 14 1.5. P2-Rezeptoren und neuronale Entwicklung; embryonale undadulte neurale Vorläuferzellen……………………………………………………. 17 1.6. Referenzen………………………………………………………………………….. 19 2. Wissenschaftliche Ergebnisse……………………………………………………… 23 2.1. Komplex I. Struktur-Wirkungs-Zusammenhänge bei rekombinanten, humanen P2X3- und P2X2/3-Rezeptoren in Expressionssystemen…………. 24 2.1.1. Amino acid residues constituting the agonist binding site of the human P2X3 receptor……………………………………………………………… 24 2.1.2. ATP binding site mutagenesis reveals different subunit stoichiometry of functional P2X2/3 and P2X2/6 receptors……………………………………... 26 2.1.3 Flexible subunit stoichiometry of functional human P2X2/3 heteromeric receptors……………………………………………………………... 28 2.2. Komplex II. Vorhandensein und Wirkung von P2X7-Rezeptoren an kultivierten adulten, neuralen Vorläuferzellen und Astrozyten………….. 29 2.2.1. P2X7 receptors at adult neural progenitor cells of the mouse subventricular zone………………………………………………………………… 29 2.2.2. Co-expression of functional P2X4 and P2X7 receptors at adult neural precursor cells of the mouse subventricular zone……………………… 31 2.2.3. Functional P2X7 receptors at cultured hippocampal astrocytes but not neurons…………………………………………………………………….. 32 2.3. Komplex III. Vorhandensein und Wirkung von P2Y-Rezeptoren an embryonalen neuralen Vorläuferzellen und dedifferenzierten kultivierten striatalenNeuronen... 33 2.3.1. Increase of intracellular Ca2+ by adenine and uracil nucleotides in human midbrain-derived neuronal precursor cells…………... 33 2.3.2. Regulation of intracellular Ca2+ by P2Y1 receptors may depend on the developmental stage of cultured rat striatal neurons…………………... 35 2.3.3. Modulation by D1 and D2 dopamine receptors of ATP-induced release of intracellular Ca2+ in cultured rat striatal neurons 36 3. Zusammenfassung und Ausblick………………………………………… ………... 37 4. Erklärungen, Danksagung…………………………………………… 38 Erklärung über die eigenständige Anfertigung der Arbeit………… 38 Erklärung über den eigenen Anteil an den einzelnen Arbeiten…………….. 39 Danksagung………………………………………………………………… 42

Gegenstand der vorliegenden Arbeit sind die purinergen Rezeptoren P2X4R und P2X7R. Die P2XR werden durch ATP aktiviert und stellen unselektive Kationenkanäle dar, die auch für Ca2+ durchlässig sind. Beiden P2XR-Subtypen werden in den Alveolarepithel Typ I (AT I)-Zellen der Lunge exprimiert und aufgrund ihrer Kanalaktivitäten in Zusammenhang mit der alveolären Flüssigkeitshomöostase gebracht. Bei bisherigen Untersuchungen wurde jedoch die mögliche Assoziation und Modulation der P2XR durch Mikrodomänen der Zellmembran außer Acht gelassen. Ein Modell von Garcia-Marcos zeigt, dass P2X7R in Zellen der Glandula submandibularis zum Teil mit Mikrodomänen assoziiert ist. Die funktionellen Eigenschaften von P2X7R sind dabei von der Lokalisation in der Zellmembran abhängig (Garcia-Marcos et al., 2006). Die Caveolen sind eine spezielle Form von Mikrodomänen, die in der Zellmembran der AT I-Zellen auftreten. Das Hauptstrukturprotein der Caveolen im Lungenepithel ist Caveolin-1 (Cav-1). Über die Verteilung von P2X4R und P2X7R in den AT I-Zellen war bislang sehr wenig bekannt. Unsere Arbeitsgruppe identifizierte bei einer Sequenzanalyse potentielle Cav-1-Bindemotive in der Aminosäureabfolge beider P2XR (Couet et al., 1997). Die Assoziation mit den Caveolen würde die P2XR in die räumliche Nähe verschiedener Signalmoleküle bringen und die Beteiligung an downstream Events ermöglichen. Für die folgenden Analysen wurde die Alveolarepithelzelllinie E10 genutzt, da die E10-Zellen AT I-typische Eigenschaften besitzen und P2X4R, P2X7R sowie die Caveoline Cav-1 und Cav-2 aufweisen. Die Untersuchungen konzentrierten sich auf die Assoziation von P2X4R und P2X7R mit Mikrodomänen der Zellmembran sowie die wechselseitige Beziehung der P2XR. Besonders wurde dabei auf die Assoziation der P2XR mit Cav-1 eingegangen. Zusätzlich wurde in vitro die Interaktion der C-terminalen Bereiche der beiden P2XR mit Membranlipiden untersucht. Einige Membranlipide sind eng mit weiteren Signalmolekülen verknüpft. Aus diesem Grund wurde die Auswirkungen der Reduzierung von P2X4R und P2X7R auf den Proteingehalt der Ca2+-aktivierbaren downstream-Effektoren PKCβI und CaM analysiert. Die Auswertungen der Ergebnisse ergaben Folgendes: P2X4R und P2X7R sind Subtyp-spezifisch in den Mikrodomänen der Zellmembran von E10-Zellen verteilt. Mit Hilfe von biochemischen und immunfluoreszenz-mikroskopischen Methoden konnte die Assoziation von P2X4R und P2X7R mit Mikrodomänen nachgewiesen werden. P2X7R ist zum Teil mit Cav-1 assoziiert, wobei Förster Resonanz Energie Transfer (FRET)-Analysen ergaben, dass beide Proteine partiell einen Abstand von kleiner als 10 nm zueinander aufweisen. Durch die Subtyp-spezifische Verteilung könnte die Funktionalität der P2XR-Subtypen spezifisch durch die Bestandteile der Mikrodomänen moduliert und reguliert werden (Martens et al., 2001). P2X4R und P2X7R sind in hochmolekularen Proteinkomplexen assoziiert. Die Ausbildung von hochmolekularen Proteinkomplexen wird in Zusammenhang mit der Assoziation von Proteinen mit Mikrodomänen diskutiert (Zurzolo et al., 2003). Die Untersuchung der molekularen Organisation von P2X4R und P2X7R in E10-Zellen mittels blue native- und high resolution clear native-PAGE zeigte, dass beide P2XR mit hochmolekularen Proteinkomplexen assoziiert sind. P2X7R konnte in drei Komplexen nachgewiesen werden. Im ersten Komplex von ~760 kDa liegt P2X7R mit Cav-1 assoziiert vor, während der dominant auftretende, zweite P2X7R-Subkomplex von ~580 kDa vermutlich nicht mit dem co-migrierten Cav-1/Cav-2-Komplex in Verbindung steht. Der dritte P2X7R-assoziierte Komplex war zusammen mit P2X4R bei ~430 kDa nachweisbar und Immunpräzipitationen bestätigten, dass P2X4R und P2X7R in einem Komplex miteinander assoziiert sind (Weinhold et al., 2010). P2X4R und P2X7R stehen in Wechselbeziehung zueinander. Diese Ergebnisse der siRNA-induzierte Herabregulation von P2X4R und P2X7R lassen vermuten, dass die beiden Rezeptoren direkt oder indirekt miteinander verbunden sind. So führte die Reduzierung von P2X4R zur Erhöhung des P2X7R-Proteingehaltes. Dabei nimmt P2X7R in der Zellmembran zu und verändert seine Verteilung nicht. Umgekehrt nimmt der Proteingehalt von P2X4R in den E10-Zellen zu, wenn P2X7R herabreguliert wird. Die Zunahme von P2X4R in der Zellmembran konnte zwar durch die Biotinylierung der Oberflächenproteine nachgewiesen werden, aber die Verteilung von P2X4R verschob sich zugunsten des intrazellulären P2X4R-Anteils. Vermutlich führt die Reduzierung von P2X7R zu Störungen im exo-/endozytotischen System. Die wechselseitige Zunahme der P2XR in den Mikrodomänen weist zudem auf einen kompensatorischen Mechanismus hin. Negativ geladene Phospholipide interagieren direkt mit den C-terminalen Abschnitten der P2XR. Mit den in vitro Bindetests konnte gezeigt werden, dass die C-terminalen Enden von P2X4R und P2X7R direkt mit den negativ geladenen Phosphoinositiden PI(4)P, PI(4,5)P2, PI(3,4,5)P3 sowie mit Phosphatidsäure, Phosphatidylserin, Phosphatidylglycerol, Cardiolipin und 3 Sulfogalactosylceramid interagieren können. Die Regulation der P2XR durch diese Phospholipide, vor allem PI(4,5)P2, und die Beteiligung der P2XR an Lipid-vermittelten Signalwegen in Epithelzellen, stellen einen möglichen Link zu weiteren downstream-Signalen dar. Die Reduzierung von P2X7R beeinflusst den Proteingehalt der downstream-Effektoren PKCβI und CaM. Sowohl im Lungengewebe von P2rx7(-/-) Mäusen als auch nach der Reduzierung von P2X7R in den E10-Zellen zeigte sich, dass der Proteingehalt der Signalmoleküle PKCβI und CaM vermindert war. Reduzierung von P2X4R hatte dagegen kaum Einfluss auf PKCβI und führte zur Erhöhung des CaM-Proteingehaltes, vermutlich hervorgerufen durch die Zunahme von P2X7R. Beide downstream-Effektoren sind in Mikrodomänen (Caveolen) der Zellmembran lokalisiert und können sowohl durch Lipid-vermittelte Signale als auch durch einen Kanal-vermittelten Ca2+-Einstrom aktiviert und reguliert werden. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigten, dass P2X4R und P2X7R in AT I-Zellen der Lunge nicht nur Kanaleigenschaften besitzen, sondern durch die Assoziation mit unterschiedlichen Mikrodomänen an verschiedene Signalwege gekoppelt sind. Trotzdem ist bisher wenig über die Funktionen der P2XR in AT I-Zellen hinsichtlich der Beteiligung an apoptotischen Prozessen, der Proliferation, der Differenzierung oder Migration und Wundheilung bekannt (Barth and Kasper, 2009). Aufgrund der komplexen Funktion, vor allem durch die Assoziation mit Cav-1 und der Wechselbeziehung mit dem P2X4R, wird der P2X7R für zukünftige Forschungen im alveolären Lungenepithel von Bedeutung sein. Barth K, Kasper M (2009) Membrane compartments and purinergic signalling: occurrence and function of P2X receptors in lung. FEBS J 276:341-353. Couet J, Li S, Okamoto T, Ikezu T, Lisanti MP (1997) Identification of peptide and protein ligands for the caveolin-scaffolding domain. Implications for the interaction of caveolin with caveolae-associated proteins. J Biol Chem 272:6525-6533. Garcia-Marcos M, Perez-Andres E, Tandel S, Fontanils U, Kumps A, Kabre E, Gomez-Munoz A, Marino A, Dehaye JP, Pochet S (2006) Coupling of two pools of P2X7 receptors to distinct intracellular signaling pathways in rat submandibular gland. J Lipid Res 47:705-714. Martens JR, Sakamoto N, Sullivan SA, Grobaski TD, Tamkun MM (2001) Isoform-specific localization of voltage-gated K+ channels to distinct lipid raft populations. Targeting of Kv1.5 to caveolae. J Biol Chem 276:8409-8414. Weinhold K, Krause-Buchholz U, Rödel G, Kasper M, Barth K (2010) Interaction and interrelation of P2X7 and P2X4 receptor complexes in mouse lung epithelial cells. Cell Mol Life Sci 67:2631-2642. Zurzolo C, van Meer G, Mayor S (2003) The order of rafts. Conference on microdomains, lipid rafts and caveolae. EMBO Rep 4:1117-1121.

Gegenstand der vorliegenden Arbeit sind die purinergen Rezeptoren P2X4R und P2X7R. Die P2XR werden durch ATP aktiviert und stellen unselektive Kationenkanäle dar, die auch für Ca2+ durchlässig sind. Beiden P2XR-Subtypen werden in den Alveolarepithel Typ I (AT I)-Zellen der Lunge exprimiert und aufgrund ihrer Kanalaktivitäten in Zusammenhang mit der alveolären Flüssigkeitshomöostase gebracht. Bei bisherigen Untersuchungen wurde jedoch die mögliche Assoziation und Modulation der P2XR durch Mikrodomänen der Zellmembran außer Acht gelassen. Ein Modell von Garcia-Marcos zeigt, dass P2X7R in Zellen der Glandula submandibularis zum Teil mit Mikrodomänen assoziiert ist. Die funktionellen Eigenschaften von P2X7R sind dabei von der Lokalisation in der Zellmembran abhängig (Garcia-Marcos et al., 2006). Die Caveolen sind eine spezielle Form von Mikrodomänen, die in der Zellmembran der AT I-Zellen auftreten. Das Hauptstrukturprotein der Caveolen im Lungenepithel ist Caveolin-1 (Cav-1). Über die Verteilung von P2X4R und P2X7R in den AT I-Zellen war bislang sehr wenig bekannt. Unsere Arbeitsgruppe identifizierte bei einer Sequenzanalyse potentielle Cav-1-Bindemotive in der Aminosäureabfolge beider P2XR (Couet et al., 1997). Die Assoziation mit den Caveolen würde die P2XR in die räumliche Nähe verschiedener Signalmoleküle bringen und die Beteiligung an downstream Events ermöglichen. Für die folgenden Analysen wurde die Alveolarepithelzelllinie E10 genutzt, da die E10-Zellen AT I-typische Eigenschaften besitzen und P2X4R, P2X7R sowie die Caveoline Cav-1 und Cav-2 aufweisen. Die Untersuchungen konzentrierten sich auf die Assoziation von P2X4R und P2X7R mit Mikrodomänen der Zellmembran sowie die wechselseitige Beziehung der P2XR. Besonders wurde dabei auf die Assoziation der P2XR mit Cav-1 eingegangen. Zusätzlich wurde in vitro die Interaktion der C-terminalen Bereiche der beiden P2XR mit Membranlipiden untersucht. Einige Membranlipide sind eng mit weiteren Signalmolekülen verknüpft. Aus diesem Grund wurde die Auswirkungen der Reduzierung von P2X4R und P2X7R auf den Proteingehalt der Ca2+-aktivierbaren downstream-Effektoren PKCβI und CaM analysiert. Die Auswertungen der Ergebnisse ergaben Folgendes: P2X4R und P2X7R sind Subtyp-spezifisch in den Mikrodomänen der Zellmembran von E10-Zellen verteilt. Mit Hilfe von biochemischen und immunfluoreszenz-mikroskopischen Methoden konnte die Assoziation von P2X4R und P2X7R mit Mikrodomänen nachgewiesen werden. P2X7R ist zum Teil mit Cav-1 assoziiert, wobei Förster Resonanz Energie Transfer (FRET)-Analysen ergaben, dass beide Proteine partiell einen Abstand von kleiner als 10 nm zueinander aufweisen. Durch die Subtyp-spezifische Verteilung könnte die Funktionalität der P2XR-Subtypen spezifisch durch die Bestandteile der Mikrodomänen moduliert und reguliert werden (Martens et al., 2001). P2X4R und P2X7R sind in hochmolekularen Proteinkomplexen assoziiert. Die Ausbildung von hochmolekularen Proteinkomplexen wird in Zusammenhang mit der Assoziation von Proteinen mit Mikrodomänen diskutiert (Zurzolo et al., 2003). Die Untersuchung der molekularen Organisation von P2X4R und P2X7R in E10-Zellen mittels blue native- und high resolution clear native-PAGE zeigte, dass beide P2XR mit hochmolekularen Proteinkomplexen assoziiert sind. P2X7R konnte in drei Komplexen nachgewiesen werden. Im ersten Komplex von ~760 kDa liegt P2X7R mit Cav-1 assoziiert vor, während der dominant auftretende, zweite P2X7R-Subkomplex von ~580 kDa vermutlich nicht mit dem co-migrierten Cav-1/Cav-2-Komplex in Verbindung steht. Der dritte P2X7R-assoziierte Komplex war zusammen mit P2X4R bei ~430 kDa nachweisbar und Immunpräzipitationen bestätigten, dass P2X4R und P2X7R in einem Komplex miteinander assoziiert sind (Weinhold et al., 2010). P2X4R und P2X7R stehen in Wechselbeziehung zueinander. Diese Ergebnisse der siRNA-induzierte Herabregulation von P2X4R und P2X7R lassen vermuten, dass die beiden Rezeptoren direkt oder indirekt miteinander verbunden sind. So führte die Reduzierung von P2X4R zur Erhöhung des P2X7R-Proteingehaltes. Dabei nimmt P2X7R in der Zellmembran zu und verändert seine Verteilung nicht. Umgekehrt nimmt der Proteingehalt von P2X4R in den E10-Zellen zu, wenn P2X7R herabreguliert wird. Die Zunahme von P2X4R in der Zellmembran konnte zwar durch die Biotinylierung der Oberflächenproteine nachgewiesen werden, aber die Verteilung von P2X4R verschob sich zugunsten des intrazellulären P2X4R-Anteils. Vermutlich führt die Reduzierung von P2X7R zu Störungen im exo-/endozytotischen System. Die wechselseitige Zunahme der P2XR in den Mikrodomänen weist zudem auf einen kompensatorischen Mechanismus hin. Negativ geladene Phospholipide interagieren direkt mit den C-terminalen Abschnitten der P2XR. Mit den in vitro Bindetests konnte gezeigt werden, dass die C-terminalen Enden von P2X4R und P2X7R direkt mit den negativ geladenen Phosphoinositiden PI(4)P, PI(4,5)P2, PI(3,4,5)P3 sowie mit Phosphatidsäure, Phosphatidylserin, Phosphatidylglycerol, Cardiolipin und 3 Sulfogalactosylceramid interagieren können. Die Regulation der P2XR durch diese Phospholipide, vor allem PI(4,5)P2, und die Beteiligung der P2XR an Lipid-vermittelten Signalwegen in Epithelzellen, stellen einen möglichen Link zu weiteren downstream-Signalen dar. Die Reduzierung von P2X7R beeinflusst den Proteingehalt der downstream-Effektoren PKCβI und CaM. Sowohl im Lungengewebe von P2rx7(-/-) Mäusen als auch nach der Reduzierung von P2X7R in den E10-Zellen zeigte sich, dass der Proteingehalt der Signalmoleküle PKCβI und CaM vermindert war. Reduzierung von P2X4R hatte dagegen kaum Einfluss auf PKCβI und führte zur Erhöhung des CaM-Proteingehaltes, vermutlich hervorgerufen durch die Zunahme von P2X7R. Beide downstream-Effektoren sind in Mikrodomänen (Caveolen) der Zellmembran lokalisiert und können sowohl durch Lipid-vermittelte Signale als auch durch einen Kanal-vermittelten Ca2+-Einstrom aktiviert und reguliert werden. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigten, dass P2X4R und P2X7R in AT I-Zellen der Lunge nicht nur Kanaleigenschaften besitzen, sondern durch die Assoziation mit unterschiedlichen Mikrodomänen an verschiedene Signalwege gekoppelt sind. Trotzdem ist bisher wenig über die Funktionen der P2XR in AT I-Zellen hinsichtlich der Beteiligung an apoptotischen Prozessen, der Proliferation, der Differenzierung oder Migration und Wundheilung bekannt (Barth and Kasper, 2009). Aufgrund der komplexen Funktion, vor allem durch die Assoziation mit Cav-1 und der Wechselbeziehung mit dem P2X4R, wird der P2X7R für zukünftige Forschungen im alveolären Lungenepithel von Bedeutung sein. Barth K, Kasper M (2009) Membrane compartments and purinergic signalling: occurrence and function of P2X receptors in lung. FEBS J 276:341-353. Couet J, Li S, Okamoto T, Ikezu T, Lisanti MP (1997) Identification of peptide and protein ligands for the caveolin-scaffolding domain. Implications for the interaction of caveolin with caveolae-associated proteins. J Biol Chem 272:6525-6533. Garcia-Marcos M, Perez-Andres E, Tandel S, Fontanils U, Kumps A, Kabre E, Gomez-Munoz A, Marino A, Dehaye JP, Pochet S (2006) Coupling of two pools of P2X7 receptors to distinct intracellular signaling pathways in rat submandibular gland. J Lipid Res 47:705-714. Martens JR, Sakamoto N, Sullivan SA, Grobaski TD, Tamkun MM (2001) Isoform-specific localization of voltage-gated K+ channels to distinct lipid raft populations. Targeting of Kv1.5 to caveolae. J Biol Chem 276:8409-8414. Weinhold K, Krause-Buchholz U, Rödel G, Kasper M, Barth K (2010) Interaction and interrelation of P2X7 and P2X4 receptor complexes in mouse lung epithelial cells. Cell Mol Life Sci 67:2631-2642. Zurzolo C, van Meer G, Mayor S (2003) The order of rafts. Conference on microdomains, lipid rafts and caveolae. EMBO Rep 4:1117-1121.

O Transtorno Bipolar é uma doença crônica e grave que apresenta curso episódico e alto impacto sobre a funcionalidade do paciente. Possui potencial para alto grau de severidade, recorrência e intensidade e estima-se que sua prevalência ao longo da vida seja de 2,4% da população mundial. A fisiopatologia deste transtorno ainda não é bem compreendida e ainda o fármaco de primeira escolha é o lítio, embora tampouco seja claro seu mecanismo de ação. O sistema purinérgico principalmente devido a suas ações sobre neuroproteção, inflamação e ativação microglial se destaca como uma via promissora de novos alvos terapêuticos, especialmente o receptor purinérgico P2X7 (P2X7R). Dessa maneira, o objetivo desta tese é caracterizar o envolvimento do sistema purinérgico na fisiopatologia do transtorno bipolar. De maneira geral, avaliamos metabólitos do sistema purinérgico em soro de pacientes e controles, correlacionando com dados clínicos. Avaliamos a frequência do polimorfismo do P2RX7 1513A>C em pacientes e controles. Realizamos um modelo animal farmacológico de mania e investigamos o envolvimento do P2X7R neste modelo e por último buscamos melhor compreender a ação neuroprotetora do lítio verificando a participação purinérgica. Nossos resultados primeiramente nos mostraram uma diminuição nos níveis de adenosina em pacientes em comparação a controles e uma importante correlação inversa entre os níveis de adenosina e a piora dos sintomas. Demonstramos ainda que pacientes com transtorno bipolar apresentam diminuição na frequência do alelo 1513C e o potencial aumento na frequência do genótipo 1513AA e 1513AA/AC em relação aos controles configurando um pior prognóstico de aumento da forma mais ativa do receptor. Também mostramos que o P2X7R possui um papel importante no estabelecimento do modelo de mania, modulando principalmente a via dopaminérgica que é refletida na mudança comportamental observada pelo modelo e por último, o lítio foi capaz de prevenir a resposta de insulto nas células neuronais (linhagem PC-12) e não foi capaz de prevenir a ativação mediada pelo P2X7R em células microgliais (linhagem N9), indicando uma resposta celular diferenciada. Podemos concluir que de maneira translacional conseguimos demonstrar a participação do sistema purinérgico na fisiopatologia do transtorno bipolar, sugerindo ainda um possível biomarcador tanto para diagnóstico como para progressão da doença, os níveis séricos de adenosina, e ainda um potencial biomarcador genético de predição e diagnóstico da doença, o polimorfismo do P2X7R 1513A>C, assim como contribuímos para o entendimento do mecanismo de ação do lítio e definimos um potencial novo alvo terapêutico para o transtorno, o receptor P2X7. / Bipolar Disorder is a severe and chronic psychiatric disorder that presents an episodic course and high impact on the patient's functionality. It has potential for a high degree of severity, recurrence and intensity. The prevalence throughout life of bipolar disorder is 2.4% of the world population. The pathophysiology of this disorder is still not well understood and the drug of first choice is lithium, although its mechanism of action is not clear. The purinergic system mainly due to its actions on neuroprotection, inflammation and microglial activation stands out as a promising pathway for new therapeutic targets, especially the purinergic receptor P2X7 (P2X7R). Thus, the purpose of this thesis is to characterize the involvement of the purinergic system in the pathophysiology of bipolar disorder. In general, we evaluated purinergic system metabolites in serum from bipolar disorder patients and healthy controls, correlating with clinical data. We evaluated the frequency of P2RX7 1513A>C polymorphism in bipolar disorder patients and in healthy subjects. We performed a pharmacological animal model of mania and investigated the involvement of the P2X7 purinergic receptor in this model and finally we sought to better understand the neuroprotective action of lithium by verifying the purinergic participation. Our results primarily showed a decrease in adenosine levels in patients compared to controls and a significant inverse correlation between adenosine levels and worsening of symptoms. We also demonstrated that patients with bipolar disorder present a decrease in the frequency of the 1513C allele and the potential increase in the frequency of genotype 1513AA and 1513AA/AC in relation to controls, setting a worse prognosis of the most active form of the receptor. We also showed that P2X7R plays an important role in the establishment of the mania model, modulating mainly the dopaminergic pathway that is reflected in the behavioral change observed by the model. Finally, lithium was able to prevent the insult response in neuronal cells (PC-12 lineage) and was not capable of preventing P2X7R-mediated activation in microglial cells (N9 lineage), indicating a differentiated cellular response. We can conclude that in a translational way we could demonstrate the participation of the purinergic system in the pathophysiology of bipolar disorder. We also suggested a possible biomarker for both diagnosis and progression of the disorder, the serum adenosine levels, and a potential genetic marker for prediction and diagnosis, the polymorphism of P2X7R 1513A>C. Lastly we contributed to the understanding of lithium action mechanism and defined a potential new therapeutic target for the disorder, the P2X7 receptor.