Zusammenfassung der Arbeit Beteiligung purinerger Rezeptoren am Schmerzgeschehen und an der neuronalen Entwicklung Patrizia Rubini Illes Rudolf-Boehm-Institut für Pharmakologie und Toxikologie, Universität Leipzig Diese kumulative Arbeit umfasst neun Publikationen, welche die Beteiligung purinerger P2-Rezeptoren (P2R) am Schmerzgeschehen sowie der neuronalen Entwicklung belegen. Im Fokus stehen zwei ATP-aktivierte Rezeptor-Kanäle (P2X3R, P2X7R) und ein G-Protein-gekoppelter, ATP-empfindlicher Rezeptor (P2Y1R). (1) Da sich humane P2X3R an peripheren und zentralen Endigungen primärer-sensorischer Afferenzen befinden, ist die Entschlüsselung der Agonisten-Bindungsstelle für die Entwicklung potenziell analgetisch wirkender, kompetitiver Antagonisten von großer Bedeutung. Wir identifizierten Gruppen konservierter und nicht-konservierter Aminosäure-Reste, die an der Schnittstelle zweier benachbarter Untereinheiten, die Agonisten-Bindungstasche auskleiden. Abhängig vom Mengenverhältnis der zur Transfektion verwendeten cDNA, bilden P2X2-, P2X3- und P2X6-Untereinheiten heteromere Rezeptoren (P2X2/3R, P2X2/6R) in einer variablen Stöchiometrie. (2) Adulte neurale Progenitorzellen (NPZ) der Subventrikulärzone der Maus besitzen Apoptose- bzw. Nekrose-vermittelnde P2X7R. Diese kommen in Assoziation mit P2X4R vor, bilden jedoch wahrscheinlich keinen heteromeren P2X4/7R. P2X7R könnten zum Absterben der, nach metabolischen Schäden im Überschuss gebildeten, NPZ beitragen. Im Laufe der neuronalen Entwicklung verlieren die NPZ ihre P2X7R. Im Gegensatz hierzu bleiben diese bei ihren astrozytären Nachkommen erhalten. (3) Humane mesencephale embryonale NPZ sind mit P2Y1R ausgestattet, die über eine Ca2+-Wellenaktivität die Proliferation der NPZ beschleunigen und in Differenzierungsvorgänge eingreifen. De-differenzierte, kultivierte Neurone des Ratten-Striatum enthalten ebenfalls P2Y1R. Diese setzen Ca2+ aus seinen intrazellulären Speichern frei und öffnen somit Ca2+-selektive „store-operated channels“ in der Zellmembran. Wir konnten zeigen, dass der P2Y1R-stimulierte Anstieg der intrazellulären Ca2+-Konzentration in den striatalen Neuronen durch die Aktivierung von Dopamin D1- und D2R inhibiert wurde. Die vorliegende Arbeit belegt die Bedeutung einiger P2R für zahlreiche, auch potentiell therapeutisch bedeutsame Funktionen des menschlichen und tierischen Organismus.

Retinale Hypoxie ist ein wichtiger Faktor bei der Pathogenese der altersbedingten Makuladegeneration (AMD), einer Erkrankung, die mit einer chronischen Entzündungsreaktion einhergeht. Das angeborene Immunsystem besitzt eine Vielzahl von Mechanismen, um pathogene Faktoren zu erkennen und zu eliminieren. Dazu gehört u.a. das NLRP3-Inflammasom, das wahrscheinlich auch bei der AMD in der Netzhaut aktiviert ist. Die Aktivierung des Inflammasoms ist ein Zweischrittprozess: der erste Schritt, das Priming, besteht in der Transkription von NLRP3-assoziierten Genen. Im zweiten Schritt kommt es zu einer Assemblierung der Inflammasombestandteile, so dass das aktivierte Inflammasom pro-IL-1ß in das biologisch aktive IL-1ß umwandelt. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es herauszufinden, ob Hypoxie in kultivierten humanen retinalen Pigmentepithelzellen (RPE)-Zellen die Transkription und Aktivierung des NLRP3-Inflammasoms induziert. Es sollte auch ermittelt werden, welche Signalwege die hypoxischen Veränderungen der Genexpression von NLRP3 und des vaskulären endothelialen Wachstumsfaktors (VEGF-A) vermitteln. Dafür wurden Untersuchungen an humanen RPE-Zellen, die in 0,2% O2 bzw. in Anwesenheit von CoCl2 kultiviert wurden, durchgeführt. Hypoxie bewirkte keine Veränderungen der Genexpression der Inflammasom-assoziierten Proteine NLRP1, NLRP6, NLRP7, NLRP12 und NLRC4, wohingegen die Expression der NLRP3- und IL-1ß-Gene sowie der NLRP3- und IL-1ß-Proteingehalt in RPE-Zellen erhöht wurden. Verschiedene Signalwege vermitteln die Hypoxie-induzierte Transkription des NLRP3-Gens. Hierzu zählen die Transkriptionsfaktoren CREB und HIF, Proteinkinase A, IP3-Rezeptoren, calcium-bindende Proteine, TRP- und SOS-Kanäle sowie autokrine/parakrine Aktivierung von EGF-, TGF-ß1-, FGF- und IL-1ß-Rezeptoren. Desweiteren wurde auch eine Beteiligung der autokrin/parakrinen Aktivierung von purinergen Rezeptoren an der hypoxischen NLRP3-Genexpression nachgewiesen. Eine Pannexin-abhängige Freisetzung von ATP trägt über eine Aktivierung von P2Y2- und Adenosin-A1-Rezeptoren zur hypoxischen Expression des NLRP3-Gens bei. Die Aktivierung der P2Y2-Rezeptoren trägt auch zur hypoxischen Expression und Sekretion von VEGF bei. Es konnte auch gezeigt werden, dass eine durch lysosomale Destabilisierung bewirkte Aktivierung des NLRP3-Inflammasoms eine Verringerung der RPE-Zellviabilität unter hypoxischen Bedingungen bewirkt. Die Daten lassen vermuten, dass Hypoxie ein Faktor ist, der ein Priming und eine Aktivierung des NLRP3-Inflammasoms in RPE-Zellen bewirkt. Dies könnte eine retinale Inflammation und eine Degeneration der RPE-Zellen begünstigen. Eine Aktivierung von P2Y2-Rezeptoren trägt sowohl zur Aktivierung des NLRP3-Inflammasoms als auch zur Produktion des angiogenen Faktors VEGF-A in RPE-Zellen bei.:Inhaltsverzeichnis 1. Abkürzungsverzeichnis 2. Einführung 2.1. Das retinale Pigmentepithel-Aufbau und Funktionen 2.2. Die Altersbedingte Makuladegneration (AMD) 2.2.1. Epidemiologie und Ätiologie 2.2.2. Pathophysiologie und Klassifikation der AMD 2.2.2.1. Frühe AMD 2.2.2.2. GA und CNV – Spätformen der AMD 2.3. Zusammenhang zwischen AMD und Immunsystem 2.4. Das NLRP3-Inflammasom 2.4.1. Signalerkennung, Rezeptoren und Aufbau des NLRP3-Inflammasoms 2.4.2. Aktivierung des Inflammasoms 2.4.3. Wirkung von inflammatorischen Prozessen und Zytokinen auf die RPE-Zelle 2.5. Komplementsystem und AMD 2.6. Therapie der AMD 3. Aufgabenstellung 4. Materialien und Methoden 4.1. Materialien 4.1.1. Chemikalien 4.1.2. Substanzen zur Zellstimulation 4.1.3. Geräte und Sonstige Materialien 4.1.4. Primerpaare 4.1.5. Antikörper für die Western-Blot-Analyse 4.1.6. ELISA 4.2. Methoden 4.2.1. Zellkultivierung und Zellstimulation 4.2.2. Zellvitalität 4.2.3. RNA Präparation 4.2.4. cDNA Synthese 4.2.5. Quantitative Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion (qRT-PCR) 4.2.6. Agarose – Gelelektrophorese 4.2.7. siRNA Transfektion 4.2.8. ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) 4.2.9. Western-Blot, Proteinbestimmung nach Bradford und SDS-PAGE 4.3. Statistische Auswertung 5. Ergebnisse 5.1. Genexpression von Inflammasom-assoziierten Proteinen 5.2. Wirkung von Hypoxie auf die Genexpression von Inflammasomproteinen 5.3. Hypoxisch induzierte Expression von NLRP3 und IL-1ß Protein 5.4. RPE Zellvitalität 5.5. Regulation der Genexpression von NLRP3 und VEGF unter hypoxischen Bedingungen 5.5.1. Transkriptionsfaktoren 5.5.2. Beteiligung intrazellulärer Signalkaskaden 5.5.2.1. NLRP3 mRNA Expression 5.5.2.2. VEGF-A mRNA-Expression 5.5.3. Beteiligung von extrazellulären Signalproteinen 5.5.3.1. NLRP3 mRNA-Expression 5.5.3.2. VEGFA-mRNA-Expression 5.5.4. Beteiligung purinerger Rezeptoren 5.5.4.1. NLRP3 mRNA Expression 5.5.4.2. VEGF-A mRNA-Expression 5.5.5. Rolle purinerger Rezeptoren bei der Hypoxie-induzierten Sekretion von VEGF 6. Diskussion 6.1. Hypoxie induziert Priming und Aktivierung des NLRP3-Inflammasoms 6.2. Hypoxie-induzierte Signalwege, die die Expression von NLRP3 und VEGF-A regulieren 6.2.1. Transkriptionsfaktoren 6.2.2. Intra- und extrazelluläre Signaltransduktion 6.2.3. Rolle purinerger Rezeptoren bei der hypoxischen Expression von NLRP3 und VEGF 6.3. Chemische Hypoxie vs. Kultivierung in 0,2% O2 6.4. Einfluss der Inflammasomaktivierung auf die Expression und Sekretion von VEGF in RPE-Zellen 6.5. Mögliche klinische Bedeutung der Ergebnisse für die AMD 7. Zusammenfassung 8. Literaturverzeichnis 9. Anhang 9.1. Danksagung 9.2. Abbildungsverzeichnis 9.3. Lebenslauf 9.4. Eigenständigkeitserklärung

Zusammenfassung der Arbeit Beteiligung purinerger Rezeptoren am Schmerzgeschehen und an der neuronalen Entwicklung Patrizia Rubini Illes Rudolf-Boehm-Institut für Pharmakologie und Toxikologie, Universität Leipzig Diese kumulative Arbeit umfasst neun Publikationen, welche die Beteiligung purinerger P2-Rezeptoren (P2R) am Schmerzgeschehen sowie der neuronalen Entwicklung belegen. Im Fokus stehen zwei ATP-aktivierte Rezeptor-Kanäle (P2X3R, P2X7R) und ein G-Protein-gekoppelter, ATP-empfindlicher Rezeptor (P2Y1R). (1) Da sich humane P2X3R an peripheren und zentralen Endigungen primärer-sensorischer Afferenzen befinden, ist die Entschlüsselung der Agonisten-Bindungsstelle für die Entwicklung potenziell analgetisch wirkender, kompetitiver Antagonisten von großer Bedeutung. Wir identifizierten Gruppen konservierter und nicht-konservierter Aminosäure-Reste, die an der Schnittstelle zweier benachbarter Untereinheiten, die Agonisten-Bindungstasche auskleiden. Abhängig vom Mengenverhältnis der zur Transfektion verwendeten cDNA, bilden P2X2-, P2X3- und P2X6-Untereinheiten heteromere Rezeptoren (P2X2/3R, P2X2/6R) in einer variablen Stöchiometrie. (2) Adulte neurale Progenitorzellen (NPZ) der Subventrikulärzone der Maus besitzen Apoptose- bzw. Nekrose-vermittelnde P2X7R. Diese kommen in Assoziation mit P2X4R vor, bilden jedoch wahrscheinlich keinen heteromeren P2X4/7R. P2X7R könnten zum Absterben der, nach metabolischen Schäden im Überschuss gebildeten, NPZ beitragen. Im Laufe der neuronalen Entwicklung verlieren die NPZ ihre P2X7R. Im Gegensatz hierzu bleiben diese bei ihren astrozytären Nachkommen erhalten. (3) Humane mesencephale embryonale NPZ sind mit P2Y1R ausgestattet, die über eine Ca2+-Wellenaktivität die Proliferation der NPZ beschleunigen und in Differenzierungsvorgänge eingreifen. De-differenzierte, kultivierte Neurone des Ratten-Striatum enthalten ebenfalls P2Y1R. Diese setzen Ca2+ aus seinen intrazellulären Speichern frei und öffnen somit Ca2+-selektive „store-operated channels“ in der Zellmembran. Wir konnten zeigen, dass der P2Y1R-stimulierte Anstieg der intrazellulären Ca2+-Konzentration in den striatalen Neuronen durch die Aktivierung von Dopamin D1- und D2R inhibiert wurde. Die vorliegende Arbeit belegt die Bedeutung einiger P2R für zahlreiche, auch potentiell therapeutisch bedeutsame Funktionen des menschlichen und tierischen Organismus.:Inhaltsverzeichnis Kapitel Seite Abkürzungen …………………………………………………………………………………. 5 1. Einführung in die Thematik.......................................................................... 7 1.1. Freisetzung von Nukleotiden und ihre Metabolisierung im Extrazellulärraum …7………………………………… 1.2. P2X-Rezeptoren…………………………………………………………………….. 9 1.3. P2Y-Rezeptoren……………………………………………………………………. 12 1.4. P2-Rezeptoren und Schmerz……………………………………………………... 14 1.5. P2-Rezeptoren und neuronale Entwicklung; embryonale undadulte neurale Vorläuferzellen……………………………………………………. 17 1.6. Referenzen………………………………………………………………………….. 19 2. Wissenschaftliche Ergebnisse……………………………………………………… 23 2.1. Komplex I. Struktur-Wirkungs-Zusammenhänge bei rekombinanten, humanen P2X3- und P2X2/3-Rezeptoren in Expressionssystemen…………. 24 2.1.1. Amino acid residues constituting the agonist binding site of the human P2X3 receptor……………………………………………………………… 24 2.1.2. ATP binding site mutagenesis reveals different subunit stoichiometry of functional P2X2/3 and P2X2/6 receptors……………………………………... 26 2.1.3 Flexible subunit stoichiometry of functional human P2X2/3 heteromeric receptors……………………………………………………………... 28 2.2. Komplex II. Vorhandensein und Wirkung von P2X7-Rezeptoren an kultivierten adulten, neuralen Vorläuferzellen und Astrozyten………….. 29 2.2.1. P2X7 receptors at adult neural progenitor cells of the mouse subventricular zone………………………………………………………………… 29 2.2.2. Co-expression of functional P2X4 and P2X7 receptors at adult neural precursor cells of the mouse subventricular zone……………………… 31 2.2.3. Functional P2X7 receptors at cultured hippocampal astrocytes but not neurons…………………………………………………………………….. 32 2.3. Komplex III. Vorhandensein und Wirkung von P2Y-Rezeptoren an embryonalen neuralen Vorläuferzellen und dedifferenzierten kultivierten striatalenNeuronen... 33 2.3.1. Increase of intracellular Ca2+ by adenine and uracil nucleotides in human midbrain-derived neuronal precursor cells…………... 33 2.3.2. Regulation of intracellular Ca2+ by P2Y1 receptors may depend on the developmental stage of cultured rat striatal neurons…………………... 35 2.3.3. Modulation by D1 and D2 dopamine receptors of ATP-induced release of intracellular Ca2+ in cultured rat striatal neurons 36 3. Zusammenfassung und Ausblick………………………………………… ………... 37 4. Erklärungen, Danksagung…………………………………………… 38 Erklärung über die eigenständige Anfertigung der Arbeit………… 38 Erklärung über den eigenen Anteil an den einzelnen Arbeiten…………….. 39 Danksagung………………………………………………………………… 42

Gegenstand der vorliegenden Arbeit sind die purinergen Rezeptoren P2X4R und P2X7R. Die P2XR werden durch ATP aktiviert und stellen unselektive Kationenkanäle dar, die auch für Ca2+ durchlässig sind. Beiden P2XR-Subtypen werden in den Alveolarepithel Typ I (AT I)-Zellen der Lunge exprimiert und aufgrund ihrer Kanalaktivitäten in Zusammenhang mit der alveolären Flüssigkeitshomöostase gebracht. Bei bisherigen Untersuchungen wurde jedoch die mögliche Assoziation und Modulation der P2XR durch Mikrodomänen der Zellmembran außer Acht gelassen. Ein Modell von Garcia-Marcos zeigt, dass P2X7R in Zellen der Glandula submandibularis zum Teil mit Mikrodomänen assoziiert ist. Die funktionellen Eigenschaften von P2X7R sind dabei von der Lokalisation in der Zellmembran abhängig (Garcia-Marcos et al., 2006). Die Caveolen sind eine spezielle Form von Mikrodomänen, die in der Zellmembran der AT I-Zellen auftreten. Das Hauptstrukturprotein der Caveolen im Lungenepithel ist Caveolin-1 (Cav-1). Über die Verteilung von P2X4R und P2X7R in den AT I-Zellen war bislang sehr wenig bekannt. Unsere Arbeitsgruppe identifizierte bei einer Sequenzanalyse potentielle Cav-1-Bindemotive in der Aminosäureabfolge beider P2XR (Couet et al., 1997). Die Assoziation mit den Caveolen würde die P2XR in die räumliche Nähe verschiedener Signalmoleküle bringen und die Beteiligung an downstream Events ermöglichen. Für die folgenden Analysen wurde die Alveolarepithelzelllinie E10 genutzt, da die E10-Zellen AT I-typische Eigenschaften besitzen und P2X4R, P2X7R sowie die Caveoline Cav-1 und Cav-2 aufweisen. Die Untersuchungen konzentrierten sich auf die Assoziation von P2X4R und P2X7R mit Mikrodomänen der Zellmembran sowie die wechselseitige Beziehung der P2XR. Besonders wurde dabei auf die Assoziation der P2XR mit Cav-1 eingegangen. Zusätzlich wurde in vitro die Interaktion der C-terminalen Bereiche der beiden P2XR mit Membranlipiden untersucht. Einige Membranlipide sind eng mit weiteren Signalmolekülen verknüpft. Aus diesem Grund wurde die Auswirkungen der Reduzierung von P2X4R und P2X7R auf den Proteingehalt der Ca2+-aktivierbaren downstream-Effektoren PKCβI und CaM analysiert. Die Auswertungen der Ergebnisse ergaben Folgendes: P2X4R und P2X7R sind Subtyp-spezifisch in den Mikrodomänen der Zellmembran von E10-Zellen verteilt. Mit Hilfe von biochemischen und immunfluoreszenz-mikroskopischen Methoden konnte die Assoziation von P2X4R und P2X7R mit Mikrodomänen nachgewiesen werden. P2X7R ist zum Teil mit Cav-1 assoziiert, wobei Förster Resonanz Energie Transfer (FRET)-Analysen ergaben, dass beide Proteine partiell einen Abstand von kleiner als 10 nm zueinander aufweisen. Durch die Subtyp-spezifische Verteilung könnte die Funktionalität der P2XR-Subtypen spezifisch durch die Bestandteile der Mikrodomänen moduliert und reguliert werden (Martens et al., 2001). P2X4R und P2X7R sind in hochmolekularen Proteinkomplexen assoziiert. Die Ausbildung von hochmolekularen Proteinkomplexen wird in Zusammenhang mit der Assoziation von Proteinen mit Mikrodomänen diskutiert (Zurzolo et al., 2003). Die Untersuchung der molekularen Organisation von P2X4R und P2X7R in E10-Zellen mittels blue native- und high resolution clear native-PAGE zeigte, dass beide P2XR mit hochmolekularen Proteinkomplexen assoziiert sind. P2X7R konnte in drei Komplexen nachgewiesen werden. Im ersten Komplex von ~760 kDa liegt P2X7R mit Cav-1 assoziiert vor, während der dominant auftretende, zweite P2X7R-Subkomplex von ~580 kDa vermutlich nicht mit dem co-migrierten Cav-1/Cav-2-Komplex in Verbindung steht. Der dritte P2X7R-assoziierte Komplex war zusammen mit P2X4R bei ~430 kDa nachweisbar und Immunpräzipitationen bestätigten, dass P2X4R und P2X7R in einem Komplex miteinander assoziiert sind (Weinhold et al., 2010). P2X4R und P2X7R stehen in Wechselbeziehung zueinander. Diese Ergebnisse der siRNA-induzierte Herabregulation von P2X4R und P2X7R lassen vermuten, dass die beiden Rezeptoren direkt oder indirekt miteinander verbunden sind. So führte die Reduzierung von P2X4R zur Erhöhung des P2X7R-Proteingehaltes. Dabei nimmt P2X7R in der Zellmembran zu und verändert seine Verteilung nicht. Umgekehrt nimmt der Proteingehalt von P2X4R in den E10-Zellen zu, wenn P2X7R herabreguliert wird. Die Zunahme von P2X4R in der Zellmembran konnte zwar durch die Biotinylierung der Oberflächenproteine nachgewiesen werden, aber die Verteilung von P2X4R verschob sich zugunsten des intrazellulären P2X4R-Anteils. Vermutlich führt die Reduzierung von P2X7R zu Störungen im exo-/endozytotischen System. Die wechselseitige Zunahme der P2XR in den Mikrodomänen weist zudem auf einen kompensatorischen Mechanismus hin. Negativ geladene Phospholipide interagieren direkt mit den C-terminalen Abschnitten der P2XR. Mit den in vitro Bindetests konnte gezeigt werden, dass die C-terminalen Enden von P2X4R und P2X7R direkt mit den negativ geladenen Phosphoinositiden PI(4)P, PI(4,5)P2, PI(3,4,5)P3 sowie mit Phosphatidsäure, Phosphatidylserin, Phosphatidylglycerol, Cardiolipin und 3 Sulfogalactosylceramid interagieren können. Die Regulation der P2XR durch diese Phospholipide, vor allem PI(4,5)P2, und die Beteiligung der P2XR an Lipid-vermittelten Signalwegen in Epithelzellen, stellen einen möglichen Link zu weiteren downstream-Signalen dar. Die Reduzierung von P2X7R beeinflusst den Proteingehalt der downstream-Effektoren PKCβI und CaM. Sowohl im Lungengewebe von P2rx7(-/-) Mäusen als auch nach der Reduzierung von P2X7R in den E10-Zellen zeigte sich, dass der Proteingehalt der Signalmoleküle PKCβI und CaM vermindert war. Reduzierung von P2X4R hatte dagegen kaum Einfluss auf PKCβI und führte zur Erhöhung des CaM-Proteingehaltes, vermutlich hervorgerufen durch die Zunahme von P2X7R. Beide downstream-Effektoren sind in Mikrodomänen (Caveolen) der Zellmembran lokalisiert und können sowohl durch Lipid-vermittelte Signale als auch durch einen Kanal-vermittelten Ca2+-Einstrom aktiviert und reguliert werden. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigten, dass P2X4R und P2X7R in AT I-Zellen der Lunge nicht nur Kanaleigenschaften besitzen, sondern durch die Assoziation mit unterschiedlichen Mikrodomänen an verschiedene Signalwege gekoppelt sind. Trotzdem ist bisher wenig über die Funktionen der P2XR in AT I-Zellen hinsichtlich der Beteiligung an apoptotischen Prozessen, der Proliferation, der Differenzierung oder Migration und Wundheilung bekannt (Barth and Kasper, 2009). Aufgrund der komplexen Funktion, vor allem durch die Assoziation mit Cav-1 und der Wechselbeziehung mit dem P2X4R, wird der P2X7R für zukünftige Forschungen im alveolären Lungenepithel von Bedeutung sein. Barth K, Kasper M (2009) Membrane compartments and purinergic signalling: occurrence and function of P2X receptors in lung. FEBS J 276:341-353. Couet J, Li S, Okamoto T, Ikezu T, Lisanti MP (1997) Identification of peptide and protein ligands for the caveolin-scaffolding domain. Implications for the interaction of caveolin with caveolae-associated proteins. J Biol Chem 272:6525-6533. Garcia-Marcos M, Perez-Andres E, Tandel S, Fontanils U, Kumps A, Kabre E, Gomez-Munoz A, Marino A, Dehaye JP, Pochet S (2006) Coupling of two pools of P2X7 receptors to distinct intracellular signaling pathways in rat submandibular gland. J Lipid Res 47:705-714. Martens JR, Sakamoto N, Sullivan SA, Grobaski TD, Tamkun MM (2001) Isoform-specific localization of voltage-gated K+ channels to distinct lipid raft populations. Targeting of Kv1.5 to caveolae. J Biol Chem 276:8409-8414. Weinhold K, Krause-Buchholz U, Rödel G, Kasper M, Barth K (2010) Interaction and interrelation of P2X7 and P2X4 receptor complexes in mouse lung epithelial cells. Cell Mol Life Sci 67:2631-2642. Zurzolo C, van Meer G, Mayor S (2003) The order of rafts. Conference on microdomains, lipid rafts and caveolae. EMBO Rep 4:1117-1121.

Gegenstand der vorliegenden Arbeit sind die purinergen Rezeptoren P2X4R und P2X7R. Die P2XR werden durch ATP aktiviert und stellen unselektive Kationenkanäle dar, die auch für Ca2+ durchlässig sind. Beiden P2XR-Subtypen werden in den Alveolarepithel Typ I (AT I)-Zellen der Lunge exprimiert und aufgrund ihrer Kanalaktivitäten in Zusammenhang mit der alveolären Flüssigkeitshomöostase gebracht. Bei bisherigen Untersuchungen wurde jedoch die mögliche Assoziation und Modulation der P2XR durch Mikrodomänen der Zellmembran außer Acht gelassen. Ein Modell von Garcia-Marcos zeigt, dass P2X7R in Zellen der Glandula submandibularis zum Teil mit Mikrodomänen assoziiert ist. Die funktionellen Eigenschaften von P2X7R sind dabei von der Lokalisation in der Zellmembran abhängig (Garcia-Marcos et al., 2006). Die Caveolen sind eine spezielle Form von Mikrodomänen, die in der Zellmembran der AT I-Zellen auftreten. Das Hauptstrukturprotein der Caveolen im Lungenepithel ist Caveolin-1 (Cav-1). Über die Verteilung von P2X4R und P2X7R in den AT I-Zellen war bislang sehr wenig bekannt. Unsere Arbeitsgruppe identifizierte bei einer Sequenzanalyse potentielle Cav-1-Bindemotive in der Aminosäureabfolge beider P2XR (Couet et al., 1997). Die Assoziation mit den Caveolen würde die P2XR in die räumliche Nähe verschiedener Signalmoleküle bringen und die Beteiligung an downstream Events ermöglichen. Für die folgenden Analysen wurde die Alveolarepithelzelllinie E10 genutzt, da die E10-Zellen AT I-typische Eigenschaften besitzen und P2X4R, P2X7R sowie die Caveoline Cav-1 und Cav-2 aufweisen. Die Untersuchungen konzentrierten sich auf die Assoziation von P2X4R und P2X7R mit Mikrodomänen der Zellmembran sowie die wechselseitige Beziehung der P2XR. Besonders wurde dabei auf die Assoziation der P2XR mit Cav-1 eingegangen. Zusätzlich wurde in vitro die Interaktion der C-terminalen Bereiche der beiden P2XR mit Membranlipiden untersucht. Einige Membranlipide sind eng mit weiteren Signalmolekülen verknüpft. Aus diesem Grund wurde die Auswirkungen der Reduzierung von P2X4R und P2X7R auf den Proteingehalt der Ca2+-aktivierbaren downstream-Effektoren PKCβI und CaM analysiert. Die Auswertungen der Ergebnisse ergaben Folgendes: P2X4R und P2X7R sind Subtyp-spezifisch in den Mikrodomänen der Zellmembran von E10-Zellen verteilt. Mit Hilfe von biochemischen und immunfluoreszenz-mikroskopischen Methoden konnte die Assoziation von P2X4R und P2X7R mit Mikrodomänen nachgewiesen werden. P2X7R ist zum Teil mit Cav-1 assoziiert, wobei Förster Resonanz Energie Transfer (FRET)-Analysen ergaben, dass beide Proteine partiell einen Abstand von kleiner als 10 nm zueinander aufweisen. Durch die Subtyp-spezifische Verteilung könnte die Funktionalität der P2XR-Subtypen spezifisch durch die Bestandteile der Mikrodomänen moduliert und reguliert werden (Martens et al., 2001). P2X4R und P2X7R sind in hochmolekularen Proteinkomplexen assoziiert. Die Ausbildung von hochmolekularen Proteinkomplexen wird in Zusammenhang mit der Assoziation von Proteinen mit Mikrodomänen diskutiert (Zurzolo et al., 2003). Die Untersuchung der molekularen Organisation von P2X4R und P2X7R in E10-Zellen mittels blue native- und high resolution clear native-PAGE zeigte, dass beide P2XR mit hochmolekularen Proteinkomplexen assoziiert sind. P2X7R konnte in drei Komplexen nachgewiesen werden. Im ersten Komplex von ~760 kDa liegt P2X7R mit Cav-1 assoziiert vor, während der dominant auftretende, zweite P2X7R-Subkomplex von ~580 kDa vermutlich nicht mit dem co-migrierten Cav-1/Cav-2-Komplex in Verbindung steht. Der dritte P2X7R-assoziierte Komplex war zusammen mit P2X4R bei ~430 kDa nachweisbar und Immunpräzipitationen bestätigten, dass P2X4R und P2X7R in einem Komplex miteinander assoziiert sind (Weinhold et al., 2010). P2X4R und P2X7R stehen in Wechselbeziehung zueinander. Diese Ergebnisse der siRNA-induzierte Herabregulation von P2X4R und P2X7R lassen vermuten, dass die beiden Rezeptoren direkt oder indirekt miteinander verbunden sind. So führte die Reduzierung von P2X4R zur Erhöhung des P2X7R-Proteingehaltes. Dabei nimmt P2X7R in der Zellmembran zu und verändert seine Verteilung nicht. Umgekehrt nimmt der Proteingehalt von P2X4R in den E10-Zellen zu, wenn P2X7R herabreguliert wird. Die Zunahme von P2X4R in der Zellmembran konnte zwar durch die Biotinylierung der Oberflächenproteine nachgewiesen werden, aber die Verteilung von P2X4R verschob sich zugunsten des intrazellulären P2X4R-Anteils. Vermutlich führt die Reduzierung von P2X7R zu Störungen im exo-/endozytotischen System. Die wechselseitige Zunahme der P2XR in den Mikrodomänen weist zudem auf einen kompensatorischen Mechanismus hin. Negativ geladene Phospholipide interagieren direkt mit den C-terminalen Abschnitten der P2XR. Mit den in vitro Bindetests konnte gezeigt werden, dass die C-terminalen Enden von P2X4R und P2X7R direkt mit den negativ geladenen Phosphoinositiden PI(4)P, PI(4,5)P2, PI(3,4,5)P3 sowie mit Phosphatidsäure, Phosphatidylserin, Phosphatidylglycerol, Cardiolipin und 3 Sulfogalactosylceramid interagieren können. Die Regulation der P2XR durch diese Phospholipide, vor allem PI(4,5)P2, und die Beteiligung der P2XR an Lipid-vermittelten Signalwegen in Epithelzellen, stellen einen möglichen Link zu weiteren downstream-Signalen dar. Die Reduzierung von P2X7R beeinflusst den Proteingehalt der downstream-Effektoren PKCβI und CaM. Sowohl im Lungengewebe von P2rx7(-/-) Mäusen als auch nach der Reduzierung von P2X7R in den E10-Zellen zeigte sich, dass der Proteingehalt der Signalmoleküle PKCβI und CaM vermindert war. Reduzierung von P2X4R hatte dagegen kaum Einfluss auf PKCβI und führte zur Erhöhung des CaM-Proteingehaltes, vermutlich hervorgerufen durch die Zunahme von P2X7R. Beide downstream-Effektoren sind in Mikrodomänen (Caveolen) der Zellmembran lokalisiert und können sowohl durch Lipid-vermittelte Signale als auch durch einen Kanal-vermittelten Ca2+-Einstrom aktiviert und reguliert werden. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigten, dass P2X4R und P2X7R in AT I-Zellen der Lunge nicht nur Kanaleigenschaften besitzen, sondern durch die Assoziation mit unterschiedlichen Mikrodomänen an verschiedene Signalwege gekoppelt sind. Trotzdem ist bisher wenig über die Funktionen der P2XR in AT I-Zellen hinsichtlich der Beteiligung an apoptotischen Prozessen, der Proliferation, der Differenzierung oder Migration und Wundheilung bekannt (Barth and Kasper, 2009). Aufgrund der komplexen Funktion, vor allem durch die Assoziation mit Cav-1 und der Wechselbeziehung mit dem P2X4R, wird der P2X7R für zukünftige Forschungen im alveolären Lungenepithel von Bedeutung sein. Barth K, Kasper M (2009) Membrane compartments and purinergic signalling: occurrence and function of P2X receptors in lung. FEBS J 276:341-353. Couet J, Li S, Okamoto T, Ikezu T, Lisanti MP (1997) Identification of peptide and protein ligands for the caveolin-scaffolding domain. Implications for the interaction of caveolin with caveolae-associated proteins. J Biol Chem 272:6525-6533. Garcia-Marcos M, Perez-Andres E, Tandel S, Fontanils U, Kumps A, Kabre E, Gomez-Munoz A, Marino A, Dehaye JP, Pochet S (2006) Coupling of two pools of P2X7 receptors to distinct intracellular signaling pathways in rat submandibular gland. J Lipid Res 47:705-714. Martens JR, Sakamoto N, Sullivan SA, Grobaski TD, Tamkun MM (2001) Isoform-specific localization of voltage-gated K+ channels to distinct lipid raft populations. Targeting of Kv1.5 to caveolae. J Biol Chem 276:8409-8414. Weinhold K, Krause-Buchholz U, Rödel G, Kasper M, Barth K (2010) Interaction and interrelation of P2X7 and P2X4 receptor complexes in mouse lung epithelial cells. Cell Mol Life Sci 67:2631-2642. Zurzolo C, van Meer G, Mayor S (2003) The order of rafts. Conference on microdomains, lipid rafts and caveolae. EMBO Rep 4:1117-1121.

Extrazelulläre Purine und Pyrimidine sind wichtige Signalmoleküle, die über membranständige Rezeptoren, so genannte purinerge Rezeptoren ihre biologischen Effekte vermitteln. In der vorliegenden Arbeit wurden ATP-induzierte Antworten in den Stützzellen des olfaktorischen Epithels mit Hilfe der Calcium-Imaging-Technik charakterisiert.Die Applikation von ATP induzierte Zunahmen der intrazellulären Kalziumkonzentration ([Ca2+]i) sowohl in Anwesenheit, als auch in Abwesenheit von extrazellulärem Kalzium. Anders bei Anwendung von CPA, einem spezifischen Hemmstoff der Ca2+-ATPase des sarkoplasmatischen bzw. endoplasmatischen Retikulums. In diesen Versuchen wurden die ATP-induzierten [Ca2+]i-Zunahmen komplett aufgehoben. Das zeigt, dass die ATP-induzierten [Ca2+]i-Zunahmen in Stützzellen größtenteils, wenn nicht vollständig, durch die Aktivierung von G-Protein gekoppelten P2Y-Rezeptoren ausgelöst werden. Die ermittelte Wirkpotenz purinerger Agonisten war UTP>ATP>ATPγS. Die ATP-induzierten [Ca2+]i-Zunahmen konnten durch die purinergen Antagonisten PPADS und RB2 reduziert werden. Die hemmende Wirkung des purinergen Antagonisten Suramin blieb aus. Zusammen weisen die oben genannten Ergebnisse dieser Arbeit darauf hin, dass extrazelluläre Nukleotide die Stützzellen des olfaktorischen Epithels über P2Y2 / P2Y4-artige Rezeptoren aktivieren. Zusätzlich zeigten die Versuche mit dem Ektonukleotidase-Hemmstoff ARL 67156, dass im olfaktorischen Epithel von larvalen Xenopus laevis eine hohe Ektonukleotidasenaktivität herrscht.

Suburothelial myofibroblasts (sMF) are located underneath the urothelium in close proximity to afferent nerves and show spontaneous calcium activity in vivo and in vitro. They express purinergic receptors and calcium transients can be evoked by ATP. Therefore they are supposed to be involved in afferent signaling of the bladder fullness. Myofibroblast cultures, established from cystectomies, were challenged by exogenous ATP in presence or absence of purinergic antagonist. Fura-2 calcium imaging was used to monitor ATP (10-16 to 10-4 mol/l) induced alterations of calcium activity. Purinergic receptors (P2X1, P2X2, P2X3) were analysed by confocal immunofluorescence. We found spontaneous calcium activity in 55.18% ± 1.65 (mean ± SEM) of the sMF (N=48 experiments). ATP significantly increased calcium activity even at 10-16 mol/l. The calcium transients were partially attenuated by subtype selective antagonist (TNP-ATP, 1μM; A-317491, 1μM), and were mimicked by the P2X1, P2X3 selective agonist α,β-methylene ATP. The expression of purinergic receptor subtypes in sMF was confirmed by immunofluorescence. Our experiments demonstrate for the first time that ATP can modulate spontaneous activity and induce intracellular Ca2+ response in cultured sMF at very low concentrations, most likely involving ionotropic P2X receptors. These findings support the notion that sMF are able to register bladder fullness very sensitively, which predestines them for the modulation of the afferent bladder signaling in normal and pathological conditions.

Suburothelial myofibroblasts (sMF) are located underneath the urothelium in close proximity to afferent nerves and show spontaneous calcium activity in vivo and in vitro. They express purinergic receptors and calcium transients can be evoked by ATP. Therefore they are supposed to be involved in afferent signaling of the bladder fullness. Myofibroblast cultures, established from cystectomies, were challenged by exogenous ATP in presence or absence of purinergic antagonist. Fura-2 calcium imaging was used to monitor ATP (10-16 to 10-4 mol/l) induced alterations of calcium activity. Purinergic receptors (P2X1, P2X2, P2X3) were analysed by confocal immunofluorescence. We found spontaneous calcium activity in 55.18% ± 1.65 (mean ± SEM) of the sMF (N=48 experiments). ATP significantly increased calcium activity even at 10-16 mol/l. The calcium transients were partially attenuated by subtype selective antagonist (TNP-ATP, 1μM; A-317491, 1μM), and were mimicked by the P2X1, P2X3 selective agonist α,β-methylene ATP. The expression of purinergic receptor subtypes in sMF was confirmed by immunofluorescence. Our experiments demonstrate for the first time that ATP can modulate spontaneous activity and induce intracellular Ca2+ response in cultured sMF at very low concentrations, most likely involving ionotropic P2X receptors. These findings support the notion that sMF are able to register bladder fullness very sensitively, which predestines them for the modulation of the afferent bladder signaling in normal and pathological conditions.:1. Introduction............................................................................ 1 1.1. Anatomy and histology of the human urinary bladder..................... 1 1.1.1. Anatomy of the human urinary bladder..................................... 1 1.1.2. Structure of the human urinary bladder wall............................... 2 1.2. Normal bladder function and bladder dysfunction.......................... 3 1.2.1 Normal bladder function......................................................... 3 1.2.2 Sensory aspect.................................................................... 4 1.2.3 Overactivity or hypersensitivity of bladder.................................. 5 1.3 The role of functional cell types and interaction in urinary bladder... 6 1.3.1 The role of urothelium.......................................................... 7 1.3.2Theroleofsuburotheliamyofibroblast...................................... 7 1.3.3Theroleofdetrusorsmoothmusclecells.................................. 9 1.3.4 Possible interactions in urinary bladder cell types........................ 10 1.4 ATP function and Purinergic signalling in bladder........................... 11 1.5 Spontaneous activity of bladder................................................... 13 2. Objective.................................................................................. 15 3. Material and methods............................................................... 16 3.1. Ethics Statement........................................................................ 16 3.2. Cell preparation.......................................................................... 16 3.3. Solutions and chemicals............................................................. 19 3.4. Intracellular calcium measurements............................................. 20 2.4.1. Preparing cells for Calcium Imaging.......................................... 20 2.4.2. Preparing workspace of calcium imaging................................... 20 2.4.3. Calcium imaging recording...................................................... 22 3.5 Data analysis with automated Fluorescence analysis..................... 22 3.6 Confocal Immunofluorescence.................................................... 25 3.7 Statistics................................................................................. 26 4. Results.................................................................................. 27 4.1 Spontaneous calcium activity of sMF........................................... 27 4.2 ATP effects on calcium response in sMF...................................... 27 4.3 Analysis of purinergic receptors involved.................................... 30 3.3.1 Agonist stimulation.............................................................. 30 3.3.2 Signal inhibition by specific antagonists................................... 31 4.4 Confocal immunofluorescence of purinergic receptors.................. 32 5. Discussion............................................................................. 34 5.1 Myofibroblast identification....................................................... 34 5.2 Spontaneous activity in the bladder............................................ 36 5.3 ATP modulated calcium activity in sMF....................................... 37 5.4 purinergic signalling in sMF........................................................ 39 6. Summary................................................................................ 42 7. References.............................................................................. 45 Declaration............................................................................. 50 Acknowledgements................................................................. 51