This thesis aimed to investigate the role of alveolar epithelial cells (AEC) on immune responses against mycobacterial infections, specifically, the role of AEC in modulating macrophage functions through the secretion of broad variety of factors. In paper I, we compared murine AEC with interstitial macrophages (PuM) in their ability to take up and control mycobacterial growth and their capacity as antigen-presenting cells. We found that AEC were able to internalize and control bacterial growth and present antigens to T cells from immunized mice. In addition, both AEC and PuM exhibited distinct patterns of secreted factors, and a more comprehensive profile of AEC responses revealed that AEC were able to secrete different factors important to generate various effects in other cells. Paper II: Since AEC secrete a broad variety of factors, we hypothesized that being in the interface; AEC may play an important role in transmitting signals from the external to the internal compartment and in modulating the activity of PuM. Thus, we prepared AEC-derived media and tested their effect on bacteria and a number of macrophage functions a) migration, b) phagocytosis and control of intracellular bacterial growth, and c) alteration in cell morphology and expression of surface markers. We found that AEC-secreted factors had a dual effect, in one hand controlling bacterial growth and on the other hand increasing macrophage activity. In paper III, we first investigated the responsible mechanisms of intracellular bacterial growth control mediated by AEC-derived media. We found that infected macrophages upon AEC-secreted factors increased the control of intracellular bacterial growth by iNOS-independent pathways. Compared with other macrophage types, PuM, did not control the intracellular bacterial growth upon the well-known potent macrophage activator, IFN-γ. We found that SOCS1 was involved in the un-responsiveness to IFN-γ by PuM to control the intracellular bacterial growth. We suggested that PuM are restricted in their inflammatory responses perhaps for avoiding tissue damage. Overall, the current findings highlight the importance of AEC in the defense against bacterial infection in the lungs by secreting factors involved in activation and differentiation of immune cells such as macrophages. / <p>At the time of the doctoral defense, the following paper was unpublished and had a status as follows: Paper 3: Manuscript.</p>

Nous nous intéressons aux mécanismes moléculaires impliqués dans la physiopathologie de la fibrose pulmonaire idiopathique. La fibrose pulmonaire estcaractérisée par l’accumulation de protéines de la matrice extracellulaire et de fibroblastes dans les espaces aériens distaux. La désorganisation et la destructionalvéolaires qui résultent de la fibrose aboutissent à une altération des propriétés mécaniques du poumon et à une incapacité à réaliser les échanges gazeux responsables d’une insuffisance respiratoire parfois mortelle. Le pronostic de la fibrose pulmonaire idiopathique (FPI) est particulièrement mauvais puisque la médiane de survie est de 3 à 5 ans. Il n’existe actuellement aucune thérapeutique efficace dans la fibrose pulmonaire. Ainsi, il est crucial d’explorer de nouvelles hypothèses physiopathologiques dans cette maladie afin d’ouvrir de nouvelles voies thérapeutiques. L'apoptose joue un rôle clé dans le développement de nombreux organes et dans l'homéostasie tissulaire chez l'adulte. Les protéines de la famille BCL-2 sont des éléments essentiels de la machinerie apoptotique. Ces protéines agissent comme des régulateurs anti- ou pro-apoptotiques. Parmi les membres de la famille BCL-2, le facteur pro-apoptotique BAX contrôle la voie mitochondriale de l’apoptose. Des perturbations de l’apoptose ont été mises en cause dans des maladies pulmonaires comme la fibrose pulmonaire idiopathique. Des études récentes suggèrent fortement que les protéines de la famille BCL-2 sont également impliquées dans d’autres fonctions cellulaires que le contrôle de l'apoptose. De plus, la protéine BAX est aussi localisée dans le noyau de nombreux types cellulaires. Même si le rôle de la fraction cytoplasmique de BAX au cours de l’apoptose est assez bien caractérisé, les fonctions nucléaires de BAX ne sont pas connues. Ce travail de thèse a pour but de mieux comprendre le rôle de la forme nucléaire de BAX dans différents processus cellulaires fondamentaux impliqués dans la fibrogenèse. Notre étude montre que la protéine BAX est présente dans le noyau à proximité de l’euchromatine dans différentes lignées d’origine pulmonaire in vitro. Ensuite, nous montrons que la forme nucléaire de BAX est impliquée dans la progression du cycle cellulaire et dans le contrôle de l’état de différenciation myofibroblastique en condition basale. Enfin, nous avons détecté la forme nucléaire de BAX dans l’épithélium hyperplasique et les foyers de fibrose dans le poumon de FPI. / Summary not transmitted

No description available.

Many preterm infants require mechanical ventilation as life-saving therapy. However, ventilation-induced overpressure can result in lung diseases. Considering the lung as a viscoelastic material, positive pressure inside the lung results in increased hydrostatic pressure and tissue compression. To elucidate the effect of positive pressure on lung tissue mechanics and cell behavior, we mimic the effect of overpressure by employing an uniaxial load onto fetal and adult rat lungs with different deformation rates. Additionally, tissue expansion during tidal breathing due to a negative intrathoracic pressure was addressed by uniaxial tension. We found a hyperelastic deformation behavior of fetal tissues under compression and tension with a remarkable strain stiffening. In contrast, adult lungs exhibited a similar response only during compression. Young’s moduli were always larger during tension compared to compression, while only during compression a strong deformation-rate dependency was found. In fact, fetal lung tissue under compression showed clear viscoelastic features even for small strains. Thus, we propose that the fetal lung is much more vulnerable during inflation by mechanical ventilation compared to normal inspiration. Electrophysiological experiments with different hydrostatic pressure gradients acting on primary fetal distal lung epithelial cells revealed that the activity of the epithelial sodium channel (ENaC) and the sodium-potassium pump (Na,K-ATPase) dropped during pressures of 30 cmH2O. Thus, pressures used during mechanical ventilation might impair alveolar fluid clearance important for normal lung function.

Aims: T1α/(podoplanin) is abundantly expressed in the alveolar epithelial type I cells (ATI) of rodent and human lungs. Caveolin-1 is a classical primary structural protein of plasmalemal invaginations, so-called caveolae, which represent specialized lipid rafts, and which are particularly abundant in ATI cells. The biological functions of T1α in the alveolar epithelium are unknown. Here we report on the characteristics of raft domains in the microplicae/microvillar protrusions of ATI cells, which contain T1α. Methods: Detergent resistant membranes (DRMs) from cell lysates of the mouse epithelial ATI-like cell line E10 were prepared using different detergents followed by flotation in a sucrose gradient and tested by Western and dot blots with raft markers (caveolin-1, GM1) and nonraft markers (transferrin receptor, PDI and β-Cop). Immunocytochemistry was employed for the localization of T1α in E10 cells and in situ in rat lungs. Results: Our biochemical results showed that the solubility or insolubility of T1α and caveolin-1 differs in Triton X-100 and Lubrol WX, two distinct non-ionic detergents. Caveolin-1 was unsoluble in both detergents, whereas T1α was Triton X-100 soluble but Lubrol WX insoluble. Immunofluorescence double stainings revealed that both proteins were colocalized with GM1, while caveolin-1 and T1α were not colocalized in the plasma membrane. Cholesterol depletion modified the segregation of T1α in Lubrol WX DRMs. Cellular processes in ultrathin sections of cultured mouse E10 cells were immunogold positive. Immunoelectron microscopy (postembedding) of rat lung tissue revealed the preferential localization of T1α on apical microvillar protrusions of ATI cells. Conclusion: We conclude that T1α and caveolin-1 are located in distinct plasma membrane microdomains, which differ in their protein-lipid interactions. The raft-associated distribution of T1α may have an impact on a specific, not yet clarified function of this protein in the alveolar epithelium. / Dieser Beitrag ist mit Zustimmung des Rechteinhabers aufgrund einer (DFG-geförderten) Allianz- bzw. Nationallizenz frei zugänglich.

Gegenstand der vorliegenden Arbeit sind die purinergen Rezeptoren P2X4R und P2X7R. Die P2XR werden durch ATP aktiviert und stellen unselektive Kationenkanäle dar, die auch für Ca2+ durchlässig sind. Beiden P2XR-Subtypen werden in den Alveolarepithel Typ I (AT I)-Zellen der Lunge exprimiert und aufgrund ihrer Kanalaktivitäten in Zusammenhang mit der alveolären Flüssigkeitshomöostase gebracht. Bei bisherigen Untersuchungen wurde jedoch die mögliche Assoziation und Modulation der P2XR durch Mikrodomänen der Zellmembran außer Acht gelassen. Ein Modell von Garcia-Marcos zeigt, dass P2X7R in Zellen der Glandula submandibularis zum Teil mit Mikrodomänen assoziiert ist. Die funktionellen Eigenschaften von P2X7R sind dabei von der Lokalisation in der Zellmembran abhängig (Garcia-Marcos et al., 2006). Die Caveolen sind eine spezielle Form von Mikrodomänen, die in der Zellmembran der AT I-Zellen auftreten. Das Hauptstrukturprotein der Caveolen im Lungenepithel ist Caveolin-1 (Cav-1). Über die Verteilung von P2X4R und P2X7R in den AT I-Zellen war bislang sehr wenig bekannt. Unsere Arbeitsgruppe identifizierte bei einer Sequenzanalyse potentielle Cav-1-Bindemotive in der Aminosäureabfolge beider P2XR (Couet et al., 1997). Die Assoziation mit den Caveolen würde die P2XR in die räumliche Nähe verschiedener Signalmoleküle bringen und die Beteiligung an downstream Events ermöglichen. Für die folgenden Analysen wurde die Alveolarepithelzelllinie E10 genutzt, da die E10-Zellen AT I-typische Eigenschaften besitzen und P2X4R, P2X7R sowie die Caveoline Cav-1 und Cav-2 aufweisen. Die Untersuchungen konzentrierten sich auf die Assoziation von P2X4R und P2X7R mit Mikrodomänen der Zellmembran sowie die wechselseitige Beziehung der P2XR. Besonders wurde dabei auf die Assoziation der P2XR mit Cav-1 eingegangen. Zusätzlich wurde in vitro die Interaktion der C-terminalen Bereiche der beiden P2XR mit Membranlipiden untersucht. Einige Membranlipide sind eng mit weiteren Signalmolekülen verknüpft. Aus diesem Grund wurde die Auswirkungen der Reduzierung von P2X4R und P2X7R auf den Proteingehalt der Ca2+-aktivierbaren downstream-Effektoren PKCβI und CaM analysiert. Die Auswertungen der Ergebnisse ergaben Folgendes: P2X4R und P2X7R sind Subtyp-spezifisch in den Mikrodomänen der Zellmembran von E10-Zellen verteilt. Mit Hilfe von biochemischen und immunfluoreszenz-mikroskopischen Methoden konnte die Assoziation von P2X4R und P2X7R mit Mikrodomänen nachgewiesen werden. P2X7R ist zum Teil mit Cav-1 assoziiert, wobei Förster Resonanz Energie Transfer (FRET)-Analysen ergaben, dass beide Proteine partiell einen Abstand von kleiner als 10 nm zueinander aufweisen. Durch die Subtyp-spezifische Verteilung könnte die Funktionalität der P2XR-Subtypen spezifisch durch die Bestandteile der Mikrodomänen moduliert und reguliert werden (Martens et al., 2001). P2X4R und P2X7R sind in hochmolekularen Proteinkomplexen assoziiert. Die Ausbildung von hochmolekularen Proteinkomplexen wird in Zusammenhang mit der Assoziation von Proteinen mit Mikrodomänen diskutiert (Zurzolo et al., 2003). Die Untersuchung der molekularen Organisation von P2X4R und P2X7R in E10-Zellen mittels blue native- und high resolution clear native-PAGE zeigte, dass beide P2XR mit hochmolekularen Proteinkomplexen assoziiert sind. P2X7R konnte in drei Komplexen nachgewiesen werden. Im ersten Komplex von ~760 kDa liegt P2X7R mit Cav-1 assoziiert vor, während der dominant auftretende, zweite P2X7R-Subkomplex von ~580 kDa vermutlich nicht mit dem co-migrierten Cav-1/Cav-2-Komplex in Verbindung steht. Der dritte P2X7R-assoziierte Komplex war zusammen mit P2X4R bei ~430 kDa nachweisbar und Immunpräzipitationen bestätigten, dass P2X4R und P2X7R in einem Komplex miteinander assoziiert sind (Weinhold et al., 2010). P2X4R und P2X7R stehen in Wechselbeziehung zueinander. Diese Ergebnisse der siRNA-induzierte Herabregulation von P2X4R und P2X7R lassen vermuten, dass die beiden Rezeptoren direkt oder indirekt miteinander verbunden sind. So führte die Reduzierung von P2X4R zur Erhöhung des P2X7R-Proteingehaltes. Dabei nimmt P2X7R in der Zellmembran zu und verändert seine Verteilung nicht. Umgekehrt nimmt der Proteingehalt von P2X4R in den E10-Zellen zu, wenn P2X7R herabreguliert wird. Die Zunahme von P2X4R in der Zellmembran konnte zwar durch die Biotinylierung der Oberflächenproteine nachgewiesen werden, aber die Verteilung von P2X4R verschob sich zugunsten des intrazellulären P2X4R-Anteils. Vermutlich führt die Reduzierung von P2X7R zu Störungen im exo-/endozytotischen System. Die wechselseitige Zunahme der P2XR in den Mikrodomänen weist zudem auf einen kompensatorischen Mechanismus hin. Negativ geladene Phospholipide interagieren direkt mit den C-terminalen Abschnitten der P2XR. Mit den in vitro Bindetests konnte gezeigt werden, dass die C-terminalen Enden von P2X4R und P2X7R direkt mit den negativ geladenen Phosphoinositiden PI(4)P, PI(4,5)P2, PI(3,4,5)P3 sowie mit Phosphatidsäure, Phosphatidylserin, Phosphatidylglycerol, Cardiolipin und 3 Sulfogalactosylceramid interagieren können. Die Regulation der P2XR durch diese Phospholipide, vor allem PI(4,5)P2, und die Beteiligung der P2XR an Lipid-vermittelten Signalwegen in Epithelzellen, stellen einen möglichen Link zu weiteren downstream-Signalen dar. Die Reduzierung von P2X7R beeinflusst den Proteingehalt der downstream-Effektoren PKCβI und CaM. Sowohl im Lungengewebe von P2rx7(-/-) Mäusen als auch nach der Reduzierung von P2X7R in den E10-Zellen zeigte sich, dass der Proteingehalt der Signalmoleküle PKCβI und CaM vermindert war. Reduzierung von P2X4R hatte dagegen kaum Einfluss auf PKCβI und führte zur Erhöhung des CaM-Proteingehaltes, vermutlich hervorgerufen durch die Zunahme von P2X7R. Beide downstream-Effektoren sind in Mikrodomänen (Caveolen) der Zellmembran lokalisiert und können sowohl durch Lipid-vermittelte Signale als auch durch einen Kanal-vermittelten Ca2+-Einstrom aktiviert und reguliert werden. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigten, dass P2X4R und P2X7R in AT I-Zellen der Lunge nicht nur Kanaleigenschaften besitzen, sondern durch die Assoziation mit unterschiedlichen Mikrodomänen an verschiedene Signalwege gekoppelt sind. Trotzdem ist bisher wenig über die Funktionen der P2XR in AT I-Zellen hinsichtlich der Beteiligung an apoptotischen Prozessen, der Proliferation, der Differenzierung oder Migration und Wundheilung bekannt (Barth and Kasper, 2009). Aufgrund der komplexen Funktion, vor allem durch die Assoziation mit Cav-1 und der Wechselbeziehung mit dem P2X4R, wird der P2X7R für zukünftige Forschungen im alveolären Lungenepithel von Bedeutung sein. Barth K, Kasper M (2009) Membrane compartments and purinergic signalling: occurrence and function of P2X receptors in lung. FEBS J 276:341-353. Couet J, Li S, Okamoto T, Ikezu T, Lisanti MP (1997) Identification of peptide and protein ligands for the caveolin-scaffolding domain. Implications for the interaction of caveolin with caveolae-associated proteins. J Biol Chem 272:6525-6533. Garcia-Marcos M, Perez-Andres E, Tandel S, Fontanils U, Kumps A, Kabre E, Gomez-Munoz A, Marino A, Dehaye JP, Pochet S (2006) Coupling of two pools of P2X7 receptors to distinct intracellular signaling pathways in rat submandibular gland. J Lipid Res 47:705-714. Martens JR, Sakamoto N, Sullivan SA, Grobaski TD, Tamkun MM (2001) Isoform-specific localization of voltage-gated K+ channels to distinct lipid raft populations. Targeting of Kv1.5 to caveolae. J Biol Chem 276:8409-8414. Weinhold K, Krause-Buchholz U, Rödel G, Kasper M, Barth K (2010) Interaction and interrelation of P2X7 and P2X4 receptor complexes in mouse lung epithelial cells. Cell Mol Life Sci 67:2631-2642. Zurzolo C, van Meer G, Mayor S (2003) The order of rafts. Conference on microdomains, lipid rafts and caveolae. EMBO Rep 4:1117-1121.

Exposure cigarette smoke (CS) during prenatal life is the leading cause of preventable premature death. In this study, we explored the hypothesis that in vitro exposure of fetal lung cells to cigarette smoke extract (CSE) may result in the alteration of apoptosis through activation of caspase-3. Alongside we compared the responses of fetal lung cells with A549 cells and rat periodontal ligament (PDL) fibroblasts exposed to CSE in a dose dependent manner. Caspase-3 activity and inhibition was measured using a fluorometric assay. Cell viability in smoke exposed cells was measured using MTT formazan assay. Caspase-3 expression and cellular localization was detected by western blot analysis and immunofluorescence. Our results indicate that caspase-3 activity was significantly (p < 0.05) elevated and cell viability was significantly inhibited in fetal rat lung cells exposed to 10% or 15 % (v/v) CSE. No significant differences were observed in the caspase-3 activity or cellular viability in A549 cells and rat PDL fibroblasts exposed to 5%, 10% or 15% (v/v) CSE. Activation of caspase-3 in fetal lung connective tissue and alveolar epithelial cells may be one of the reasons for the developmental pulmonary toxicity induced by CSE.

Exposure cigarette smoke (CS) during prenatal life is the leading cause of preventable premature death. In this study, we explored the hypothesis that in vitro exposure of fetal lung cells to cigarette smoke extract (CSE) may result in the alteration of apoptosis through activation of caspase-3. Alongside we compared the responses of fetal lung cells with A549 cells and rat periodontal ligament (PDL) fibroblasts exposed to CSE in a dose dependent manner. Caspase-3 activity and inhibition was measured using a fluorometric assay. Cell viability in smoke exposed cells was measured using MTT formazan assay. Caspase-3 expression and cellular localization was detected by western blot analysis and immunofluorescence. Our results indicate that caspase-3 activity was significantly (p < 0.05) elevated and cell viability was significantly inhibited in fetal rat lung cells exposed to 10% or 15 % (v/v) CSE. No significant differences were observed in the caspase-3 activity or cellular viability in A549 cells and rat PDL fibroblasts exposed to 5%, 10% or 15% (v/v) CSE. Activation of caspase-3 in fetal lung connective tissue and alveolar epithelial cells may be one of the reasons for the developmental pulmonary toxicity induced by CSE.

Gegenstand der vorliegenden Arbeit sind die purinergen Rezeptoren P2X4R und P2X7R. Die P2XR werden durch ATP aktiviert und stellen unselektive Kationenkanäle dar, die auch für Ca2+ durchlässig sind. Beiden P2XR-Subtypen werden in den Alveolarepithel Typ I (AT I)-Zellen der Lunge exprimiert und aufgrund ihrer Kanalaktivitäten in Zusammenhang mit der alveolären Flüssigkeitshomöostase gebracht. Bei bisherigen Untersuchungen wurde jedoch die mögliche Assoziation und Modulation der P2XR durch Mikrodomänen der Zellmembran außer Acht gelassen. Ein Modell von Garcia-Marcos zeigt, dass P2X7R in Zellen der Glandula submandibularis zum Teil mit Mikrodomänen assoziiert ist. Die funktionellen Eigenschaften von P2X7R sind dabei von der Lokalisation in der Zellmembran abhängig (Garcia-Marcos et al., 2006). Die Caveolen sind eine spezielle Form von Mikrodomänen, die in der Zellmembran der AT I-Zellen auftreten. Das Hauptstrukturprotein der Caveolen im Lungenepithel ist Caveolin-1 (Cav-1). Über die Verteilung von P2X4R und P2X7R in den AT I-Zellen war bislang sehr wenig bekannt. Unsere Arbeitsgruppe identifizierte bei einer Sequenzanalyse potentielle Cav-1-Bindemotive in der Aminosäureabfolge beider P2XR (Couet et al., 1997). Die Assoziation mit den Caveolen würde die P2XR in die räumliche Nähe verschiedener Signalmoleküle bringen und die Beteiligung an downstream Events ermöglichen. Für die folgenden Analysen wurde die Alveolarepithelzelllinie E10 genutzt, da die E10-Zellen AT I-typische Eigenschaften besitzen und P2X4R, P2X7R sowie die Caveoline Cav-1 und Cav-2 aufweisen. Die Untersuchungen konzentrierten sich auf die Assoziation von P2X4R und P2X7R mit Mikrodomänen der Zellmembran sowie die wechselseitige Beziehung der P2XR. Besonders wurde dabei auf die Assoziation der P2XR mit Cav-1 eingegangen. Zusätzlich wurde in vitro die Interaktion der C-terminalen Bereiche der beiden P2XR mit Membranlipiden untersucht. Einige Membranlipide sind eng mit weiteren Signalmolekülen verknüpft. Aus diesem Grund wurde die Auswirkungen der Reduzierung von P2X4R und P2X7R auf den Proteingehalt der Ca2+-aktivierbaren downstream-Effektoren PKCβI und CaM analysiert. Die Auswertungen der Ergebnisse ergaben Folgendes: P2X4R und P2X7R sind Subtyp-spezifisch in den Mikrodomänen der Zellmembran von E10-Zellen verteilt. Mit Hilfe von biochemischen und immunfluoreszenz-mikroskopischen Methoden konnte die Assoziation von P2X4R und P2X7R mit Mikrodomänen nachgewiesen werden. P2X7R ist zum Teil mit Cav-1 assoziiert, wobei Förster Resonanz Energie Transfer (FRET)-Analysen ergaben, dass beide Proteine partiell einen Abstand von kleiner als 10 nm zueinander aufweisen. Durch die Subtyp-spezifische Verteilung könnte die Funktionalität der P2XR-Subtypen spezifisch durch die Bestandteile der Mikrodomänen moduliert und reguliert werden (Martens et al., 2001). P2X4R und P2X7R sind in hochmolekularen Proteinkomplexen assoziiert. Die Ausbildung von hochmolekularen Proteinkomplexen wird in Zusammenhang mit der Assoziation von Proteinen mit Mikrodomänen diskutiert (Zurzolo et al., 2003). Die Untersuchung der molekularen Organisation von P2X4R und P2X7R in E10-Zellen mittels blue native- und high resolution clear native-PAGE zeigte, dass beide P2XR mit hochmolekularen Proteinkomplexen assoziiert sind. P2X7R konnte in drei Komplexen nachgewiesen werden. Im ersten Komplex von ~760 kDa liegt P2X7R mit Cav-1 assoziiert vor, während der dominant auftretende, zweite P2X7R-Subkomplex von ~580 kDa vermutlich nicht mit dem co-migrierten Cav-1/Cav-2-Komplex in Verbindung steht. Der dritte P2X7R-assoziierte Komplex war zusammen mit P2X4R bei ~430 kDa nachweisbar und Immunpräzipitationen bestätigten, dass P2X4R und P2X7R in einem Komplex miteinander assoziiert sind (Weinhold et al., 2010). P2X4R und P2X7R stehen in Wechselbeziehung zueinander. Diese Ergebnisse der siRNA-induzierte Herabregulation von P2X4R und P2X7R lassen vermuten, dass die beiden Rezeptoren direkt oder indirekt miteinander verbunden sind. So führte die Reduzierung von P2X4R zur Erhöhung des P2X7R-Proteingehaltes. Dabei nimmt P2X7R in der Zellmembran zu und verändert seine Verteilung nicht. Umgekehrt nimmt der Proteingehalt von P2X4R in den E10-Zellen zu, wenn P2X7R herabreguliert wird. Die Zunahme von P2X4R in der Zellmembran konnte zwar durch die Biotinylierung der Oberflächenproteine nachgewiesen werden, aber die Verteilung von P2X4R verschob sich zugunsten des intrazellulären P2X4R-Anteils. Vermutlich führt die Reduzierung von P2X7R zu Störungen im exo-/endozytotischen System. Die wechselseitige Zunahme der P2XR in den Mikrodomänen weist zudem auf einen kompensatorischen Mechanismus hin. Negativ geladene Phospholipide interagieren direkt mit den C-terminalen Abschnitten der P2XR. Mit den in vitro Bindetests konnte gezeigt werden, dass die C-terminalen Enden von P2X4R und P2X7R direkt mit den negativ geladenen Phosphoinositiden PI(4)P, PI(4,5)P2, PI(3,4,5)P3 sowie mit Phosphatidsäure, Phosphatidylserin, Phosphatidylglycerol, Cardiolipin und 3 Sulfogalactosylceramid interagieren können. Die Regulation der P2XR durch diese Phospholipide, vor allem PI(4,5)P2, und die Beteiligung der P2XR an Lipid-vermittelten Signalwegen in Epithelzellen, stellen einen möglichen Link zu weiteren downstream-Signalen dar. Die Reduzierung von P2X7R beeinflusst den Proteingehalt der downstream-Effektoren PKCβI und CaM. Sowohl im Lungengewebe von P2rx7(-/-) Mäusen als auch nach der Reduzierung von P2X7R in den E10-Zellen zeigte sich, dass der Proteingehalt der Signalmoleküle PKCβI und CaM vermindert war. Reduzierung von P2X4R hatte dagegen kaum Einfluss auf PKCβI und führte zur Erhöhung des CaM-Proteingehaltes, vermutlich hervorgerufen durch die Zunahme von P2X7R. Beide downstream-Effektoren sind in Mikrodomänen (Caveolen) der Zellmembran lokalisiert und können sowohl durch Lipid-vermittelte Signale als auch durch einen Kanal-vermittelten Ca2+-Einstrom aktiviert und reguliert werden. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigten, dass P2X4R und P2X7R in AT I-Zellen der Lunge nicht nur Kanaleigenschaften besitzen, sondern durch die Assoziation mit unterschiedlichen Mikrodomänen an verschiedene Signalwege gekoppelt sind. Trotzdem ist bisher wenig über die Funktionen der P2XR in AT I-Zellen hinsichtlich der Beteiligung an apoptotischen Prozessen, der Proliferation, der Differenzierung oder Migration und Wundheilung bekannt (Barth and Kasper, 2009). Aufgrund der komplexen Funktion, vor allem durch die Assoziation mit Cav-1 und der Wechselbeziehung mit dem P2X4R, wird der P2X7R für zukünftige Forschungen im alveolären Lungenepithel von Bedeutung sein. Barth K, Kasper M (2009) Membrane compartments and purinergic signalling: occurrence and function of P2X receptors in lung. FEBS J 276:341-353. Couet J, Li S, Okamoto T, Ikezu T, Lisanti MP (1997) Identification of peptide and protein ligands for the caveolin-scaffolding domain. Implications for the interaction of caveolin with caveolae-associated proteins. J Biol Chem 272:6525-6533. Garcia-Marcos M, Perez-Andres E, Tandel S, Fontanils U, Kumps A, Kabre E, Gomez-Munoz A, Marino A, Dehaye JP, Pochet S (2006) Coupling of two pools of P2X7 receptors to distinct intracellular signaling pathways in rat submandibular gland. J Lipid Res 47:705-714. Martens JR, Sakamoto N, Sullivan SA, Grobaski TD, Tamkun MM (2001) Isoform-specific localization of voltage-gated K+ channels to distinct lipid raft populations. Targeting of Kv1.5 to caveolae. J Biol Chem 276:8409-8414. Weinhold K, Krause-Buchholz U, Rödel G, Kasper M, Barth K (2010) Interaction and interrelation of P2X7 and P2X4 receptor complexes in mouse lung epithelial cells. Cell Mol Life Sci 67:2631-2642. Zurzolo C, van Meer G, Mayor S (2003) The order of rafts. Conference on microdomains, lipid rafts and caveolae. EMBO Rep 4:1117-1121.

La fibrose pulmonaire idiopathique (FPI) et le syndrome de détresse respiratoire aiguë (SDRA) de l’adulte constituent des affections sévères du poumon distal, avec un pronostic sombre pour les patients. A ce jour, aucun traitement n’est réellement efficace. De manière intéressante, une hypoxie alvéolaire est retrouvée dans ces pathologies.La thérapie cellulaire utilisant des cellules souches mésenchymateuses humaines (CSMh) pourrait représenter un intérêt thérapeutique chez l’Homme. Cependant, leurs mécanismes d’action sont multiples et encore mal définis. Aussi, nous avons testé in vitro l’hypothèse selon laquelle les CSMh pourraient exercer un effet cytoprotecteur paracrine sur les cellules épithéliales alvéolaires (CEA) soumises à l’hypoxie.Dans une première étude, nous avons montré qu’une exposition prolongée à l’hypoxie telle que celle rencontrée au cours de la FPI induisait des modifications phénotypiques des CEA primaires de rat, évocatrices d’une transition épithélio-mésenchymateuse (TEM). On observe une perte progressive d’expression des marqueurs épithéliaux (TTF1, AQP5, ZO-1 et E-Cadhérine), couplée à l’apparition tardive de marqueurs mésenchymateux (α-SMA et Vimentine). Ces modifications phénotypiques s’accompagnent de l’expression dès les premières heures d’hypoxie de facteurs de transcription impliqués dans la TEM (SNAI1, TWIST1 et ZEB1) ou induits par l’hypoxie (HIF-1α et HIF-2α), et de protéines induisant la TEM (TGF-β1 et CTGF). La co-culture des CEA avec des CSMh en fond de puits prévient les modifications phénotypiques induites par l’hypoxie ainsi que l’expression des facteurs pro-TEM TWIST1, ZEB1, TGF-β1 et CTGF. Cet effet bénéfique des CSM est en partie expliqué par la sécrétion d’un facteur de croissance épithélial, le KGF.Dans une deuxième étude, nous avons confirmé que les CEA entraient en apoptose en condition hypoxique, via l’induction de deux voies de signalisations hypoxiques pro-apoptotiques. D’une part, les facteurs de transcription induits par l’hypoxie HIF sont stabilisés, et une cible pro-apoptotique, Bnip3, est induite. D’autre part, l’hypoxie induit une accumulation d’espèces réactives à l’oxygène délétère pour la cellule, perturbant l’équilibre redox de la cellule, endommageant l’ADN, et conduisant à l’apoptose. Cette accumulation pourrait résulter notamment d’une diminution de l’activité des enzymes anti-oxydantes SOD, en hypoxie. Le manque d’oxygène entraine également l’expression de CHOP, facteur de transcription pro-apoptotique impliqué dans le stress du réticulum endoplasmique, qui va13inhiber l’expression de la protéine anti-apoptotique Bcl-2. Nous avons montré que la culture des CEA en présence de milieu conditionné de CSMh (mc-CSMh) permet de prévenir partiellement l’apoptose des CEA en hypoxie, en modulant la voie de signalisation HIF, et en prévenant l’accumulation et les effets délétères des ROS. L’effet protecteur des CSM impliquerait le KGF comme observé lors de la première étude, mais également le HGF.Ces deux études indiquent que les CSMh sont susceptibles d’exercer des effets cytoprotecteurs paracrines vis-à-vis des CEA soumises à l’hypoxie aiguë ou prolongée, en limitant d’une part les modifications phénotypiques évocatrices de TEM, et d’autre part l’apoptose des CEA via la modulation des voies de signalisations hypoxiques. La sécrétion par les CSMh de KGF et de HGF, facteurs de croissance épithéliaux connus pour leurs effets bénéfiques sur les CEA, explique en partie les effets protecteurs paracrines des CSMh. Nos résultats suggèrent que les effets cytoprotecteurs des CSMh vis-à-vis des CEA pourraient contribuer aux effets bénéfiques des CSMh observés in vivo dans différents modèles animaux de fibrose induite, ou lors d’agressions alvéolaires aiguës. / Acute or chronic alveolar injuries provoke massive apoptosis of alveolar epithelial cells (AEC) that compromises an efficient repair of the alveolar epithelium and leads to lung diseases such as ARDS or IPF. These disorders are commonly associated with local alveolar hypoxia aggravating their progression through the stimulation of AEC apoptosis. Administration of allogenic mesenchymal stem cells (MSCs) has been shown to limit lung inflammation and fibrosis in murine models of alveolar injury, through a still poorly understood paracrine mechanism. In a first study, we showed that long term exposure of AEC in hypoxia leads to phenotypic alterations which looks like epithelio-mesenchymal transition (EMT). Co-culture with MSCs prevent hypoxia-induced EMT.In a second work, we studied whether MSC could protect AEC from hypoxia-induced apoptosis and the mechanisms involved. hMSC-conditioned media (hMSC-CM) significantly reduced hypoxia-induced apoptosis of AEC. Such a anti-apoptotic effect was also obtained with ROS scavenger N-acetylcystein or HIF1a inhibitor YC-1. hMSC-CM decreased the protein expression of HIF1α and HIF2α and of their pro-apoptotic target Bnip3 in hypoxic AEC. hMSC-CM also reduced ROS accumulation in hypoxic AEC by enhancing the activity of anti-oxidant enzymes and prevented the induction of CHOP, a pro-apoptotic factor induced by ROS signaling. The paracrine effect of hMSC was partly dependent on KGF and HGF secretion. hMSC prevent via a paracrine effect hypoxia-induced apoptosis of AEC by modulating hypoxic and ROS signaling.These two studies show that MSCs exert cytoprotective effects in vitro against hypoxia-induced apoptosis and EMT in AEC