Harnblase. Weiterhin bestärkt die beobachtete Kopplung die Hypothese, dass das Myofibroblastennetzwerk afferente Signale Verstärken und modulieren kann. Die Verbesserung des Verständnisses der Harnblasenfunktion ist von grundlegendem Interesse für die Behandlung von Miktionsstörungen. Eine Störung von mechanischer Stimulierbarkeit und Kopplung der suburothelialen Myofibroblasten kann eine Störung der Sensorik der Harnblase plausibel erklären und stellt einen neuen Therapieansatz dar.:1 Abkürzungsverzeichnis 2 Einführung 2.1 Hintergrund 2.2 Anatomische und physiologische Grundlagen der Harnblasenfunktion 2.2.1 Aufbau der Harnblasenwand 2.2.2 Terminologie und Klassifikation interstitieller Zellen der Harnblase 2.2.3 Phänotypisierung der suburothelialen Myofibroblasten 2.2.4 Funktionsweise der Myofibroblasten 2.2.5 Innervation des unteren Harntraktes und neuronale Kontrolle der Harnblasenfunktion 2.2.6 Lokale sensorische Netzwerke der Harnblase 3 Aufgabenstellung 4 Material und Methoden 4.1 Gewinnung und Zellkultur suburothelialer Myofibroblasten 4.2 Lösungen und Chemikalien 4.3 Calcium imaging 4.4 Datenanalyse 4.4.1 Erzeugung der FI-Ratio Datensätze 4.4.2 Automatische Fluoreszenz-Signal-Analyse 4.5 Aufbau und Anordnung der Experimente 4.5.1 Spontanaktivität 4.5.2 Mechanische Stimulation mittels Glasmikropipette 4.5.3 Mechanische Stimulation durch Scherstress 4.5.4 Hypoosmolare Stimulation 5 Ergebnisse 5.1 Spontane Kalziumaktivität humaner suburothelialer Myofibroblasten 5.2 Mechanische Stimulierbarkeit durch Druck mittels Glasmikropipette 5.2.1 Intrazelluläre Ausbreitung mechanisch induzierter Kalziumsignale 5.2.2 Interzelluläre Ausbreitung mechanisch induzierter Kalziumsignale in kultivierten humanen suburothelialen Myofibroblasten 5.3 Mechanische Stimulierbarkeit durch Scherstress 5.4 Mechanische Stimulierbarkeit durch osmotischen Stress 6 Diskussion 6.1 Beobachtete Kalziumsignale suburothelialer Myofibroblasten 6.2 Bedeutung der mechanischen Stimulierbarkeit 6.3 Identifikation der stretch-activated channels 6.4 Bedeutung der interzellulären Kopplung 6.5 Konzept zur Rolle der suburothelialen Myofibroblasten 6.6 Methodischer und experimenteller Ansatz 6.6.1 Selbst entwickelte Fluoresence Analysis Software 6.6.2 Methoden der mechanischen Stimulierbarkeit 6.7 Pathophysiologische Aspekte 7 Zusammenfassung der Arbeit 8 Literaturverzeichnis 9 Anlagen 9.1 Selbstständigkeitserklärung 9.2 Lebenslauf 9.3 Publikationen 9.4 Danksagung

Um das Langzeitüberleben eines Kreuzbandtransplantates nach Ersatz des VKB zu gewährleisten muß das Transplantat revaskularisiert werden. Trotz zahlreicher Studien zu diesem Thema gibt es noch immer eine kontroverse Diskussion bezüglich der Revaskularisierung von Kreuzbandtransplantaten. Ziel der vorliegenden Studie war es die endoligamentäre mikrokapilläre Revaskularisierung eines freien Sehnentransplantates mit Hilfe immunhistochemischer Färbetechnik darzustellen und ihren Verlauf über die Zeit zu dokumentieren. Darüber hinaus sollten die im Rahmen des Remodelingprozesses nach vorderem Kreuzbandersatz ablaufenden Ab- und Aufbauprozesse der Extrazellulärmatrix des Transplantates weiter aufgeklärt werden. Bei der Heilung des medialen Kollateralband des Kniegelenkes wurden kontraktile fibroblastische Zellen entdeckt, die eine mögliche Rolle bei der Wiederherstellung der Matrixhomöostase spielen. Nach Entdeckung dieses Zelltyps im intakten vorderen Kreuzbandes wurde gemutmaßt, Myofibroblasten könnten eine entscheidende Rolle bei der Entstehung der Kollagentertiärstruktur spielen. In der vorliegenden Studie sollte aufgeklärt werden, ob Myofibroblasten im intakten ovinen vorderen Kreuzband und seinem freien Sehnentransplantat nach VKB-Ersatz während des Remodelings wieder auftaucht. 36 ausgewachsene Merinoschafe erhielten einen vorderen Kreuzbandersatz mittels ipsilateralem Flexorsehnentransplantat. Nach je 6, 9, 12, 24, 52 und 104 Wochen wurden 6 Tiere getötet und das mittlere Drittel des Kreuzbandtransplantates histologisch aufgearbeitet. Neben konventionellen Färbungen zur Auswertung von Gesamtzellzahl und Crimpstruktur wurden immunhistochemische Färbungen mit anti-v. Willebrandt Factor (Factor VIII) zum Nachweis von Endothelzellen der Gefäßwand und anti-alpha-smooth-muscle Aktin zum Nachweis von Myofibroblasten durchgeführt. In Querschnittpräparaten, je in 3 Zonen (subsynovial, intermediär und zentral) unterteilt, wurden Gefäßanschnitte ausgezählt. In Längsschnittpräparaten wurden Myofibroblasten nachgewiesen. Die Auswertungen wurden mit Hilfe eines digitalen Bildanalysesystems vorgenommen. Die Untersuchungen zur Revaskularisierung zeigten von peripher nach zentral über die Zeit einwachsende Kapillaren. Die größte Dichte an Gefäßanschnitten wurde nach 6 Wochen gefunden, der Gefäßstatus des nativen VKB wurde nach 24 Wochen erreicht. Myofibroblasten konnten sowohl im intakten VKB als auch im Flexorsehnentransplantat vor Implantation nachgewiesen werden. Weiterhin konnten Myofibroblasten erstmalig auch im remodelierenden Bandgewebe bereits nach 6 Wochen innerhalb neu gebildeter Kollagenfasern identifiziert werden. Die vorliegende Studie konnte damit erstmalig die Kinetik der endoligamentären Revaskularisierung auf kapillärer Ebene darstellen. Im vorliegenden Modell war die Revaskularisierung wesentlich früher abgeschlossen als zuvor beschrieben. Myofibroblasten stellen einen regulären Bestandteil sowohl des nativen als auch des remodelierenden VKB dar. Dabei könnten diese Zellen eine wichtige Rolle bei der Wiedererlangung der Gewebehomöostase durch die Ausbildung der Kollagentertiärstruktur spielen. Die Präsenz dieser Zellen während der frühen Remodellingphase läßt weiterhin vermuten, daß alpha smooth muscle Actin exprimierende Zellen in der frühsten Phase der Bildung von Kollagenfibrillen mitbeteiligt sind. / After replacement of the anterior cruciate ligament with a free tendon autograft, the substitute initially is avascular and without a synovial surface. To ensure long-term survival, the graft must become revascularised. Despite numerous studies on the topic, there still is controversial discussion regarding revascularisation. The first aim of the current study was to investigate the endoligamentous microcapillary revascularisation of the free tendon graft after anterior cruciate ligament replacement with time. Furthermore degeneration and reformation of the extracellular matrix during remodeling of the anterior cruciate ligament graft was to elucidate. Contractile fibroblastic cells expressing the alpha-smooth muscle actin isoform, so called myofibroblasts, have been identified to play a possible role during the healing of the medial collateral ligament by means of restoring the tissue s in situ strain via extracellular matrix contraction. Recently, these cells have also been identified to be a normal part of the human anterior cruciate ligament. It has been hypothesised that myofibroblasts play a role in wrinkling of the extracellular matrix. Therefore the second aim of the current study was to identify myofibroblasts in the intact ovine anterior cruciate ligament and their reoccurrence in a free autologous tendon graft during remodeling after anterior cruciate ligament reconstruction. Thirty-six mature sheep had an anterior cruciate ligament reconstruction with an ipsilateral flexor tendon split graft. Besides conventional staining to analyse total cell density and collagen crimp, midsubstance tissue samples were immunostained for von Willebrandt factor (Factor VIII) to detect the endothelial cells of capillaries and for a-smooth muscle actin to identify myofibroblasts. For vessel detection cross sections of the samples were determined in three zones (subsynovial, intermediate, and center of the graft). Myofibroblast distribution was analysed in longitudinal sections. Evaluation was performed at 6, 9, 12, 24, 52, and 104 weeks by means of histomorphometry using a digital imaging analysis system. The observations showed that capillary vessels, which originate from the synovial envelope, invaded the avascular graft tissue from the surface toward the center zone. The highest level of vascular density was found after 6 weeks, reaching the vascular status of the native anterior cruciate ligament after 24 weeks. Myofibroblasts were identified in the intact ovine anterior cruciate ligament as well as in the flexor tendon graft prior to implantation. During remodeling first myofibroblasts were found at 6 weeks within newly formed fibre bundles. At 24, 52, and 104 weeks myofibroblast distribution and cell density was similar to that of the intact ovine anterior cruciate ligament. The current study has shown, for the first time, the kinetics of an endoligamentous revascularisation of a free tendon graft at the capillary level. In the current model, the process of revascularisation terminated earlier than previously described. Furthermore the current study has shown that alpha-smooth muscle actin containing fibroblastic cells are a regular part of the intact as well as the remodeled anterior cruciate ligament. There is evidence, that myofibroblasts may be involved in maintaining tissue homeostasis in the mature ligament e.g. by means of crimp formation. The presence of these cells during the early remodeling may further indicate that alpha-smooth muscle actin containing fibroblastic cells are involved in the earliest stages of fibre bundle formation.

Die Expansion des renalen Tubulointerstitiums aufgrund einer Akkumulation zellulärer Bestandteile und extrazellulärer Matrix ist eine charakteristische Eigenschaft der chronischen Nierenerkrankung (CKD) und führt zu einer Progression der Erkrankung in Richtung eines terminalen Nierenversagens. Die Fibroblasten Proliferation und ihre Transformation hin zum sekretorischen Myofibroblasten-Phänotyp stellen hierbei Schlüsselereignisse dar. Signalprozesse, die zur Induktion der Myofibroblasten führen, werden aktiv beforscht um anti-fibrotische Therapieansätze zu identifizieren. Das anti-inflammatorische Protein Annexin A1 und sein Rezeptor Formyl-Peptid Rezeptor 2 (FPR2) wurden in verschiedenen Organsystemen mit der Regulation von Fibroblastenaktivität in Verbindung gebracht, jedoch wurden ihre Expression und Funktion bei renalen fibrotischen Erkrankungen bisher nicht untersucht. Ziel der aktuellen Studie war daher die Untersuchung der renalen Annexin A1- und FPR2-Expression in einem Tiermodell des chronischen Nierenversagens, sowie die Charakterisierung der funktionellen Rolle von Annexin A1 in der Regulation des Fibroblasten Phänotyps und ihrer Syntheseleistung. Dazu wurden neugeborene Sprague-Dawley Ratten in den ersten zwei Wochen ihres Lebens entweder mit Vehikel oder mit einem Angiotensin II Typ I Rezeptor Antagonisten behandelt und ohne weitere Intervention bis zu einem Alter von 11 Monaten (CKD Ratten) gehalten. Die Regulation und Lokalisation von Annexin A1 und FPR2 wurden mit Hilfe von Real-Time PCR und Immunhistochemie erfasst. Annexin A1- und FPR2-exprimierende Zellen wurden weiter durch Doppelimmunfluoreszenzfärbungen charakterisiert. Gefärbt wurde mit Antikörpern gegen endotheliale Zellen (rat endothelial cell antigen), Makrophagen (CD 68), Fibroblasten (CD73) und Myofibroblasten (alpha-smooth muscle actin (α-sma)). Zellkulturstudien wurden an immortalisierten renalen kortikalen Fibroblasten aus Wildtyp- und Annexin A1-defizienten Mäusen, sowie an etablierten humanen und murinen renalen Fibrolasten durchgeführt. Eine Überexpression von Annexin A1 wurde durch eine stabile Transfektion erreicht. Die Expression von Annexin A1, α-sma und Kollagen 1α1 wurde durch Real-Time PCR, Western Blot und Immuhistochemie erfasst. Die Sekretion des Annexin A1 Proteins wurde nach TCA-Fällung des Zellkulturüberstandes im Western Blot untersucht. Wie zu erwarten zeigten die CKD Ratten eine geringere Anzahl an Nephronen mit deutlicher glomerulären Hypertrophie. Der tubulointerstitielle Raum war durch fibrilläres Kollagen, aktivierte Fibroblasten und inflammatorische Zellen expandiert. Parallel dazu war die mRNA Expression von Annexin A1 und Transforming growth factor beta (TGF-β) signifikant erhöht. Die Annexin A1-Lokalisation mittels Doppelimmunfluorsezenz identifizierte eine große Anzahl von CD73-positiven kortikalen Fibroblasten und eine Subpopulation von Makrophagen als Annexin A1-positiv. Die Annexin A1-Menge in Myofibroblasten und renalen Endothelien war gering. FPR2 konnte in der Mehrzahl der renalen Fibroblasten, in Myofibroblasten, in einer Subpopulation von Makrophagen und in renalen Epithelzellen nachgewiesen werden. Eine Behandlung der murinen Fibroblasten mit dem pro-fibrotischen Zytokin TGF-β führte zu einem parallelen Anstieg der α-sma-, Kollagen 1α1- und Annexin A1-Biosynthese und zu einer gesteigerten Sekretion von Annexin A1. Eine Überexpression von Annexin A1 in murinen Fibroblasten reduzierte das Ausmaß der TGF-β induzierten α-sma- und Kollagen 1α1-Biosynthese. Fibroblasten aus Annexin A1-defizienten Mäusen zeigten einen starken Myofibroblasten-Phänotyp mit einer gesteigerten Expression an α-sma und Kollagen 1α1. Der Einsatz eines Peptidantagonisten des FPR2 (WRW4) resultierte in einer Stimulation der α-sma-Biosynthese, was die Vermutung nahe legte, dass Annexin A1 FPR2-vermittelt anti-fibrotische Effekte hat. Zusammenfassend zeigen diese Ergebnisse, dass renale kortikale Fibroblasten eine Hauptquelle des Annexin A1 im renalen Interstitium und einen Ansatzpunkt für Annexin A1-Signalwege in der Niere darstellen. Das Annexin A1/FPR2-System könnte daher eine wichtige Rolle in der Kontrolle des Fibroblasten Phänotyp und der Fibroblasten Aktivität spielen und daher einen neuen Ansatz für die anti-fibrotischen pharmakologischen Strategien in der Behandlung des CKD darstellen. / Expansion of the renal tubulointerstitium due to an accumulation of cellular constituents and extracellular matrix is a characteristic feature of chronic kidney disease (CKD) and leads to the progression towards renal failure. Fibroblast proliferation and transformation to the secretory myofibroblast phenotype present key events herein. The signaling process which leads to the generation of myofibroblasts is actively investigated to identify targets for antifibrotic therapeutic strategies. The antiinflammatory protein annexin A1 and its receptor formyl peptide receptor 2 (FPR2) have been implicated in the regulation of fibroblasts from various organs but the expression and function of the two products in renal fibrotic disease have not been elucidated so far. Aim of the present study was therefore to investigate the renal expression of annexin A1 and FPR2 in an animal model of chronic kidney disease and to characterize the role of annexin A1 in the regulation of fibroblast phenotype and synthetic activity. To this end, newborn Sprague-Dawley rats were treated either with vehicle or with an angiotensin II type I receptor antagonist during the first two weeks of their life and kept without further intervention until the age of 11 month (CKD rats). Regulation and localization of annexin A1 and FPR2 were studied using real-time PCR and immunohistochemistry. Annexin A1 and FPR2 expressing cells were further characterized by double labeling immunofluorescence with markers for endothelial cells (rat endothelial cell antigen), macrophages (CD68), fibroblasts (CD73), and myofibroblasts (alpha-smooth muscle actin (α-sma)). Cell culture studies were conducted in immortalized renal cortical fibroblast derived from wildtype and from annexin A1-deficient mice as well as in established cell lines of human and murine renal fibroblasts. Overexpression of annexin A1 was achieved by stable transfection. Expression of annexin A1, α-sma and collagen 1α1 was determined using real-time PCR, Western blotting and immunohistochemistry. Secretion of annexin A1 was studied using trichloroacetic acid protein precipitation of cell culture supernatants and Western blotting. As expected, CKD rats had an overall lower number of nephrons with a marked glomerular hypertrophy. The tubulointerstitial space was expanded due to an accumulation of fibrillar collagens, activated fibroblasts and inflammatory cells. In parallel, mRNA expression for Annexin A1 and transforming growth factor beta (TGF-β) was significantly increased. Double labeling immunofluorescence localization of annexin A1 demonstrated a high abundance in CD73 positive cortical interstitial fibroblasts and in a subset of CD68 immunoreactive macrophages. The abundance in myofibroblasts and renal endothelia was low. FPR2 was found in the majority of renal fibroblasts, myofibroblasts, a subset of macrophages, and in renal endothelial cells. Treatment of cultured murine fibroblasts with the profibrotic cytokine TGF-β resulted in a parallel induction of α-sma-, collagen 1α1- and annexin A1 biosynthesis. In addition, annexin A1 secretion was markedly increased. Overexpression of annexin A1 in murine fibroblasts reduced TGF β-induced α-sma- and collagen 1α1-biosynthesis. Fibroblasts derived from annexin A1-deficient mice showed a strong myofibroblast phenotype with increased expression of both, α-sma-, and collagen 1α1. Application of a peptide antagonist of FPR2 receptor (WRW4) caused a stimulation of α-sma biosynthesis thus suggesting a role of FPR2 in the antifibrotic effects of annexin A1. In conclusion, these results identify renal cortical interstitial fibroblasts as major source and as a target for annexin A1 signalling in the kidney. The annexin A1/FPR2 signalling system may therefore play an important role in the control of fibroblast phenotype and activity and may therefore provide a novel target for antifibrotic pharmacological strategies in the treatment of CKD.

Infektionen mit H. pylori führen zu Veränderungen im Aufbau und der zellulären Zusammensetzung des Magenepithels. Aktuelle Studien haben gezeigt, dass Stromazellen, die sich in unmittelbarer Nähe der epithelialen Stammzelle befinden, die funktionelle Nische für dieses Kompartiment bilden und wichtige Faktoren für die Regulierung des Stammzellumsatzes und Differenzierung darstellen. Daher konzentriere ich mich bei dieser Arbeit auf die Rolle der Myh11+ Myofibroblasten, die sich sowohl unter als auch zwischen den Epitheldrüsenzellen befinden. Ich fand heraus, dass die Myofibroblasten in der Homöostase einen BMP-Gradienten entlang der Drüsenachse mit erhöhter Expression von Bmp2 im oberen Teil erzeugen, während die Drüsenbasis von Zellen umgeben ist, die Bmp-Inhibitoren produzieren. Basierend auf der Funktionsanalyse mit 3D-Organoidmodellen ist der Bmp-Signalweg ein zentraler Faktor für die rasche Differenzierung von Stammzellen in faveoläre mukusproduzierende Zellen. Darüber hinaus wurde ein auto-parakriner Signalweg gefunden, der zur Bildung von Bmp2 in Epithelzellen führt. Meine Untersuchungen Daten zeigten eine Verringerung des BMP-Signalwegs in H. pylori-infizierten Myofibroblasten. Darüber hinaus führte eine Infektion mit H. pylori nicht nur zum Verlust der stromalen, sondern auch der epithelialen Bmp2-Expression. Diese Beobachtung ging mit einer Zunahme von IFNγ einher, was auf eine Verbindung zwischen beiden Signalwegen hinwies. Tatsächlich zeigten anschließende Experimente mit Organoiden, dass IFNγ den Bmp-Signalweg hemmt und dadurch die terminale Differenzierung blockiert. Zusammenfassend zeigen meine Untersuchungen, dass das Schicksal einer Zelle, die zur Oberfläche der Magendrüse wandert, eine Induktion des BMP-Signalwegs erfährt. Die Reduktion dieses Signals durch IFNγ deutet auf einen Mechanismus hin, der Veränderungen in der zellulären Differenzierung und die Entwicklung von prämalignen epithelialen Läsionen im Verlauf einer H. pylori-Infektion bewirkt. / Infection with Helicobacter pylori (H. pylori) leads to alterations of the topology and cellular composition of the gastric epithelium. Recent studies have shown that stromal cells located in close proximity to the epithelial stem cell are creating the niche for this compartment and provide crucial factors that regulate stem cell turnover and fate decisions. Therefore, this thesis focuses on of Myh11+ myofibroblasts that are located beneath and between the epithelial gland cells. I found that during homeostasis, the myofibroblasts generate a BMP gradient along the gland axis with strong expression of Bmp2 in the upper part, whereas the base is surrounded by cells producing BMP inhibitors. Based on functional analysis with 3D organoid models, the BMP gradient occurs to be a main factor responsible for rapid differentiation of stem cells into pit surface mucous cells. Moreover, experiments led me to identify an auto-paracrine feed-forward BMP2 loop in epithelial cells, which further stabilizes BMP signaling once it is activated and induces terminal differentiation. Data presented in this study demonstrated a reduction of BMP signaling in H. pylori-infected myofibroblasts. Furthermore, infection with H. pylori resulted in loss of not only stromal, but also epithelial Bmp2 expression. This observation was accompanied with increase of Interferon γ (IFNγ), which indicated a link between both pathways. Consistently, stimulation of organoids with IFNγ impairs BMP signaling and the BMP2 feed-forward loop, and thereby blocks terminal differentiation. Together, this study shows that the fate of a cell migrating into the surface of the gastric gland is determined by an induction of BMP signaling and stabilized by an auto-paracrine BMP signaling enhancement. Reduction of this signaling by IFNγ revealed a mechanism which contributes to altered cellular differentiation and development of premalignant epithelial alterations in the context of H. pylori infection.

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Suburothelial myofibroblasts (sMF) are located underneath the urothelium in close proximity to afferent nerves and show spontaneous calcium activity in vivo and in vitro. They express purinergic receptors and calcium transients can be evoked by ATP. Therefore they are supposed to be involved in afferent signaling of the bladder fullness. Myofibroblast cultures, established from cystectomies, were challenged by exogenous ATP in presence or absence of purinergic antagonist. Fura-2 calcium imaging was used to monitor ATP (10-16 to 10-4 mol/l) induced alterations of calcium activity. Purinergic receptors (P2X1, P2X2, P2X3) were analysed by confocal immunofluorescence. We found spontaneous calcium activity in 55.18% ± 1.65 (mean ± SEM) of the sMF (N=48 experiments). ATP significantly increased calcium activity even at 10-16 mol/l. The calcium transients were partially attenuated by subtype selective antagonist (TNP-ATP, 1μM; A-317491, 1μM), and were mimicked by the P2X1, P2X3 selective agonist α,β-methylene ATP. The expression of purinergic receptor subtypes in sMF was confirmed by immunofluorescence. Our experiments demonstrate for the first time that ATP can modulate spontaneous activity and induce intracellular Ca2+ response in cultured sMF at very low concentrations, most likely involving ionotropic P2X receptors. These findings support the notion that sMF are able to register bladder fullness very sensitively, which predestines them for the modulation of the afferent bladder signaling in normal and pathological conditions.

Suburothelial myofibroblasts (sMF) are located underneath the urothelium in close proximity to afferent nerves and show spontaneous calcium activity in vivo and in vitro. They express purinergic receptors and calcium transients can be evoked by ATP. Therefore they are supposed to be involved in afferent signaling of the bladder fullness. Myofibroblast cultures, established from cystectomies, were challenged by exogenous ATP in presence or absence of purinergic antagonist. Fura-2 calcium imaging was used to monitor ATP (10-16 to 10-4 mol/l) induced alterations of calcium activity. Purinergic receptors (P2X1, P2X2, P2X3) were analysed by confocal immunofluorescence. We found spontaneous calcium activity in 55.18% ± 1.65 (mean ± SEM) of the sMF (N=48 experiments). ATP significantly increased calcium activity even at 10-16 mol/l. The calcium transients were partially attenuated by subtype selective antagonist (TNP-ATP, 1μM; A-317491, 1μM), and were mimicked by the P2X1, P2X3 selective agonist α,β-methylene ATP. The expression of purinergic receptor subtypes in sMF was confirmed by immunofluorescence. Our experiments demonstrate for the first time that ATP can modulate spontaneous activity and induce intracellular Ca2+ response in cultured sMF at very low concentrations, most likely involving ionotropic P2X receptors. These findings support the notion that sMF are able to register bladder fullness very sensitively, which predestines them for the modulation of the afferent bladder signaling in normal and pathological conditions.:1. Introduction............................................................................ 1 1.1. Anatomy and histology of the human urinary bladder..................... 1 1.1.1. Anatomy of the human urinary bladder..................................... 1 1.1.2. Structure of the human urinary bladder wall............................... 2 1.2. Normal bladder function and bladder dysfunction.......................... 3 1.2.1 Normal bladder function......................................................... 3 1.2.2 Sensory aspect.................................................................... 4 1.2.3 Overactivity or hypersensitivity of bladder.................................. 5 1.3 The role of functional cell types and interaction in urinary bladder... 6 1.3.1 The role of urothelium.......................................................... 7 1.3.2Theroleofsuburotheliamyofibroblast...................................... 7 1.3.3Theroleofdetrusorsmoothmusclecells.................................. 9 1.3.4 Possible interactions in urinary bladder cell types........................ 10 1.4 ATP function and Purinergic signalling in bladder........................... 11 1.5 Spontaneous activity of bladder................................................... 13 2. Objective.................................................................................. 15 3. Material and methods............................................................... 16 3.1. Ethics Statement........................................................................ 16 3.2. Cell preparation.......................................................................... 16 3.3. Solutions and chemicals............................................................. 19 3.4. Intracellular calcium measurements............................................. 20 2.4.1. Preparing cells for Calcium Imaging.......................................... 20 2.4.2. Preparing workspace of calcium imaging................................... 20 2.4.3. Calcium imaging recording...................................................... 22 3.5 Data analysis with automated Fluorescence analysis..................... 22 3.6 Confocal Immunofluorescence.................................................... 25 3.7 Statistics................................................................................. 26 4. Results.................................................................................. 27 4.1 Spontaneous calcium activity of sMF........................................... 27 4.2 ATP effects on calcium response in sMF...................................... 27 4.3 Analysis of purinergic receptors involved.................................... 30 3.3.1 Agonist stimulation.............................................................. 30 3.3.2 Signal inhibition by specific antagonists................................... 31 4.4 Confocal immunofluorescence of purinergic receptors.................. 32 5. Discussion............................................................................. 34 5.1 Myofibroblast identification....................................................... 34 5.2 Spontaneous activity in the bladder............................................ 36 5.3 ATP modulated calcium activity in sMF....................................... 37 5.4 purinergic signalling in sMF........................................................ 39 6. Summary................................................................................ 42 7. References.............................................................................. 45 Declaration............................................................................. 50 Acknowledgements................................................................. 51