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Abstract Laminins are basement membrane glycoproteins consisting of three polypeptide chains α, β and γ. Until now 12 members of the protein family have been characterized and all isoforms have an αβγ chain composition, but they assemble in varying combinations of chain variants. The functional properties of laminins include cell adhesion, proliferation, differentiation, growth and migration. Laminin-5 has a chain composition of α3β3γ2 with the distribution mainly restricted to epithelial basement membranes, where its biological functions involve anchorage and locomotion of cells. The importance of this protein for the attachment of basal keratinocytes is clearly demonstrated by the fact that all genes encoding its chains have been shown to be mutated in the severe skin blistering disease Epidermolysis bullosa junctionalis. The present study focused on investigations of the role of the laminin-5 isoform and particularly its γ2 chain in cell adhesion and migration. The role of the short arm of the laminin γ2 chain in the process of epithelial cell attachment is to serve as a kind of a bridging molecule to the extracellular environment, because it does not have any cell binding activity by itself. It was also shown that the newly synthesized γ2 chain participates in the complex process of cell migration, probably as one of the first attachment components for moving cells. Thus, as a migration and differentiation-associated molecule, laminin-5 was considered a potential marker for detection of malignant processes where cell movement plays a role. Subsequently it was shown that the γ2 chain is expressed not only in a restricted manner in human epithelial tissues, but also in a number of human epithelium-derived cancers. In some carcinomas, expression of the γ2 chain appeared to be a characteristic of cancer cells with invasive properties. Examination of over 50 dysplasias and cervical tumors revealed that γ2 chain antibodies were able to distinguish between lesions with or without invasive capacity. This is the first systematic study of epithelial cancers where γ2 chain antibodies have been shown to be a useful marker in the histopathological diagnostics. In addition, this study showed in a mouse tumor model that the γ2 chain of laminin-5 has a potential for being of use for in vivo tumor imaging.

PURPOSE. Recessive mutations in CLN7/MFSD8 usually cause variant late-infantile onset neuronal ceroid lipofuscinosis (vLINCL), a poorly understood neurodegenerative condition, though mutations may also cause nonsyndromic maculopathy. A series of 12 patients with nonsyndromic retinopathy due to novel CLN7/MFSD8 mutation combinations were investigated in this study. METHODS. Affected patients and their family members were recruited in ophthalmic clinics at each center where they were examined by retinal imaging and detailed electrophysiology. Whole exome or genome next generation sequencing was performed on genomic DNA from at least one affected family member. Immunofluorescence confocal microscopy of murine retina cross-sections were used to localize the protein. RESULTS. Compound heterozygous alleles were identified in six cases, one of which was always p.Glu336Gln. Such combinations resulted in isolated macular disease. Six further cases were homozygous for the variant p.Met454Thr, identified as a founder mutation of South Asian origin. Those patients had widespread generalized retinal disease, characterized by electroretinography as a rod-cone dystrophy with severe macular involvement. In addition, the photopic single flash electroretinograms demonstrated a reduced b- to a-wave amplitude ratio, suggesting dysfunction occurring after phototransduction. Immunohistology identified MFSD8 in the outer plexiform layer of the retina, a site rich in photoreceptor synapses. CONCLUSIONS. This study highlights a hierarchy of MFSD8 variant severity, predicting three consequences of mutation: (1) nonsyndromic localized maculopathy, (2) nonsyndromic widespread retinopathy, or (3) syndromic neurological disease. The data also shed light on the underlying pathogenesis by implicating the photoreceptor synaptic terminals as the major site of retinal disease.

Estudos apontam a neuroinflamação como um dos possíveis agravantes do mal de Parkinson. Aqui investigamos a susceptibilidade de duas linhagens de camundongos selecionados quanto a suas capacidades de produzir alta (AIRmax) ou baixa (AIRmin) resposta inflamatória aguda aos agentes neurotóxicos 1-Metil-4-Fenil-1,2,3,6-Tetrahidropirimidina (MPTP) (Tratamento agudo: 4 x 20 mg/kg ou 5 x 20 mg/kg s.c. a cada 2 horas em um único dia) e rotenona (tratamento crônico: infusão s.c. contínua por bomba osmótica Alzet a 3, 6 e 12 mg/kg/dia por 28 dias ou sub-crônico: injeção i.p na dose de 3 mg/kg/dia durante 10 dias). A avaliação motora contou com Rotarod empregando paradigma de 5 minutos e rotação crescente de 5 a 50 rpm. A lesão foi quantificada por imunohistoquímica para tirosina hidroxilase em cortes de estriado e substância negra. Os resultados sugerem que ambas as linhagens AIRmax e AIRmin, são resistentes a lesão neuronal por MPTP ou rotenona. Conjecturamos que as linhagens se diferenciam quanto a resposta inflamatória periférica, mas não de origem central (neuroinflamação). / Studies suggest that neuroinflammatory processes are involved in Parkinson\'s disease. Here we investigated the susceptibility of two inbred strains of mice selected for their ability to produce high (AIRmax) or low (AIRmin) acute inflammatory response to neurotoxins 1-Methyl-4-phenyl-1,2,3,6-Tetrahydropyridine (MPTP) (4 x 20 mg/kg or 5 x 20 mg/kg s.c. every 2 hours in a single day) and rotenone (chronic treatment: continuous s.c. infusion of 3, 6 and 12 mg/kg/day by Alzet osmotic pump for 28 days or sub-chronic treatment: i.p. injection at a dose of 3 mg/kg/day for 10 days). The animals were evaluated by rotarod apparatus in sessions of 5 minutes and constantly increasing speed from 5 to 50 rpm. The lesion was quantified by tyrosine hydroxylase immunohistochemistry in sections of striatum and substantia nigra. The results suggest that both strains AIRmax and AIRmin are resistant to neuronal damage by MPTP or rotenone. We conjecture that the strains differ concerning the peripheral inflammatory response, but not in neuroinflammatory mechanisms.

The processing of lambskins plays an important role in the New Zealand meat industry. The use of enzyme dewooling offers considerable advantages over the conventional depilation method which generates unpleasant working conditions and poses product quality risks when not properly handled. Prior to this work it was unclear from the literature why the practice of enzymatic depilation had not generally been adopted by industry. The aim of this work was to determine the problems associated with enzymatic depilation and provide a mechanistic understanding of the dewooling and damaging processes of enzyme depilation to provide underpinning knowledge for the design of a successful enzymatic depilation system. It was found that variability in depilation between different regions of the skin resulted in either over exposure of the skin to the enzyme regent and subsequent damage or underexposure of the skin to the enzyme reagent and incomplete depilation. Two approaches were taken in the work: Firstly an attempt was made for the first time to understand the variability in enzymatic depilation so that the variability observed in enzymatic depilation could potentially be reduced, thereby allowing a complete depilation process with no overexposure. Secondly an investigation was made for the first time to understand the cause of damage to skins during the process of enzymatic depilation so that the enzyme depilation process could potentially be modified to avoid damage. Experimental work characterising the time course of depilation and damage development was carried out and compared with the variation of physical properties across the skin. Correlations between depilation and physical properties such as thickness, grease content and follicle density were found. Reduction in the variability of these properties would likely improve the evenness of depilation but would not reduce it enough to eliminate damage due to over exposure. A range of techniques including: immunohistology, 2-dimensional electrophoresis, matrix assisted laser desorption ionisation, and atomic force microscopy were used to probe the structural and biochemical mechanism of enzyme depilation and damage. In this way it was found that the removal of minor collagen components were the likely cause of damage observed. In particular the removal of collagen VI was associated with a disruption of the smooth mesh of fine collagen fibres observed at the surface of the leather. The key requirement identified for a successful enzyme depilation system was the use of a broad spectrum protease which has no activity against collagen VI. The means to select a protease with these attributes was also developed by adopting a micro depilation assay incorporating immunohistology. This knowledge will enable the future development of non damaging enzyme depilatory reagents that could revolutionise the industry.

Estudos apontam a neuroinflamação como um dos possíveis agravantes do mal de Parkinson. Aqui investigamos a susceptibilidade de duas linhagens de camundongos selecionados quanto a suas capacidades de produzir alta (AIRmax) ou baixa (AIRmin) resposta inflamatória aguda aos agentes neurotóxicos 1-Metil-4-Fenil-1,2,3,6-Tetrahidropirimidina (MPTP) (Tratamento agudo: 4 x 20 mg/kg ou 5 x 20 mg/kg s.c. a cada 2 horas em um único dia) e rotenona (tratamento crônico: infusão s.c. contínua por bomba osmótica Alzet a 3, 6 e 12 mg/kg/dia por 28 dias ou sub-crônico: injeção i.p na dose de 3 mg/kg/dia durante 10 dias). A avaliação motora contou com Rotarod empregando paradigma de 5 minutos e rotação crescente de 5 a 50 rpm. A lesão foi quantificada por imunohistoquímica para tirosina hidroxilase em cortes de estriado e substância negra. Os resultados sugerem que ambas as linhagens AIRmax e AIRmin, são resistentes a lesão neuronal por MPTP ou rotenona. Conjecturamos que as linhagens se diferenciam quanto a resposta inflamatória periférica, mas não de origem central (neuroinflamação). / Studies suggest that neuroinflammatory processes are involved in Parkinson\'s disease. Here we investigated the susceptibility of two inbred strains of mice selected for their ability to produce high (AIRmax) or low (AIRmin) acute inflammatory response to neurotoxins 1-Methyl-4-phenyl-1,2,3,6-Tetrahydropyridine (MPTP) (4 x 20 mg/kg or 5 x 20 mg/kg s.c. every 2 hours in a single day) and rotenone (chronic treatment: continuous s.c. infusion of 3, 6 and 12 mg/kg/day by Alzet osmotic pump for 28 days or sub-chronic treatment: i.p. injection at a dose of 3 mg/kg/day for 10 days). The animals were evaluated by rotarod apparatus in sessions of 5 minutes and constantly increasing speed from 5 to 50 rpm. The lesion was quantified by tyrosine hydroxylase immunohistochemistry in sections of striatum and substantia nigra. The results suggest that both strains AIRmax and AIRmin are resistant to neuronal damage by MPTP or rotenone. We conjecture that the strains differ concerning the peripheral inflammatory response, but not in neuroinflammatory mechanisms.

Um das Langzeitüberleben eines Kreuzbandtransplantates nach Ersatz des VKB zu gewährleisten muß das Transplantat revaskularisiert werden. Trotz zahlreicher Studien zu diesem Thema gibt es noch immer eine kontroverse Diskussion bezüglich der Revaskularisierung von Kreuzbandtransplantaten. Ziel der vorliegenden Studie war es die endoligamentäre mikrokapilläre Revaskularisierung eines freien Sehnentransplantates mit Hilfe immunhistochemischer Färbetechnik darzustellen und ihren Verlauf über die Zeit zu dokumentieren. Darüber hinaus sollten die im Rahmen des Remodelingprozesses nach vorderem Kreuzbandersatz ablaufenden Ab- und Aufbauprozesse der Extrazellulärmatrix des Transplantates weiter aufgeklärt werden. Bei der Heilung des medialen Kollateralband des Kniegelenkes wurden kontraktile fibroblastische Zellen entdeckt, die eine mögliche Rolle bei der Wiederherstellung der Matrixhomöostase spielen. Nach Entdeckung dieses Zelltyps im intakten vorderen Kreuzbandes wurde gemutmaßt, Myofibroblasten könnten eine entscheidende Rolle bei der Entstehung der Kollagentertiärstruktur spielen. In der vorliegenden Studie sollte aufgeklärt werden, ob Myofibroblasten im intakten ovinen vorderen Kreuzband und seinem freien Sehnentransplantat nach VKB-Ersatz während des Remodelings wieder auftaucht. 36 ausgewachsene Merinoschafe erhielten einen vorderen Kreuzbandersatz mittels ipsilateralem Flexorsehnentransplantat. Nach je 6, 9, 12, 24, 52 und 104 Wochen wurden 6 Tiere getötet und das mittlere Drittel des Kreuzbandtransplantates histologisch aufgearbeitet. Neben konventionellen Färbungen zur Auswertung von Gesamtzellzahl und Crimpstruktur wurden immunhistochemische Färbungen mit anti-v. Willebrandt Factor (Factor VIII) zum Nachweis von Endothelzellen der Gefäßwand und anti-alpha-smooth-muscle Aktin zum Nachweis von Myofibroblasten durchgeführt. In Querschnittpräparaten, je in 3 Zonen (subsynovial, intermediär und zentral) unterteilt, wurden Gefäßanschnitte ausgezählt. In Längsschnittpräparaten wurden Myofibroblasten nachgewiesen. Die Auswertungen wurden mit Hilfe eines digitalen Bildanalysesystems vorgenommen. Die Untersuchungen zur Revaskularisierung zeigten von peripher nach zentral über die Zeit einwachsende Kapillaren. Die größte Dichte an Gefäßanschnitten wurde nach 6 Wochen gefunden, der Gefäßstatus des nativen VKB wurde nach 24 Wochen erreicht. Myofibroblasten konnten sowohl im intakten VKB als auch im Flexorsehnentransplantat vor Implantation nachgewiesen werden. Weiterhin konnten Myofibroblasten erstmalig auch im remodelierenden Bandgewebe bereits nach 6 Wochen innerhalb neu gebildeter Kollagenfasern identifiziert werden. Die vorliegende Studie konnte damit erstmalig die Kinetik der endoligamentären Revaskularisierung auf kapillärer Ebene darstellen. Im vorliegenden Modell war die Revaskularisierung wesentlich früher abgeschlossen als zuvor beschrieben. Myofibroblasten stellen einen regulären Bestandteil sowohl des nativen als auch des remodelierenden VKB dar. Dabei könnten diese Zellen eine wichtige Rolle bei der Wiedererlangung der Gewebehomöostase durch die Ausbildung der Kollagentertiärstruktur spielen. Die Präsenz dieser Zellen während der frühen Remodellingphase läßt weiterhin vermuten, daß alpha smooth muscle Actin exprimierende Zellen in der frühsten Phase der Bildung von Kollagenfibrillen mitbeteiligt sind. / After replacement of the anterior cruciate ligament with a free tendon autograft, the substitute initially is avascular and without a synovial surface. To ensure long-term survival, the graft must become revascularised. Despite numerous studies on the topic, there still is controversial discussion regarding revascularisation. The first aim of the current study was to investigate the endoligamentous microcapillary revascularisation of the free tendon graft after anterior cruciate ligament replacement with time. Furthermore degeneration and reformation of the extracellular matrix during remodeling of the anterior cruciate ligament graft was to elucidate. Contractile fibroblastic cells expressing the alpha-smooth muscle actin isoform, so called myofibroblasts, have been identified to play a possible role during the healing of the medial collateral ligament by means of restoring the tissue s in situ strain via extracellular matrix contraction. Recently, these cells have also been identified to be a normal part of the human anterior cruciate ligament. It has been hypothesised that myofibroblasts play a role in wrinkling of the extracellular matrix. Therefore the second aim of the current study was to identify myofibroblasts in the intact ovine anterior cruciate ligament and their reoccurrence in a free autologous tendon graft during remodeling after anterior cruciate ligament reconstruction. Thirty-six mature sheep had an anterior cruciate ligament reconstruction with an ipsilateral flexor tendon split graft. Besides conventional staining to analyse total cell density and collagen crimp, midsubstance tissue samples were immunostained for von Willebrandt factor (Factor VIII) to detect the endothelial cells of capillaries and for a-smooth muscle actin to identify myofibroblasts. For vessel detection cross sections of the samples were determined in three zones (subsynovial, intermediate, and center of the graft). Myofibroblast distribution was analysed in longitudinal sections. Evaluation was performed at 6, 9, 12, 24, 52, and 104 weeks by means of histomorphometry using a digital imaging analysis system. The observations showed that capillary vessels, which originate from the synovial envelope, invaded the avascular graft tissue from the surface toward the center zone. The highest level of vascular density was found after 6 weeks, reaching the vascular status of the native anterior cruciate ligament after 24 weeks. Myofibroblasts were identified in the intact ovine anterior cruciate ligament as well as in the flexor tendon graft prior to implantation. During remodeling first myofibroblasts were found at 6 weeks within newly formed fibre bundles. At 24, 52, and 104 weeks myofibroblast distribution and cell density was similar to that of the intact ovine anterior cruciate ligament. The current study has shown, for the first time, the kinetics of an endoligamentous revascularisation of a free tendon graft at the capillary level. In the current model, the process of revascularisation terminated earlier than previously described. Furthermore the current study has shown that alpha-smooth muscle actin containing fibroblastic cells are a regular part of the intact as well as the remodeled anterior cruciate ligament. There is evidence, that myofibroblasts may be involved in maintaining tissue homeostasis in the mature ligament e.g. by means of crimp formation. The presence of these cells during the early remodeling may further indicate that alpha-smooth muscle actin containing fibroblastic cells are involved in the earliest stages of fibre bundle formation.

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Bei der Bestrahlung von Kopf-Hals-Tumoren tritt die orale Mukositis als wichtigste und dosislimitierende frühe Nebenwirkung auf. Verschiedene prophylaktische und therapeutische Maßnahmen wurden untersucht, jedoch konnte bisher keine Methode in der klinischen Routine etabliert werden. Ein neuer Ansatz ist die Verwendung des Cholesterinsynthese-hemmers Lovastatin. Für diesen Wirkstoff konnte in vorhergehenden Untersuchungen ein mukoprotektiver Effekt nachgewiesen werden. In der vorliegenden Arbeit wurde der Zusammenhang zwischen diesem schleimhaut-schützenden Effekt und der Expression von induzierbarer Stickstoffmonoxid-Synthase (iNOS), Nitrotyrosin (NT) und CD105 betrachtet. Das Enzym iNOS ist an Entzündungsreaktionen beteiligt; NT stellt ein Folgeprodukt des durch iNOS gebildeten Stickstoffmonoxids dar. CD105 wird von aktivierten Monozyten und Makrophagen exprimiert. Ausgangsmaterial für die vorliegende Studie waren 174 Präparate aus dem vorangegangenen Tierversuch. In diesem wurde bei Mäusen eine fraktionierte Schnauzenbestrahlung zum Teil mit einer Lovastatingabe kombiniert. Zusätzlich wurden Tiere alleinig mit Lovastatin behandelt. Für diesen Versuch wurden Mäuse des Stammes C3H/Neu verwendet. Die Bestrahlung erfolgte mit 5 x 3 Gy über zwei Wochen. Lovastatin wurde in einer Dosis von 16 mg/kg oral verabreicht. Gegenstand der aktuellen Untersuchung war - neben der allgemeinen histologischen Charakterisierung - die immunhistochemische Darstellung von iNOS, NT und CD105 im Epithel der Zungenunterseite sowie im subepithelialen Gewebe. Ausgewertet wurden die Gesamtzellzahl im Epithel, die Zahl iNOS- und NT-positiver Zellkerne in Germinativ- und funktioneller Schicht sowie jeweils die Farbintensität der positiven Epithelzellen. In der L. propria und L. muscularis wurden die CD105-, iNOS-, und NT-positiven Makrophagen sowie die weiteren iNOS- und NT-positiven Immunzellen erfasst und ihre Farbintensität bestimmt. Weiterhin wurde die Homogenität und Intensität der Expression von iNOS im Endothel bewertet. Die Auswertung umfasst die deskriptive Darstellung der Werteverläufe dieser Parameter. Aufgrund der geringen Anzahl von drei Versuchstieren je Tag und Gruppe wurde auf die Berechnung der statistischen Signifikanz der Ergebnisse verzichtet. Die Gesamtzellzahl im Zungenepithel zeigte bei Bestrahlung eine deutliche Reduktion auf 65 % des Ausgangswertes. Mit Beendigung der Behandlung war eine entsprechende Erholung zu sehen. Die alleinige Lovastatinbehandlung bewirkte dagegen eine Steigerung der Gesamtzell-zahl auf ca. 110 %. Während iNOS sowohl im unbehandelten als auch im behandelten Epithelgewebe nachweisbar war, war NT im unbehandelten Epithel kaum vorhanden. Die Ausgangswerte betrugen 22 % iNOS-positive Kerne in der Germinativschicht und 8 % in der funktionellen Schicht, sowie 2 % und 1 % für die NT-Färbung. In der Germinativschicht waren sowohl bei alleiniger Bestrahlung als auch bei alleiniger Lovastatintherapie 30 - 50 % der Zell-kerne iNOS-positiv. Bei zweiwöchiger Kombinationstherapie lagen die Werte teils darunter; bei Lovastatingabe ab Tag 7 lagen sie vornehmlich in dem oberen Bereich. In der funktionellen Schicht spiegelten sich diese Verteilungsmuster wider, allerdings lag die Anzahl positiver Kerne insgesamt überwiegend unter 30 %. Die Zahl NT-positiver Zellkerne stieg in beiden Schichten infolge der Bestrahlung auf ca. 50 - 60 %. Unter alleiniger Lovastatintherapie lag sie unter 30 %. Die zweiwöchige Kombination zeigte ebenfalls eine Tendenz zum niederen Bereich. Bei Lovastatingabe ab Tag 7 lagen die Werte geringgradig vermehrt im höheren Bereich. Die Anfärbung der Makrophagen gegen CD105 verdeutlichte bei allen Gruppen eine Reduktion der Makrophagenzahl auf ca. 50 % des Ausgangswertes. Auch die Zahl iNOS-positiver Makrophagen reduzierte sich in allen Behandlungsgruppen einheitlich auf unter 80 % der Norm. Die Zahl NT-positiver Makrophagen lag näher am Ausgangswert. Im Gegensatz dazu waren die restlichen Immunzellen unter Behandlung vermehrt iNOS-positiv. Die Werte lagen häufig weit oberhalb des Referenzbereichs. Dabei zeigte im Vergleich die alleinige Bestrahlung die niedrigsten Werte mit maximal 136 % der Norm. Bei der Färbung gegen NT konnten nur bei alleiniger Lovastatinverabreichung konstant Werte oberhalb des Ausgangswertes festgestellt werden. Innerhalb der Untersuchungen konnte das Endothel nur mit iNOS-AK auswertbar angefärbt werden. Es zeigte in allen Gruppen eine durchgängig homogene Färbung. Die Farbintensität war mittelmäßig und wurde in allen Behandlungsgruppen zum Ende des Untersuchungszeitraums kräftiger. Als Resultat dieser Arbeit ist festzuhalten, dass bei allen vier Behandlungsvarianten iNOS und NT in hohem Maße in der Germinativschicht des Epithels exprimiert wurden. In der funktionellen Schicht war die Expression von iNOS schwächer, während die NT-expression nahezu gleich blieb. Damit muss NT eine längere Halbwertszeit haben. Des Weiteren waren nicht alle aktivierten (CD105-positiven) Makrophagen iNOS-positiv und wiederum produzierte iNOS nicht in allen Zellen NT. Dies wurde auch durch die deutlich höhere Zahl iNOS-positiver Immunzellen in den Ll. propriae und musculares deutlich. Die biochemischen Abläufe, durch welche Lovastatin zur Reduktion der radiogenen Mucositis enoralis führt, bleiben daher weiterhin zu erforschen. In der durchgeführten Untersuchung zeigte sich kein eindeutiger Hinweis auf einen Zusammenhang mit dem iNOS-NT-Signaltransduktionsweg.:Abkürzungsverzeichnis VIII 1 Einleitung 1 2 Literaturübersicht 3 2.1 Bedeutung von Tumorerkrankungen bei Mensch und Tier 3 2.2 Kopf-Hals-Tumoren 4 2.2.1 Tumorvorkommen beim Menschen 4 2.2.2 Tumorvorkommen bei Hund und Katze 4 2.2.3 Symptome beim Kleintier 5 2.2.4 Behandlungsmethoden 5 2.2.4.1 Chirurgie 5 2.2.4.2 Chemotherapie 5 2.2.4.3 Radiotherapie 6 2.2.4.4 Radiochemotherapie 7 2.2.5 Nebenwirkungen der Tumorbehandlung 7 2.2.5.1 Nebenwirkungen der Chemotherapie 7 2.2.5.2 Nebenwirkungen der Radiotherapie 8 2.3 Mucositis enoralis 8 2.3.1 Aufbau von Zunge und Zungenepithel 8 2.3.2 Pathogenese und zeitlicher Verlauf der radiogenen oralen Mukositis 10 2.3.2.1 Stadien der Mukositis und klinisches Erscheinungsbild 10 2.3.2.2 Reaktionskette der Strahlenwirkung 11 2.3.3 Einteilung des Schweregrades der Mukositis 12 2.3.3.1 Einteilung für die Humanmedizin 12 2.3.3.2 Einteilung für die Veterinärmedizin 13 2.3.4 Aktuelle Herangehensweise an die radiogene orale Mukositis 13 2.4 Lovastatin 14 2.4.1 Struktur und Anwendung 14 2.4.2 Weitere Wirkmechanismen von Statinen 14 2.4.2.1 Die apoptotische Wirkung der Statine 15 2.4.3 Eigenschaften im Tiereinsatz 15 2.5 Induzierbare Stickstoffmonoxid-Synthase und Nitrotyrosin 16 2.5.1 Die NOS und Nitrotyrosinbildung 16 2.5.2 Vorkommen von iNOS und Nitrotyrosin 17 3 Zielstellung der Arbeit 19 4 Material und Methoden 20 4.1 Versuchstiere 20 4.2 Perkutane Schnauzenbestrahlung 20 4.3 Applikation von Lovastatin 22 4.4 Versuchsprotokoll 22 4.5 Histologische Aufbereitung 23 4.5.1 Antikörper 23 4.5.1.1 Induzierbare Stickstoffmonoxid-Synthase (iNOS) 23 4.5.1.2 Nitrotyrosin 23 4.5.1.3 CD105 ... 23 4.5.1.4 Kontroll-Antikörper 23 4.5.2 Färbeprotokolle 24 4.5.2.1 iNOS und CD105 24 4.5.2.2 Nitrotyrosin 26 4.5.2.3 Optimierung der Konzentration der primären Antikörper 27 4.5.3 Histologische Auswertung 29 4.5.3.1 Epithel .. 29 4.5.3.2 L. propria und L. muscularis 30 4.5.3.3 Endothel 31 4.6 Analyse 31 5 Ergebnisse 32 5.1 Zellzahlen im Epithel 32 5.1.1 Kontrollgruppe 32 5.1.2 Alleinige Bestrahlung 32 5.1.3 Alleinige Lovastatinbehandlung 33 5.1.4 Bestrahlung und Lovastatingabe von Tag 0 bis 14 34 5.1.5 Bestrahlung und Lovastatingabe von Tag 7 bis 14 34 5.2 Expression von iNOS 36 5.2.1 Kontrollgruppe 36 5.2.2 Alleinige Bestrahlung 36 5.2.3 Alleinige Lovastatingabe 38 5.2.4 Bestrahlung und Lovastatingabe von Tag 0 bis 14 41 5.2.5 Bestrahlung und Lovastatingabe von Tag 7 bis 14 43 5.3 Expression von Nitrotyrosin 45 5.3.1 Kontrollgruppe 45 5.3.2 Alleinige Bestrahlung 45 5.3.3 Alleinige Lovastatinbehandlung 47 5.3.4 Bestrahlung und Lovastatingabe von Tag 0 bis 14 49 5.3.5 Bestrahlung und Lovastatingabe von Tag 7 bis 14 51 5.4 Expression von CD105 54 5.4.1 Alleinige Bestrahlung 54 5.4.2 Alleinige Lovastatinbehandlung 54 5.4.3 Bestrahlung und Lovastatingabe von Tag 0 bis 14 55 5.4.4 Bestrahlung und Lovastatingabe von Tag 7 bis 14 55 6 Diskussion 57 6.1 Klinischer Hintergrund 57 6.2 Tiermodelle für die radiogene orale Mukositis 58 6.2.1 Maus 58 6.2.2 Ratte 58 6.2.3 Hamster 58 6.3 Eigenschaften des unbehandelten Zungengewebes 59 6.3.1 Epithel der Zungenunterseite 59 6.3.1.1 Zellzahl . .59 6.3.1.2 Nachweis von iNOS 59 6.3.1.3 Nachweis von Nitrotyrosin 60 6.3.2 Immunzellen in der L. propria und L. muscularis 60 6.3.2.1 Nachweis von iNOS 60 6.3.2.2 Nachweis von Nitrotyrosin 60 6.3.2.3 Nachweis von CD105 60 6.3.3 Endothelien der L. propria und L. muscularis 60 6.4 Veränderungen bei konventioneller fraktionierter Bestrahlung 61 6.4.1 Epithel der Zungenunterseite 61 6.4.1.1 Zellzahl . 61 6.4.1.2 Nachweis von iNOS 61 6.4.1.3 Nachweis von Nitrotyrosin 62 6.4.2 Immunzellen in der L. propria und L. muscularis 62 6.4.2.1 Nachweis von iNOS 62 6.4.2.2 Nachweis von Nitrotyrosin 62 6.4.2.3 Nachweis von CD105 63 6.4.3 Endothelien der L. propria und L. muscularis 63 6.5 Veränderungen bei alleiniger Lovastatinbehandlung 63 6.5.1 Epithel der Zungenunterseite 63 6.5.1.1 Zellzahl . 63 6.5.1.2 Nachweis von iNOS 63 6.5.1.3 Nachweis von Nitrotyrosin 64 6.5.2 Immunzellen in der L. propria und L. muscularis 64 6.5.2.1 Nachweis von iNOS 64 6.5.2.2 Nachweis von Nitrotyrosin 64 6.5.2.3 Nachweis von CD105 64 6.5.3 Endothelien der L. propria und L. muscularis 65 6.6 Veränderungen bei fraktionierter Bestrahlung mit zusätzlicher Lovastatinbehandlung über 2 Wochen 65 6.6.1 Epithel der Zungenunterseite 65 6.6.1.1 Zellzahl . 65 6.6.1.2 Nachweis von iNOS 65 6.6.1.3 Nachweis von Nitrotyrosin 66 6.6.2 Immunzellen in den L. propria und L. muscularis 66 6.6.2.1 Nachweis von iNOS 66 6.6.2.2 Nachweis von Nitrotyrosin 67 6.6.2.3 Nachweis von CD105 67 6.6.3 Endothelien der L. propria und L. muscularis 67 6.7 Veränderungen bei fraktionierter Bestrahlung mit zusätzlicher Lovastatinbehandlung ab Tag 7 68 6.7.1 Epithel der Zungenunterseite 68 6.7.1.1 Zellzahl . 68 6.7.1.2 Nachweis von iNOS 68 6.7.1.3 Nachweis von Nitrotyrosin 68 6.7.2 Immunzellen in der L. propria und L. muscularis 69 6.7.2.1 Nachweis von iNOS 69 6.7.2.2 Nachweis von Nitrotyrosin 69 6.7.2.3 Nachweis von CD105 69 6.7.3 Endothelien der L. propria und L. muscularis 70 6.8 Zusammenfassende Einschätzung der Ergebnisse 70 7 Ausblick 72 8 Zusammenfassung 73 9 Summary 75 10 Abbildungsverzeichnis 77 11 Tabellenverzeichnis 80 12 Literatur 81 13 Anhang 92 14 Danksagung 100 / During radiation of head-and-neck-cancer oral mucositis is the most important and dose-limiting early side effect. Different preventive and theoretical procedures were investigated, but so far there has been no method established in clinical routine. A new approach is the application of the cholesterol synthesis inhibitor lovastatin. Previous investigtions proved a mucoprotective effect of this agent. In this investigation the correlation between this mucoprotective effect and the expression of inducible nitric oxide synthase (iNOS), nitrotyrosine (NT) and CD105 was observed. The enzyme iNOS takes part in inflammtory reactions; NT is a secondary product of the nitric oxide produced by iNOS. CD105 is expressed by activated monocytes and macrophages. The source material for this study were 174 preparations from previous animal examinations. In this investigation a daily fractionated radiation of the snout was partly combined with lovastatin applications. In addition some mice were treated with lovastatin only. For this research mice of the line C3H/Neu were used. Radiation was performed with 5 x 3Gy over two weeks. Lovastatin was used at an oral dose of 16mg/kg. The matter of the research was - next to general histological characterisation - the immunohistochemical exposure of iNOS, NT and CD105 in the epithelial layer of the undersurface of the tongue and in the subepithelial tissue. The total cell count in the epithelium, the number of iNOS- and NT-positive nuclei in the germinal and the functional layer, as well as the intensity of the staining were evaluated. In the l. propria and l. muscularis CD105-, iNOS-, and NT-positive macrophages and other iNOS- and NT-positive immune cells were identified and the intensity of their staining was determined. Furthermore the homogeneity and intensity of the expression of iNOS in the endothelium were rated. The analysis contains the descriptive presentation of the value patterns of these parameters. Because of the small number of three test animals per day and group the statistical significance of the results was not determined. In consequence of radiotherapy the total cell count in the epithelium decreased to 65% of origin. Recovery was visible after termination of the treatment. With lovastatin medication only, the cell count increased to approximately 110%. While iNOS was present in the untreated as well as in the treated tissue, NT was hardly visible in the untreated one. The basic values were 22% of iNOS-positive nuclei in the germinal layer and 8% in the functional layer, and 2% and 1% for the NT-staining. Both, sole radiation and sole lovastatin therapy, showed 30-50% iNOS-positive nuclei in the germinal layer. With combined therapy for two weeks the values were partially lower, with lovastatin treatment from day 7 they were in the upper range. This group distribution was reflected in the functional layer, although altogether the quantity of positive nuclei was mostly under 30%. Due to radiation the number of NT-positive nuclei increased to 50-60% in both layers. With sole lovastatin therapy it was under 30%. Combined therapy over two weeks showed a tendency to the lower range too. With lovastatin treatment from day 7 the values were situated a little bit more in the upper range. The macrophage staining against CD105 revealed a reduction of macrophage cell count to approximately 50% of origin in all groups. Likewise the number of iNOS-positive macrophages decreased in all groups consistently to less than 80% of normal. The number of NT-positive macrophages was closer to the origin. In contrast to this, the other immunocompetent cells were increasingly iNOS-positive under treatment. Often values were high above the reference range. In comparison sole radiation therapy showed the lowest values with a maximum of 136% of normal. Regarding the staining against NT only sole lovastatin treatment showed values constantly above origin. Within this study the only evaluable staining for the endothelium was with iNOS-antibody. It showed a constant homogeneous staining in all groups. The intensity of the staining was moderate and increased in all treatment groups towards the end of the examination. Therefore it can be concluded that under treatment iNOS and NT were both highly expressed in the germinal layer. In the functional layer the expression of iNOS was reduced whereas the expression of NT remained about the same. So NT must have a longer half-life. In addition not all activated (CD105-positive) macrophages were also iNOS-positive and again iNOS did not produce NT in all cells. This was also proven by the distinct higher number of iNOS-positive immunocompetent cells in the ll. propriae and musculares. Therefore the biochemical processes, because of which lovastatin leads to the reduction of the radiogenic mucositis enoralis, remain to be investigated. During the present investigation there was no distinct hint for a correlation with the iNOS-NT-pathway.:Abkürzungsverzeichnis VIII 1 Einleitung 1 2 Literaturübersicht 3 2.1 Bedeutung von Tumorerkrankungen bei Mensch und Tier 3 2.2 Kopf-Hals-Tumoren 4 2.2.1 Tumorvorkommen beim Menschen 4 2.2.2 Tumorvorkommen bei Hund und Katze 4 2.2.3 Symptome beim Kleintier 5 2.2.4 Behandlungsmethoden 5 2.2.4.1 Chirurgie 5 2.2.4.2 Chemotherapie 5 2.2.4.3 Radiotherapie 6 2.2.4.4 Radiochemotherapie 7 2.2.5 Nebenwirkungen der Tumorbehandlung 7 2.2.5.1 Nebenwirkungen der Chemotherapie 7 2.2.5.2 Nebenwirkungen der Radiotherapie 8 2.3 Mucositis enoralis 8 2.3.1 Aufbau von Zunge und Zungenepithel 8 2.3.2 Pathogenese und zeitlicher Verlauf der radiogenen oralen Mukositis 10 2.3.2.1 Stadien der Mukositis und klinisches Erscheinungsbild 10 2.3.2.2 Reaktionskette der Strahlenwirkung 11 2.3.3 Einteilung des Schweregrades der Mukositis 12 2.3.3.1 Einteilung für die Humanmedizin 12 2.3.3.2 Einteilung für die Veterinärmedizin 13 2.3.4 Aktuelle Herangehensweise an die radiogene orale Mukositis 13 2.4 Lovastatin 14 2.4.1 Struktur und Anwendung 14 2.4.2 Weitere Wirkmechanismen von Statinen 14 2.4.2.1 Die apoptotische Wirkung der Statine 15 2.4.3 Eigenschaften im Tiereinsatz 15 2.5 Induzierbare Stickstoffmonoxid-Synthase und Nitrotyrosin 16 2.5.1 Die NOS und Nitrotyrosinbildung 16 2.5.2 Vorkommen von iNOS und Nitrotyrosin 17 3 Zielstellung der Arbeit 19 4 Material und Methoden 20 4.1 Versuchstiere 20 4.2 Perkutane Schnauzenbestrahlung 20 4.3 Applikation von Lovastatin 22 4.4 Versuchsprotokoll 22 4.5 Histologische Aufbereitung 23 4.5.1 Antikörper 23 4.5.1.1 Induzierbare Stickstoffmonoxid-Synthase (iNOS) 23 4.5.1.2 Nitrotyrosin 23 4.5.1.3 CD105 ... 23 4.5.1.4 Kontroll-Antikörper 23 4.5.2 Färbeprotokolle 24 4.5.2.1 iNOS und CD105 24 4.5.2.2 Nitrotyrosin 26 4.5.2.3 Optimierung der Konzentration der primären Antikörper 27 4.5.3 Histologische Auswertung 29 4.5.3.1 Epithel .. 29 4.5.3.2 L. propria und L. muscularis 30 4.5.3.3 Endothel 31 4.6 Analyse 31 5 Ergebnisse 32 5.1 Zellzahlen im Epithel 32 5.1.1 Kontrollgruppe 32 5.1.2 Alleinige Bestrahlung 32 5.1.3 Alleinige Lovastatinbehandlung 33 5.1.4 Bestrahlung und Lovastatingabe von Tag 0 bis 14 34 5.1.5 Bestrahlung und Lovastatingabe von Tag 7 bis 14 34 5.2 Expression von iNOS 36 5.2.1 Kontrollgruppe 36 5.2.2 Alleinige Bestrahlung 36 5.2.3 Alleinige Lovastatingabe 38 5.2.4 Bestrahlung und Lovastatingabe von Tag 0 bis 14 41 5.2.5 Bestrahlung und Lovastatingabe von Tag 7 bis 14 43 5.3 Expression von Nitrotyrosin 45 5.3.1 Kontrollgruppe 45 5.3.2 Alleinige Bestrahlung 45 5.3.3 Alleinige Lovastatinbehandlung 47 5.3.4 Bestrahlung und Lovastatingabe von Tag 0 bis 14 49 5.3.5 Bestrahlung und Lovastatingabe von Tag 7 bis 14 51 5.4 Expression von CD105 54 5.4.1 Alleinige Bestrahlung 54 5.4.2 Alleinige Lovastatinbehandlung 54 5.4.3 Bestrahlung und Lovastatingabe von Tag 0 bis 14 55 5.4.4 Bestrahlung und Lovastatingabe von Tag 7 bis 14 55 6 Diskussion 57 6.1 Klinischer Hintergrund 57 6.2 Tiermodelle für die radiogene orale Mukositis 58 6.2.1 Maus 58 6.2.2 Ratte 58 6.2.3 Hamster 58 6.3 Eigenschaften des unbehandelten Zungengewebes 59 6.3.1 Epithel der Zungenunterseite 59 6.3.1.1 Zellzahl . .59 6.3.1.2 Nachweis von iNOS 59 6.3.1.3 Nachweis von Nitrotyrosin 60 6.3.2 Immunzellen in der L. propria und L. muscularis 60 6.3.2.1 Nachweis von iNOS 60 6.3.2.2 Nachweis von Nitrotyrosin 60 6.3.2.3 Nachweis von CD105 60 6.3.3 Endothelien der L. propria und L. muscularis 60 6.4 Veränderungen bei konventioneller fraktionierter Bestrahlung 61 6.4.1 Epithel der Zungenunterseite 61 6.4.1.1 Zellzahl . 61 6.4.1.2 Nachweis von iNOS 61 6.4.1.3 Nachweis von Nitrotyrosin 62 6.4.2 Immunzellen in der L. propria und L. muscularis 62 6.4.2.1 Nachweis von iNOS 62 6.4.2.2 Nachweis von Nitrotyrosin 62 6.4.2.3 Nachweis von CD105 63 6.4.3 Endothelien der L. propria und L. muscularis 63 6.5 Veränderungen bei alleiniger Lovastatinbehandlung 63 6.5.1 Epithel der Zungenunterseite 63 6.5.1.1 Zellzahl . 63 6.5.1.2 Nachweis von iNOS 63 6.5.1.3 Nachweis von Nitrotyrosin 64 6.5.2 Immunzellen in der L. propria und L. muscularis 64 6.5.2.1 Nachweis von iNOS 64 6.5.2.2 Nachweis von Nitrotyrosin 64 6.5.2.3 Nachweis von CD105 64 6.5.3 Endothelien der L. propria und L. muscularis 65 6.6 Veränderungen bei fraktionierter Bestrahlung mit zusätzlicher Lovastatinbehandlung über 2 Wochen 65 6.6.1 Epithel der Zungenunterseite 65 6.6.1.1 Zellzahl . 65 6.6.1.2 Nachweis von iNOS 65 6.6.1.3 Nachweis von Nitrotyrosin 66 6.6.2 Immunzellen in den L. propria und L. muscularis 66 6.6.2.1 Nachweis von iNOS 66 6.6.2.2 Nachweis von Nitrotyrosin 67 6.6.2.3 Nachweis von CD105 67 6.6.3 Endothelien der L. propria und L. muscularis 67 6.7 Veränderungen bei fraktionierter Bestrahlung mit zusätzlicher Lovastatinbehandlung ab Tag 7 68 6.7.1 Epithel der Zungenunterseite 68 6.7.1.1 Zellzahl . 68 6.7.1.2 Nachweis von iNOS 68 6.7.1.3 Nachweis von Nitrotyrosin 68 6.7.2 Immunzellen in der L. propria und L. muscularis 69 6.7.2.1 Nachweis von iNOS 69 6.7.2.2 Nachweis von Nitrotyrosin 69 6.7.2.3 Nachweis von CD105 69 6.7.3 Endothelien der L. propria und L. muscularis 70 6.8 Zusammenfassende Einschätzung der Ergebnisse 70 7 Ausblick 72 8 Zusammenfassung 73 9 Summary 75 10 Abbildungsverzeichnis 77 11 Tabellenverzeichnis 80 12 Literatur 81 13 Anhang 92 14 Danksagung 100