Doctor en Ciencias de la Ingeniería, Mención Modelación Matemática / La tesis de compone de dos partes. En la primer parte estudiamos estrategias de tiempo mínimo para el tratamiento de la contaminación en recursos acuíferos de gran volumen, tales como lagos o reservas naturales, mediante el uso de un biorreactor continuo que opera en un estado cuasi-estacionario. El control consiste en la alimentación del biorreactor desde el recurso, con un efluente más limpio siendo devuelto al recurso con el mismo caudal. Eliminamos la hipótesis de homogeneidad en la concentración del contaminante en el recurso proponiendo tres modelos espacialmente estructurados. El primer modelo considera dos zonas conectadas entre ellas mediante difusión y donde sólo una de ellas es tratada por el biorreactor. Con la ayuda el Principio del Máximo de Pontryagin probamos que el control retroalimentado óptimo depende sólo de las mediciones del contaminante en la zona tratada, sin dependencia del volumen, de la difusión, o de la concentración del contaminante en la zona no tratada. Mostramos que el efecto de añadir una bomba de recirculación que ayuda a mezclar ambas zonas es benéfico si ésta se opera a su máxima velocidad. El segundo modelo consiste en dos zonas conectadas entre sí por difusión y cada una de ellas conectada al biorreactor. Este es un problema donde el conjunto de velocidades es no convexo y para el cual no es posible probar directamente la existencia de soluciones. Superamos esta dificultad y resolvemos completamente el problema estudiad aplicando el principio de Pontryagin al problema asociado con controles relajados, obteniendo un control retroalimentado que trata le zona más contaminada hasta la homogeneización de ambas zonas. También obtenemos cotas explícitas sobre la función valor mediante técnicas de Hamilton-Jacobi-Bellman. Probamos que la función de tiempo mínimo es no-monótona como función del parámetro de difusión. El tercer modelo consiste en un sistema de dos zonas conectadas al biorreactor en serie, y una bomba de recirculación entre ellas. El conjunto de controles depende de la variable de estado; mostramos que esta restricción es activa a partir de cierto instante de tiempo hasta el final del proceso. Este es un resultado no intuitivo. Simulaciones numéricas ilustran los resultados teóricos, y las estrategias obtenidas son testeadas en modelos hidrodinámicos, mostrando ser buenas aproximaciones de la solución del problema no homogéneo. La segunda parte consiste en el desarrollo y estudio de un modelo estocástico de biorreactor secuencial por lotes. Obtenemos el modelo como un límite de procesos de nacimiento y muerte. Establecemos la existencia y unicidad de soluciones de la ecuación controlada que no satisface las hipótesis usuales. Probamos que para cualquier control, la probabilidad de extinción es positiva, resultado que no es clásico. Estudiamos el problema de la maximización de la probabilidad de llegar al nivel deseado de contaminación, con el reactor lleno, antes de la extinción. Este problema no satisface ninguna de las hipótesis usuales (dinámica no Lipschitz, coeficiente de difusión degenerado localmente Hölder, restricciones de espacio de estado, conjuntos objetivo y absorbente se intersectan), por lo que el problema debe ser estudiado en dos etapas: primero, probamos la continuidad de la función de costo sin control para condiciones iniciales con volumen máximo, y luego desarrollamos un principio de programación dinámica para una modificación del problema como un problema de control óptimo con costo final y sin restricciones de estado. / Este trabajo ha sido parcialmente financiado por Conicyt beca de Doctorado Nacional folio 21130840.

El uso de biosurfactantes en biorremediación facilita y acelera la degradación microbiana de hidrocarburos. El método del agar CTAB/MB creado por Siegmund y Wagner para el screening de cepas productoras de ramnolípidos (RL), ha sido ampliamente utilizado sin sufrir mejoras significativas en más de 20 años. Con el fin de optimizar la técnica como método cuantitativo, se hicieron placas con agar CTAB/MB y se probaron diferentes variables, tales como tiempo de incubación, refrigeración, concentración de CTAB, presencia de azul de metileno, diámetro de los pozos y volumen del inóculo. Adicionalmente, se desarrolló un nuevo método para detectar el RL de los halos mediante precipitación con HCl, lo cual permite la observación de un nuevo patrón de halos más fáciles de observar y medir. Este trabajo reafirma que este método no es del todo apropiado para un análisis cuantitativo fino, debido a la dificultad de correlacionar de forma precisa la concentración de RL y el área de los halos formados. La difusión del RL no parece tener un comportamiento simple y existen numerosos factores que afectan la velocidad de migración del RL. A pesar de todo, aún es muy útil para una pre-selección semi-cuantitativa de cepas productoras de RL; si bien no es posible determinar exactamente cuánto RL se ha producido, aún es posible diferenciar cepas con productividad significativamente diferentes bajo condiciones similares. La aplicación de este método y su modificación permitió reducir el número candidatos de 2517 cepas potenciales a tan solo 3 cepas superproductoras (0.12%). Palabras clave: Bromuro de Cetiltrimetilamonio (CTAB), azul de metileno, Pseudomonas, screening, ramnolípidos, biosurfactantes / Tesis

Los hidrocarburos de petróleo constituyen uno de los mayores contaminantes de ambientes terrestres y marinos. Aunque la evaporación y la fotooxidación contribuyen a la detoxificación, su degradación completa es sólo llevada a cabo por microorganismos. Las dos estrategias generales de la biorremediación son la modificación ambiental o bioestimulación (aplicación de nutrientes, biosurfactantes y aireación para mejorar las condiciones metabólicas de la microbiota autóctona), y la siembra de microorganismos degradadores de xenobióticos apropiados o bioaumentación. Esta última no siempre alcanza el objetivo propuesto dado que los microorganismos elegidos deben superar los inconvenientes que plantean los factores bióticos y abióticos del ambiente en que son introducidos. El uso de formulaciones de inoculantes que comprenden materiales soportes a los que se fijan las células microbianas para su introducción en ecosistemas naturales constituye una opción interesante. El soporte brinda a los microorganismos protección, favoreciendo su supervivencia y permitiendo su actividad degradadora. En esta Tesis se plantea el desarrollo de inoculantes, utilizando quitina y derivados como soportes, con el fin de optimizar la biorremediación de ambientes contaminados y los tratamientos biológicos de efluentes con hidrocarburos. Se evalúa el potencial de la quitina y sus derivados, obtenidos a partir de cáscaras de langostinos y camarones para su utilización como soportes de bacterias hidrocarburolíticas. La cepa degradadora seleccionada, Rhodococcus corynebacterioides (accesion number AY 157677) fue aislada en estudios anteriores de suelos costeros de Bahía Blanca. Se realiza el estudio de los parámetros de crecimiento y de la actividad metabólica vinculados al desarrollo de inoculantes de la misma: rango de temperaturas de crecimiento, cinética de crecimiento, desarrollo frente a diferentes hidrocarburos, determinación del coeficiente de hidrofobicidad y actividad degradadora frente a petróleo crudo. Se estudia el comportamiento de la quitina y derivados, obtenidos a partir de los exoesqueletos de langostinos (Pleoticus mülleri) en el Laboratorio de Investigaciones Básicas y Aplicadas en Quitina (L.I.B.A.Q.) del Departamento de Química de la Universidad Nacional del Sur, como posibles soportes de cepas bacterianas. Se establecen procedimientos para su decontaminación. Se plantean y seleccionan las estrategias más eficientes para la inmovilización de los microorganismos en la superficie de las escamas y posterior formación de biofilm. Una vez logrado el inoculante, se procede al estudio de la supervivencia de las cepas inmovilizadas sobre los distintos soportes y evaluación de su actividad biodegradativa. También se determinan las condiciones de almacenamiento más adecuadas del inoculante obtenido. Se evalúa el potencial de la cepa degradadora de hidrocarburos inmovilizada sobre los soportes para optimizar tratamientos de biorremediación. Se trabaja sobre tres microcosmos diferentes: un suelo típico de zona semiárida de uso agronómico contaminado con petróleo crudo, un suelo proveniente de una refinería de petróleo local y agua de mar contaminada con petróleo crudo. En términos de porcentajes de remoción de petróleo crudo los microcosmos de suelo de zona semiárida y de agua de mar inoculados alcanzan los valores más altos. Es importante enfatizar que los inoculantes formulados con quitina como soporte muestran el mejor desempeño en cuanto a condiciones de almacenamiento y tratamientos de biorremediación. El trabajo realizado permite el aprovechamiento de un residuo que se genera en grandes cantidades en nuestro litoral costero, como son los exoesqueletos de crustáceos, a la vez que se hace un aporte al tratamiento de aguas y suelos impactados por la actividad industrial y portuaria de la zona de Bahía Blanca. / Petroleum hydrocarbons are one of the major pollutants of terrestrial and marine environments. Although evaporation and photo-oxidation play an important role in detoxification, ultimate and complete degradation is accomplished mainly by microorganisms. The general strategies for bioremediation are biostimulation (release of nutrients, biosurfactans and aereation to enhance the metabolic conditions of the native microbial community), and the inoculation of appropriated degradative organisms or bioaugmentation. Bioaugmentation not always reaches the objective successfully because the selected microorganisms must also be able to overcome biotic and abiotic stresses in the environment in which they are introduced. The use of inoculant formulations involving carrier materials for the delivery of microbial cells to natural ecosystems, is an attractive option. The carrier provides microorganisms favorable conditions for survival as well as functioning of the inoculant cells, resulting in a sufficiently long shelf life as well as improved survival and activity. In this Thesis the development of inoculants, using chitin and derivates as carriers, to optimize the bioremediation of polluted environments and the biological treatment of hydrocarbons efluents is studied. Potential of chitin and derivates flakes obtained from shrimp wastes as carrier materials for a hydrocarbon-degrading bacterial strain is examined. The selected microorganism, Rhodococcus corynebacterioides, was isolated in previous research, from coastal soils of Bahía Blanca Estuary. Growing parameters and metabolic activity of the selected strain related to the development of the inoculant are determined: growing temperature range, generation range, use of different hydrocarbon products, hidrophobicity coefficient and crude oil biodegrading activity. Chitin and derivates, obtained from the exoskeletons of shrimps (Pleoticus mülleri) at the Laboratorio de Investigaciones Básicas y Aplicadas en Quitina (L.I.B.A.Q.) of the Departamento de Química at Universidad Nacional del Sur, were studied as carrier material of bacterial strains. Suitable methods for reducing the microbial load of the carrier and the ability to link bacterial cells are determined. Suitable conditions for the immobilization of microorganisms and formation of an abundant biofilm on the flakes are established. Once developed the inoculant, the survival of the immobilized strains on the different carrier materials and its biodegrading activity is evaluated. Also storage conditions and viability assessment of the inoculant are tested. The effectiveness of inoculant addition in bioremediation process is evaluated. Different microcosms are prepared: an agricultural soil contaminated with crude oil, soil of a local petrochemichal refinery and seawater polluted with crude oil. In all the cases the developed inoculants improve survival and degrading activity of the immobilized microorganisms. In terms of removal percentaqe of crude oil after the different treatments agricultural soil and seawater microcosms prove to be most successful. It is important to emphasize that the inoculants formulated with chitin flakes show the best perfomance during storage and bioremediation treatments. These results allow the use of an abundant residue of the local fishing industry, the exoskeletons of shrimps, that is produced in high amounts in our coasts, meanwhile there is a contribution for the treatment of waters and soils polluted with crude oil that come from the industrial and port activity of Bahía Blanca zone.

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Determina la actividad biorremediadora de la microbiota autóctona del ecosistema del mangle rojo, utilizada en la biorremediación del agua recirculante en el cultivo del camarón blanco. Los resultados demuestran la eficacia de la microbiota en el proceso de biorremediación al disminuir y mantener en niveles óptimos los parámetros monitoreados en cada una de las fases de producción y evidencian que la biodiversidad microbiana no afecta la salud del crustáceo al mantener similares características metagenómicas. Se concluye que la microbiota del mangle rojo actúa eficazmente en la biorremediación del agua en el cultivo del camarón blanco. Las especies más predominantes son: Unclassified, Uncultured bacterium y Lactobacilos. La técnica empleada evidencia la calidad del agua, salud animal, conservación del medio ambiente y rendimiento del producto. / Tesis

El objetivo general del siguiente trabajo es contribuir al mejoramiento de los conocimientos básicos que permitan evaluar y mejorar las tecnologías de biorremediación. Los objetivos específicos son: • Aislar a partir de suelos de la Patagonia semiárida, microorganismos degradadores de PAH capaces de resistir condiciones ambientales de la región. • Evaluar la aplicabilidad de las estrategias ABA de bioaumento sobre la biorremediación de suelos patagónicos contaminados con PAH y con mezclas complejas de los mismos. • Estudiar los cambios producidos en la estructura y función de las comunidades microbianas de suelos contaminados por efecto del inoculante y de las variaciones en las condiciones abióticas. • Incursionar en el estudio de los mecanismos moleculares presentes en las bacterias degradadoras de PAH aisladas de suelos de la Patagonia semiárida y seleccionadas como inoculantes por su adaptación a las condiciones ambientales típicas de la región (resistencia a la desecación, déficit de nutrientes, entre otros).

Los objetivos del estudio fueron conocer la viabilidad de las semillas, y evaluar el desarrollo de Lupinus ballianus, L. condensiflorus y Astragalus garbancillo en suelos contaminados con cadmio, plomo y zinc y el uso potencial de estas especies en la fitorrestauración de suelos contaminados con metales pesados. El trabajo fue realizado en el invernadero en Lachaqui, Canta, región Lima, y en el Laboratorio de Fitología Aplicada en la Universidad Nacional Mayor de San Marcos. La prueba de germinación de las semillas fue realizada en placas petri e incubadas en una cámara de crecimiento a una temperatura de 21/15 °C, un fotoperiodo de 12 horas día / y 12 horas noche, humedad relativa (80% día/ 90% noche), y una iluminación de 4800 lux: La prueba de emergencia de las plántulas fue realizado en un sustrato preparado en un diseño experimental completamente al azar. El contenido de la humedad de las semillas fue calculado en base al peso seco. Asimismo, el desarrollo de las tres especies vegetales fue evaluado con 12 tratamientos de relave de mina, y la unidad experimental fue una maceta de 19 cm de diámetro y 5 kg de capacidad. El experimento se realizó mediante el diseño experimental factorial completo de 3 x 4, y la distribución de las unidades experimentales de los tratamientos se realizó al azar, con 5 repeticiones por cada tratamiento. La acumulación de cadmio, plomo y zinc en los tejidos de las plantas se determinó mediante el método de absorción atómica. Las semillas con escarificación mecánica de lijado de la testa e inducidas en oscuridad, permitió una alta germinación de Lupinus ballianus L. condensiflorus y Astragalus garbancillo. Por lo tanto, las semillas escarificadas favorecieron la emergencia de plántulas en el sustrato, y la mayor emergencia de plántulas se obtuvo en Astragalus garbancillo. El mayor contenido de humedad en las semillas fue registrado en Astragalus garbancillo. La longitud de planta, el número de hojas y la producción de biomasa en las tres especies disminuyeron significativamente con el tratamiento de 100% de relave de mina. Los mayores valores de acumulación de cadmio total, plomo total, zinc total; y el contenido de estos metales en las raíces de Lupinus ballianus, L. condensiflorus y en Astragalus garbancillo, fueron obtenidos con el tratamiento de 100% de relave de mina. El factor de bioconcentración de cadmio en las tres especies fue > 1. Pero, el factor de bioconcentración y de transferencia de plomo y zinc en las tres especies fue < 1, en conclusión, las tres especies son fitoestabilizadores de metales pesados. / Tesis

Determina la caracterización fenotípica y realiza el análisis genómico de dos cepas nativas del género Shewanella con capacidad de degradar colorantes azoico. Las cepas usadas fueron Shewanella sp. LC6 y Shewanella sp. 2NE11, caracterizadas a nivel fisiológico, bioquímico y genómico. Se realizaron cinéticas de crecimiento y de decoloración con los colorantes azul directo 71, anaranjado de metilo, amarillo proción HEXL y azul brillante remazol. Los ensayos relacionados a su fisiología incluyeron la evaluación de crecimiento bajo distintos parámetros como temperatura, pH y NaCl (%); entre las pruebas bioquímicas se evaluaron la producción de catalasa, oxidasa, movilidad, indol, H2S, lisina descarboxilasa, consumo de citrato, reducción de nitratos, licuefacción de gelatina, hemólisis y consumo de carbohidratos. El análisis genómico estuvo dirigido hacia la búsqueda de genes relacionados a decoloración, resistencia a metales y consumo de carbohidratos. Los resultados obtenidos muestran que las características fisiológicas y bioquímicas relacionan a la cepa Shewanella sp. LC6 dentro de la especie Shewanella xiamenensis y a Shewanella sp. 2NE11 dentro de Shewanella algae. Se identificaron proteínas como azorreductasas, peroxidasas, oxidorreductasas y ACP fosfodiesterasas relacionadas al proceso de decoloración y una gran cantidad de genes de resistencia a metales como el mercurio, zinc, cadmio, cobre y plata. Asimismo se encontraron proteínas relacionadas al consumo de carbohidratos como N-acetylglucosamina, maltosa, L-arabinosa, DL-lactato, D-fructosa y sucrosa. La presente investigación muestra el amplio potencial que tienen estas cepas para ser utilizadas en biorremediación de colorantes textiles y metales pesados. / Tesis

La industria textil anualmente genera 280 000 toneladas de efluentes contaminados con colorantes azoico, que son tóxicos, cancerígenos y mutagénicos; por ende, requiere soluciones eficientes de descontaminación. Se diseña y caracteriza un consorcio microbiano con excelente capacidad de degradación de azul directo, que podría ser usado para la descontaminación de efluentes. Se colectaron en total 12 muestras: 6 de aguas residuales y 6 de fango acumulado en el punto de confluencia del efluente, ambas colectadas de una fábrica textil ubicada en la región de Lima. Se seleccionaron 2 cultivos debido a su mejor respuesta a la decoloración in vitro en medio Zhou y Zimmerman (ZZ). Se aislaron 5 cepas bacterianas, y con ello se construyeron 27 consorcios. Se seleccionó el consorcio CP23, pues resultó tener mejor rendimiento promedio. Se extrajo el DNA genómico de las 2 cepas bacterianas que conformaban el consorcio CP23, y se secuenciaron mediante tecnología de Illumina MiSeq®. Las cepas fueron identificadas como Enterococcus gallinarum PL23 y Stenotrophomonas maltophilia LS23. Se evaluaron las cinéticas de crecimiento de las cepas puras y cuando conformaban el consorcio CP23 en medio ZZ suplementado con 100 ppm de Azul Directo a través del recuento en cámara PetroffHausser. Se obtuvo una mayor velocidad de crecimiento (μ) de parte del consorcio, siendo esta de 2.6 +/- 0.05 x 10-2 min-1, y un menor tiempo de duplicación, el cual fue de 26.5 +/- 0.5 min. Se optimizaron los parámetros más importantes de biodegradación in vitro cuantificados mediante espectrofotometría UV-Vis, estos fueron 0,5% de glucosa, 1% de extracto de levadura, pH 8, 37ºC, 2 x 106 UFC x ml-1 de inóculo inicial y 100 ppm de colorante, obteniéndose un rendimiento promedio de 91.53% a las 6 horas. Además, se evaluaron cinéticas de decoloración del consorcio CP23 con otros colorantes azo: amarillo drimaren, rojo drimaren, azul marino remazol, azul remazol, amarillo oro remazol, azul turquesa remazol y rojo remazol, con rendimientos de más del 95% en su mayoría. Los resultados representan el primer estudio en el país sobre el diseño y caracterización de consorcios microbianos con capacidad de degradación de colorantes azo, aislados de efluentes textiles en Perú con potencial uso en biorremediación de aguas residuales. / Tesis

La presente tesis doctoral tiene como principal objetivo aportar conocimiento en el área de la biorremediación de suelos contaminados por hidrocarburos, mediante el estudio a escala real y de laboratorio de tratamientos enfocados a mejorar la degradación de los contaminantes y el uso de técnicas moleculares para determinar la biodiversidad microbiana presente en el suelo, así como su evolución a lo largo de dichos tratamientos. Los estudios llevados a cabo pretenden abordar aspectos todavía no resueltos y por tanto necesitados de investigación. En primer lugar la presencia de hidrocarburos de elevado peso molecular como las fracciones alifáticas pesadas o los HAPs de 4 y 5 anillos, en concentraciones excesivamente elevadas después de aplicar la biotecnología de la biorremediación con técnicas convencionales como la aireación y la adición de nutrientes. Otro aspecto a resolver es la falta de accesibilidad de estas moléculas de excesivo tamaño molecular a aquellos microrganismos capaces de metabolizarlas. Cabe resaltar que mientras el grupo de investigación logró muy buenos resultados en la utilización de biosurfactantes para mejorar la biodisponibilidad de hidrocarburos de elevado peso molecular en medio líquido, los intentos llevados a cabo en distintos suelos, no condujeron a ninguna mejora de la biodegradación. Finalmente el reto más importante que actualmente tiene la comunidad científica, es aumentar el conocimiento de las poblaciones microbianas implicadas en los procesos de biorremediación. Deberíamos dejar la pura descripción para alcanzar el objetivo último que sería conocer qué función está llevando a cabo cada microorganismo identificado. Por suerte, las metodologías moleculares que están evolucionando vertiginosamente nos están ofreciendo el camino. Relacionado con este aspecto, y que quizás no ha sido abordado suficientemente, estaría el conocimiento de las interacciones entre bacterias y hongos o entre poblaciones autóctonas y aquellas introducidas como inóculos en procesos de bioaumentación. El presente trabajo de tesis doctoral aborda todos estos aspectos que se exponen en seis capítulos: (I) a multi-approach assessment to evaluate biostimulation and bioaugmentation strategies for heavily oil-contaminated soil, (II) ensayo piloto de biorremediación por tecnología de la biopila dinámica para la descontaminación de suelos contaminados por creosotas provenientes de las actividades dedicadas a la preparación de la madera, (III) microbial populations related to PAH biodegradation in an aged biostimulated creosote-contaminated soil, (IV) Fungal/bacterial interactions throughout bioremediation assays in an aged creosote polluted soil, (V) Comparative assessment of bioremediation approaches to highly recalcitrant PAH degradation in a real industrial polluted soil y (VI) Combining DGGE and barcoded pyrosequencing for microbial community characterization throughout different soil bioremediation strategies in an aged creosote-polluted soil. / The main objective of the present thesis work is to provide knowledge in the field of bioremediation of hydrocarbon contaminated soils, by performing field-scale and lab-scale treatments focused on improving the degradation of organic pollutants and the use of molecular techniques to determine the microbial biodiversity present in the soil and their evolution due to the treatment effect. The studies carried out intended to address unresolved issues and therefore in need of investigation. Firstly, the presence of high molecular weight hydrocarbon fractions such as heavy aliphatic or 4 and 5-ring PAHs, in excessively high concentrations after application of bioremediation biotechnology techniques as aeration and addition of nutrients. Another issue to address is the lack of accessibility of these high molecular weight compounds for those microorganisms able to metabolize them. It is noteworthy that while our research group obtained very good results using biosurfactants to improve bioavailability of PAHs in liquid medium, the attempts made in different soils did not lead to any improvement in biodegradation. Finally, the most important challenge that currently has the scientific community in our research field is to increase the knowledge of microbial populations involved in bioremediation processes. We should achieve the objective of knowing what function is conducting each organism identified and try to forget the simply ecological description. Fortunately, molecular methodologies are faster than before. Related to this aspect, it is important to highlight the paramount importance for bioremediation success of the interactions between bacteria and fungi or between indigenous communities and those introduced as inoculum in bioaugmentation processes. The present doctoral thesis deal with all these issues, which are presented in six chapters: (I) a multi-approach assessment to evaluate biostimulation and bioaugmentation strategies for heavily oil-contaminated soil, (II) ensayo piloto de biorremediación por tecnología de la biopila dinámica para la descontaminación de suelos contaminados por creosotas provenientes de las actividades dedicadas a la preparación de la madera, (III) microbial populations related to PAH biodegradation in an aged biostimulated creosote-contaminated soil, (IV) Fungal/bacterial interactions throughout bioremediation assays in an aged creosote polluted soil, (V) Comparative assessment of bioremediation approaches to highly recalcitrant PAH degradation in a real industrial polluted soil and (VI) Combining DGGE and barcoded pyrosequencing for microbial community characterization throughout different soil bioremediation strategies in an aged creosote-polluted soil.