La aprobación sucesiva de normativas acerca de la contaminación de suelos (RD 9/2005) y los cambios en el uso del suelo, están aumentando la demanda en la descontaminación de suelos. Sin embargo, aún existen áreas necesitadas de investigación como son el estudio de las poblaciones microbianas implicadas en los procesos de biorremediación; estudiar el destino de los contaminantes y evaluar la ecotoxicidad de los procesos de biorremediación. Se ha llevado a cabo una caracterización catabólica de tres consorcios microbianos no definidos, obtenidos mediante procesos de enriquecimiento con diferentes familias de hidrocarburos, para su utilización en la biorremediación de suelos contaminados por hidrocarburos. Para ello, se han incubado tres consorcios (TD, F1AA y AM) con crudo de petróleo ligero (Casablanca). Los resultados obtenidos muestran que la capacidad catabólica de los tres consorcios está en consonancia con el sustrato utilizado para su obtención. Asimismo, la amplificación de los consorcios en medio rico para su utilización en experiencias reales de bioaumento, no disminuye su potencial degradador. La adición de los ramnolípidos MAT10, producidos por Pseudomonas aeruginosa AT10 incrementa la biodegradación del crudo Casablanca por el consorcio AM, tanto la tasa de biodegradación como la degradación de algunos componentes como los isoprenoides de la fracción saturada y los HAPs alquilados de la fracción aromática.. Se ha realizado una caracterización de la diversidad microbiana del consorcio AM, degradador de HAPs, mediante métodos dependientes e independientes de cultivo. Para ello se han aislado cepas heterotrofas y degradadoras de HAPs, se han construido librerías de clones de genes 16S y 18S rRNA y se ha estudiado la población de genes 16S rRNA por DGGE. Se han identificado un total de 19 componentes microbianos diferentes pertenecientes al grupo filogenético de las Proteobacterias (16/19), Cytophaga-Flexibacter-Bacteroides (CFB) (2/19) y Ascomicota (1/19). Los resultados obtenidos indican que es necesario realizar estudios polifásicos para conocer más profundamente la composición de un consorcio microbiano.Se ha diseñado un protocolo de ensayos de biotratabilidad, a escala de laboratorio, previo a la biorremediación de suelos contaminados por hidrocarburos, que consta de 2 fases de estudio. La primera fase evalúa la presencia de poblaciones microbianas, su actividad metabólica real y potencial y la biodegradabilidad de los contaminantes presentes en el suelo. La segunda fase estudia la optimización de las condiciones fisicoquímicas (humedad, aireación, nutrientes inorgánicos, biodisponibilidad) y biológicas (posibilidad de inocular poblaciones microbianas alóctonas) que pueden condicionar el proceso de biodegradación durante la biorremediación de suelos contaminados por hidrocarburos. Se han aplicado los ensayos de biotratabilidad para la biorremediación de un suelo contaminado por creosota y se ha profundizando en la caracterización microbiológica, química y ecotoxicológica del proceso de biodegradación. Los resultados obtenidos en la fase I, indican que el suelo es apto para la aplicación de la biorremediación. La aireación y la humedad del 40% de la capacidad de campo han sido los factores claves para alcanzar una importante biodegradación de los TPH y de los HAPs de 3 y 4 anillos, por parte de la población autóctona del suelo. El análisis por DGGE combinado con el análisis de componentes principales muestra que la estructura y la composición de las comunidades microbianas cambia de forma muy distinta con la adición de nutrientes, así como también a lo largo de todo el proceso de biodegradación. El proceso de biorremediación disminuye la toxicidad y la teratogenicidad de los lixiviados evaluados por los ensayos de Microtox® y FETAX, así como también la genotoxicidad potencial de los TPH analizada por microscopía de fuerzas atómicas (AFM), pero no disminuye la letalidad del suelo entero frente a Eisenia foetida. ENGLISH / Successful application of bioremediation technology to contaminated soil requires knowledge of the characteristics of the site and the parameters that affect the microbial biodegradation of pollutants.Three microbial consortia were obtained by sequential enrichment using a variety of oil products. The three consortia (TD, AM, F1AA) were incubated with a crude oil to assess their metabolic capacity and to identify possible differences in their pattern of biodegradation. Metabolic capacity was found to depend on the carbon source used in the enrichment procedures. Amplification of the consortia by subculture in rich media did not affect this capacity. Addition of rhamnolipids produced by Pseudomonas aeruginosa AT10 increased biodegradation by consortium AM,. A microbial consortium (AM) used for the aerobic degradation of polycyclic aromatic hydrocarbon (PAHs) was examined by a triple approach based on various cultivation strategies, denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) and screening of 16S and 18S rRNA gene clone libraries. 19 microbial components were identified. Proteobacteria were the dominant group (16/19), whilst the Cytophaga-Flexibacter-Bacteroides group (CFB) was 2/19, and the ascomycota fungi 1/19. The results indicate that polyphasic assessment is necessary for a proper understanding of the composition of a microbial consortium. A protocol for biotreatability assays in two phases was proposed. In the first phase we examined the type and metabolic activity of the soil indigenous microorganisms, the presence of possible inhibitors and the biodegradability of contaminants. In the second phase several parameters affecting bioremediation were evaluated in microcosms. The application of this protocol to 2 hydrocarbon-contaminated soils is described. The information obtained from the results in the first phase of the protocol indicates whether a biological treatment of contaminated soil is appropriate, whereas in the second phase the most appropriate treatment is evaluated. Biotreatability assays, bacterial community dynamics and biodegradation processes were investigated in a highly creosote-contaminated soil. Moisture content and aeration were established as the key factors of PAH bioremediation. TPH, three- and four-ringed PAHs were degraded significantly in all treatments (72-79% and 83-87% respectively). Enumeration of heterotrophic and PAH-degrading populations, DGGE analysis and Principal Component Analysis corroborated a dramatic shift in bacterial community, due to both the addition of nutrients and the biodegradation process. Acute toxicity and teratogenicity were evaluated by MicrotoxTM, Eisenia foetida and FETAX assays, and potential genotoxicity was assayed by atomic force microscopy (AFM).

En el contexto de desarrollar combustibles alternativos para transporte, en la presente tésis doctoral se describen métodos de activación fotocatalíticos que permiten la conversión de metano y etano en alcoholes por reacción directa con agua o la reducción de óxidos de carbono a C elemental o metano. / Sastre Calabuig, F. (2013). Activació d'hidrocarburs i òxids de carboni mitjançant fotocatàlisi [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/31644

Polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) are pollutants of great concern due to their toxicity, ubiquitous distribution and environmental persistence. Generally, the PAHs are found as part of complex mixtures such as crude oil and derivatives, and mineral coal. Mismanagement during industrial operations, and accidental spills result in the contamination of wide areas with potential risk for the public health and negative impact in the local economy. Nowadays, there is a considerable interest in the use of biological procedures to clean up polluted environments because of their pollutant removal efficiency, feasibility and associated low cost. Bioremediation experiences are based on the ability that microorganisms (bacteria, algae and fungi) possess in degrading a wide range of pollutants, including PAHs containing from two to five aromatic rings. The microbial biodegradation of low molecular weight (LMW) PAHs has been extensively studied revealing a variety of bacteria capable to efficiently degrade these pollutants. The studies with high molecular weight (HMW) PAHs, more recalcitrant and with higher toxicity, indicate that in soil environments this compounds are generally degraded by members of the group Actinobacteria. However, little is known about HMW-PAH degradation in marine environments. Recent studies carried out with marine consortia and isolates have identified a few genera as PAHs degraders in sea waters, but no associations have been established between pyrene degradation and actinobacteria in such environments. Here, with the study of a pyrene microbial marine consortium, we provide the first evidence on the key role of actinobacteria in the removal of pyrene from polluted marine shorelines. Moreover, the detailed analysis of the community structure of the microbial consortium have revealed the presence of a bacterial strain not classifiable in the previously described genus, that have been isolated, thoroughly characterized and proposed as a type strain of a new genus and species. Bioremediation experiences do not always produce the desired results. PAHs are usually degraded until certain limit after which degradation is hardly observed. This phenomenon may be mainly caused by the low bioavailiability and limited concentration of nutrients. PAHs are usually found in non-aqueous phase liquids (NAPLs), which results in a slow partition of these components into the aqueous phase and their persistence in to the environment for long periods. In order to enhance microbial degradation and reduce the residual PAH concentration in polluted environments, we have conducted an experiment in which the effect of an oleophilic fertilizer has been evaluated. We also have targeted the possible nutritional deficiencies during bioremediation and have examined the biodegradation of PAHs and potential accumulation of partially oxidized metabolites, more available and toxic than their parent PAHs. Finally, we have evaluated the efficiency of sunflower rhizosphere in PAH removal from polluted soils that have undergone extensive remediation but still contain intolerable levels of pollutants. The results indicate that the sunflower rhizosphere enhance the removal of PAHs by promoting the selective growth of degradative bacteria, incrementing the bioaccesibility and possible favouring the degrading processes through specific mechanism associated with the composition of the roots exudates. These results represent a promising alternative for increasing bioremediation in a sustainable and cost-efficient manner. / Los hidrocarburos aromáticos policíclicos son un grupo de contaminantes que suscitan gran preocupación debido a su toxicidad, amplia distribución y persistencia en el medio ambiente. Generalmente, los HAPs se encuentran formando parte de mezclas complejas como crudos de petróleo, carbón mineral y derivados. La mala gestión durante las operaciones industriales, y los vertidos accidentales causan amplias áreas contaminadas que conllevan un importante riesgo para la salud pública junto con un impacto negativo en la economía local. Actualmente, hay un notable interés en el uso de procedimientos biológicos para descontaminar emplazamientos debido a la eficiencia en la eliminación, viabilidad y bajo coste asociado de estos métodos. Las experiencias de biorremediación se basan en la capacidad de los microorganismos (bacterias, algas y hongos) de degradar una amplia variedad de contaminantes, incluyendo HAPs. La degradación microbiana de HAPs de bajo peso molecular ha sido ampliamente estudiada revelando numerosas bacterias capaces de eliminar eficientemente estos compuestos. Los estudios realizados con HAPs de alto peso molecular, más recalcitrantes y con mayor toxicidad, han mostrado que en suelos la degradación de estos compuestos es principalmente llevada a cabo por miembros del grupo Actinobacteria. Sin embargo, se desconoce la degradación de HAPs de elevado peso molecular en ambientes marinos. Estudios recientes llevados a cabo en consorcios marinos han identificado algunos géneros degradadores de HAPs en agua de mar, pero no se han establecido asociaciones entre el pireno y actinobacterias. Aquí, con el estudio del consorcio marino degradador de pireno, nosotros proveemos la primera evidencia del papel de las actinobacterias en la eliminación del pireno de costas marinas. Además, el análisis de la estructura de la comunidad bacteriana nos reveló la presencia de una cepa no clasificable en los géneros previamente descritos, que fue aislada, profundamente caracterizada y propuesta como cepa tipo de un nuevo género y especie. Las experiencias de biorremediación no siempre producen los resultados deseados. A menudo. los HAPs son degradados hasta cierto límite tras el cual la degradación apenas es observada. Este fenómeno puede ser causado principalmente por la baja disponibilidad y limitación de nutrientes. Los HAPs generalmente se encuentran formando parte de fases líquidas no acuosas (FLNAs), lo que resulta en una lenta partición de estos compuestos hacia la fase acuosa y por tanto en una persistencia medioambiental. Con el fin de incrementar la degradación microbiana y reducir la concentración residual de los HAPs en ambientes contaminados, se realizó un experimento en el cual se evaluaba el efecto de un fertilizante oleofílico. También se examinaron las posibles deficiencias nutricionales y la acumulación de metabolitos parcialmente oxidados resultantes de la degradación, los cuales son más disponibles y tóxicos que sus parentales. Finalmente, hemos evaluado la eficiencia de la rizosfera de girasol en la eliminación de HAPs de suelos contaminados con HAPs que han sido sometidos a una extensiva remediación, pero que contienen niveles inaceptables de HAPs. Los resultados indican que la rizosfera de girasol aumentó la eliminación de HAPs promoviendo el crecimiento selectivo de bacterias degradadoras y favoreciendo los procesos de degradación a través de mecanismos asociados con la composición de los exudados. Los resultados representan por tanto una alternativa prometedora para potenciar la biorremediación de una manera sostenible y rentable.

La presente tesis doctoral tiene como principal objetivo aportar conocimiento en el área de la biorremediación de suelos contaminados por hidrocarburos, mediante el estudio a escala real y de laboratorio de tratamientos enfocados a mejorar la degradación de los contaminantes y el uso de técnicas moleculares para determinar la biodiversidad microbiana presente en el suelo, así como su evolución a lo largo de dichos tratamientos. Los estudios llevados a cabo pretenden abordar aspectos todavía no resueltos y por tanto necesitados de investigación. En primer lugar la presencia de hidrocarburos de elevado peso molecular como las fracciones alifáticas pesadas o los HAPs de 4 y 5 anillos, en concentraciones excesivamente elevadas después de aplicar la biotecnología de la biorremediación con técnicas convencionales como la aireación y la adición de nutrientes. Otro aspecto a resolver es la falta de accesibilidad de estas moléculas de excesivo tamaño molecular a aquellos microrganismos capaces de metabolizarlas. Cabe resaltar que mientras el grupo de investigación logró muy buenos resultados en la utilización de biosurfactantes para mejorar la biodisponibilidad de hidrocarburos de elevado peso molecular en medio líquido, los intentos llevados a cabo en distintos suelos, no condujeron a ninguna mejora de la biodegradación. Finalmente el reto más importante que actualmente tiene la comunidad científica, es aumentar el conocimiento de las poblaciones microbianas implicadas en los procesos de biorremediación. Deberíamos dejar la pura descripción para alcanzar el objetivo último que sería conocer qué función está llevando a cabo cada microorganismo identificado. Por suerte, las metodologías moleculares que están evolucionando vertiginosamente nos están ofreciendo el camino. Relacionado con este aspecto, y que quizás no ha sido abordado suficientemente, estaría el conocimiento de las interacciones entre bacterias y hongos o entre poblaciones autóctonas y aquellas introducidas como inóculos en procesos de bioaumentación. El presente trabajo de tesis doctoral aborda todos estos aspectos que se exponen en seis capítulos: (I) a multi-approach assessment to evaluate biostimulation and bioaugmentation strategies for heavily oil-contaminated soil, (II) ensayo piloto de biorremediación por tecnología de la biopila dinámica para la descontaminación de suelos contaminados por creosotas provenientes de las actividades dedicadas a la preparación de la madera, (III) microbial populations related to PAH biodegradation in an aged biostimulated creosote-contaminated soil, (IV) Fungal/bacterial interactions throughout bioremediation assays in an aged creosote polluted soil, (V) Comparative assessment of bioremediation approaches to highly recalcitrant PAH degradation in a real industrial polluted soil y (VI) Combining DGGE and barcoded pyrosequencing for microbial community characterization throughout different soil bioremediation strategies in an aged creosote-polluted soil. / The main objective of the present thesis work is to provide knowledge in the field of bioremediation of hydrocarbon contaminated soils, by performing field-scale and lab-scale treatments focused on improving the degradation of organic pollutants and the use of molecular techniques to determine the microbial biodiversity present in the soil and their evolution due to the treatment effect. The studies carried out intended to address unresolved issues and therefore in need of investigation. Firstly, the presence of high molecular weight hydrocarbon fractions such as heavy aliphatic or 4 and 5-ring PAHs, in excessively high concentrations after application of bioremediation biotechnology techniques as aeration and addition of nutrients. Another issue to address is the lack of accessibility of these high molecular weight compounds for those microorganisms able to metabolize them. It is noteworthy that while our research group obtained very good results using biosurfactants to improve bioavailability of PAHs in liquid medium, the attempts made in different soils did not lead to any improvement in biodegradation. Finally, the most important challenge that currently has the scientific community in our research field is to increase the knowledge of microbial populations involved in bioremediation processes. We should achieve the objective of knowing what function is conducting each organism identified and try to forget the simply ecological description. Fortunately, molecular methodologies are faster than before. Related to this aspect, it is important to highlight the paramount importance for bioremediation success of the interactions between bacteria and fungi or between indigenous communities and those introduced as inoculum in bioaugmentation processes. The present doctoral thesis deal with all these issues, which are presented in six chapters: (I) a multi-approach assessment to evaluate biostimulation and bioaugmentation strategies for heavily oil-contaminated soil, (II) ensayo piloto de biorremediación por tecnología de la biopila dinámica para la descontaminación de suelos contaminados por creosotas provenientes de las actividades dedicadas a la preparación de la madera, (III) microbial populations related to PAH biodegradation in an aged biostimulated creosote-contaminated soil, (IV) Fungal/bacterial interactions throughout bioremediation assays in an aged creosote polluted soil, (V) Comparative assessment of bioremediation approaches to highly recalcitrant PAH degradation in a real industrial polluted soil and (VI) Combining DGGE and barcoded pyrosequencing for microbial community characterization throughout different soil bioremediation strategies in an aged creosote-polluted soil.