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La ecología de Bacillus thuringiensis, un bioinsecticida muy común, es poco conocida. Nuestro principal objetivo era investigar acerca de la ecología de esta bacteria en la filosfera. En un primer estudio se recogieron 35 muestras de hojas del género Piper de bosques andinos colombianos. Se obtuvieron 256 aislamientos de B. thuringiensis del 74% de las muestras estudiadas. Los aislamientos fueron caracterizados según la morfología del cristal, la presencia de genes cry por PCR y la toxicidad contra insectos. Además, se estimaron las poblaciones de células vegetativas viables y endosporas por unidad de área obteniéndose 2-5x103 cfu/cm2 de hoja. En general, no se encontraron diferencias estadísticamente significativas en el número de aislamientos de B. thuringiensis por cm2 de hoja ni en las características de los aislamientos de B. thuringiensis entre las diferentes especies de Piper. Después de comprobar que B. thuringiensis estaba presente en el filoplano, se quiso comparar las poblaciones de esta bacteria en el suelo y en las hojas. Se aisló B. thuringiensis del filoplano y del suelo de cultivos de maíz y fríjol. Se recuperaron 214 aislamientos de 96 muestras de filoplano (0-34 cfu/cm2) y 59 aislamientos de 24 muestras de suelo. Todos los aislamientos fueron caracterizados como se ha explicado anteriormente. Las poblaciones predominantes de B. thuringiensis en el filoplano contenían genes cry1 y eran activas contra Spodoptera frugiperda, mientras que los aislamientos del suelo tenían genes cry11 y eran activos contra Culex quinquefasciatus. El hecho de que predominaran poblaciones específicas de B. thuringiensis en las hojas diferentes a las del suelo sugiere que existe una selección diferencial en las poblaciones de B. thuringiensis en el filoplano y en el suelo. Entonces, se investigó la capacidad de migración de B. thuringiensis desde el suelo a las hojas. Se inocularon dos cepas diferentes de B. thuringiensis en suelos, semillas y hojas jóvenes de plantas de fríjol, para determinar si podían migrar a las hojas superiores en condiciones controladas. Aunque se recuperaron aislamientos de B. thuringiensis en las hojas, las poblaciones fueron muy bajas (menos de 10 cfu/cm2 de hoja). Además el número de células recuperado disminuía a medida que las hojas estaban más distantes del suelo o de las hojas inoculadas. Todo esto indicaba que B. thuringiensis migra pobremente desde el suelo o la semilla a las hojas o entre hojas de la misma planta. También se evaluó la capacidad de varias cepas de B. thuringiensis de colonizar la superficie de las plantas y se comparó con otras bacterias epífitas. Mientras que todas las cepas de B. thuringiensis se multiplicaron en cierta medida después de la inoculación sobre hojas de fríjol, las poblaciones máximas alcanzadas fueron de 106 cfu/g de hoja, muy inferiores a las conseguidas por otras bacteria epífitas, como Pseudomonas fluorescens. Muy poco tiempo después de la inoculación, una porción importante de las células de B. thuringiensis estaban en forma de endospora. Además el crecimiento de B. thuringiensis no se vio afectado por la presencia de Pseudomonas spp. cuando fueron co-inoculados y viceversa. Por otro lado, cuando se observaron al microscopio las cepas de B. thuringiensis (marcadas con el gen de la proteína verde fluorescente) sobre hojas de fríjol, se observó que no formaban agregados celulares y no estaban asociadas con otras bacterias epífitas ni con estructuras de la hoja. Finalmente se investigó la capacidad de B. thuringiensis de crecer en un medio diseñado para simular la composición de nutrientes del filoplano. Sin embargo el crecimiento fue inferior al de otras bacterias. Aparentemente, B. thuringiensis tiene unos requisitos nutricionales mayores que otras especies bacterianas habitantes naturales del filoplano. / The ecology of Bacillus thuringiensis, a common biopesticide, is poorly understood. Our main objective was to investigate the ecology of this bacteria on the phylloplane. In a first study 35 leaf samples of the genus Piper were collected from the Colombian Andean forest. Two hundred and fifty-six isolates of B. thuringiensis were obtained from 74% of the samples studied. The isolates were characterized by crystal morphology, the presence of cry genes by PCR and toxicity against insects. The populations of viable vegetative cells and spores per unit area were estimated (2-5x103 cfu/cm2 of leaf). Overall, no significant differences in the number of B. thuringiensis isolates per cm2 of leaf nor in the B. thuringiensis characteristics were found among the different Piper species evaluated. After observing B. thuringiensis on the phylloplane, a comparison was performed between soil and leaf populations. B. thuringiensis was isolated from the phylloplane and soil in plantings of maize and bean from Colombia; and 214 isolates were recovered from 96 phylloplane samples (0-34 cfu/cm2) while 59 isolates from 24 soil samples. All the isolates were characterized as above-mentioned. The predominant population of B. thuringiensis on the phylloplane harbored cry1 gene and was active against Spodoptera frugiperda, whereas in soil the isolates harboring cry11 gene and active against Culex quinquefasciatus predominated. The predominance of specific B. thuringiensis populations both on the leaves and in the soil, suggests the presence of differential selection in B. thuringiensis populations on the phylloplane and in soil. Then, we addressed the process of immigration of B. thuringiensis from soil to leaves. Two different B. thuringiensis strains were inoculated into soils, onto seeds or onto lower leaves of bean plants to determine if they were able to disperse to upper leaves under controlled conditions. While B. thuringiensis isolates were commonly recovered from leaves exposed to such inocula, populations were very low (less than 10 cfu/cm2 of leaf). In addition, the number of cells of B. thuringiensis recovered decreased with increasing distance from the soil or from the inoculated leaves. This indicates that B. thuringiensis disperses poorly from the soil or the seed to the leaves or between leaves of the same plant under controlled conditions. Moreover, the ability of several B. thuringiensis strains to colonize plant surfaces was assessed and compared with that of more common epiphytic bacteria. While all B. thuringiensis strains multiplied to some extent after inoculation on bean plants, their maximum epiphytic population sizes of 106 cfu/g of leaf were always much less than that achieved by other resident epiphytic bacteria or an epiphytically fit Pseudomonas fluorescens strain. Many cells were in a spore form soon after inoculation onto plants. The growth of B. thuringiensis was not affected by the presence of Pseudomonas syringae spp. when co-inoculated, and vice versa. B. thuringiensis strains harboring a green fluorescent protein marker gene did not form large cell aggregates, were not associated with other epiphytic bacteria, and were not found associated with leaf structures when directly observed on bean leaves by epifluorescent microscopy. Finally, we analyzed the capacity of B. thuringiensis to grow on a medium designed to simulate the nutrient composition of the phylloplane but the growth observed was very poor compared to other bacteria. This bacterium apparently has greater nutrient requirements than other bacterial species that are prominent inhabitants of the phylloplane.

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La presente tesis doctoral tiene como principal objetivo aportar conocimiento en el área de la biorremediación de suelos contaminados por hidrocarburos, mediante el estudio a escala real y de laboratorio de tratamientos enfocados a mejorar la degradación de los contaminantes y el uso de técnicas moleculares para determinar la biodiversidad microbiana presente en el suelo, así como su evolución a lo largo de dichos tratamientos. Los estudios llevados a cabo pretenden abordar aspectos todavía no resueltos y por tanto necesitados de investigación. En primer lugar la presencia de hidrocarburos de elevado peso molecular como las fracciones alifáticas pesadas o los HAPs de 4 y 5 anillos, en concentraciones excesivamente elevadas después de aplicar la biotecnología de la biorremediación con técnicas convencionales como la aireación y la adición de nutrientes. Otro aspecto a resolver es la falta de accesibilidad de estas moléculas de excesivo tamaño molecular a aquellos microrganismos capaces de metabolizarlas. Cabe resaltar que mientras el grupo de investigación logró muy buenos resultados en la utilización de biosurfactantes para mejorar la biodisponibilidad de hidrocarburos de elevado peso molecular en medio líquido, los intentos llevados a cabo en distintos suelos, no condujeron a ninguna mejora de la biodegradación. Finalmente el reto más importante que actualmente tiene la comunidad científica, es aumentar el conocimiento de las poblaciones microbianas implicadas en los procesos de biorremediación. Deberíamos dejar la pura descripción para alcanzar el objetivo último que sería conocer qué función está llevando a cabo cada microorganismo identificado. Por suerte, las metodologías moleculares que están evolucionando vertiginosamente nos están ofreciendo el camino. Relacionado con este aspecto, y que quizás no ha sido abordado suficientemente, estaría el conocimiento de las interacciones entre bacterias y hongos o entre poblaciones autóctonas y aquellas introducidas como inóculos en procesos de bioaumentación. El presente trabajo de tesis doctoral aborda todos estos aspectos que se exponen en seis capítulos: (I) a multi-approach assessment to evaluate biostimulation and bioaugmentation strategies for heavily oil-contaminated soil, (II) ensayo piloto de biorremediación por tecnología de la biopila dinámica para la descontaminación de suelos contaminados por creosotas provenientes de las actividades dedicadas a la preparación de la madera, (III) microbial populations related to PAH biodegradation in an aged biostimulated creosote-contaminated soil, (IV) Fungal/bacterial interactions throughout bioremediation assays in an aged creosote polluted soil, (V) Comparative assessment of bioremediation approaches to highly recalcitrant PAH degradation in a real industrial polluted soil y (VI) Combining DGGE and barcoded pyrosequencing for microbial community characterization throughout different soil bioremediation strategies in an aged creosote-polluted soil. / The main objective of the present thesis work is to provide knowledge in the field of bioremediation of hydrocarbon contaminated soils, by performing field-scale and lab-scale treatments focused on improving the degradation of organic pollutants and the use of molecular techniques to determine the microbial biodiversity present in the soil and their evolution due to the treatment effect. The studies carried out intended to address unresolved issues and therefore in need of investigation. Firstly, the presence of high molecular weight hydrocarbon fractions such as heavy aliphatic or 4 and 5-ring PAHs, in excessively high concentrations after application of bioremediation biotechnology techniques as aeration and addition of nutrients. Another issue to address is the lack of accessibility of these high molecular weight compounds for those microorganisms able to metabolize them. It is noteworthy that while our research group obtained very good results using biosurfactants to improve bioavailability of PAHs in liquid medium, the attempts made in different soils did not lead to any improvement in biodegradation. Finally, the most important challenge that currently has the scientific community in our research field is to increase the knowledge of microbial populations involved in bioremediation processes. We should achieve the objective of knowing what function is conducting each organism identified and try to forget the simply ecological description. Fortunately, molecular methodologies are faster than before. Related to this aspect, it is important to highlight the paramount importance for bioremediation success of the interactions between bacteria and fungi or between indigenous communities and those introduced as inoculum in bioaugmentation processes. The present doctoral thesis deal with all these issues, which are presented in six chapters: (I) a multi-approach assessment to evaluate biostimulation and bioaugmentation strategies for heavily oil-contaminated soil, (II) ensayo piloto de biorremediación por tecnología de la biopila dinámica para la descontaminación de suelos contaminados por creosotas provenientes de las actividades dedicadas a la preparación de la madera, (III) microbial populations related to PAH biodegradation in an aged biostimulated creosote-contaminated soil, (IV) Fungal/bacterial interactions throughout bioremediation assays in an aged creosote polluted soil, (V) Comparative assessment of bioremediation approaches to highly recalcitrant PAH degradation in a real industrial polluted soil and (VI) Combining DGGE and barcoded pyrosequencing for microbial community characterization throughout different soil bioremediation strategies in an aged creosote-polluted soil.

El estudio de los microorganismos en cultivo puro ha propiciado el desarrollo de la genética, la bioquímica y la biotecnología. Sin embargo, la ecología ha permanecido reticente a incorporar a los microorganismos en su acervo teórico y experimental, principalmente debido a las dificultades metodológicas para observar a los microbios en la naturaleza, y como resultado de los caminos divergentes que han trazado las disciplinas de la microbiología y la ecología general. Esta tesis trata de demostrar que los patrones ecológicos de comunidades microbianas son susceptibles de ser analizados mediante la combinación de técnicas filogenéticas y herramientas de estadística multivariante. El uso de técnicas filogenéticas permite solventar, o al menos paliar, el hecho de la no independencia de los organismos vivos debido a la ascendencia común. Con la información ambiental adicional (como reflejo del determinismo abiótico) y la información espacial (como amalgama de eventos históricos y de dispersión), es posible explorar los posibles mecanismos que subyacen a la estructura y a la diversidad de las comunidades microbianas. / The study of microorganisms in pure laboratory culture has delivered fruitful insights into genetics, biochemistry and biotechnology. However, ecology has remained reluctant to incorporate microorganisms in its experimental and theoretical underpinnings mainly due to methodological difficulties in observing microorganisms in nature, and as a result of the different paths followed by the disciplines of microbiology and general ecology. In this dissertation, I argue that novel insights into microbial community patterns arise when phylogenetic relatedness are used in conjunction with multivariate statistical techniques in the context of broad scales of description.

Pollution by toxic compounds is one of the most relevant environmental damages to ecosystems produced by human activity and, therefore, it must be considered in environmental protection and restoration of contaminated sites. According to this purposes, the main goal of this doctoral thesis has been to analyse the impact of several chlorophenols and heavy metals on the microbial communities of two typical Mediterranean soils. The ecological risk concentrations of each pollutant, which have been determined according to respirometric activity and changes in the microbial community composition, and the factors that influence on their effective toxic concentrations (bioavailable pollutants) have been analysed in order to predict their potential impact on different soil ecosystems and provide scientific data for the regulation of the soil protection policies. Moreover, resistant microorganisms with pollutant removal capacities have been isolated from artificially contaminated soil microcosms and tested in axenic cultures, to infer their potential usefulness for bioremediation. / La contaminació amb compostos tòxics antropogènics és un dels perjudicis ambientals més rellevants per als ecosistemes i, per tant, cal tenir-ho en compte en la protecció ambiental i la restauració de llocs contaminats. Amb aquests propòsits, l’objectiu principal d’aquesta tesi doctoral ha estat analitzar l’impacte de clorofenols i metalls pesants sobre la microbiota de dos sòls típicament mediterranis. S’han analitzat les concentracions de risc ecològic de cada contaminant, determinades segons activitat respiromètrica i canvis en la composició de la comunitat microbiana, i els factors que influeixen en les seves concentracions tòxiques efectives (contaminants biodisponibles), per predir l’impacte potencial sobre diferents ecosistemes edàfics i proporcionar evidències científiques per a les polítiques de protecció del sòl. D’altra banda, a partir de microcosmos edàfics contaminats artificialment, es van aïllar també microorganismes resistents amb capacitat per eliminar els contaminants, que van ser analitzats en cultius purs per avaluar-ne la utilitat potencial en bioremediació.