Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / En los últimos treinta años se ha visto un aumento a nivel global del fenómeno de Floración de algas nocivas (FAN), más conocido como marea roja. Esto implica, entre otras cosas, problemas de salud pública y una gran pérdida económica para los productores de moluscos bivalvos. Es por esto que se ha generado un gran interés para entender el por qué de estos fenómenos naturales y si existe la posibilidad de crear métodos que permitan: predecir, mitigar o controlar estas floraciones una vez que se producen. Por esta razón, es importante investigar acerca de los factores involucrados en el fenómeno, entre los cuales se encuentran las bacterias que normalmente crecen asociadas a las microalgas causantes de las FAN. En Chile las FAN se producen fundamentalmente por el crecimiento explosivo de los dinoflagelados Alexandrium catenella y Dynophysis acuta, productores de toxinas paralizante y diarreica respectivamente. En el laboratorio de Toxinas Marinas de la Universidad de Chile se mantiene en cultivo una cepa de Alexandrium catenella denominada ACCO1 la cual fue aislada el año 1994 en la XI región de Aysén. A partir de estos cultivos, en el año 2002 se aislaron, caracterizaron e identificaron tres bacterias asociadas a esta microalga, correspondientes a: Citophaga sp. AMA-01, Pseudoalteromonas sp. cepa AMA- 02, y Ruegeria atlántica cepa AMA- 03. Ruegeria atlántica cepa AMA-03 es una bacteria que crece en forma saprofita asociada a A. catenella cepa ACC01, pero al crecerla separada de la microalga en un medio de cultivo enriquecido con nutrientes orgánicos, libera al medio un producto, el cual es capaz de producir la lisis de A. catenella en cultivo. Cuando la misma bacteria, libre de materia orgánica (lavadas) es devuelta al cultivo de origen, esta recupera su carácter simbionte ya que no se observa muerte, ni lisis celular de las microalgas. El efecto lítico de este factor liberado al medio, es menor cuando se pone en contacto con Heterocapsa sp. y A. catenella cepa ACC02, sugiriendo algún grado de especificidad de este fenómeno . Al aislar, purificar parcialmente y caracterizar este producto, logramos concluir que se trata de un compuesto de características parcialmente hidrofóbicas, de un tamaño menor de 1 KDa con capacidad de inmovilizar y producir la muerte de las microalgas, las que luego son degradadas probablemente por las enzimas liberadas al medio por las bacterias asociadas al cultivo del dinoflagelado

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / Las Floraciones de Algas Nocivas (FAN) en el mar, son fenómenos de gran impacto económico, productivo, sanitario y social. El dinoflagelado tóxico Alexandrium catenella cepa ACC01, fue aislado desde la XIa Región de Aysen, Chile (45º 32´ S, 73º 34´O), un área que fue afectada previamente por Floraciones de Algas Nocivas del tipo paralizante y diarreico. Este dinoflagelado ha sido cultivado y mantenido en el Laboratorio de Toxinas Marinas de la Facultad de Medicina de la Universidad de Chile. A partir de estos cultivos, en el año 2002, se aisló la bacteria marina Pseudoalteromonas sp. cepa AMA-02. Esta bacteria, que normalmente crece en forma saprófita asociada a Alexandrium catenella, al crecerla separada de ella, en un medio de cultivo con nutrientes orgánicos, es capaz de liberar al medio de cultivo sustancias líticas para la microalga de la cual fue aislada. Sin embargo, la actividad lítica no se observa cuando la bacteria, libre de nutrientes orgánicos, es reinsertada en el cultivo de A. catenella ACC01. El efecto lítico observado, es aparentemente específico para las cepas ACC01 y ACC02 de A. catenella, pero no para la microalga no tóxica Heterocapsa sp. cepa SGM01. Las sustancias líticas liberadas al medio de cultivo son capaces de inmovilizar inicialmente al dinoflagelado y promover, posteriormente la lisis celular a través de enzimas hidrolíticas liberadas al medio por la bacteria Pseudoalteromonas sp. cepa AMA-02, normalmente asociadas a la microalga. La caracterización preliminar y purificación de el o los factores liberados al medio de cultivo, responsables de la actividad lítica, demostró que corresponde a un compuesto de características hidrofóbicas, de un peso molecular menor a 1 KDa

Titulo Ingeniero en Biotecnología Molecular

Los microorganismos cumplen un rol importante en la remineralización de la materia orgánica que ocurre en los sedimentos marinos. Los nutrientes obtenidos de este proceso son llevados a la superficie mediante los afloramientos que ocurren en la costa central del Perú, contribuyendo así en la alta productividad de nuestro litoral. A pesar de su importancia, se han realizado escasos estudios sobre la ecología de los microorganismos presentes en los sedimentos de nuestras costas. Es así, que el objetivo de éste trabajo fue el de determinar la densidad y la biomasa microbiana bentónicas y establecer su relación con los factores oceanográficos y sedimentarios frente al Callao, durante el año 2007. Para ello se utilizó la técnica de recuento directo con microscopía de epifluorescencia, el análisis de imágenes digitales, y el análisis de correlación. Así, la densidad varió entre 4,35 x 10^9 a 3,06 x 10^10 cel./cm³. La biomasa encontrada fue de 79,73 a 2527,93 µgC/cm³. Los valores de biovolumen oscilaron de 0,06 a 0,51 µm³/cel. Se encontró una relación positiva significativa entre la clorofila y la biomasa, así como entre la clorofila y el biovolumen en la estación más cercana a la costa. Asimismo, se encontró una relación negativa significativa entre el carbono orgánico total y las variables densidad y biomasa. La temperatura del agua de fondo mostró una relación positiva significativa tanto con la densidad como con la biomasa. Por otro lado, no se observó una disminución significativa de la biomasa respecto a la profundidad del sedimento, por lo que la materia orgánica de origen fitoplanctónico no sería el principal factor en la distribución de los microorganismos. Otros factores como la disponibilidad de aceptores de electrones, que controlan la remineralización de nutrientes, deben ser estudiados. Palabras clave: sedimentos marinos, abundancia microbiana, biovolumen microbiano, biomasa microbiana, epifluorescencia, remineralización. / Microorganisms play an important role in the remineralization of organic matter in marine sediments. Nutrients obtained by this process are taken to the surface with the upwelling at the central coast of Peru, contributing to the high productivity of this region. Nevertheless, there are few studies about the microbial ecology of marine sediments in Peru. Therefore, the objective of this study was to determine the benthic microbial density and biomass, and to establish their relationship with oceanographic and sedimentary parameters in the coast of Callao during the year 2007. The technique of direct counting by epifluorescence microscopy was used, as well as analysis of digital pictures and statistical correlation. Microbial density varied between 4,35 x 10^9 and 3,06 x 10^10 cell/cm³. Biomass values ranged from 79,73 to 2527,93 µgC/cm³. The biovolume oscillated between 0.06 and 0.51 µm³/cell. A significant positive correlation between chlorophyll and biomass, as well as between chlorophyll and biovolume at the closest station to the coast was found. A significant negative correlation between total organic carbon and both microbial density and biomass was also found. Bottom water temperature showed a significant positive correlation with both microbial density and biomass. On other hand, we did not observe a significant decrease of microbial biomass with sediment depth, therefore, we conclude that the phytoplanktonic organic matter is not the only factor that affects the distribution of microbial abundance. Other factors such as the availability of electron acceptors, which controls the nutrient remineralization, should be explored. Keywords: marine sediments, microbial abundance, microbial biovolume, microbial biomass, epifluorescence, remineralization.

Evalúa el potencial antibacteriano de los metabolitos producidos por el actinomiceto marino M10-77. La evaluación preliminar mediante la prueba de “doble capa” mostró gran capacidad inhibitoria de la cepa en estudio, generando halos de inhibición cercanos a 70 mm de diámetro contra patógenos Gram positivos y halos de tamaño reducido contra Gram negativos. Estos datos se vieron reflejados en el ensayo de Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) del extracto diclorometánico, donde los resultados más notorios fueron contra una cepa de S. aureus resistente a meticilina, S. saprophyticus 7694 y Streptococcus sp. 7751 (1,9; 1,9 y 0,9 µg/mL, respectivamente) todas de origen clínico. El extracto activo fue fraccionado y parcialmente purificado por cromatografía en columna, obteniéndose cuatro fracciones orgánicas. Estas mostraron poseer actividad antimicrobiana moderada y menor a la del extracto original, hecho que se interpreta como un fenómeno de sinergismo, lo que motivó la realización del bioensayo de sinergismo aplicado a antibióticos. Los resultados mostraron la capacidad sinergística de la fracción II con antibióticos beta lactámicos y aminoglucósidos frente a S. aureus ATCC 43300 (MRSA), potenciando la actividad de la bencilpenicilina, cefotaxima y ceftriaxona hasta por 128 veces, y mejorando la actividad de la estreptomicina y gentamicina hasta por 8 veces. Finalmente, la cepa M10-77 fue clasificada dentro del género Streptomyces en base a características morfológicas y a información brindada sobre su identificación molecular. Se concluye que la cepa Streptomyces M10-77 es una cepa multi-productora de metabolitos antibacterianos de potente actividad y a su vez de metabolitos con capacidad sinergística sobre antibióticos de referencia. / Tesis

Aisla un bacteriófago lítico denominado Vf1, procedente del mar peruano, capaz de infectar a Vibrio fluvialis, bacteria que afecta humanos y organismos acuáticos. El bacteriófago Vf1 fue caracterizado con respecto a su morfología, estabilidad térmica, diferentes rangos de pH, sensibilidad frente al cloroformo, exposición a la luz UV, rango de hospederos y la curva de crecimiento de un paso. La microscopía electrónica de transmisión, evidenció cabeza de forma icosaedrica con un diámetro de 82.773 nm y un talo largo no contráctil de 142.318 nm de longitud, características propias a la familia Siphoviridae. El fago Vf1, fue resistente al calor a 20°C por 30 minutos, perdiendo su viabilidad a partir de 50 y 60°C; y en valores de pH entre 7 y 8 mantuvo títulos elevados, disminuyendo el título entre 5 y 6, siendo nulo a valores de pH ácido. La viabilidad frente a la exposición al cloroformo, evidenció una reducción en el título del 50% y frente a la luz UV, la reducción fue del 100% a 90 segundos de exposición. En la curva de crecimiento de un paso evidenció un período de latencia de 20 minutos y el tamaño de la explosión o burst size fue 602 partículas por centro infectivo. Los parámetros biológicos evaluados en este estudio evidenciaron el potencial del bacteriófago Vf1 para poder ser utilizado en fagoterapia, además, la metodología evaluada podría ser utilizado para el aislamiento de otros bacteriófagos de ambientes marinos. / Tesis

Publicación a texto completo no autorizada por el autor / Presenta a los bacteriófagos que son biocontroladores naturales de las bacterias como una alternativa para el control de las poblaciones de Vibrio cholerae, causantes de la enfermedad de transmisión alimentaria (ETA). El objetivo de este trabajo es aislar y caracterizar bacteriófagos capaces de infectar a Vibrio cholerae. Se toman muestras de aguas residuales de Lima - Perú. Los métodos empleados son para el aislamiento de Vibrio cholerae enriqueciendo, aislando en medio TCBS y bioquímica. Para el aislamiento y purificación del bacteriófago Φ K14 se realiza las pruebas de enfrentamiento en caldo, goteo, propagación y titulación. Para la caracterización microbiológica del bacteriófago Φ K14 se realiza las pruebas de rango de hospedero, multiplicidad de infección y curva de un paso. Para la caracterización fisicoquímica son las pruebas de estabilidad a diferentes condiciones ambientales (temperatura, pH y sensibilidad al cloroformo) y se realiza la microscopía electrónica. El bacteriófago K14 de Vibrio cholerae es caracterizado microbiológica y fisicoquímicamente de un total de 3 bacteriófagos aislados de aguas residuales es caracterizado microbiológica y fisicoquímicamente. Presenta una multiplicidad de infección (MOI) óptima de 0.001. El periodo latente del fago K14 es de 10 a 15 minutos y el tamaño de explosión de 25 UFP por célula infectada. Es estable a temperaturas de 40 oC, 50 oC y 60 oC e inestable a los 70 oC y 80 oC. El bacteriófago K14 no es sensible al cloroformo. Es inestable a pH 3 y estable del pH 7 a pH 9 pero tiene mayor estabilidad a pH 8. Según la micrografía electrónica el bacteriófago Φ K14 pertenece según sus estructuras a la familia Myoviridae. / Tesis

El biofouling es una acumulación indeseada de sustancias orgánicas en una superficie sumergida en agua y se considera que el origen se debe principalmente a la formación de biofilm por parte de bacterias, el cual sirve de alimento en la colonización de organismos superiores responsables de impactos negativos en el ambiente e industria acuática. Debido a esto, se debe identificar bacterias asociadas a este fenómeno en cultivos de “concha de abanico” (Argopecten purpuratus) en la bahía de Huaynuma, Casma, Perú, que permita realizar trabajos para disminuir la adhesión bacteriana. Se aislaron 40 cepas en total, las cuales fueron sometidas a la prueba de adherencia, para evaluar la producción de biofilm y su capacidad para adherirse a un sustrato, determinándose así que 16 (40%), 8 (20%) y 7 (17.5%) cepas fueron fuerte, moderada y débilmente productoras de biofilm y 9 (22.5%) cepas no productoras. Posteriormente se realizó la identificación fenotípica, basada en las pruebas del Manual de Bergey, cuyos resultados de similitud fueron superiores al 90%, predominando el género Vibrio, principalmente la especie de V. alginolyticus; la identificación molecular ratificó el predominio del género Vibrio, en especial V. alginolyticus, sin embargo esta identificación no fue específica para una sola especie por los altos porcentajes de similitud (100%) entre dos o más cepas. Por su parte la cepa M28 fue identificada al 100% como Photobacterium damselae subs. damselae., el cual se reporta por primera vez en cultivos de “concha de abanico” en la bahía de Huaynuma. / Tesis

Determina la caracterización fenotípica y realiza el análisis genómico de dos cepas nativas del género Shewanella con capacidad de degradar colorantes azoico. Las cepas usadas fueron Shewanella sp. LC6 y Shewanella sp. 2NE11, caracterizadas a nivel fisiológico, bioquímico y genómico. Se realizaron cinéticas de crecimiento y de decoloración con los colorantes azul directo 71, anaranjado de metilo, amarillo proción HEXL y azul brillante remazol. Los ensayos relacionados a su fisiología incluyeron la evaluación de crecimiento bajo distintos parámetros como temperatura, pH y NaCl (%); entre las pruebas bioquímicas se evaluaron la producción de catalasa, oxidasa, movilidad, indol, H2S, lisina descarboxilasa, consumo de citrato, reducción de nitratos, licuefacción de gelatina, hemólisis y consumo de carbohidratos. El análisis genómico estuvo dirigido hacia la búsqueda de genes relacionados a decoloración, resistencia a metales y consumo de carbohidratos. Los resultados obtenidos muestran que las características fisiológicas y bioquímicas relacionan a la cepa Shewanella sp. LC6 dentro de la especie Shewanella xiamenensis y a Shewanella sp. 2NE11 dentro de Shewanella algae. Se identificaron proteínas como azorreductasas, peroxidasas, oxidorreductasas y ACP fosfodiesterasas relacionadas al proceso de decoloración y una gran cantidad de genes de resistencia a metales como el mercurio, zinc, cadmio, cobre y plata. Asimismo se encontraron proteínas relacionadas al consumo de carbohidratos como N-acetylglucosamina, maltosa, L-arabinosa, DL-lactato, D-fructosa y sucrosa. La presente investigación muestra el amplio potencial que tienen estas cepas para ser utilizadas en biorremediación de colorantes textiles y metales pesados. / Tesis

Caracteriza in silico el gen lip de Marinobacter sp. LB aislado de las Salinas de Pilluana, San Martín. Para lo cual, se extrajo y purifico ADN de esta bacteria. Luego, se amplificó el gen lip mediante la reacción en cadena de la polimerasa usando cebadores específicos y el producto amplificado fue secuenciado. Posteriormente, se realizó la caracterización in silico que incluyó el diseño de cebadores para el gen lip; análisis evolutivos utilizando los genes ribosómicos 16S y lip; análisis estructurales del gen lip, modelamiento por homología del producto génico empleando como molde a la lipasa 1EX9 de Pseudomonas aeruginosa PAO1, validación de la estructura terciaria considerando la calidad estereoquímica de los puntos de Ramachandran y el entorno de los aminoácidos; y acoplamiento molecular proteína-sustrato. Los análisis evidenciaron que la cepa en estudio se encuentra muy relacionada a Marinobacter hydrocarbonoclasticus. El gen lip midió 927 pb; y la proteína madura, 284 aminoácidos distribuidos en once α-hélices periféricas y siete láminas-β internas. La lipasa de Marinobacter sp. LB pesó 29.99 kDa y presentó un pI de 8.89, así como, los residuos Ser78, Asp229 e His251, típicos de la triada catalítica de lipasas de la familia I. La región del bolsillo de unión y su afinidad por lípidos fue demostrada realizando un acoplamiento molecular con tributirina con energía de -248.11 kcal/mol. En conclusión, el análisis in silico indicó que Marinobacter sp. LB contiene una lipasa de la familia I, con aminoácidos conservados en la triada catalítica. / Tesis