La respuesta estricta (RE) es una respuesta celular conservada frente al estrés ambiental. En la RE, se produce ppGpp y se genera la reducción de los RNA estables (rRNA y tRNA). Estudios in vitro muestran que el ppGpp reduce de la velocidad de transcripción de la RNA polimerasa (RNAP) en los complejos de elongación (CTE) de Escherichia coli. Sin embargo, hasta la fecha, no se conoce el mecanismo básico de su accionar. Los estudios de moléculas individuales muestran que la RNAP polimeriza un RNA (estados dentro de la vía de actividad u on-pathway) interrumpido por pausas (estados fuera de la vía u off-pathway). En el presente estudio se evaluó el efecto del ppGpp en la elongación de los CTE por la microscopía de pinzas ópticas, en tiempo real y a nivel individual. Se observó que el ppGpp duplica la velocidad libre de pausas (11 a 20 nt/s) y mantiene la naturaleza difusiva de las pausas (off-pathway). Además, se deduce una ecuación para calcular la energía media de activación en pausas (ε) y se presenta un esquema general (unificación de una cadena Markov y la cinética de Cleland) para el análisis cinético de cualquier reacción enzimática. Gracias a esto se observó que el ppGpp triplica el factor pre-exponencial de la difusión de la RNAP sobre el DNA (24 a 67 s-1); mantiene el número de estados del on-pathway, el valor de la constante de catálisis (k_cat≈17 s-1) y la energía de activación en pausas (ε ≈ 4 KBT). Este estudio nos muestra el mecanismo básico de acción del ppGpp en la transcripción: aumento de la tasa de difusión de la RNAP sobre el DNA en una dimensión. Ya que la RE es conservada en bacterias, este conocimiento es de gran interés para el entendimiento del mecanismo de virulencia y resistencia de patógenos como Mycobacterium tuberculosis, Staphylococcus aureus, entre otros. / Tesis

Pseudomonas aeruginosa es un importante patógeno oportunista del ser humano y tiene amplia versatilidad metabólica por lo que se puede adaptar a vivir en ambientes ubicuos, pudiendo persistir en ciertas superficies como tejidos formando comunidades especializadas llamadas biopelículas, además de elaborar otros factores de virulencia, como el pili tipo IV (T4P) vinculado no sólo a la motilidad llamada “contracción” sino también pareciera estar relacionada con las etapas tempranas en la formación de las biopelículas. La presente tesis tuvo como principal objetivo determinar la presencia de los diferentes genotipos del T4P así como los factores de virulencia asociados en cepas clínicas de diferentes fuentes, encontrando que la distribución de genotipos fue 25,9 % para el Grupo II, 19 % para el Grupo I, 24,1 % para el Grupo III, 10,3 % el Grupo IV y 20,7 % para el Grupo V, de tal manera que en nuestro medio existe distribución homogénea de los diversos genotipos. Palabras clave: Pseudomonas aeruginosa, Genotipos de pilA, Motilidad

El presente estudio se dirigió a la identificación molecular de bacterias presentes en el compartimiento 1 de alpacas Huacaya mediante secuenciamiento del gen 16S rRNA. ADN genómico bacteriano fue extraído a partir de licor ruminal de 4 alpacas adultas de la raza Huacaya. Fragmentos de 728 bases del gen 16S rDNA fueron amplificados mediante PCR y clonados en un vector de expresión PGEM-T (Promega), transformados en Escherichia coli JM109 y secuenciados en un analizador genético ABI 3130. Cincuenta clonas fueron secuenciadas dando como resultado un total de 24 secuencias únicas del gen 16S ARNr. El análisis de las 24 secuencias únicas indicaron altos grados de identidad (> 95%, > e-140) con secuencias de bacterias previamente descritas en bases de datos del GeneBank, Blast server for bacterial identification, Ribosomal data base Project y BiBi database. Los resultados indican la presencia de Ruminococcus flavefaciens, Ruminococcus bromi, Clostridium thermocellum, Succiniclasticum ruminis, Sporobacter mitidis, Fastidiosipila sanguinis en el compartimiento 1 de la alpaca. / Tesis

Aplica la genómica comparativa para hallar las principales diferencias entre un nuevo genoma nativo de At. ferrivorans y At. ferrooxidans, con el fin de descubrir los genes de tolerancia al frío. Para cumplir el objetivo, una cepa de Acidithiobacillus ferrivorans PQ33 se aisló de Cerro de Pasco (4261 msnm) y se cultivó en medio base 9K con sulfuro de cobre 0,5% (w/v) hasta llegar a una densidad de 5x108 células/ml a una temperatura de 5°C. La cinética de crecimiento se analizó en hierro ferroso y en sulfuro cobre a través de recuento en cámara de Petroff-Housser y la cuantificación de cobre (II) liberado se determinó mediante absorción atómica. Por otro lado, se secuenció el genoma de la cepa nativa de At. ferrivorans PQ33 con HiSeq Illumina. Los reads fueron ensamblados con SPAdes y los contigs fueron alineados y extendidos con el genoma de referencia At. ferrivorans SS3 usando los software ABACAS e IMAGEN. La revisión de la calidad final y la anotación del genoma se realizaron con Quast y Prokka respectivamente. La identificación de islas genómicas fue verificada con IslandViewer por la presencia de genes de movilidad y desvío de GC. La cepa se identificó a través de secuenciación de RNA ribosomal 16S y se determinó el 100% de similitud con secuencias de At. ferrivorans SS3 y ACH ya reportadas. Se observó un tiempo de duplicación de 66,6 ± 5,1 h en hierro ferroso a pH 1.6. Por otra parte, después de 30 días de evaluación, la cepa de At. ferrivorans PQ33 mostró un tiempo de duplicación de 63,6 ± 3,9 h en sulfuro de cobre y se cuantificó 1780 ± 32 mg/l de cobre liberado (II). En cuanto al genoma, este presentó 3298172 pb en 101 contigs y 56,5% de GC. La anotación del genoma evidenció 3347 genes que codifican proteínas, 47 de ARNt y 3 ARNr. En contraste con las cepas 23270 y 53993 de At. ferrooxidans, el genoma de At. ferrivorans PQ33 mostró 2 Islas Genómicas (IGs), donde una de ellas mostró proteínas con dominio pilT, y un gen de rusticianina. Por otro lado, la proteína Rus de la IG mostró mayor flexibilidad que la de los operones rus. Adicionalmente, a diferencia del cepas SS3 y CF27 de At. ferrivorans, PQ33 mostró un gen que codifica un sistema ATPasa de salida de protones que ofrecería resistencia adicional al pH ácido. En conclusión, At. ferrivorans PQ33 oxida sulfuro de cobre a baja temperatura y oxida hierro ferroso a pH de 1.6. Además, At. ferrivorans PQ33 mostró plasticidad genómica al presentar dos IGs, donde una contiene un gen adicional rus que elucida posible mejora en el fitness evolutivo psicrotolerante de At. ferrivorans. Estos resultados tienen un significado importante para el desarrollo de la biolixiviación a gran altura, como en los andes peruanos. / Tesis

Utiliza la cepa psicrotolerante Acidithiobacillus ferrivorans PQ33 aislada de Cerro de Pasco para el análisis de los niveles de expresión de genes relacionados con el metabolismo del ión ferroso a ión férrico involucrado en la biolixiviación en condiciones de baja temperatura (5°C), así como los niveles de expresión de genes que han sido señalados en investigaciones anteriores como candidatos a conferir resistencia a condiciones de baja temperatura (genes pertenecientes al operon de síntesis de la trehalosa y diguanilato ciclasas), como condición control, se tomó el crecimiento de esta cepa a temperatura ambiente (21°C), lo más cercano posible a la temperatura de crecimiento ideal (22°C). Para el análisis de los niveles de expresión, se usaron primers diseñados por el investigador para genes de referencia, genes de metabolismo y genes de resistencia al frío. La información base para la síntesis de estos primers fue el genoma de Acidithiobacillus ferrivorans PQ33, secuenciado por nuestro laboratorio. El análisis de los niveles de transcritos para los genes de referencia evidenció una expresión invariable en ambas condiciones, validando 3 genes (rpoC, gyrB y alaS) como genes de referencia añadiendo una nueva herramienta metodológica a la investigación en esta especie. Los genes candidatos a estar involucrados en la adaptación a bajas temperaturas, los genes de la vía de síntesis de trehalosa: trehalosa sintasa (treS) y trehalosa oligosil tetrahidrolasa (treZ) no mostraron sobreexpresión bajo condiciones de baja temperatura, de hecho, treS mostró sobreexpresión a 21ºC. Asimismo, se analizaron dos genes relacionados con la síntesis de exopolímeros y la formación de biofilm (Diguanilato ciclasas, DGC) sobreexpresados a condiciones de 21°C. También se analizaron dos genes metabólicos relacionados con la oxidación del ion ferroso (genes rusA y rusB), que no mostraron ningún cambio de expresión significativo en ninguna de las condiciones. Estos resultados muestran congruencia con los últimos estudios sobre la expresión génica de Acidithiobacillus ferrivorans con enfoques de transcriptómica, lo que demuestra que los genes candidatos clásicos de adaptación al frío (genes de síntesis de trehalosa) no muestran cambios significativos en condiciones de baja temperatura, el sistema genético de esta especie estaría constantemente adaptado a la resistencia al frío, reforzando la hipótesis de su clasificación como especie euripsicrófila; o de lo contrario podrían haber otros mecanismos no clásicos de resistencia al frío. / Tesis

Caracteriza in silico el gen lip de Marinobacter sp. LB aislado de las Salinas de Pilluana, San Martín. Para lo cual, se extrajo y purifico ADN de esta bacteria. Luego, se amplificó el gen lip mediante la reacción en cadena de la polimerasa usando cebadores específicos y el producto amplificado fue secuenciado. Posteriormente, se realizó la caracterización in silico que incluyó el diseño de cebadores para el gen lip; análisis evolutivos utilizando los genes ribosómicos 16S y lip; análisis estructurales del gen lip, modelamiento por homología del producto génico empleando como molde a la lipasa 1EX9 de Pseudomonas aeruginosa PAO1, validación de la estructura terciaria considerando la calidad estereoquímica de los puntos de Ramachandran y el entorno de los aminoácidos; y acoplamiento molecular proteína-sustrato. Los análisis evidenciaron que la cepa en estudio se encuentra muy relacionada a Marinobacter hydrocarbonoclasticus. El gen lip midió 927 pb; y la proteína madura, 284 aminoácidos distribuidos en once α-hélices periféricas y siete láminas-β internas. La lipasa de Marinobacter sp. LB pesó 29.99 kDa y presentó un pI de 8.89, así como, los residuos Ser78, Asp229 e His251, típicos de la triada catalítica de lipasas de la familia I. La región del bolsillo de unión y su afinidad por lípidos fue demostrada realizando un acoplamiento molecular con tributirina con energía de -248.11 kcal/mol. En conclusión, el análisis in silico indicó que Marinobacter sp. LB contiene una lipasa de la familia I, con aminoácidos conservados en la triada catalítica. / Tesis