Publicación a texto completo no autorizada por el autor / Produce un complejo de elongación ternario de la ARN polimerasa de Mycobacterium tuberculosis recombinante independiente del promotor transcripcionalmente activo. Para ello, prueba el efecto de las diferentes proporciones molares de las subunidades en la reconstitución in vitro de la ARN polimerasa de Mycobacterium tuberculosis, compara la coexpresión de la ARN polimerasa de Mycobacterium tuberculosis en Escherichia coli bajo dos temperaturas distintas: 25 y 37 °C y establece un método para la evaluación de la transcripción de dicha polimerasa independiente de promotor. / Tesis

La respuesta estricta (RE) es una respuesta celular conservada frente al estrés ambiental. En la RE, se produce ppGpp y se genera la reducción de los RNA estables (rRNA y tRNA). Estudios in vitro muestran que el ppGpp reduce de la velocidad de transcripción de la RNA polimerasa (RNAP) en los complejos de elongación (CTE) de Escherichia coli. Sin embargo, hasta la fecha, no se conoce el mecanismo básico de su accionar. Los estudios de moléculas individuales muestran que la RNAP polimeriza un RNA (estados dentro de la vía de actividad u on-pathway) interrumpido por pausas (estados fuera de la vía u off-pathway). En el presente estudio se evaluó el efecto del ppGpp en la elongación de los CTE por la microscopía de pinzas ópticas, en tiempo real y a nivel individual. Se observó que el ppGpp duplica la velocidad libre de pausas (11 a 20 nt/s) y mantiene la naturaleza difusiva de las pausas (off-pathway). Además, se deduce una ecuación para calcular la energía media de activación en pausas (ε) y se presenta un esquema general (unificación de una cadena Markov y la cinética de Cleland) para el análisis cinético de cualquier reacción enzimática. Gracias a esto se observó que el ppGpp triplica el factor pre-exponencial de la difusión de la RNAP sobre el DNA (24 a 67 s-1); mantiene el número de estados del on-pathway, el valor de la constante de catálisis (k_cat≈17 s-1) y la energía de activación en pausas (ε ≈ 4 KBT). Este estudio nos muestra el mecanismo básico de acción del ppGpp en la transcripción: aumento de la tasa de difusión de la RNAP sobre el DNA en una dimensión. Ya que la RE es conservada en bacterias, este conocimiento es de gran interés para el entendimiento del mecanismo de virulencia y resistencia de patógenos como Mycobacterium tuberculosis, Staphylococcus aureus, entre otros. / Tesis