Los plásmidos en cepas de Acidithiobacillus sp. aislados de aguas ácidas de mina son recursos genéticos que aún no han sido reportado en nuestro país, que podrían usarse en la construcción de vectores y el mejoramiento de cepas bacterianas para su aplicación en biorremediación y biolixiviación. Por ello, el objetivo de esta tesis fue determinar la presencia de plásmidos de Acidithiobacillus aislados de aguas ácidas de zonas mineras, y analizar in sílico genes putativos identificados a partir del secuenciamiento y anotación de dos plásmidos de la cepa At. ferrivorans PQ33. Para la extracción de plásmidos se utilizó el protocolo de PureLink™ Quick Plasmid Miniprep Kit (Invitrogen ™). Los plásmidos de At. ferrivorans PQ33 fueron secuenciados por síntesis química en sistema HiSeq 200 de Illumina. El software Velveth, versión 1.1, fue empleado para el ensamblamiento de novo de las secuencias. Los plásmidos circularizados fueron anotados usando las herramientas Prokka y ORFfinder, las búsquedas de similaridad se realizaron empleando BlastX contra la base de datos del GenBank. Blastn y el software Artemis fueron usados para identificar los orígenes de replicación. De 24 cepas de Acidithiobacillus (10 de Puno, 6 de Huancavelica y 8 de Cerro de Pasco), 17 (70.83%) presentaron plásmidos. El análisis in silico reveló la presencia de genes implicados en la conjugación (TraD, MobA, proteínas de exclusión de entrada y XerD), sistemas toxina-anti toxina (HicA y HicB), proteínas de replicación (RepA y proteínas de union a DNA), reguladores de transcripción y post traducción (CopG y la chaperona DnaJ), así como la destacable presencia de una proteína de virulencia (VapD), además de dos proteínas (Porina fosfato selectiva O y diguanilato ciclasa), implicadas en la resistencia a la falta de nutrientes y producción de biofilm, respectivamente. Es la primera vez que se reporta plásmidos caracterizados de un cepa psicrotolerante de Acidithiobacillus ferrivorans, con capacidad de transferencia horizontal y sistemas de regulación implicados tanto en el mantenimiento del plásmido como en la adherencia a sustratos, característica importante de esta especie para su aplicación en biominería. / Tesis

Aplica la genómica comparativa para hallar las principales diferencias entre un nuevo genoma nativo de At. ferrivorans y At. ferrooxidans, con el fin de descubrir los genes de tolerancia al frío. Para cumplir el objetivo, una cepa de Acidithiobacillus ferrivorans PQ33 se aisló de Cerro de Pasco (4261 msnm) y se cultivó en medio base 9K con sulfuro de cobre 0,5% (w/v) hasta llegar a una densidad de 5x108 células/ml a una temperatura de 5°C. La cinética de crecimiento se analizó en hierro ferroso y en sulfuro cobre a través de recuento en cámara de Petroff-Housser y la cuantificación de cobre (II) liberado se determinó mediante absorción atómica. Por otro lado, se secuenció el genoma de la cepa nativa de At. ferrivorans PQ33 con HiSeq Illumina. Los reads fueron ensamblados con SPAdes y los contigs fueron alineados y extendidos con el genoma de referencia At. ferrivorans SS3 usando los software ABACAS e IMAGEN. La revisión de la calidad final y la anotación del genoma se realizaron con Quast y Prokka respectivamente. La identificación de islas genómicas fue verificada con IslandViewer por la presencia de genes de movilidad y desvío de GC. La cepa se identificó a través de secuenciación de RNA ribosomal 16S y se determinó el 100% de similitud con secuencias de At. ferrivorans SS3 y ACH ya reportadas. Se observó un tiempo de duplicación de 66,6 ± 5,1 h en hierro ferroso a pH 1.6. Por otra parte, después de 30 días de evaluación, la cepa de At. ferrivorans PQ33 mostró un tiempo de duplicación de 63,6 ± 3,9 h en sulfuro de cobre y se cuantificó 1780 ± 32 mg/l de cobre liberado (II). En cuanto al genoma, este presentó 3298172 pb en 101 contigs y 56,5% de GC. La anotación del genoma evidenció 3347 genes que codifican proteínas, 47 de ARNt y 3 ARNr. En contraste con las cepas 23270 y 53993 de At. ferrooxidans, el genoma de At. ferrivorans PQ33 mostró 2 Islas Genómicas (IGs), donde una de ellas mostró proteínas con dominio pilT, y un gen de rusticianina. Por otro lado, la proteína Rus de la IG mostró mayor flexibilidad que la de los operones rus. Adicionalmente, a diferencia del cepas SS3 y CF27 de At. ferrivorans, PQ33 mostró un gen que codifica un sistema ATPasa de salida de protones que ofrecería resistencia adicional al pH ácido. En conclusión, At. ferrivorans PQ33 oxida sulfuro de cobre a baja temperatura y oxida hierro ferroso a pH de 1.6. Además, At. ferrivorans PQ33 mostró plasticidad genómica al presentar dos IGs, donde una contiene un gen adicional rus que elucida posible mejora en el fitness evolutivo psicrotolerante de At. ferrivorans. Estos resultados tienen un significado importante para el desarrollo de la biolixiviación a gran altura, como en los andes peruanos. / Tesis

Utiliza la cepa psicrotolerante Acidithiobacillus ferrivorans PQ33 aislada de Cerro de Pasco para el análisis de los niveles de expresión de genes relacionados con el metabolismo del ión ferroso a ión férrico involucrado en la biolixiviación en condiciones de baja temperatura (5°C), así como los niveles de expresión de genes que han sido señalados en investigaciones anteriores como candidatos a conferir resistencia a condiciones de baja temperatura (genes pertenecientes al operon de síntesis de la trehalosa y diguanilato ciclasas), como condición control, se tomó el crecimiento de esta cepa a temperatura ambiente (21°C), lo más cercano posible a la temperatura de crecimiento ideal (22°C). Para el análisis de los niveles de expresión, se usaron primers diseñados por el investigador para genes de referencia, genes de metabolismo y genes de resistencia al frío. La información base para la síntesis de estos primers fue el genoma de Acidithiobacillus ferrivorans PQ33, secuenciado por nuestro laboratorio. El análisis de los niveles de transcritos para los genes de referencia evidenció una expresión invariable en ambas condiciones, validando 3 genes (rpoC, gyrB y alaS) como genes de referencia añadiendo una nueva herramienta metodológica a la investigación en esta especie. Los genes candidatos a estar involucrados en la adaptación a bajas temperaturas, los genes de la vía de síntesis de trehalosa: trehalosa sintasa (treS) y trehalosa oligosil tetrahidrolasa (treZ) no mostraron sobreexpresión bajo condiciones de baja temperatura, de hecho, treS mostró sobreexpresión a 21ºC. Asimismo, se analizaron dos genes relacionados con la síntesis de exopolímeros y la formación de biofilm (Diguanilato ciclasas, DGC) sobreexpresados a condiciones de 21°C. También se analizaron dos genes metabólicos relacionados con la oxidación del ion ferroso (genes rusA y rusB), que no mostraron ningún cambio de expresión significativo en ninguna de las condiciones. Estos resultados muestran congruencia con los últimos estudios sobre la expresión génica de Acidithiobacillus ferrivorans con enfoques de transcriptómica, lo que demuestra que los genes candidatos clásicos de adaptación al frío (genes de síntesis de trehalosa) no muestran cambios significativos en condiciones de baja temperatura, el sistema genético de esta especie estaría constantemente adaptado a la resistencia al frío, reforzando la hipótesis de su clasificación como especie euripsicrófila; o de lo contrario podrían haber otros mecanismos no clásicos de resistencia al frío. / Tesis