Memoria para optar al título de Químico Farmacéutico / En el corazón, los fibroblastos, las células más abundantes, tienen funciones estructurales, actúan como sensores de los cambios del entorno, reaccionan frente a estímulos externos secretando factores de crecimiento, tienen una alta capacidad proliferativa y de secreción de proteínas de matriz extracelular. El retículo endoplasmático (RE) es el responsable de la síntesis y correcto plegamiento de las proteínas, pero cuando por diferentes estímulos se ve alterado el correcto proceso de plegamiento se produce lo que se conoce como estrés de retículo endoplasmático. La acumulación de proteínas mal plegadas en el lumen del RE contribuye al desarrollo de un gran número de enfermedades neurodegenerativas, inmunes, endocrinas y cardiovasculares. En el RE existe toda una maquinaría traduccional que mantiene un correcto flujo de la información para el correcto plegamiento proteico, entre las que destacan los sensores de estrés de RE como PERK, IRE, ATF6, las chaperonas BiP y PDI y la proteína CHOP que funciona como un inductor de apoptosis. Este es el primer estudio que considera evaluar el efecto del estrés de RE sobre la viabilidad celular y la secreción de proteínas de la MEC en fibroblastos cardiacos de ratas neonatas y para ello utilizamos Tunicamicina (Tn), un antibiótico que induce estrés de RE. Nuestros resultados mostraron que los fibroblastos cardiacos presentan una alta sensibilidad a la apoptosis inducida por Tn, junto con un cambio en la expresión de las proteínas marcadoras de estrés de RE. Además de lo anterior, nuestros resultados mostraron que el pre-tratamiento con TGFβ1 (un agente pro-fibrótico de marcada acción sobre fibroblastos cardiacos) fue capaz de prevenir la muerte por apoptosis inducida por Tn en los fibroblastos cardiacos, a través de un mecanismo de adaptación al estrés de RE, modificando los niveles de expresión de las proteínas marcadoras de estrés de RE. Sin embargo, TGFβ1 no fue capaz de revertir la disminución en la secreción de colágeno inducida por efecto de Tn. En conclusión, TGFβ1 protege de la apoptosis inducida por Tn, abriendo perspectivas como un mecanismo de prevención de patologías en las que participa el estrés de RE / In the heart, fibroblasts, the cells more abundant, have structural features, act as sensors of the changing environment, react to external stimuli secreting growth factors, have a high proliferative capacity and secretion of extracellular matrix proteins. The endoplasmic reticulum (ER) is responsible for the synthesis and proper folding of proteins, but when a stimulus alters the proper folding process occurs endoplasmic reticulum stress. The accumulation of bad folded proteins into the ER lumen contributes to the development of a large number of neurodegenerative diseases, immune, endocrine and cardiovascular disorders. In ER there is a whole translational machinery that maintains the proper flow of information to the proper protein folding, including ER stress sensors as PERK, IRE1α, ATF6, proteins like BiP and PDI and the protein CHOP that works as an inducer of apoptosis. This is the first study that considers assess the effect of ER stress on the feasibility of cell and secretion of the MEC proteins in neonate rat cardiac fibroblasts and for that we use Tunicamicina (Tn), an antibiotic that induces stress of ER. Our results showed that cardiac fibroblasts have a high sensitivity to apoptosis induced by Tn, along with a change in the expression of the protein marker of stress ER. In addition, our results showed that pre-treatment with TGF β1 (an agent with marked pro-fibrotic action on cardiac fibroblasts) was able to prevent death by apoptosis induced by Tn in cardiac fibroblasts, through a mechanism of adaptation to ER stress, by changing levels of expression of the protein marker of stress RE. However, TGF β1 was not able to reverse the decline in the secretion of collagen induced by effect of Tn. In conclusion, TGF-β1 protects apoptosis induced Tn, opening prospects as a mechanism for the prevention of diseases in which participates ER stress

Memoria para optar al título de Químico Farmacéutico / En el corazón, los fibroblastos son las células más abundantes y tienen características estructurales y funcionales muy determinadas: a) actúan como sensores de los cambios del entorno reaccionando frente a estímulos externos; b) secretan factores de crecimiento, citoquinas, y poseen sus receptores; c) tienen una alta capacidad proliferativa; d) secretan una gran cantidad de proteínas de matriz extracelular; e) se diferencian a un fenotipo conocido como miofibroblasto, los que participan activamente del proceso de cicatrización tisular después de una injuria cardiaca. En el proceso de secreción de proteínas, una vez sintetizadas, estas deben ser plegadas al interior del retículo endoplásmico (RE) a través de un complejo proceso en el que participan proteínas conocidas como proteínas chaperonas. Cuando por diversos factores como alteración de la homeostasis del calcio, estrés oxidativo, estado redox, isquemia o isquemia/reperfusión, se altera la homeostasis del RE, se afecta el plegamiento y maduración de proteínas en vías a ser secretadas, conduciendo a un estado celular conocido como Estrés de Retículo Endoplásmico (ERE). Esta nueva condición activa la Respuesta a Proteínas Mal Plegadas, que induce mecanismos compensatorios que llevan al aumento de la expresión de chaperonas del RE. Cuando esta respuesta no es capaz de recuperar la homeostasis del plegamiento de proteínas, se gatilla la expresión del factor transcripcional CHOP que activa la expresión de genes que conducen a la muerte celular de tipo apoptótica. En este estudio se demostró que tanto isquemia como Isquemia/Reperfusión (I/R) simuladas (cultivo de fibroblastos en medio isquémico y cámara hipóxica), son capaces de generar una pérdida significativa en la viabilidad celular de fibroblastos cardíacos neonatos de rata (FCNR). La pérdida de viabilidad celular es debido a que tanto isquemia como I/R son capaces de inducir ERE, evidenciado por un aumento de los niveles de CHOP (8 horas de isquemia y 8 horas de isquemia seguidas de 24 horas de reperfusión), resultando en una pérdida de un 25% y un 50% de la viabilidad celular en isquemia e I/R respectivamente. Muchos han sido los intentos para solucionar el principal problema que se genera ante un evento isquémico, la muerte celular. En la literatura se ha reportado que TGF-β1 es capaz de generar un efecto cardioprotector en cultivos primarios de cardiomiocitos sometidos a isquemia e I/R. Nuestros resultados muestran que TGF-β1 a una concentración de 5 ng/mL, disminuye, aunque no totalmente, la pérdida de viabilidad de FCNR inducida por isquemia e I/R. De igual manera, nuestros resultados muestran que esta citoquina es capaz de bloquear totalmente el aumento en la expresión de CHOP inducidos por isquemia e I/R simuladas. De estos resultados se concluye que tanto en isquemia como I/R, la pérdida de la viabilidad celular se debe, al menos en parte, al ERE, un efecto que es atenuado por TGF-β1, no descartando que existen otros mecanismos no regulados por ERE que generan la pérdida de viabilidad celular. Una segunda alternativa para enfrentar este problema, fue la utilización de la chaperona química Ácido 4-fenilbutírico (4-PBA, quien ha demostrado proteger del ERE por tapsigargina en FCNR). Nuestros resultados muestran que distintas concentraciones de 4-PBA en isquemia, o pre-incubando los FCNR 24 horas antes de realizar la isquemia con 4-PBA, no se observó un efecto sobre la pérdida de viabilidad celular. Si bien estos resultados son discordantes con TGF-β1, fortalece la idea de que el ERE es parte de la perdida de viabilidad celular o que TGF-β1 gatilla vías de sobrevida, una de las cuales podría ser frenar la muerte celular inducida por ERE / In the heart, fibroblasts are the most abundant cell type and they have very specific structural and functional features: a) act as sensors of changes in the environment reacting under external stimuli; b) secrete growth factors, cytokines and have their receptors; c) have a high proliferative capacity; d) secrete a large amount of extracellular matrix proteins; e) differentiate into a phenotype known as myofibroblast, which is involved in the wound healing process after a cardiac injury. In the protein secretion process, once synthesized, they have to be fold inside the endoplasmic reticulum (ER) through a complex process in which are involved many proteins known as chaperone proteins. When because of many factors such alterations in calcium homeostasis, oxidative stress, redox state, ischemia or ischemia/reperfusion (I/R), is altered the endoplasmic reticulum homeostasis, the fold and maturation of proteins in the secretory pathways is affected, leading to a state known as Endoplasmic Reticulum Stress (ERS). This new condition activates de Unfolded Protein Response, which induces compensatory mechanisms that leads to an increase of the expression of the chaperone proteins of the endoplasmic reticulum. When this response is not able to restore homeostasis in the correct protein folding, it triggers the expression of the transcriptional factor CHOP that activates the expression of genes that lead to cell death by apoptosis. In this study we demonstrated that either simulated ischemia or I/R (fibroblast culture in ischemic medium and hypoxic chamber), are capable to generate a significant loss of cardiac fibroblast viability. The loss of cell viability is because either ischemia and I/R are capable of inducing ERS, evidenced by an increased levels of CHOP (8 hours for ischemia and 8 hours of ischemia followed by 24 hours of reperfusion), resulting in a loss of 25% and 50% of cell viability in ischemia and I/R. There have been many attempts to solve the principal problem of an ischemic event, the cell death. In literature has been reported that TGF-β1 is capable of generating a cardio protective effect in primary cardiac myocytes cultures under ischemia and I/R. Our results show that TGF-β1 [5 ng/mL], decreases, although not entirely, the loss of cardiac fibroblasts viability induced by ischemia and I/R. Similarly, our results show that this cytokine is able to block totally the increase in the expression of CHOP induced by ischemia and I/R. From these results it is concluded, that either in ischemia as well as in I/R, the loss of cell viability is due, at least in part, to ERS, and it is attenuated by TGF-β1, not ruling out that there are other mechanisms not regulated by ERS that lead to a loss of cell viability. A second alternative to face this problem, was the use of the chemical chaperone 4-PBA (who has demonstrated protect from cardiac fibroblast death thapsigargin-induced by ERS cardiac fibroblasts). Our results show that different concentrations of 4-PBA in ischemia, or pretreatment the cardiac fibroblasts by 24 hours before the ischemia with 4-PBA, don´t have any effect in the loss of cell viability. Although these results are discordant with TGF-β1, they strengthen the idea that the ERS is a part of the loss of cell viability, or that TGF-β1 triggers survival pathways, one of which could be to prevent ERS cell death

Memoria para optar al título profesional de Bioquímico / La deposición excesiva de proteínas de matriz extracelular (MEC) se conoce como fibrosis y es una de las características de las enfermedades musculares degenerativas como la distrofia muscular de Duchenne (DMD). En esta enfermedad, la función muscular se pierde cuando las miofibras son reemplazadas por deposición de colágeno y otras proteínas de MEC. Entre los factores que desencadenan la fibrosis muscular se encuentran el Factor de Crecimiento Transformante tipo (TGF- ) y Angiotensina II (Ang II), éste último perteneciente al Sistema Renina-Angiotensina (RAS). Los principales efectos biológicos ejercidos por Ang II están mediados a través de los receptores tipo 1 y tipo 2 para Ang II denominados AT-1 y AT-2. El receptor AT-1 es responsable de mediar los efectos fibróticos dependientes de Ang II mientras que AT-2 participa como inductor de los efectos antifibróticos. En fibrosis de tejidos cardiaco, pulmonar y renal, TGF- 1 aumenta los niveles de AT-1 y AT-2, adicionando mayor complejidad a los mecanismos que regulan la fibrosis. Los efectos de TGF- 1 sobre los niveles de los receptores de Ang II en el músculo esquelético aún no se conocen. El objetivo de este trabajo fue evaluar el efecto de TGF- 1 sobre los niveles proteicos de los receptores AT-1 y AT-2 en mioblastos C2C12 y en músculo esquelético de ratón. Los resultados que se obtuvieron de los análisis in vitro en células musculares esqueléticas expuestas a TGF-b1, mostraron un aumento en los niveles proteicos de AT-2 de una manera dependiente de la dosis de TGF- 1 con un efecto máximo a las 48 h en paralelo a la inducción de fibrosis determinada por la acumulación de fibronectina y colágeno III. Sin embargo, los niveles proteicos de AT-1 no fueron afectados. Experimentos in vivo de inyección de TGF- 1 a músculo esquelético dañado de ratón, mostraron un aumento en los niveles del receptor AT-2, sin cambios en los niveles del receptor AT-1. Utilizando inhibidores farmacológicos de la actividad quinasa del receptor tipo I de TGF- y de la actividad p38 MAPK se pudo establecer que ambos eran requeridos para el aumento de los niveles proteicos de AT-2 inducido por TGF- 1, sugiriendo que el efecto es directamente mediado por los receptores de TGF- y por la vía MAPK p38. En un modelo murino de la distrofia muscular de Duchenne (ratones mdx), el cual presenta fibrosis y niveles aumentados de TGF- 1, se observó un aumento de los niveles proteicos del receptor AT-2 en diversos músculos esqueléticos comparados a los niveles observados en un ratón normal, sin embargo, los niveles del receptor AT-1 no se observó cambios. Durante la diferenciación de los mioblastos C2C12, proceso en el cual la vía de señalización de TGF- 1 se encuentra disminuida, los niveles proteicos de los receptores AT-1 y AT-2, disminuyó. Estos resultados sugieren que los niveles proteicos de AT-2, y no los de AT-1, son modulados por el factor profibrótico TGF- 1 en células musculares esqueléticas y en músculo esquelético, y que, durante la diferenciación, tanto AT-1 como AT-2 son modulados, sugiriendo así que estos receptores tienen un papel en el desarrollo y fisiopatología de la DMD / The excessive deposition of extracellular matrix (ECM) proteins is known as fibrosis and is a key hallmark of degenerative muscle diseases such as Duchenne muscular dystrophy (DMD). In this disease, muscle function is lost when myofibers are replaced by deposition of collagen and other ECM proteins. Among the factors that triggers muscle fibrosis are Transforming Growth Factor Type beta (TGF- ) and Angiotensin II (Ang II) from the Renin-Angiotensin System (RAS). Ang II exerts its biological effects mainly through two receptors, AT-1 and AT- 2, where AT-1 is responsible for Ang II fibrotic effects and AT-2 mediates antifibrotic effects. In cardiac, pulmonary and renal fibrotic tissues TGF- 1 increases AT-1 and AT-2 levels adding more complexity to the mechanisms that regulate fibrosis. The effects of TGF-b on the AngII receptor levels in skeletal muscle are not know. The aim of this work was to evaluate the effect of TGF- 1on protein levels of AT-1 and AT-2 receptors. The results were determined by western blot assays, and they show that TGF- 1 increases fibronectin and collagen III expression in C2C12 cells. We also determined that AT-2 protein levels were increased in a dose-dependent manner with a maximal effect at 48 h. However, levels of AT-1 remain unchanged. In vivo experiments in a mice damage skeletal muscle model injected with TGF- 1 shown an increase of AT-2 protein level and no changes were observed in AT-1 protein level. TGF- 1-dependent increase of AT-2 is abolished when cells were treated with a specific inhibitor of the TGF- receptor I kinase activity and with an inhibitor of p38 MAPK pathway, suggesting that the effect is directly mediated by TGF- receptors and p38 MAPK pathway. In a murine model of DMD (mdx mice), which presents fibrosis and augmented TGF- 1 levels, AT-1 and AT-2 receptors were evaluated in several muscles, AT-1 levels remain unchanged and AT-2 levels were augmented in dystrophic muscles. However, during differentiation, in which TGF- pathway is downregulated, C2C12 myoblasts, diminished the expression of AT-1 and AT-2 receptors. These results suggest that AT-2 protein levels, and not AT-1 levels, are differentially modulated by the profibrotic factor TGF- 1 in skeletal muscle cells and skeletal muscle, and during differentiation AT-1 and AT-2 are modulated, suggesting that these receptors have a role in the development and physiopathology of DMD. / FONDECYT

Memoria para optar el título de Bioquímico / No autorizada por el autor para ser publicada a texto completo en el Portal de Tesis Electrónicas / En las últimas décadas el cáncer se ha establecido como una de las principales causas de muerte. Por eso es importante dilucidar los mecanismos por los cuales se genera esta enfermedad con el fin de combatirla. El estudio de esta enfermedad es complejo, y debido a los modelos que se han generado para estudiar este mal, se ha logrado llegar a comprender mejor esta enfermedad. Entre los modelos actuales de cáncer, se encuentra el modelo de carcinogénesis química de piel de ratón, el cual nos permite abarcar en su totalidad el estudio de la progresión tumoral. Una de las líneas de investigación del cáncer es el estudio de la citoquina TGF-ß1, citoquina multifuncional que modula muchos procesos íntimamente relacionados con cáncer. En la actualidad se acepta que TGF-ß1 posee un rol dual en la progresión tumoral, debido a que este factor puede tanto inhibir como estimular la tumorogénesis, dependiendo del estadío en la progresión tumoral en el cual se encuentren las células que están bajo su estímulo. TGF-ß1 actúa sobre la célula modulando funciones determinadas mediante vías de transducción de señales. Entre estas vías la vía Smad3 y la vía ERK1/2, ambas importantes por su conexión con el cáncer. La activación de las vías de transducción de señales tiene como efecto, entre otros, un aumento en las proteínas relacionadas con la metástasis, como uPA, PAI-1 y MMP9. Estas proteínas participan activamente en la degradación de la matriz extracelular, proceso imprescindible para la migración y por ende la malignidad. Además de una mayor capacidad degradativa, en la célula tumoral se producen cambios morfológicos que facilitan su motilidad y por tanto la malignidad. Las células epiteliales bajo el estímulo de TGF-ß1 sufren un proceso denominado transición epitelio-mesenquimática (TEM). La TEM se relaciona con una mayor independencia celular, y una mayor migración debido a una morfología más fibroblastoidea de las células. Este proceso está asociado a una disminución de cadherina-E y a un aumento de vimentina. La TEM es un proceso importante en la búsqueda de terapias contra el cáncer y es por eso que los esfuerzos se han centrado en entender los mecanismos y las proteínas que modulan las señalizaciones de TGF-ß1, y por ende este proceso. Entre estas proteínas se ha descrito Skip, proteína asociada a la maquinaria de maduración de los mRNA y a la transcripción. Además esta proteína interactúa con proteínas virales relacionadas con el cáncer. Skip también tiene la capacidad de activar la vía Smad3 bajo el estímulo de TGF-ß1, lo cual nos sugiere un posible papel de Skip en la progresión tumoral inducida por TGF-ß1. Nuestros resultados mostraron que Skip puede regular las vías de transducción de TGF-1, Smad3 y ERK1/2, además de la expresión de uPA, PAI-1 y MMP9 tanto en células PDV como en células humanas de cáncer de próstata, PC-3. A su vez TGF-ß1 regula la expresión de Skip en forma dependiente del tipo celular, lo cual podría tener relación con el efecto que produce Skip sobre las vías moduladas por TGF-ß1. También se investigó la relación entre Skip y TEM. En este ámbito nuestros resultados indicaron que la disminución en la expresión de Skip evita que se realice el proceso de TEM. Esto quedó evidenciado en las células con menor expresión de Skip (C14), ya que en estas no se formaron los filamentos de vimentina, así como tampoco las fibras gruesas y largas en la periferia celular que son inducidas normalmente por TGF-ß1 en células PDV. Además nuestros datos indicaron que la disminución en la expresión de Skip produce una meno migración bajo el estímulo de TGF-ß1 en las células PDV, lo que indica que dicha disminución implica una resistencia a la inducción de la malignidad de las células PDV debida a TGF-ß1. Estas evidencias indicarían que Skip podría ser un blanco posible para bloquear procesos de malignidad debido a TGF-ß1, sin embargo antes es necesario estudiar el efecto de Skip sobre la TEM en células humanas. En función de esto se podrían diseñar estrategias para evitar el proceso de TEM, lo que impediría una de las etapas cruciales en la malignidad

Los tumores de mama pertenecen a un grupo de lesiones neoplásicas denominadas tumores desmoplásicos que, bajo la influencia de ciertos factores epiteliales, originan una estructura estromal rígida responsable de la consistencia dura de la masa tumoral. Este proceso fibrótico ocurre en etapas tempranas de la enfermedad, es controlado por una forma de fibroblastos conocidos como miofibroblastos, o fibroblastos activados, y sus mecanismos son pobremente comprendidos. La activación del tejido estromal es una etapa fundamental en la progresión tumoral, permitiendo tanto la adquisición de propiedades malignas en células epiteliales, como la capacidad invasiva y metastásica. En esta memoria de título estudiamos la miodiferenciación de fibroblastos mamarios no tumorales RMF-EG, frente al estímulo de TGF-β1, secretado por células tumorales y que es abundante en el microambiente tumoral. Los resultados mostraron que 5ng/mL de TGF-β1 aumentó la expresión de actina α-SMA, marcador de miofibroblastos, y de CTGF, molécula asociada a diversos desórdenes fibróticos. A través del uso del inhibidor DPI y el knock-down de NOX4 demostramos que TGF-β1 promovió un ambiente oxidativo que favoreció la miodiferenciación fibroblástica de células RMF-EG. Determinamos también que TGF-β1 activó la ruta de señalización JNK1,2 y que esta activación era fundamental para el aumento de la expresión de CTGF, NOX4 y α-SMA. Estudiamos la influencia de la activación de esta ruta alternativa junto con el aumento del tenor oxidativo, sobre la activación de la ruta canónica Smad2,3. Los resultados mostraron que el aumento en la expresión de NOX4 y la fosforilación de JNK1,2 actuaban de manera sinérgica para activar la ruta Smad2,3. En conjunto, estos resultados demuestran que TGF-β1 provoca la miodiferenciación de fibroblastos no tumorales, a través de un mecanismo que requiere de la activación de JNK1,2, el aumento temprano de la expresión de CTGF y NOX4 con un consecuente aumento de los niveles intracelulares de ROS. / Memoria para optar al título de Bioquímico / Brest tumors belong to a group of neoplastic lesions known as desmoplastics or scirrhous tumors which, under the influence of tumor cell factors, originate a fibrous structure responsible for the hard consistency of the tumor mass. This fibrotic process occurs during early stages of the disease, it is orchestrated by activated fibroblast i.e. myofibroblast and its mechanisms are poorly understood. Activation of the stromal compartment is a critical step in tumor progression, enabling the epithelial acquisition of malignant properties, such as invasive and metastatic capacities. In the present study, we investigated the myofibroblastic differentiation of normal human mammary fibroblast RMF-EG, induced by TGF-β1, a growth factor secreted by tumor cells and abundant in tumor microenvironment. Our results reveal that a 5ng/mL TGF-β1 stimulus increased the expression of myofibroblast marker α-SMA and CTGF, a molecule associated to several fibrotic disorders. Using a NOX inhibitor (DPI) and a siRNA for NOX4, we demonstrated that TGF-β1 promoted an oxidative environment that favors myofibroblastic differentiation of RMF-EG cells. We also determined that TGF-β1-dependant activation of JNK1,2 was essential for CTGF, NOX4 and α-SMA increased expression. We assessed the influence of JNK1,2 activation and NOX4 activity on canonical Smad2,3 activation. Our results reveal that the TGF-β1-dependant increase of NOX4 expression and JNK1,2 phosphorylation induced a synergical activation of the canonical TGF-β1 pathway, Smad2,3.Taken together, these results demonstrate that TGF-β1 promotes myofibroblastic differentiation of normal fibroblasts RMF-EG through a mechanism that requires JNK1,2 activation, early increase of CTGF and NOX4 expression with a consequent increase of intracellular ROS levels

Tesis presentada a la Universidad de Chile para optar al grado de Doctora en Farmacología / La fibrosis cardiaca se genera por un depósito exagerado de proteínas de matriz extracelular (MEC) producto de la activación de los fibroblastos (FC). Estas células, representan cerca de un 60 a 70% de las células del corazón, y en respuesta a un daño, son activadas por diversas citoquinas y factores de crecimiento (entre ellas, TGF-β1, Ang II, etc.), los que desencadenan en ellas un cambio estructural y funcional que las diferencia a miofibroblastos cardiacos (MFC). Los MFC tienen como principal función la de secretar proteínas de la MEC con el fin de contraer y reparar la zona dañada en el caso de un infarto al corazón. Así, el MFC juega un papel crucial en la respuesta frente a un daño en el tejido cardiaco. A pesar de ello, es muy poco lo que se sabe con respecto al comportamiento de este tipo celular frente al remodelado cardiaco. Además, se tiene un escaso conocimiento acerca de los receptores celulares que presenta este tipo celular, pudiendo ser piezas claves en la regulación de la secreción exacerbada de MEC y por tanto, de la generación de fibrosis del tejido. En la fibrosis cardiaca, adquiere gran importancia la participación del sistema calicreina-cinina. Se ha propuesto que la ausencia de los receptores de cininas es deletérea a nivel del tejido cardiaco, especialmente en la respuesta frente a una injuria. Dentro de este sistema, se encuentran bradicinina (BK) que actúa sobre el receptor B2 de cininas (B2R) y lis-des-Arg-BK (DAKD) que ejercen su acción sobre el receptor B1 (B1R). En FC se ha demostrado que, BK produce liberación de NO y de prostaglandinas, además de reducir la secreción de colágeno. Sin embargo, en MFC se desconocen que subtipos de receptores están presentes, así como las vías transduccionales que se activan tras la estimulación de ambos subtipos de receptores. En la presente tesis y de acuerdo con el contexto, se realizaron diversos experimentos para demostrar la existencia y funcionalidad de los receptores de cininas tanto en FC como en MFC. Por western blot (WB) se evidenció la presencia de ambos receptores tanto en FC como en MFC, no obstante, la expresión de B1R es mayor en MFC que FC; mientras que B2R permanece constante. La expresión de B1R aumentó tras el tratamiento de FC con TGF-β1, principal diferenciador a MFC. Además mediante las técnicas de inmunofluorescencia y ensayos de radioligando, se determinó que en FC el B1R se encuentra localizado principalmente a nivel intracelular, mientras que en MFC se localiza marcadamente en las membranas plasmáticas. Por otro lado, mediante el análisis de los movimientos de calcio intracelular, se demostró que B2R es funcional en ambos tipos celulares, mientras que B1R es funcional en MFC y no así en FC. Sin embargo, en FC la preincubación con el agonista de B1R (DAKD), y la posterior estimulación (30 min) con el mismo agonista, mostró que estos receptores son también funcionales. Mediante inmunofluorescencia se evidenció que tras la preincubación con el agonista existe una relocalización de B1R hacia las membranas plasmáticas, dónde son capaces de generar movimientos de calcio intracelular, demostrando que también son receptores activos. Además, en MFC se demostró que la activación de B1R y B2R por sus respectivos agonistas induce una reducción en la expresión de colágeno I (Col I). En FC, la activación de B2R induce la disminución en los niveles de Col I, mientras que la activación de B1R que provoca la reducción en la expresión de Col I, requiere de un estímulo previo que redistribuya este receptor hacia la membrana plasmática. Finalmente, el uso de distintos inhibidores permitió demostrar que en MFC, tanto la activación de B1R como B2R, conducen a la disminución en la expresión de Col I a través de la activación de una vía transduccional que es compartida por ambos receptores, y que corresponde a: PKC/PLA2/COX-2/PGI2/IPR. En resumen, los resultados de esta tesis sostienen que en MFC la activación de B1R y B2R conduce a la disminución de la expresión de Col I, lo cual se relaciona a los efectos antifibróticos de las cininas en el progreso de patologías como la fibrosis cardiaca / Cardiac fibrosis is generated by an excessive deposit of extracellular matrix proteins (ECM) product of fibroblast (CF) activation. These cells account for about 60 to 70% of the cells in the heart. In response to injury, fibroblasts are activated by various cytokines and growth factors (including TGF-β1, Ang II, etc.), which trigger in them structural and functional changes, differentiating to cardiac myofibroblasts (CMF). The main function of CMF is to secrete ECM proteins to repair the damaged area in the case of a heart attack. Thus CMF play a crucial role in the response to injury in the heart tissue. However, very little is known about the behavior of this cell type versus cardiac remodeling. Furthermore, the knowledge on the receptors present on this cell type is scarce, and they could be key elements in the regulation of the exacerbated secretion of MEC and therefore the generation of tissue fibrosis. In cardiac fibrosis, the participation of the kallikrein-kinin system is very important. It has been proposed that the absence of kinin receptors is deleterious for cardiac tissue, especially in response to an injury. Within this system are bradykinin (BK) which acts on the B2 kinin receptor (B2R) and lis-des-Arg-BK (DAKD) that exerts its action on the B1 receptor (B1R). In CF, it has been shown that BK induces NO release and prostaglandins production, which reduce collagen secretion. However, in CMF it is not known which kinin receptor subtype is present and what signal transduction pathways are activated by these receptors. In this thesis and in accordance with the context, various experiments were conducted to prove the existence and functionality of kinin receptors in both CF and CMF the presence of both receptors in both CF as MFC was observed by Western blot (WB), however, expression of B1R in CMF was greater than in FC, while B2R remained constant. B1R expression increased after treatment of CF with TGF-β1, the main differentiator to CMF. By immunofluorescence techniques and radioligand assays, it was determined that CF B1R was located primarily intracellularly, whereas CMF was markedly located in the plasma membranes. Moreover, by analyzing intracellular calcium movements, B2R was shown to be functional in both cell types, while B1R was functional in CMF, but not in CF. However, when CF were preincubated with the B1R agonist (DAKD) and subsequently stimulated (30 min) with the same agonist, these receptors were also functional. By Immunofluorescence it was shown that after preincubation with the agonist the B1R was relocated to plasma membranes, where they were able to generate intracellular calcium movements, showing they are active receptors. Furthermore, it was demonstrated that B1R and B2R activation in CMF by their respective agonists, induces a reduction in the expression of collagen I (Col I). In contrast in CF, B2R activation induced a decrease in Col I levels, whereas a previous stimulus that redistributes B1R receptor to the plasma membrane is required to induce a reduction in Col I expression after B1R stimulation. Finally, the use of various inhibitors shows that CMF allowed both B1R activation and B2R, leading to a decrease in Col I expression through activation of a signal transduction pathway which is shared by both receptors, and that is mediated by PKC/PLA2/COX-2/PGI2/IPR. In summary, the results of this study argue that B1R and B2R activation in CMF leads to decreased expression of Col I, which is related to antifibrotic effects of kinins in the progress of diseases such as cardiac fibrosis / Conicyt Fondecyt

Doctor en Ciencias Farmacéuticas / Las enfermedades cardiovasculares son, hoy en día, una de las principales causas de muerte. Estas enfermedades generan comúnmente cambios en la estructura del corazón que conlleva a un remodelamiento del tejido generando hipertrofia y fibrosis, lo cual altera la función cardiaca normal y que finalmente se traduce en una insuficiencia cardiaca. La fibrosis cardiaca se genera por un depósito excesivo de proteínas de la matriz extracelular (MEC) producto de la activación de fibroblastos. Estas células, que representan alrededor del 70% del total de las células del corazón humano, frente a una injuria cardiaca, responden a una variedad de citoquinas y factores de crecimiento que promueven su diferenciación a miofibroblastos. Estos a su vez, expresan la proteína α-actina del músculo liso (α-SMA) la que le confiere propiedades contráctiles y durante el proceso de reparación del tejido cardiaco, son los principales responsables de la síntesis de numerosas proteínas de la MEC, las que incluyen colágeno, fibronectina y laminina lo que finalmente se traduce en el cierre de la herida. Asimismo, los miofibroblastos están encargados de liberar citoquinas, factores de crecimiento, como angiotensina II, y en forma adicional, incrementan el número de receptores para estos mismos mediadores. Por otro lado, existen numerosos antecedentes que demuestran que la activación de la vía de transducción del 3’,5’-adenosina monofosfato cíclico (AMPc) podría estar contribuyendo a la reducción de la fibrosis cardiaca, ya que se ha visto que un incremento en los niveles de AMPc en el fibroblasto cardiaco, puede disminuir su función celular así como también inhibir la diferenciación de fibroblasto a miofibroblasto. En este sentido, durante mucho tiempo se ha establecido como regla general que los efectos mediados por el AMPc en las células eucariontes ocurría exclusivamente a través de la activación de la proteína quinasa A (PKA) y que a su vez la PKA mediaba los cambios en la expresión y función de las proteínas. Sin embargo, el descubrimiento de otra proteína llamada EPAC (del acrónimo exchange protein activated directly by cAMP), que regula la actividad de las proteínas G pequeñas Rap 1 y Rap 2, y que también es activada por el AMPc, comenzó a cambiar el campo de investigación relacionado con el estudio de la vía de transducción de este segundo mensajero. A pesar de que los fibroblastos cardiacos expresan EPAC-1, poco se conoce acerca de los mecanismos que regulan la expresión de las isoformas de EPAC en los fibroblastos y miofibroblastos, y de que factores (péptidos, citoquinas, hormonas, entre otros) son los que están involucrados en la regulación de la misma. Estudios han demostrado que los niveles de expresión de EPAC-1 se encuentran aumentados en ratones con hipertrofia cardiaca y que la vía AMPc-EPAC1-Rap1 se encuentra activa bajo estas circunstancias. Estos antecedentes estarían dando cuenta de que EPAC-1 podría estar participando de forma activa en procesos asociados al remodelamiento cardiaco. Paralelamente, se ha observado que el factor de crecimiento transformante β1 (TGF-β1), citoquina estrechamente relacionada con el proceso de fibrosis cardiaca, promueve la disminución de la expresión de EPAC-1 en el fibroblasto cardiaco de rata adulta. Sin embargo, se desconoce el mecanismo por el cual TGF-β1 regula la expresión de EPAC-1 tanto en el fibroblasto como en los miofibroblastos cardiacos. Desde el punto de vista de la funcionalidad de EPAC-1, existen algunos estudios que demuestran la participación de esta proteína en algunos procesos celulares asociados al remodelamiento cardiaco, tales como la migración de fibroblastos y secreción de colágeno, pero se desconoce totalmente su participación en los mecanismos asociados a adhesión y contracción de geles de colágeno, procesos celulares importantes en el remodelamiento del miocardio, en donde participan activamente tanto fibroblastos como miofibroblastos. Bajo este contexto, en la presente tesis, se estudió en una primera instancia cómo el TGF-β1 era capaz de regular los niveles de EPAC-1 tanto en fibroblastos como en miofibroblastos de rata neonata. Para ello se realizaron estudios mediante westernblot con el fin de determinar los niveles basales de EPAC-1 en nuestro modelo de estudio, para luego estudiar la influencia del TGF- β1 sobre estos niveles a través de la intervención de sus vías de señalización canónica (Smad2/3) y no canónica (MAPK y Akt). Los resultados obtenidos dieron cuenta de que los miofibroblastos poseían mayores niveles de EPAC-1 comparado a los fibroblastos y que en la regulación de EPAC- 1 en fibroblastos cardiacos participaron proteínas tales como Smad-2 y JNK, mientras que en el miofibroblasto ambas vías de señalización, canónica y no canónica, participaron de la regulación de los niveles de EPAC-1. Posteriormente y con el fin de dilucidar el rol que juega este factor intercambiador de nucleótidos de guanina sobre las funciones de fibroblastos y miofibroblastos, se evaluó la capacidad de EPAC-1 de fosforilar a su efector río abajo Rap-1, utilizando para ello un análogo del AMPc con capacidad de activar selectivamente a EPAC-1. Los resultados demostraron que en ambos fenotipos celulares EPAC-1 fue capaz de activar a su efector río abajo Rap-1, y más aún, que en los miofibroblastos está activación era mucho mayor en comparación a sus precursores los fibroblastos. Finalmente y con el objetivo de dilucidar la participación de EPAC-1 en procesos asociados al remodelamiento cardiaco tales como adhesión, migración, contracción de geles de colágeno y expresión de colágeno; se llevaron a cabo una serie de experimentos destinados a evaluar los procesos antes mencionados en nuestro modelo de estudio. Para ello se utilizaron herramientas mediante las cuales fue posible dilucidar los efectos mediados principalmente por EPAC-1 y a la vez los efectos mediados por PKA, ya que al ser ambas proteínas efectoras del AMPc, era importante poder establecer la contribución real de cada una de ellas a los procesos antes señalados. Los resultados obtenidos sugieren que EPAC-1 participaría aumentando la adhesión de fibroblastos y miofibroblastos a fibronectina, promoviendo la migración de fibroblastos, aumentando la contracción de geles de colágeno tanto en fibroblastos como en miofibroblastos y disminuyendo los niveles de colágeno en ambos fenotipos celulares. Estos resultados se complementan con los obtenidos en relación a la PKA, en donde se logró dilucidar que esta proteína estaría participando en los procesos de contracción de geles de colágeno y expresión de colágeno. PKA al parecer aumentaría la contracción de geles de colágeno en miofibroblastos y además, sería capaz de disminuir la expresión de colágeno tanto en fibroblastos como en miofibroblastos. En resumen, los resultados de la presente tesis sugieren por un lado que, el TGF- β1 regularía diferencialmente los niveles de EPAC-1 en fibroblastos y miofibroblastos cardiacos y por otro lado, que EPAC-1 estaría regulando importantes funciones asociadas al remodelamiento cardiaco tales como adhesión, migración, contracción de geles de colágeno y expresión de colágeno en ambos fenotipos celulares. / Throughout the last decades cardiovascular diseases has become one of the most important causes of death. These diseases commonly generate changes in the structure of the heart which leads to tissue remodeling and fibrosis, which alters the normal cardiac function and eventually resulting in cardiac failure. Cardiac fibrosis is generated by excessive deposition of extracellular matrix proteins (ECM) produced by the activation of fibroblasts. These cells represent about 70% of total human heart cells and following a cardiac injury, they respond to a wide range of cytokines and growth factors promoting their differentiation into myofibroblasts. These myofibroblasts express the protein α-smooth muscle actin (α-SMA) synonymous with increased contractile force. Enhanced contractility that attends this protein’s expression is believed to be important in allowing these cells to contract during the wound healing in the damaged heart. Myofibroblasts are the primary mediators responsible for synthesis of many ECM proteins, including collagen, fibronectin and laminin, among others. During transition of fibroblast into myofibroblasts they acquire the capability to be avid producers of cytokines and growth factors, and in addition, increase the receptor number for the same mediators. A growing body of literature over the last years has made evident that activation of the transduction pathway of 3', 5'-cyclic adenosine monophosphate (cAMP) may be contributing to the reduction of cardiac fibrosis. It has been demonstrated that an increase in cAMP levels in cardiac fibroblasts can reduce their cellular function as well as inhibit fibroblast differentiation into myofibroblasts. In this regard, it has become generally accepted, that the effects mediated by cAMP in eukaryotic cells occurred only by activation of protein kinase A (PKA) which once activated was able to mediate expression and protein function. However, the discovery of another protein, called EPAC (exchange protein activated directly by cAMP), which regulates the activity of small G proteins Rap 1 and 2, has begun to innovate the research field of the cAMP transduction pathway. It is known that cardiac fibroblast express EPAC-1, however little is known about the mechanism regulating the expression of this protein in fibroblast and myofibroblasts. In this regard, studies in this area have demonstrated that levels of EPAC-1 expression were increased in mice with cardiac hypertrophy and cAMP pathway EPAC1-Rap1 was very active. These results support the idea that EPAC-1 could be actively involved in processes associated with cardiac remodeling. In parallel, it has been observed that the transforming growth factor β1 (TGF-β1), cytokine closely related to the process of cardiac fibrosis, promotes the decrease of EPAC-1 expression in cardiac fibroblasts. However, the mechanism by which TGF-β1 regulates fibroblasts and myofibroblasts EPAC-1 expression still remains unclear. There are few studies demonstrating the involvement of EPAC-1 in cellular processes associated with cardiac remodeling. There are some investigations related to fibroblast migration and collagen secretion, nevertheless EPAC-1 participation in processes associated to cardiac remodeling such as cellular adhesion and those related to capability to contract collagen gels matrix are completely unknown. In this context, we studied EPAC-1 levels and the effect caused by TGF-β1 on EPAC-1 expression in both cardiac fibroblasts and myofibroblasts through the intervention of TGF-β1 canonical (Smad) and no canonical (MAPK and Akt) signaling pathways. The data obtained showed that cardiac myofibroblasts have greater amounts of EPAC-1 than cardiac fibroblasts. In the presence of chemical inhibitors the results showed that fibroblast EPAC-1 expression is regulated by JNK-MAPK and Smad2 protein, and the myofibroblast EPAC-1 expression is regulated by both signaling pathways (Smad, MAPKs and Akt). Subsequently, in order to determine the EPAC-1 capability to activate its downstream effector Rap1, we stimulated this protein using a cAMP analog able to specifically activate EPAC-1. The results showed that EPAC-1 was able to phosphorylate its downstream effector Rap-1 in both fibroblast and myofibroblasts, however myofibroblasts demonstrated to have higher levels of Rap1-GTP compared to cardiac fibroblasts. Finally and in order to elucidate the EPAC-1 involvement in cardiac remodeling, we performed a series of experiments designed to evaluate cellular adhesion, migration, collagen gel contraction and collagen expression. To evaluate these functions we used selective molecules ables to recognize specifically both EPAC-1 and PKA. The results suggest that EPA-1 increases fibroblast and myofibroblast fibronectin adhesion, promotes fibroblasts migration, enhances collagen gel contraction in both fibroblast and myofibroblast and decrease collagen levels measured by western blot. On the other hand, the results obtained using a PKA agonist suggest that this protein apparently increases myofibroblasts collagen gel contraction and reduces collagen expression measured by western blot in both fibroblast and myofibroblasts. In summary, the results obtained in this thesis suggest TGF-β1 participation in regulating differentially EPAC-1 levels in cardiac fibroblasts and myofibroblasts and EPAC-1 participation in cellular processes related to adhesion, migration, collagen gel contraction and collagen expression; all of them important cellular processes involved in cardiac remodeling in both fibroblast and myofibroblasts. / Fondecyt

Tesis Magíster en Bioquímica, área de especialización en Bioquímica Clínica Aplicada, y Memoria para optar al Título de Bioquímico / El cáncer ovárico epitelial (COE) es la primera causa de muerte por neoplasias ginecológicas en países desarrollados como Canadá, EE.UU e Israel. Específicamente en Chile, es la segunda causa de muerte por neoplasias ginecológicas. Este cáncer se caracteriza por ser de diagnóstico tardío, debido a su sintomatología inespecífica, y poseer una pobre respuesta al tratamiento. Debido a lo anterior, es importante entender los mecanismos tanto de la génesis como del desarrollo de esta neoplasia. Actualmente, hay mucha literatura sobre los factores de crecimiento que están involucrado en la progresión del COE, así como también de aquellos factores de crecimiento que juegan un rol crítico en la carcinogénesis ovárica. En COE se sabe que la vía de señalización de TGF-β1 se encuentra alterada de modo que esta vía podría estar involucrada en la progresión de esta patología. Por otro lado, NGF y su receptor TRKA participan en la progresión del cáncer ovárico debido a su rol en la proliferación celular y angiogénesis. Estudios en nuestro laboratorio han reportado que a medida que progresa el cáncer ovárico epitelial, hay un aumento en los niveles de VEGF, NGF, receptor TRKA y su forma activa (p-TRKA). En otras patologías, se ha demostrado que TGF-β1 es capaz de aumentar los niveles de la ciclooxigenasa-2 (COX-2), así como también que NGF puede inducir esta enzima en ovario bovino. COX-2 juega un papel importante en muchos tipos de cáncer y es clave en la síntesis de prostaglandinas a partir de ácido araquidónico, siendo la PGE2 la más común y ubicuamente producida. Se ha reportado que esta prostaglandina es capaz de inducir la expresión de VEGF y, por ende, promover la angiogénesis tumoral. Hipótesis: En cáncer ovárico epitelial, hay un aumento en los niveles de COX-2, y los factores de crecimiento NGF y TGF-β1, en forma independiente, aumentan los niveles de COX-2 y PGE2, induciendo un incremento en los niveles de VEGF en líneas celulares de cáncer de ovario. Objetivos: Evaluar si la presencia y el cambio en los niveles de COX-2 se relacionan con la progresión del COE; además, determinar si TGF-β1 o NGF aumentan los niveles de COX-2 y la producción de PGE2, y si este último induce un aumento en los niveles de VEGF en las líneas celulares de epitelio de la superficie ovárica humana (HOSE) y de cancer ovárico epitelial humano (A2780). Metodología: En los experimentos ex vivo se evaluaron los niveles de COX-2 en 36 muestras de tejido ovárico (6 OVI; 6 TBE; 6 TBO; 6 COE I; 6 COE II y 6 COE III) mediante inmunohistoquímica, western blot y RT-PCR. En relación a los experimentos in vitro, ambas líneas celulares se estimularon con TGF-β1 o NGF para determinar los niveles de COX-2, tanto por RT-PCR como western blot, y los los niveles secretados de PGE2 y VEGF en los medios de cultivo por inmunoanálisis. Resultados: La inmunotinción de COX-2 en las muestras de tejido ovárico muestra un aumento en los niveles proteicos de esta enzima a medida que progresa el cáncer ovárico epitelial. Acorde a lo anterior, mediante western blot y RT-PCR se aprecian mayores niveles de COX-2 en las muestras de tejido de cáncer ovárico en comparación con las muestras de ovario inactivo. En las líneas celulares de ovario, sólo la línea celular cancerígena A2780 respondió ante los tratamientos con NGF o TGF-β1 durante 2 horas, observando un aumento en los niveles del transcrito y proteína de COX-2 y de PGE2. Finalmente, al utilizar un inhibidor de COX-2 no se aprecia una disminución en los niveles de secreción de VEGF, por efecto de los tratamientos con NGF o TGF-β1. Estos resultados sugieren que el incremento en los niveles de VEGF por NGF, demostrado y publicado por nuestro grupo de laboratorio, puede ser sin la participación de PGE2. Proyecciones: Desde el punto de vista clínico, sería interesante evaluar qué procesos tales como proliferación, migración o invasión celular está modulando COX-2 y PGE2, por efecto de NGF o TGF-β1 en las células A2780. Adicionalmente, sería importante determinar a través de qué vía de señalización esta prostaglandina está mediando tales procesos, puesto que sería crucial tener una visión mucho más acabada de los mecanismos involucrados en esta patología. Considerando lo anterior, se podrían plantear nuevos blancos terapéuticos que permitan mejorar la sobrevida de las pacientes que padecen de este tipo de cáncer / Epithelial ovarian cancer (EOC) is the leading cause of death from gynecological malignancies in developed countries like Canada, USA and Israel. Specifically in Chile, is the second leading cause of death from gynecological malignancies. This cancer is characterized by being diagnosed in advanced stages, due to its nonspecific symptoms, and have a poor response to therapy. Because of this, it is important to understand the mechanisms of both the genesis and development of this pathology. Currently, there are many information regarding the effect of growth factors involved in EOC progression as well as those growth factors that play a critical role in ovarian carcinogenesis. It is known that in EOC the signaling pathway of TGF-β is altered then could be involved in the progression of this disease. On the other hand, NGF and TRKA receptor are involved in ovarian cancer progression due to its role in cellular proliferation and angiogenesis. Studies in our laboratory have reported that during epithelial ovarian cancer progression, there is an increase in VEGF, NGF, TRKA and p-TRKA levels. In other pathologies, it has been demonstrated that TGF-β1 is able to increase cyclooxygenase-2 (COX-2) levels and that NGF can also induce this enzyme in bovine ovary. COX-2 plays an important role in many cancers and is essential in prostaglandin synthesis from arachidonic acid, where PGE2 is the most common and ubiquitously produced. It has been reported that this prostaglandin induces VEGF expression and thus promote tumor angiogenesis. Hypothesis: In epithelial ovarian cancer, there is an increase of COX-2 levels, and the growth factors NGF and TGF-β1, independently, increase COX-2 and PGE2 levels, inducing an increase in VEGF levels in ovarian cancer cell lines. Objectives: To evaluate whether the presence and change in COX-2 levels are associated with EOC progression; also to determine whether TGF-β1 or NGF increase COX-2 and PGE2 synthesis, and if the latter induces an increase in VEGF levels in human ovarian surface epithelium (HOSE) and human epithelial ovarian cancer (A2780) cell lines. Methods: In ex vivo experiments COX-2 levels were evaluated in 36 ovarian tissue samples (6 OVI; TBE 6; 6 TBO; 6 COE I; 6 COE II and 6 COE III) by immunohistochemistry, western blot and RT-PCR. In relation to in vitro experiments, both cell lines were stimulated with TGF-β1 or NGF to determine COX-2 levels by RT-PCR and western blot, and PGE2 and VEGF levels secreted into the culture medium by immunoassay. Results: Immunohistochemical detection of COX-2 in ovarian tissue samples shows an increase in protein levels of this enzyme with the progression of epithelial ovarian cancer. According to the above, by RT-PCR and western blot, higher COX-2 levels are observed in ovarian cancer compared to inactive ovary tissue samples. In ovarian cell lines, only A2780 cancer cell line responded to the treatment with NGF or TGF-β1 for 2 hours, observing an increase in transcript and protein COX-2 and PGE2 levels. Finally, when a COX-2 inhibitor is used, there is no decrease in VEGF secretion levels, by NGF or TGF-β1 effect. This results suggest that the increase of VEGF by NGF found and published by our group may be without the participation of PGE2. Projections: From the clinical standpoint, it would be interesting to evaluate what processes such as proliferation, migration or invasion is modulating COX-2 and PGE2, by effect of NGF or TGF-β1 in A2780 cells. Additionally, it would be important to determine what signaling pathway is mediating such processes, since it would be important to have a better understanding of the mechanisms involved in this pathology. Considering the above, it could propose new therapeutic targets to improve the survival of patients suffering this cancer / Fondecyt

Tesis presentada para optar al grado de Doctora en Bioquímica / El cáncer ovárico epitelial (COE) representa el 90% de los cánceres de ovario. Esta enfermedad presenta un transcurso silencioso y por lo tanto una detección tardía; es altamente angiogénico y tiene una pobre respuesta a la terapia con una baja sobrevida. Existen varias hipótesis sobre la etiología del COE, una de ellas postula que los andrógenos estimulan la proliferación de células epiteliales del ovario dentro de los quiste de inclusión y también del epitelio transformado. Con el fin de dilucidar el mecanismo molecular por el cual los andrógenos contribuyen al desarrollo del carcinoma ovárico, se realizaron estudios relacionando los andrógenos con vías de señalización de moléculas como el factor de crecimiento transformante beta 1 (TGF-β1), el cual es un inhibidor de la proliferación celular. Además, existen reportes sobre el efecto de los andrógenos sobre factores pro-angiogénicos como NGF y VEGF. Estos antecedentes, sugieren que los andrógenos podrían estar participando de la génesis del cáncer y podrían ser responsables de cambios importantes en los niveles de expresión de moléculas como TGF-β1, NGF y VEGF. Por este motivo, se planteó la siguiente hipótesis; el andrógeno dihidrotestosterona (DHT) inhibe el efecto antiproliferativo de TGF-β1 e induce la expresión de factores angiogénicos, favoreciendo la proliferación celular y la angiogénesis en células de cáncer ovárico epitelial. El objetivo de este estudio fue evaluar la participación de DHT en la vía de señalización de TGF-β1 y en la expresión de factores angiogénicos en células de cáncer de ovárico epitelial. Para abordar este objetivo, la metodología fue diseñada en dos partes: 1.- experimentos ex-vivo, para lo cual se trabajó con muestras de ovario normal inactivo (OI) y cáncer ovárico epitelial pobremente diferenciado (COE) en donde se evaluó por IHQ los niveles de AR y de los receptores I y II (TGFBR1 y TGFBR2) de TGF-β1 por IHQ y W-B. 2.- experimentos in-vitro con dos líneas celulares, HOSE (células epiteliales de la superficie ovárica) y A2780 (células de cáncer ovárico epitelial), las cuales fueron estimuladas con 0, 10 y 100 nM de DHT, por 48 y 72 h para evaluar las mismas proteínas que se evaluaron en tejidos por las técnicas de ICQ y W-B. Además, se realizaron experimentos con siRNA del receptor de andrógenospara confirmar la acción de los andrógenos en cáncer ovárico epitelial. Adicionalmente, se evaluó el ciclo celular por citometría de flujo, así como también, se evaluó los niveles de p21 por WB Resultados de nuestro trabajo, indicarían un aumento de los niveles del AR y una disminución de los receptores I y II (TGFBR1 y TGFBR2) de TGF-β1 en COE versus OI. Estos resultados concuerdan con los obtenidos en las líneas celulares, donde también encontramos un aumento de los AR y una disminución de estas proteínas (TGFBR1 y TGFBR2) en la línea celular de cáncer ovárico epitelial A2780 versus la línea celular de epitelio normal de la superficie ovárica HOSE. Por otra parte, cuando estimulamos las células A2780 con DHT, observamos que los niveles de mRNA de TGF-β1 no fueron modificados por este andrógeno, sin embargo, los niveles de los receptores I y II de TGF-β1 disminuyeron significativamente (*p<0,05) a las 72 h con 100 nM de DHT. Estos resultados sugieren que el AR y TGF-β1 podrían participar en la regulación de la homeostasis tisular en el COE. Además, la disminución en los niveles de los receptores de TGF-β1 por efecto de DHT, sugiere que los andrógenos alterarían la vía de señalización de TGF-β1, lo que podría explicar el aumento en la proliferación celular de esta patología. El estudio del ciclo celular indicó que hay un aumento del porcentaje de células en fase S en las líneas celulares A2780, sin embargo, no se logró relacionar el efecto de DHT y TGF- β1 en la proliferación, probablemente por la cantidad de factores que están involucrados en este proceso. Por otra parte, se analizaron los niveles proteicos de p21 y se encontró que el tratamiento con DHT provocó una disminución en los niveles de p21, lo que podría relacionarse con una falla en la regulación del ciclo celular en células A2780, sin embargo, este efecto no se observó en las células HOSE. Finalmente, se analizó el efecto de DHT sobre los niveles de expresión de NGF y VEGF sin encontrar cambios en los niveles de mRNA y proteína de NGF en ninguna de las líneas celulares en estudio. Por otro lado cuando se analizó la secreción de VEGF, se observó una mayor secreción de este factor en células A2780 tratadas con DHT en comparación con las células HOSE en las mismas condiciones. En conclusión, los resultados obtenidos en tejido de COE y en la línea celular A2780 sugieren que la vía de señalización canónica de TGF-β estaría alterada en COE, donde los andrógenos podrían desempeñar un papel importante regulando negativamente la expresión de sus receptores (TGFBR1) lo que significaría que DHT al bloquear la vía de señalización canónica de TGF-β podría estar involucrado en la disminución de los niveles de p21. También es importante destacar que DHT tendría una participación importante en el proceso de angiogénesis, aumentando los niveles de VEGF, según lo encontrado en este trabajo. Estas fallas, entre otras, podrían contribuir a la progresión del cáncer de ovárico epitelial, siendo interesante dilucidar los mecanismos implicados en futuros estudios para contribuir con nuevas y efectivas terapias anti-carcinogénicas / Epithelial ovarian cancer (EOC) represents 90% of ovarian cancers. This disease has a silent course, a late detection. It is highly angiogenic and has a poor response to therapy, therefore a low survival. There are several hypotheses about the etiology of the EOC, one of them postulates that androgens stimulate the proliferation of epithelial cells within the ovary inclusion cyst and epithelium transformed. To elucidate the molecular mechanism by which androgens contribute to the development of ovarian cancer, studies were related the androgen with signaling pathway, such as transforming growth factor beta 1 (TGF-β1), which is a cell proliferation inhibitor. In addition, there are reports on the effect of androgens on pro-angiogenic factors such as VEGF and NGF. These facts suggest that androgens could be involved in the genesis of cancer and could be responsible for significant changes in expression levels of molecules such as TGF-β1, NGF and VEGF. For these reasons, the following hypothesis is raised; the androgen dihydrotestosterone (DHT) inhibits the antiproliferative effect of TGF-β1 and induces the expression of angiogenic factors promoting cell proliferation and angiogenesis in epithelial ovarian cancer cells. The objective of this study was to evaluate the participation of DHT in the signaling pathway of TGF-β1 and expression of angiogenic factors in cells of epithelial ovarian cancer. To address this goal, the methodology was designed in two parts: 1. ex-vivo experiments with samples of inactive normal ovary (IO) and poorly differentiated epithelial ovarian cancer (EOC) and 2. Experiments in vitro with two cell lines, HOSE (ovarian epithelial cell surface) and A2780 (epithelial ovarian cancer cells), which were stimulated with 0, 10 and 100 nM DHT for 48 and/or 72 h. To answer each of the objectives, conventional RTPCR, qPCR, blot, immunocytochemistry, immunohistochemistry and western were used. The results indicate an increase of AR levels and a decreased of TGF-β1 receptors I and II (TGFBR2 and TGFBR1) in EOC versus IO. These results are in agreement with those obtained in cell lines, where we also found an increase in AR and a decrease in TGF-β1 receptors (TGFBR1 and TGFBR2) in epithelial ovarian cancer cells A2780 versus HOSE cells. Moreover, when stimulate A2780 cells with DHT, the mRNA levels of TGF-β1 were not modified by this androgen, however, the levels of TGF-β1 receptors I and II decreased significantly (* p <0.05) at 72 h with 100 nM DHT. These results suggest that AR and TGF-β1 may be involved in regulating tissue homeostasis in the EOC. Furthermore, decreased levels of TGF-β1 receptors and the effect of DHT in TGF-β1 canonical sinaling pathway, suggests that androgen could increase cell proliferation in this pathology. The cell cycle studies indicated that there is an increase in the percentage of cells in S phase in the cell lines A2780, however, failed to relate the effect of DHT and TGF-β1 in proliferation, probably because the number of factors are involved in this process. Moreover, the protein levels of p21 were analyzed and was found that the DHT treatment caused a decrease in p21 levels, which could be related to a failure in cell cycle regulation in A2780 cells, this effect was not observed in the HOSE cells. Finally, the effect of DHT on NGF and VEGF expression levels was analyzed. No changes were observed in mRNA levels or of NGF protein levels in both cells lines studied. Furthermore when VEGF protein levels were analyzed, it was found that the secretion of this factor was greater in A2780 cells treated with DHT compared to HOSE cells under the same conditions. In conclusion, these results of tissue and cell line A2780 suggest that the TGF-β canonical signaling pathway would be altered in EOC where androgens may play a role downregulating expression of its receptors (TGFBR1) and this could potentially be involved in the reduction of p21 levels. Is also important highlight as found in this investigation, androgens have an important role in the angiogenesis process, increasing the levels of VEGF. These failures, among others, could contribute to the progression of epithelial ovarian cancer, it is interesting to elucidate the mechanisms involved in future studies to contribute with new and effective anti-carcinogenic therapies / Fondecyt; Fondap

Memoria para optar el título de Bioquímico / TGF-β1 es uso de los miembros de la superfamilia de TGF-β, capaz de activar vías de señalización dentro de la célula que modulan la expresión de diversos genes. Entre estas vías encontramos a los complejos Smad2, Smad3 y ERK1, 2. La modulación y/o regulación de estas vías activadas por TGF-β1 es de vital importancia, puesto que se piensa que esta regulación podría servir como blanco farmacológica contra el desarrollo de tumores. En nuestro laboratorio nos hemos enfocado en buscar proteínas o factores capaces de regular la activación de las vías del factor de crecimiento. Basado en la evidencia de la presencia de la proteína QM en ciertos tipos de tumores y la capacidad de ésta de interaccionar con factores transcripcionales, hemos propuesto que QM tiene la capacidad de regular a los factores Smad2,Smad3 y ERK1,2 activados por TGF-β1. Nuestros resultados indicaron que QM es capaz de modular las tres vías estudiadas en respuesta a un estímulo con TGF-β1 en células COS-7, PDV y CarC, sin embargo esta modulación fue diferente en los tres tipos celulares. Se observó que al sobre-expresar QM en células COS-7 que representan un estadio normal, las vías de Smad2 y ERK1,2 aumentan su actividad. La actividad de la vía Smad3 en células COS-7 se ve potenciada en respuesta a un estímulo con TGF-β1 en conjunto con la sobre-expresión de QM. En (el caso de) células humanas PC3 que representan un estado muy tumorogénico se observó que al sobre-expresar QM, la actividad de la vía Smad2 se ve disminuida al comparar el efecto que se observa al estimular con TGF-β1. Se obtuvo un efecto similar cuando determinamos la trans-activación del sistema Smad2-Gal4 y junto con los resultados obtenidos por western blot notamos una caída en los niveles de proteína fosforilada. Por el contrario, la actividad de la vía Smad3 se ve aumentada cuando estimulamos con TGF-β1 y sobre-expresamos QM. El efecto sobre la trans-activacion del sistema Smad3-Gal4 en conjunto con los niveles de p-Smad3 determinados por western blot muestran un aumento de la fosforilación de la proteína, lo que indicaría la mayor actividad de la vía. La actividad de la vía ERK1,2 se ve fuertemente estimulada por la presencia de QM. La trans-activación del sistema Elk1-Gal4 sugiere que la presencia de QM colabora con la fosforilación del factor Elk1 lo que indicaría la mayor actividad de la vía ERK1,2. En (el caso de las) células de ratón PDV, al sobre-expresar QM se observó que aumenta la actividad de las vías Smad2 y Smad3. Además la presencia de QM potenciaría el efecto de TGF-β1. Al determinar el efecto de QM sobre la trans-activación del sistema Smad2-Gal4 y Smad3-Gal4 esta aumento. Además los resultados obtenidos por western blot para p-Smad2 y pSmad3, muestran un aumento en los niveles de p-Smad2 y p-Smad3 cuando sobre-expresamos QM. El efecto contrario se observó cuando inhibimos la expresión de QM con siRNA. Estos resultados sugieren que QM tendría un efecto sobre la fosforilación de Smad2 y Smad3, lo que explicaría la mayor actividad de estas vías. Al sobre-expresar QM en células PDV observamos también un gran aumento de la actividad de la vía ERK1,2. La trans-activación del sistema Elk1-Gal4 aumentó al sobre-expresar QM, sugiriendo que QM tendría un efecto sobre la fosforilación de ERK, lo que explica el aumento de la actividad de la vía. Al suprimir QM en células PDV y analizar el efecto sobre la expresión de u-PA y MMP9, se observó que u-PA decae y también disminuye MMP9, aunque en menor medida. Nuestros datos también indicaron que QM tendría implicancias sobre la migración celular en células PDV. Los resultados obtenidos en nuestro trabajo permiten concluir que QM activa las vías de señalización de TGF-β1 involucradas en procesos tumorales, además de alterar la expresión de u-PA y MMP9 y favorecer la migración en células transformadas. En su conjunto, estos datos sugieren que la posibilidad de modular la expresión de QM en células tumorales aparece como una posible herramienta terapéutica para el tratamiento del cáncer en humanos