Memoria para optar al título de Químico Farmacéutico / Los fibroblastos cardiacos son las principales células no contráctiles presentes en el miocardio. Su función principal es preservar la estructura y el buen funcionamiento cardiaco, lo cual se realiza a través de la síntesis y secreción de componentes de la matriz extracelular. Después de un daño tisular, los fibroblastos cardiacos son células claves, del proceso reparativo y de cicatrización. Si este proceso se exacerba, se llega a fibrosis cardiaca rigidizando el corazón e incrementando el riesgo de arritmias, alterando fuertemente la función cardiaca. En este sentido, se ha demostrado que el aumento de AMPc, contribuye a disminuir el grado de fibrosis cardíaca, por regulación de procesos tales como adhesión, migración, secreción de colágeno y la diferenciación celular. En fibroblastos cardiacos se ha descrito que isoproterenol, un agonista de los receptores β-adrenérgicos, actúa vía Gs y estimula la producción de AMPc. Por otro lado, BK agonista del receptor B2 de cininas, activa su receptor vía Gq, y por sí mismo, no altera la producción de AMPc. Sin embargo, BK en combinación con isoproterenol potencia la respuesta adrenérgica aumentando de manera sinérgica la producción de AMPc en relación a la activación solo por isoproterenol. El objetivo de este trabajo fue estudiar in vitro, en cultivos primaros de fibroblastos cardiacos de ratas neonatas, el cross-talk entre las vías de señalización Gs-Gq y determinar si el aumento en los niveles de AMPc modula la adhesión, migración, síntesis de colágeno y diferenciación en fibroblastos cardiacos. BK tiene un efecto sinérgico en los niveles de AMPc aumentados por isoproterenol. Del mismo modo, BK potencia la adhesión de fibroblastos cardiacos estimulada por Isoproterenol; sin embargo, BK no tiene efectos sobre la migración en los fibroblastos cardiacos inducida por isoproterenol. Por otro lado, BK e isoproterenol por separado disminuyen la síntesis de colágeno; sin embargo, la administración conjunta de ISO+BK induce una mayor disminución de la síntesis. El efecto sinérgico de BK sobre el aumento de AMPc inducido por ISO potencia la inhibición de la diferenciación celular de fibroblasto a miofibroblasto estimulada por TGF-β1. Finalmente, determinamos que el efecto sinérgico de BK sobre la señalización de ISO es gatillada vía Gq-PLC-CaMK-II, conduciendo al aumento sinérgico en la producción de AMPc / Cardiac fibroblasts are the major non-contractile cells present in the myocardium. Its main function is to preserve the structure and the proper functioning of the heart, which is done through the synthesis and secretion of extracellular matrix components. After tissue injury, cardiac fibroblasts are key cells of the reparative process and healing. If this process is exacerbated cardiac fibrosis is reached, stiffening the heart and increasing the risk of arrhythmia, altering strongly the heart function In this regard, it has been shown that the increase of cAMP, helps to reduce the degree of cardiac fibrosis, by regulating processes such as adhesion, migration, collagen secretion and cell differentiation. In cardiac fibroblasts has been reported that isoproterenol, an agonist of β-adrenergic receptors, acts via Gs and stimulates the production of cAMP. On the other hand, BK an agonist of B2 kinin receptor, activates its receptor Gq, and by itself does not alter cAMP production. However, in combination with isoproterenol enhances the adrenergic response, increasing the levels of cAMP in a synergistic manner, in relation to activation by isoproterenol alone. The aim of this work was to study in vitro, in cultured of neonatal rat cardiac fibroblasts, the cross-talk between signaling pathways Gs-Gq and determine if the increase in cAMP modulates adhesion, migration, collagen secretion and differentiation in cardiac fibroblasts. BK has a synergistic effect on cAMP levels increased by isoproterenol. Similarly, BK enhances the adhesion of cardiac fibroblasts stimulated by isoproterenol, but BK has no effect on migration in cardiac fibroblasts induced by isoproterenol. Furthermore, BK and isoproterenol separately decrease collagen synthesis, but the co-administration of ISO+ BK induces a greater decrease in the synthesis. The synergistic effect of BK in the cAMP levels induced by ISO, showed inhibit the cellular differentiation of fibroblasts into myofibroblasts stimulated by TGF-β1 Finally, we determined that the synergistic effect of BK on ISO signaling is triggered via Gq-PLC-CaMK-II, leading to the synergistic increase in cAMP production

Tesis presentada a la Universidad de Chile para optar al grado de Doctora en Farmacología / La fibrosis cardiaca se genera por un depósito exagerado de proteínas de matriz extracelular (MEC) producto de la activación de los fibroblastos (FC). Estas células, representan cerca de un 60 a 70% de las células del corazón, y en respuesta a un daño, son activadas por diversas citoquinas y factores de crecimiento (entre ellas, TGF-β1, Ang II, etc.), los que desencadenan en ellas un cambio estructural y funcional que las diferencia a miofibroblastos cardiacos (MFC). Los MFC tienen como principal función la de secretar proteínas de la MEC con el fin de contraer y reparar la zona dañada en el caso de un infarto al corazón. Así, el MFC juega un papel crucial en la respuesta frente a un daño en el tejido cardiaco. A pesar de ello, es muy poco lo que se sabe con respecto al comportamiento de este tipo celular frente al remodelado cardiaco. Además, se tiene un escaso conocimiento acerca de los receptores celulares que presenta este tipo celular, pudiendo ser piezas claves en la regulación de la secreción exacerbada de MEC y por tanto, de la generación de fibrosis del tejido. En la fibrosis cardiaca, adquiere gran importancia la participación del sistema calicreina-cinina. Se ha propuesto que la ausencia de los receptores de cininas es deletérea a nivel del tejido cardiaco, especialmente en la respuesta frente a una injuria. Dentro de este sistema, se encuentran bradicinina (BK) que actúa sobre el receptor B2 de cininas (B2R) y lis-des-Arg-BK (DAKD) que ejercen su acción sobre el receptor B1 (B1R). En FC se ha demostrado que, BK produce liberación de NO y de prostaglandinas, además de reducir la secreción de colágeno. Sin embargo, en MFC se desconocen que subtipos de receptores están presentes, así como las vías transduccionales que se activan tras la estimulación de ambos subtipos de receptores. En la presente tesis y de acuerdo con el contexto, se realizaron diversos experimentos para demostrar la existencia y funcionalidad de los receptores de cininas tanto en FC como en MFC. Por western blot (WB) se evidenció la presencia de ambos receptores tanto en FC como en MFC, no obstante, la expresión de B1R es mayor en MFC que FC; mientras que B2R permanece constante. La expresión de B1R aumentó tras el tratamiento de FC con TGF-β1, principal diferenciador a MFC. Además mediante las técnicas de inmunofluorescencia y ensayos de radioligando, se determinó que en FC el B1R se encuentra localizado principalmente a nivel intracelular, mientras que en MFC se localiza marcadamente en las membranas plasmáticas. Por otro lado, mediante el análisis de los movimientos de calcio intracelular, se demostró que B2R es funcional en ambos tipos celulares, mientras que B1R es funcional en MFC y no así en FC. Sin embargo, en FC la preincubación con el agonista de B1R (DAKD), y la posterior estimulación (30 min) con el mismo agonista, mostró que estos receptores son también funcionales. Mediante inmunofluorescencia se evidenció que tras la preincubación con el agonista existe una relocalización de B1R hacia las membranas plasmáticas, dónde son capaces de generar movimientos de calcio intracelular, demostrando que también son receptores activos. Además, en MFC se demostró que la activación de B1R y B2R por sus respectivos agonistas induce una reducción en la expresión de colágeno I (Col I). En FC, la activación de B2R induce la disminución en los niveles de Col I, mientras que la activación de B1R que provoca la reducción en la expresión de Col I, requiere de un estímulo previo que redistribuya este receptor hacia la membrana plasmática. Finalmente, el uso de distintos inhibidores permitió demostrar que en MFC, tanto la activación de B1R como B2R, conducen a la disminución en la expresión de Col I a través de la activación de una vía transduccional que es compartida por ambos receptores, y que corresponde a: PKC/PLA2/COX-2/PGI2/IPR. En resumen, los resultados de esta tesis sostienen que en MFC la activación de B1R y B2R conduce a la disminución de la expresión de Col I, lo cual se relaciona a los efectos antifibróticos de las cininas en el progreso de patologías como la fibrosis cardiaca / Cardiac fibrosis is generated by an excessive deposit of extracellular matrix proteins (ECM) product of fibroblast (CF) activation. These cells account for about 60 to 70% of the cells in the heart. In response to injury, fibroblasts are activated by various cytokines and growth factors (including TGF-β1, Ang II, etc.), which trigger in them structural and functional changes, differentiating to cardiac myofibroblasts (CMF). The main function of CMF is to secrete ECM proteins to repair the damaged area in the case of a heart attack. Thus CMF play a crucial role in the response to injury in the heart tissue. However, very little is known about the behavior of this cell type versus cardiac remodeling. Furthermore, the knowledge on the receptors present on this cell type is scarce, and they could be key elements in the regulation of the exacerbated secretion of MEC and therefore the generation of tissue fibrosis. In cardiac fibrosis, the participation of the kallikrein-kinin system is very important. It has been proposed that the absence of kinin receptors is deleterious for cardiac tissue, especially in response to an injury. Within this system are bradykinin (BK) which acts on the B2 kinin receptor (B2R) and lis-des-Arg-BK (DAKD) that exerts its action on the B1 receptor (B1R). In CF, it has been shown that BK induces NO release and prostaglandins production, which reduce collagen secretion. However, in CMF it is not known which kinin receptor subtype is present and what signal transduction pathways are activated by these receptors. In this thesis and in accordance with the context, various experiments were conducted to prove the existence and functionality of kinin receptors in both CF and CMF the presence of both receptors in both CF as MFC was observed by Western blot (WB), however, expression of B1R in CMF was greater than in FC, while B2R remained constant. B1R expression increased after treatment of CF with TGF-β1, the main differentiator to CMF. By immunofluorescence techniques and radioligand assays, it was determined that CF B1R was located primarily intracellularly, whereas CMF was markedly located in the plasma membranes. Moreover, by analyzing intracellular calcium movements, B2R was shown to be functional in both cell types, while B1R was functional in CMF, but not in CF. However, when CF were preincubated with the B1R agonist (DAKD) and subsequently stimulated (30 min) with the same agonist, these receptors were also functional. By Immunofluorescence it was shown that after preincubation with the agonist the B1R was relocated to plasma membranes, where they were able to generate intracellular calcium movements, showing they are active receptors. Furthermore, it was demonstrated that B1R and B2R activation in CMF by their respective agonists, induces a reduction in the expression of collagen I (Col I). In contrast in CF, B2R activation induced a decrease in Col I levels, whereas a previous stimulus that redistributes B1R receptor to the plasma membrane is required to induce a reduction in Col I expression after B1R stimulation. Finally, the use of various inhibitors shows that CMF allowed both B1R activation and B2R, leading to a decrease in Col I expression through activation of a signal transduction pathway which is shared by both receptors, and that is mediated by PKC/PLA2/COX-2/PGI2/IPR. In summary, the results of this study argue that B1R and B2R activation in CMF leads to decreased expression of Col I, which is related to antifibrotic effects of kinins in the progress of diseases such as cardiac fibrosis / Conicyt Fondecyt