Made available in DSpace on 2018-08-01T22:57:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_10774_025 - DAYANNE PINHO ROSA - DISSERTAÇÃO DE MESTRADO - FINAL.pdf: 805134 bytes, checksum: a0838bf2c2101acc6105315b494bc58a (MD5) Previous issue date: 2017-02-23 / Os solventes orgânicos são comuns em processos industriais que utilizam enzimas, mas, ao mesmo tempo, sabe-se que alteram suas propriedades. Assim, os efeitos do solvente orgânico aquoso (etanol) em diferentes concentrações na estrutura α- tripsina foram investigadas por técnicas espectroscópicas e análise de dados termodinâmicos. A espectroscopia de absorção UV-Vis, a fluorescência intrínseca do triptofano e o espalhamento dinâmico da luz (DLS) sugerem a formação de estados parcialmente dobrados, em vez de estados agregados, em alta concentração de etanol (> 60% v/v de etanol/tampão), exibindo pouca perda de estrutura secundária, mas alterações significativas na estrutura terciária. Os dados termodinâmicos (Tm e ∆H) sugerem um afrouxamento de interações intramoleculares fracas, o que se reflete em um aumento de flexibilidade de tal forma que a capacidade catalítica pode ser aumentada ou diminuída de acordo com a concentração de etanol no sistema. Os resultados globais sugerem que na faixa de 0-60% v/v de etanol/tampão, a α- tripsina sofre fenômenos de multimerização reversíveis, mantendo a sua atividade catalítica. No entanto a partir de 60% v/v de etanol/tampão, a população de estados parcialmente enovelados com menor atividade catalítica é predominante. Palavras chaves: tripsina, isoformas, enzimologia, solventes orgânicos, estrutura, termodinâmica.

Grado de doctor en ciencias biomédicas. / La familia de proteínas de andamio MAGUK-DLG participa en la formación de complejos proteicos en uniones intercelulares y juega un importante papel en la fisiología sináptica particularmente en la plasticidad. En vertebrados se conocen 4 miembros de esta familia: SAP90/PSD95, SAP102/NEDLG, SAP97/hDLG y PSD93/Chapsyn-110. El papel in vivo de estas proteínas ha sido difícil de estudiar debido al alto grado de redundancia que poseen. En Drosophila melanogaster solo existe un gen MAGUK-DLG, dlg. Este gen codifica 2 proteínas: DLGS97 y DLGA. Ambas se encuentran presentes en la unión neuromuscular de la larva de Drosophila (UNMDL) modelo de estudio de sinapsis glutamatérgicas que comparte componentes moleculares básicos con las sinapsis centrales de vertebrados. En este trabajo con el propósito de tener una mejor comprensión de la función de las MAGUK-DLGs, se hizo uso de mutantes específicos para cada isoforma (dlgS975 y dlgA40.2) y se combinó estudios electrofisiológicos e inmunohistoquímicos con herramientas genéticas. De esta manera se demostró que solo la ausencia postsináptica de DLGS97 se asocia con un incremento en las corrientes excitatorias de juntura en miniatura (mEJCs)y a un mayor tamaño de los campos de receptores de glutamato. La ausencia presináptica de ambas isoformas presenta alteraciones en las corrientes excitatorias de juntura evocadas (eEJCs) y en distintos procesos de plasticidad sináptica, sugiriendo una menor probabilidad de liberación, la que, se pudo demostrar que correlaciona con una pérdida de la distribución normal del canal de Ca+2 dependiente de voltaje “Cacophony”. / The DLG-MAGUK family of scaffolding proteins participates in the formation of multiprotein complexes in cell-cell interaction domains and plays an important role in the synaptic physiology, particularly in synaptic plasticity. In vertebrates this family has four members: SAP90/PSD95, SAP102/NEDLG, SAP97/hDLG y PSD93/Chapsyn-110. The in vivo role of these proteins has been difficult to study due to their high degree of redundancy. In Drosophila melanogaster there is only one DLG-MAGUK, dlg. This gene encodes two proteins: DLGS97 and DLGA. Both are at the Drosophila larvae neuromuscular junction (UNMDL) a glutamatergic synapse that shares the basic molecular components with the synapses of the central nervous system of vertebrates. In order to get a better understanding of the role of the DLG-MAGUKs using specific isoform mutants (dlgS975 y dlgA40.2) we combined the use of electrophysiology, immunohistochemistry and genetic tools to show that only the postsynaptic absence of DLGS97 can be associated with an increase in the miniature excitatory junction currents (mEJCs), due to a bigger size in the glutamate receptor fields; moreover, the lack of both dlg isoforms affects the evoked excitatory junction currents (eEJCs) and synaptic plasticity, suggesting a smaller probability of release, which can be attributed to an abnormal distribution of the voltage dependant Ca+2 channel cacophony.

Tesis para optar al grado académico de Magíster en Bioquímica. Área de especialización: Bioquímica Clínica / Introducción: El Cáncer de Ovario Epitelial (COE) es el cáncer ginecológico con mayor mortalidad en mujeres post-menopáusica. Su carcinogénesis y progresión neoplásica es atribuida a múltiples moléculas relacionadas con la proliferación, diferenciación y angiogénesis; entre las cuales, se ha estudiado el factor de crecimiento neuronal (NGF), su receptor de alta afinidad (TrkA) y el factor de crecimiento de endotelio vascular (VEGF), que aumentan su expresión a medida que COE pierde su diferenciación. Además, las isoformas del Receptor de Estrógenos α y β (REα y REβ), que poseen efectos antagónicos de proliferación celular, modifican su expresión en COE al compararla con epitelio ovárico normal. Esto sugiere que los cambios en la expresión de ambos RE es un evento importante en la progresión de COE. Objetivos:1)Determinar la localización subcelular de REα, p-REα ser 118 y REβ y semicuantificar su expresión, en el epitelio superficial de ovario normal funcional e inactivo, tumores ováricos benignos, borderline y COE seroso grado I, II y III. 2) Evaluar si NGF modifica la inmunodetección de REα, p-REα ser 118 y REβ en explantes de COE. 3)Analizar si las gonadotrofinas (LH y FSH) modifican la inmunodetección de REα, p-REα ser 118 y REβ en explantes de COE Metodología: Estudio ex-vivo: Se utilizaron biopsias de ovario pertenecientes a los siete grupos de estudio que siguen una progresión neoplásica de COE, incluidas en parafina para evaluación histológica y posterior estudio de Inmunodetección de las isoformas de RE por Inmunohistoquímica (IHQ). Estudio in-vitro: Se utilizaron explantes de COE estimulados por dos horas con NGF, FSH, LH y la mezcla de ambas gonadotrofinas. Luego se incluyeron en parafinas para su posterior análisis de Inmunodetección de las isoformas de RE por IHQ. Resultados: Estudio ex–vivo: REα se localiza en el núcleo de células epiteliales y estromales de todos los grupos de estudio, manteniendo constante su detección durante la progresión neoplásica de COE. pREα se localiza a nivel nuclear en ambos compartimentos de los grupos de estudio, aumentando su expresión en forma significativa desde Ovario normal funcional hasta Borderline (p < 0.01), sin embargo su expresión disminuye drásticamente en COE I, para volver a aumentar en forma significativa hasta COE III (p < 0.01). REβ se localiza principalmente en el citoplasma de células epiteliales y estromales de todos los grupos de estudio, sin hacer un cambio en su inmunodeteccion entre los grupos estudiados. REβ se expresa también en el núcleo de las células epiteliales y estromales de Ovario normal funcional hasta Tumor ovárico benigno con una expresión ascendente (p < 0,05), y luego desaparece su expresión nuclear en los tres grados de diferenciación de COE (p < 0.01). Estudio in– vitro: Existe un aumento de la Inmunodetección de pREα en células epiteliales de explantes de COE al estimularlos con concentraciones crecientes de NGF. No existen cambios significativos de la expresión de las tres isoformas de RE al estimularlos con FSH, LH y la mezcla de ambas gonadotrofinas. Conclusión: La Inmunodetección de REα total no se modifica durante la progresión neoplásica de COE, mientras que REβ disminuye desde tumor benigno hasta COE II; aumentando así la relación REα/REβ. La Inmunodetección de pREα aumenta significativamente desde COE I hasta COE III. Este último resultado, junto al aumento de pREα por efecto de NGF en explantes de COE, podría sugerir que existe una activación de REα por vía no clásica ligando independiente, a través de la transducción vía MAPK/ERK desencadenada por la unión de factores de crecimiento y sus respectivos receptores, entre ellos NGF a través de TrkA

Ingeniera Civil en Biotecnología / En distintos estudios se ha determinado que mutaciones en la proteína transportadora DMT1, encargada de transportar hierro desde el lumen intestinal hacia los enterocitos, son causantes de distintos tipos de anemia, no obstante, poco se conoce sobre su estructura tridimensional y su mecanismo de transporte. Por esta razón, el objetivo del presente trabajo es obtener un modelo estructural de la isoforma 1A/IRE(+) de la proteína DMT1 humana y a partir de éste estudiar el posible comportamiento de la proteína inserta en membrana. La predicción de dominios transmembrana para la proteína de interés estableció la presencia de 12 dominios transmembrana, 6 loops extracelulares, 5 loops intracelulares y los extremos amino y carboxilo terminales al interior del citoplasma de los enterocitos, lo cual concuerda totalmente con lo expuesto en bibliografía. Se obtuvieron 100 modelos de la proteína mediante modelamiento comparativo, utilizando el cristal de la familia de la proteína, ScaDMT, como plantilla principal. El mejor modelo se obtuvo a través de un análisis energético y estructural. Este modelo obtuvo un z-score de -4.3, dentro de la densidad de puntajes obtenidos por estructuras cristalinas, un perfil energético por residuo similar al del cristal de ScaDMT, y un gráfico de Ramachandran con tan solo 2 residuos dentro de zonas no permitidas. Se realizaron cuatro dinámicas moleculares para estudiar el comportamiento del modelo en membrana, las cuales fueron analizadas para estudiar las características de la proteína. A partir del análisis de los modos normales, se observó un movimiento de apertura y cierre, el cual podría representar el movimiento principal de captura y liberación del ion de hierro. Por otro lado, se presentó una variación en el potencial electrostático en las regiones superior e inferior de la proteína, lo que podría estar relacionado al mecanismo de interacción de la proteína con hierro. A partir del análisis del comportamiento de las moléculas de agua en el sistema, se determinó que éstas ingresan a la proteína por la zona orientada hacia el citoplasma, posicionándose entre las hélices TM1 y TM6, donde se ubica el ion de hierro. Finalmente, en cuanto a la interacción de la proteína con hierro, se proponen los residuos Asp115, Asn118, Ala291 y Met294 como principales candidatos a interaccionar con él, y se observa un posible rol del agua en la estabilización de éste. De esta manera, los resultados y discusiones aquí expuestos representan los primeros avances para un mejor conocimiento de la estructura y características de la proteína DMT1 humana. Se requiere profundizar y extender estos análisis para poder establecer bases más sólidas respecto a la relación estructura-función y dilucidar el mecanismo de transporte asociado a la proteína. Esto resultaría de gran utilidad para comprender la causa de las enfermedades asociadas a mutaciones en DMT1 y posteriormente proponer tratamientos más efectivos para estas enfermedades.

Os canais seletivos a ânions dependente de voltagem (VDACs) são um grupo de proteínas, primeiramente identificadas na membrana mitocondrial externa, capazes de formar estruturas de poros hidrofílicos em membranas. As VDACs são conhecidas pela sua função essencial no metabolismo celular e nos estágios recentes de apoptose. Em mamíferos, foram identificadas três isoformas de VDACs (VDAC1, 2 e 3). Uma pesquisa proteômica, consistindo de eletroforese bi-dimensional seguida por western blotting com anticorpos anti-VDAC 1, anti-VDAC 2 e anti-VDAC 3 e espectrometria de massas com fonte de ionização/desorção à laser assistido por matriz e tempo de vôo foi utilizada para estudar a expressão das isoformas de VDAC em mitocôndrias cerebrais de aves, ratos e bois. Foi estudada a possibilidade que diferenças na expressão relativa das isoformas de VDAC possam ser um fator determinante da proporção espécie-dependente dos sítios de ligação da hexoquinase tipo A: tipo B nas mitocôndrias cerebrais. Os spots foram caracterizados, e a intensidade de sinal foi comparada entre os spots. VDAC1 e VDAC2 foram divididas dentro de múltiplos spots. A VDAC1 foi dividida em dois spots nos géis bi-dimensionais realizados com amostras de cérebros de ratos e bois, e três spots para cérebros de aves. A VDAC2 foi separada em três, cinco e dois spots para cérebros de ratos, bois e aves, respectivamente. Os resultados reportam uma heterogeneidade de carga das VDACs 1 e 2 nos cérebros analisados. A VDAC1 foi a mais expressa das três isoformas. Além disso, a expressão da VDAC1 mais VDAC2 foi muito maior em cérebros de aves e bois do que em cérebros de ratos. Mitocôndrias de cérebro de aves mostraram uma maior expressão de VDAC1 e menor de VDAC2. As mitocôndrias de cérebro bovino apresentaram os níveis mais altos de VDAC2. A VDAC3 não foi detectada nos cérebros das espécies estudadas. / The voltage dependent anion selective channels (VDACs) are a group of proteins first identified in the mitochondrial outer membrane that are able to form hydrophilic pore structures in membranes. VDAC are known to play an essential role in cellular metabolism and in the early stages of apoptosis. In mammals, three VDACs isoforms (VDAC1, 2, 3) have been identified. A proteomic approach, consisting of two dimensional electrophoresis, followed by western blotting with anti-VDAC 1, anti-VDAC 2 and anti-VDAC 3 and by matrix assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry was used to study the expression of VDAC isoforms in rat, bovine and avian brain mitochondria. We were studying the possibility that differences in the relative expression of VDAC isoforms may be a factor in determining the species-dependent ratio of type A: type B hexokinase binding sites on brain mitochondria. The spots were characterized, and the signal intensities among spots were compared. VDAC1 and VDAC2 were divided into multiple spots. VDAC1 was divided in two spots in two dimensional gels of rat and bovine brains and three spots in avian brains. VDAC2 was separated into three, five and two spots in rat, bovine and avian brains, respectively. The results report charge heterogeneity of VDACs 1 and 2 in the analyzed brains. VDAC1 was the most abundantly expressed of the three isoforms. Moreover the expression of VDAC1 plus VDAC2 was much higher in avian and bovine brains than in rat brains. Avian brain mitochondria showed the highest expression of VDAC1 and the lowest of VDAC2. Bovine brain mitochondria had the highest levels of VDAC2. No VDAC 3 was detected in studied species brains.

O câncer de próstata (CaP) e a hiperplasia prostática benigna (HPB) são as doenças da próstata mais comuns, e ambas são alterações do controle do crescimento prostático, compartilhando uma prevalência aumentada com o avanço da idade. A deprivação androgênica é uma das opções de tratamento mais comuns para o CaP e, embora resulte em um período de regressão clínica, muitos pacientes acabam progredindo para uma condição refratária à terapia hormonal, conhecida como CaP independente de androgênios (resistente à castração). Alterações moleculares no receptor de androgênios (AR) têm sido associadas à progressão do CaP. Neste estudo, buscamos identificar a presença de isoformas do AR derivadas de splicing alternativo tanto em tecido benigno de HPB (n = 30) quanto em tecido maligno de CaP (n = 27). As isoformas estudadas foram o AR3, AR4, AR5 e AR6. A expressão gênica do AR não apresentou diferença entre os tecidos estudados (P = 0,160). O AR4 apresentou maior expressão nos pacientes com CaP (P = 0,029) e, dentre estes, os níveis de expressão foram maiores nos pacientes que apresentaram recidiva bioquímica (P = 0,049). Dada a similaridade entre as moléculas de cDNA das isoformas AR3, AR5 e AR6, diferentes estratégias de detecção do mRNA foram utilizadas. A amplificação conjunta do AR3, AR5 e AR6 (AR3/5/6) foi maior no grupo CaP (P = 0,021), enquanto que a expressão das isoformas AR5 e AR6 (AR5/6) não foi diferente entre os grupos (P = 0,184). Com o objetivo de inferir um valor para a expressão do AR3, também foi analisada a razão (AR3/5/6) / (AR5/6), que apresentou maiores níveis de expressão no grupo CaP em relação ao grupo HPB (P < 0,0001). Nas amostras de CaP, foi encontrada uma correlação positiva entre o escore de Gleason e os níveis de mRNA das isoformas AR5/6 (0,524; P = 0,006) e uma correlação negativa entre o escore de Gleason e a razão (AR3/5/6) / (AR5/6) (-0,429; P = 0,029). A expressão gênica do AR4 correlacionou-se positivamente com a expressão gênica das isoformas AR3/5/6 e AR5/6 (0,646; P < 0,001 e 0,518; P = 0,006). Nas amostras de HPB, foi encontrada uma correlação positiva entre a expressão gênica do AR e os níveis plasmáticos de PSA pré-operatório (0,479; P = 0,013). Também foi encontrada uma correlação positiva entre a expressão gênica do AR4 e a expressão gênica do AR3/5/6 (0,818; P < 0,001), do AR5/6 (0,387; P = 0,035) e a razão (AR3/5/6) / (AR5/6) (0,394; P = 0,031) nesse grupo. Embora em níveis diferentes, todas as isoformas estudadas foram expressas tanto em tecido benigno (HPB) quanto em tecido maligno (CaP). Desta forma, estes resultados permitem assumir que estas isoformas constitutivamente ativas estejam envolvidas no desenvolvimento destas doenças prostáticas. E, ainda, a expressão do AR4 pode ser associada com a recidiva do CaP após o tratamento cirúrgico. / Prostate cancer (PCa) and benign prostatic hyperplasia (BPH) are the most common prostatic diseases and both are disorders in prostatic growth, whose prevalence increase with age. The androgen deprivation is one of the most common therapies for PCa, and, although there is a period of clinical remission, many patients occasionally progress to a condition refractory to hormone therapy, known as androgen-independent CaP (castration-resistant). Molecular changes in the androgen receptor (AR) have been associated with progression of PCa. This study aimed at identifying the presence of AR isoforms derived from alternative splicing both in benign tissue of BPH (n = 30) and in malignant tissue of PCa (n = 27). The isoforms studied were AR3, AR4, AR5 and AR6. AR gene expression did not differ between the studied groups (P = 0.160). AR4 showed higher expression in PCa patients (P = 0.029) and, among these, the expression levels were higher in patients with biochemical recurrence (P = 0.049). Given the similarity between the molecules of cDNA from AR3, AR5 and AR6, their detection was performed using a different strategy for mRNA amplification. The expression of AR3, AR5 and AR6 (AR3/5/6), together, was higher in PCa group (P = 0.021), while the expression of only AR5 and AR6 (AR5/6) was not different between the groups (P = 0.184). Aiming at inferring a value for the expression of AR3, it was also analyzed the ratio (AR3/5/6) / (AR5/6), which showed higher expression levels in PCa group compared to BPH group (P <0.001). In PCa samples, we found a positive correlation between the Gleason score and the levels of mRNA isoforms AR5/6 (0,524; P = 0,006), and a negative correlation between the Gleason score and the ratio (AR3/5/6) / (AR5/6) (-0.429, P = 0.029). AR4 gene expression was positively correlated with the expression of gene isoforms AR3/5/6 and AR5/6 (0.646, P < 0.001 and 0.518, P = 0.006) in this group. In the BPH group, we found a positive correlation between the gene expression of AR and plasmatic levels of preoperative PSA (0.479, P = 0.013). We also found a positive correlation between AR4 and AR3/5/6 gene expression (0.818, P = 0.0001), AR5/6 (0.387, P = 0.035) and the reason (AR3/5/6) / (AR5/6) (0.394, P = 0.031) in this group. Although at different levels, all investigated isoforms were expressed both in benign tissue (BPH) and in malignant tissue (PCa). These results support the assumption that these constitutively active isoforms of AR are involved in the development of prostatic diseases. Furthermore, AR4 expression may be associated with recurrence after radical prostatectomy.

Tesis (bioquímica)--Universidad de Chile, 2013 Tesis (magíster en bioquímica, área de especialización en bioquímica toxicológica y diagnóstico molecular)--Universidad de Chile, 2013

O câncer de próstata (CaP) e a hiperplasia prostática benigna (HPB) são as doenças da próstata mais comuns, e ambas são alterações do controle do crescimento prostático, compartilhando uma prevalência aumentada com o avanço da idade. A deprivação androgênica é uma das opções de tratamento mais comuns para o CaP e, embora resulte em um período de regressão clínica, muitos pacientes acabam progredindo para uma condição refratária à terapia hormonal, conhecida como CaP independente de androgênios (resistente à castração). Alterações moleculares no receptor de androgênios (AR) têm sido associadas à progressão do CaP. Neste estudo, buscamos identificar a presença de isoformas do AR derivadas de splicing alternativo tanto em tecido benigno de HPB (n = 30) quanto em tecido maligno de CaP (n = 27). As isoformas estudadas foram o AR3, AR4, AR5 e AR6. A expressão gênica do AR não apresentou diferença entre os tecidos estudados (P = 0,160). O AR4 apresentou maior expressão nos pacientes com CaP (P = 0,029) e, dentre estes, os níveis de expressão foram maiores nos pacientes que apresentaram recidiva bioquímica (P = 0,049). Dada a similaridade entre as moléculas de cDNA das isoformas AR3, AR5 e AR6, diferentes estratégias de detecção do mRNA foram utilizadas. A amplificação conjunta do AR3, AR5 e AR6 (AR3/5/6) foi maior no grupo CaP (P = 0,021), enquanto que a expressão das isoformas AR5 e AR6 (AR5/6) não foi diferente entre os grupos (P = 0,184). Com o objetivo de inferir um valor para a expressão do AR3, também foi analisada a razão (AR3/5/6) / (AR5/6), que apresentou maiores níveis de expressão no grupo CaP em relação ao grupo HPB (P < 0,0001). Nas amostras de CaP, foi encontrada uma correlação positiva entre o escore de Gleason e os níveis de mRNA das isoformas AR5/6 (0,524; P = 0,006) e uma correlação negativa entre o escore de Gleason e a razão (AR3/5/6) / (AR5/6) (-0,429; P = 0,029). A expressão gênica do AR4 correlacionou-se positivamente com a expressão gênica das isoformas AR3/5/6 e AR5/6 (0,646; P < 0,001 e 0,518; P = 0,006). Nas amostras de HPB, foi encontrada uma correlação positiva entre a expressão gênica do AR e os níveis plasmáticos de PSA pré-operatório (0,479; P = 0,013). Também foi encontrada uma correlação positiva entre a expressão gênica do AR4 e a expressão gênica do AR3/5/6 (0,818; P < 0,001), do AR5/6 (0,387; P = 0,035) e a razão (AR3/5/6) / (AR5/6) (0,394; P = 0,031) nesse grupo. Embora em níveis diferentes, todas as isoformas estudadas foram expressas tanto em tecido benigno (HPB) quanto em tecido maligno (CaP). Desta forma, estes resultados permitem assumir que estas isoformas constitutivamente ativas estejam envolvidas no desenvolvimento destas doenças prostáticas. E, ainda, a expressão do AR4 pode ser associada com a recidiva do CaP após o tratamento cirúrgico. / Prostate cancer (PCa) and benign prostatic hyperplasia (BPH) are the most common prostatic diseases and both are disorders in prostatic growth, whose prevalence increase with age. The androgen deprivation is one of the most common therapies for PCa, and, although there is a period of clinical remission, many patients occasionally progress to a condition refractory to hormone therapy, known as androgen-independent CaP (castration-resistant). Molecular changes in the androgen receptor (AR) have been associated with progression of PCa. This study aimed at identifying the presence of AR isoforms derived from alternative splicing both in benign tissue of BPH (n = 30) and in malignant tissue of PCa (n = 27). The isoforms studied were AR3, AR4, AR5 and AR6. AR gene expression did not differ between the studied groups (P = 0.160). AR4 showed higher expression in PCa patients (P = 0.029) and, among these, the expression levels were higher in patients with biochemical recurrence (P = 0.049). Given the similarity between the molecules of cDNA from AR3, AR5 and AR6, their detection was performed using a different strategy for mRNA amplification. The expression of AR3, AR5 and AR6 (AR3/5/6), together, was higher in PCa group (P = 0.021), while the expression of only AR5 and AR6 (AR5/6) was not different between the groups (P = 0.184). Aiming at inferring a value for the expression of AR3, it was also analyzed the ratio (AR3/5/6) / (AR5/6), which showed higher expression levels in PCa group compared to BPH group (P <0.001). In PCa samples, we found a positive correlation between the Gleason score and the levels of mRNA isoforms AR5/6 (0,524; P = 0,006), and a negative correlation between the Gleason score and the ratio (AR3/5/6) / (AR5/6) (-0.429, P = 0.029). AR4 gene expression was positively correlated with the expression of gene isoforms AR3/5/6 and AR5/6 (0.646, P < 0.001 and 0.518, P = 0.006) in this group. In the BPH group, we found a positive correlation between the gene expression of AR and plasmatic levels of preoperative PSA (0.479, P = 0.013). We also found a positive correlation between AR4 and AR3/5/6 gene expression (0.818, P = 0.0001), AR5/6 (0.387, P = 0.035) and the reason (AR3/5/6) / (AR5/6) (0.394, P = 0.031) in this group. Although at different levels, all investigated isoforms were expressed both in benign tissue (BPH) and in malignant tissue (PCa). These results support the assumption that these constitutively active isoforms of AR are involved in the development of prostatic diseases. Furthermore, AR4 expression may be associated with recurrence after radical prostatectomy.

Submitted by Maykon Nascimento (maykon.albani@hotmail.com) on 2016-04-18T19:53:42Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Dissertacao Lacerda CD.pdf: 1763421 bytes, checksum: 9db822a6306602d4f7c830ea507fcc4a (MD5) / Approved for entry into archive by Patricia Barros (patricia.barros@ufes.br) on 2016-06-27T18:49:55Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Dissertacao Lacerda CD.pdf: 1763421 bytes, checksum: 9db822a6306602d4f7c830ea507fcc4a (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-27T18:49:55Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Dissertacao Lacerda CD.pdf: 1763421 bytes, checksum: 9db822a6306602d4f7c830ea507fcc4a (MD5) / Uma nova isoforma tripsina bovina foi purificada a partir de amostras comerciais por cromatografia de troca iônica por Sephadex SP C50®. A nova isoforma contém, além da perda do hexapeptídeo N-terminal (como encontrado na molécula progenitora β-tripsina) uma clivagem intra-cadeia entre o Lys-155 e Ser-156. A nova enzima denominada -tripsina mostrou propriedades similares com a isoforma α-tripsina que contém o mesmo número de cadeia polipeptídica (duas cadeias), massa molecular (23312 Da), estrutura secundária, volume hidrodinâmico e outros. Apesar das semelhanças estruturais e enzimáticas dessas duas isoformas, -tripsina tem uma taxa de formação inferior a partir da β-tripsina, carga superficial inferior, mas a -tripsina tem estabilidade térmica mais elevada do que a α-tripsina. Devido à facilidade de purificação das isoformas a partir de tripsina bovina de fonte comercial, e as propriedades descritas acima, esta enzima tornar-se uma alternativa interessante para a indústria de alimentos e de detergente, bem como para pesquisa de biocatalisadores. / A novel bovine trypsin isoform was purified from commercial sample by ion exchange chromatography by Sephadex SP C50®. New isoform contain in addition of loss of N- terminus hexapeptide (as found in parent molecule β-trypsin) an intra-chain split between Lys-155 and Ser-156. The novel enzyme denominate gamma-trypsin showed similar properties with α-trypsin isoform in: polypeptide number chain (two chain), molecular masses (23,312 Da), secondary structure, hydrodynamic radius and others. In spite of enzymatic and structural similarities of both isoforms, -trypsin preferably has a lower rate formation from β-trypsin, a lower surface charge, but the gamma-trypsin has a higher thermal stability than α-trypsin. Due to obtaining facility of purification of bovine trypsin isoforms from commercial font, and properties described above, become this enzyme an interesting alternative for the food industry, detergent and biocatalysis research.

O câncer de próstata (CaP) e a hiperplasia prostática benigna (HPB) são as doenças da próstata mais comuns, e ambas são alterações do controle do crescimento prostático, compartilhando uma prevalência aumentada com o avanço da idade. A deprivação androgênica é uma das opções de tratamento mais comuns para o CaP e, embora resulte em um período de regressão clínica, muitos pacientes acabam progredindo para uma condição refratária à terapia hormonal, conhecida como CaP independente de androgênios (resistente à castração). Alterações moleculares no receptor de androgênios (AR) têm sido associadas à progressão do CaP. Neste estudo, buscamos identificar a presença de isoformas do AR derivadas de splicing alternativo tanto em tecido benigno de HPB (n = 30) quanto em tecido maligno de CaP (n = 27). As isoformas estudadas foram o AR3, AR4, AR5 e AR6. A expressão gênica do AR não apresentou diferença entre os tecidos estudados (P = 0,160). O AR4 apresentou maior expressão nos pacientes com CaP (P = 0,029) e, dentre estes, os níveis de expressão foram maiores nos pacientes que apresentaram recidiva bioquímica (P = 0,049). Dada a similaridade entre as moléculas de cDNA das isoformas AR3, AR5 e AR6, diferentes estratégias de detecção do mRNA foram utilizadas. A amplificação conjunta do AR3, AR5 e AR6 (AR3/5/6) foi maior no grupo CaP (P = 0,021), enquanto que a expressão das isoformas AR5 e AR6 (AR5/6) não foi diferente entre os grupos (P = 0,184). Com o objetivo de inferir um valor para a expressão do AR3, também foi analisada a razão (AR3/5/6) / (AR5/6), que apresentou maiores níveis de expressão no grupo CaP em relação ao grupo HPB (P < 0,0001). Nas amostras de CaP, foi encontrada uma correlação positiva entre o escore de Gleason e os níveis de mRNA das isoformas AR5/6 (0,524; P = 0,006) e uma correlação negativa entre o escore de Gleason e a razão (AR3/5/6) / (AR5/6) (-0,429; P = 0,029). A expressão gênica do AR4 correlacionou-se positivamente com a expressão gênica das isoformas AR3/5/6 e AR5/6 (0,646; P < 0,001 e 0,518; P = 0,006). Nas amostras de HPB, foi encontrada uma correlação positiva entre a expressão gênica do AR e os níveis plasmáticos de PSA pré-operatório (0,479; P = 0,013). Também foi encontrada uma correlação positiva entre a expressão gênica do AR4 e a expressão gênica do AR3/5/6 (0,818; P < 0,001), do AR5/6 (0,387; P = 0,035) e a razão (AR3/5/6) / (AR5/6) (0,394; P = 0,031) nesse grupo. Embora em níveis diferentes, todas as isoformas estudadas foram expressas tanto em tecido benigno (HPB) quanto em tecido maligno (CaP). Desta forma, estes resultados permitem assumir que estas isoformas constitutivamente ativas estejam envolvidas no desenvolvimento destas doenças prostáticas. E, ainda, a expressão do AR4 pode ser associada com a recidiva do CaP após o tratamento cirúrgico. / Prostate cancer (PCa) and benign prostatic hyperplasia (BPH) are the most common prostatic diseases and both are disorders in prostatic growth, whose prevalence increase with age. The androgen deprivation is one of the most common therapies for PCa, and, although there is a period of clinical remission, many patients occasionally progress to a condition refractory to hormone therapy, known as androgen-independent CaP (castration-resistant). Molecular changes in the androgen receptor (AR) have been associated with progression of PCa. This study aimed at identifying the presence of AR isoforms derived from alternative splicing both in benign tissue of BPH (n = 30) and in malignant tissue of PCa (n = 27). The isoforms studied were AR3, AR4, AR5 and AR6. AR gene expression did not differ between the studied groups (P = 0.160). AR4 showed higher expression in PCa patients (P = 0.029) and, among these, the expression levels were higher in patients with biochemical recurrence (P = 0.049). Given the similarity between the molecules of cDNA from AR3, AR5 and AR6, their detection was performed using a different strategy for mRNA amplification. The expression of AR3, AR5 and AR6 (AR3/5/6), together, was higher in PCa group (P = 0.021), while the expression of only AR5 and AR6 (AR5/6) was not different between the groups (P = 0.184). Aiming at inferring a value for the expression of AR3, it was also analyzed the ratio (AR3/5/6) / (AR5/6), which showed higher expression levels in PCa group compared to BPH group (P <0.001). In PCa samples, we found a positive correlation between the Gleason score and the levels of mRNA isoforms AR5/6 (0,524; P = 0,006), and a negative correlation between the Gleason score and the ratio (AR3/5/6) / (AR5/6) (-0.429, P = 0.029). AR4 gene expression was positively correlated with the expression of gene isoforms AR3/5/6 and AR5/6 (0.646, P < 0.001 and 0.518, P = 0.006) in this group. In the BPH group, we found a positive correlation between the gene expression of AR and plasmatic levels of preoperative PSA (0.479, P = 0.013). We also found a positive correlation between AR4 and AR3/5/6 gene expression (0.818, P = 0.0001), AR5/6 (0.387, P = 0.035) and the reason (AR3/5/6) / (AR5/6) (0.394, P = 0.031) in this group. Although at different levels, all investigated isoforms were expressed both in benign tissue (BPH) and in malignant tissue (PCa). These results support the assumption that these constitutively active isoforms of AR are involved in the development of prostatic diseases. Furthermore, AR4 expression may be associated with recurrence after radical prostatectomy.