O desenvolvimento de doenças que acometem a próstata está associado ao eixo de sinalização androgênica, o qual é altamente dependente do receptor de androgênios (AR) e dos níveis de androgênios circulantes. O AR atua como fator de transcrição, mediando a ativação ou repressão da transcrição de inúmeros genes. Deste modo, o AR apresenta um importante papel na regulação da proliferação e diferenciação de células prostáticas. Nesse estudo, buscamos identificar a expressão gênica de diversos genes associados à via de sinalização androgênica em amostras microdissecadas de tecido epitelial de hiperplasia prostática benigna (HPB) (n=3) e câncer de próstata (CaP) (n=3) através do ensaio TaqManArrayHumanAndrogens pela técnica de RT-qPCR, além da expressão proteica de alguns genes diferentemente expressos. A expressão gênica mostrou que 17 genes (AIG1, APPL1, BRCA1, BRCA2, CDC25B, ESR2, HSD17B3, HSD17B8, IL8, MED17, MED24, PAK6, PIM1, POR, SHH, SOAT1 e WDR19) apresentaram expressão somente no grupo CaP, 7 genes (MED13, SPDEF, RDH11, CALR, NKX3-1, KLK4 e PMEPA1) apresentaram expressão aumentada no grupo CaP em relação ao grupo HPB, 40 genes (HSD11B1, TGFB1I1, BCL2, UGT2B17, SRY, UGT2B15, MED1, RCHY1, PA2G4, KAT2B, FOXO3, MED14, SUMO1, PIAS2, CALCOCO1, HSD17B6, DAXX, MED4, PARK7, PATZ1, NR2C1, TMPRSS2, PIAS1, AR, MED12, SCARB1, PART1, PIAS3, NSD1, MED16, AOF2, ZMIZ1, NCOA1, MYST2, IGFBP5, SART3, CREBBP, TGIF1, CLDN3 e FKBP4) apresentaram expressão diminuída no grupo CaP em relação ao grupo HPB, 21 genes (AKR1C4, BMX, CRISP1, CYP11A1, CYP11B1, CYP19A1, CYP21A1, DHRS9, FGF8, GPX5, GRP, HSD3B1, IL4, INFG, SHBG, STS, SPAG11B, TGM4, UGT1A8, UGT2A1 e UGT2B7) não apresentaram expressão em nenhum dos grupos e 7 genes (ESR1, IL6, NCOA2, NCOA4, PDS5B, SRD5A1 e SRD5A2) apresentaram expressão em ambos os grupos, mas não foi possível analisá-los. Na expressão proteica do AR encontramos que este está mais expresso no núcleo de células hiperplásicas e no citoplasma em células tumorais. O BRCA1 predomina no citoplasma de células tumorais, enquanto uma pequena fração de células hiperplásicas apresenta positividade no núcleo e o NKX3-1 apresenta maior expressão citoplasmática no CaP e semelhante expressão no núcleo de ambos os grupos. Assim, este trabalho mostra a grande heterogeneidade tumoral através da variação na expressão gênica e proteica tanto de genes que favorecem como que os que impedem a permanência tumoral no tecido tumoral específico, e, acredita-se que por se tratar de um CaP primário, ainda estejam ativadas vias regulatórias que tendem a contensão tumoral. / The development of diseases affecting the prostate is associated with the androgenic signaling axis, which is highly dependent on the androgen receptor (AR) and circulating levels of androgens. The AR acts as a transcription factor, mediating the activation or repression of the transcription of innumerable genes. Thus, AR plays an important role in the regulation of prostate cell proliferation and differentiation. In this study, we sought to identify the gene expression of several genes associated with the androgenic signaling pathway in microdissected samples of benign prostatic hyperplasia (BPH) (n = 3) and prostate cancer (PC) (n = 3) by RT-qPCR , as also the protein expression of some differentially expressed genes. Gene expression showed that 17 genes (AIG1, APPL1, BRCA1, BRCA2, CDC25B, ESR2, HSD17B3, HSD17B8, IL8, MED17, MED24, PAK6, PIM1, POR, SHH, SOAT1 and WDR19) Presented expression only in the CaP group Seven genes (MED13, SPDEF, RDH11, CALR, NKX3-1, KLK4 and PMEPA1) presented increased expression in the CaP group compared to the HPB group; 40 genes (HSD11B1, TGFB1I1, BCL2, UGT2B17, SRY, UGT2B15, MED1, RCHY1, PA2G4, KAT2B, FOXO3, MED14, SUMO1, PIAS2, CALCOCO1, HSD17B6, DAXX, MED4, PARK7, PATZ1, NR2C1, TMPRSS2, PIAS1, AR, MED12 , SCARB1, PART1, PIAS3, NSD1, MED16, AOF2, ZMIZ1, NCOA1, MYST2, IGFBP5, SART3, CREBBP, TGIF1, CLDN3 and FKBP4) had decreased expression in the CaP group compared to the HPB group; 21 genes (AKR1C4, BMX, CRISP1, CYP11B1, CYP19A1, CYP21A1, DHRS9, FGF8, GPX5, GRP, HSD3B1, IL4, INFG, SHBG, STS, SPAG11B, TGM4, UGT1A8, UGT2A1 and UGT2B7) did not show expression in any of the groups and 7 genes (ESR1, IL6, NCOA2, NCOA4, PDS5B, SRD5A1 and SRD5A2) presented expression in both groups, but it was not possible to analyze them. In the protein expression of AR we find that it is more expressed in the nucleus of hyperplastic cells and in the cytoplasm in tumor cells. BRCA1 predominates in the cytoplasm of tumor cells, whereas a small fraction of hyperplastic cells is positive in the nucleus, and NKX3-1 shows greater cytoplasmic expression in CaP and similar expression in the nucleus of both groups. Thus, this work shows the great tumor heterogeneity through the variation in the gene and protein expression of both genes that favor as well as those that prevent tumor permanence in the specific tumor tissue, and it is believed to be the primary CaP, regulatory pathways that tend to contain tumor are activated.

O câncer de próstata (CaP) e a hiperplasia prostática benigna (HPB) são as doenças da próstata mais comuns, e ambas são alterações do controle do crescimento prostático, compartilhando uma prevalência aumentada com o avanço da idade. A deprivação androgênica é uma das opções de tratamento mais comuns para o CaP e, embora resulte em um período de regressão clínica, muitos pacientes acabam progredindo para uma condição refratária à terapia hormonal, conhecida como CaP independente de androgênios (resistente à castração). Alterações moleculares no receptor de androgênios (AR) têm sido associadas à progressão do CaP. Neste estudo, buscamos identificar a presença de isoformas do AR derivadas de splicing alternativo tanto em tecido benigno de HPB (n = 30) quanto em tecido maligno de CaP (n = 27). As isoformas estudadas foram o AR3, AR4, AR5 e AR6. A expressão gênica do AR não apresentou diferença entre os tecidos estudados (P = 0,160). O AR4 apresentou maior expressão nos pacientes com CaP (P = 0,029) e, dentre estes, os níveis de expressão foram maiores nos pacientes que apresentaram recidiva bioquímica (P = 0,049). Dada a similaridade entre as moléculas de cDNA das isoformas AR3, AR5 e AR6, diferentes estratégias de detecção do mRNA foram utilizadas. A amplificação conjunta do AR3, AR5 e AR6 (AR3/5/6) foi maior no grupo CaP (P = 0,021), enquanto que a expressão das isoformas AR5 e AR6 (AR5/6) não foi diferente entre os grupos (P = 0,184). Com o objetivo de inferir um valor para a expressão do AR3, também foi analisada a razão (AR3/5/6) / (AR5/6), que apresentou maiores níveis de expressão no grupo CaP em relação ao grupo HPB (P < 0,0001). Nas amostras de CaP, foi encontrada uma correlação positiva entre o escore de Gleason e os níveis de mRNA das isoformas AR5/6 (0,524; P = 0,006) e uma correlação negativa entre o escore de Gleason e a razão (AR3/5/6) / (AR5/6) (-0,429; P = 0,029). A expressão gênica do AR4 correlacionou-se positivamente com a expressão gênica das isoformas AR3/5/6 e AR5/6 (0,646; P < 0,001 e 0,518; P = 0,006). Nas amostras de HPB, foi encontrada uma correlação positiva entre a expressão gênica do AR e os níveis plasmáticos de PSA pré-operatório (0,479; P = 0,013). Também foi encontrada uma correlação positiva entre a expressão gênica do AR4 e a expressão gênica do AR3/5/6 (0,818; P < 0,001), do AR5/6 (0,387; P = 0,035) e a razão (AR3/5/6) / (AR5/6) (0,394; P = 0,031) nesse grupo. Embora em níveis diferentes, todas as isoformas estudadas foram expressas tanto em tecido benigno (HPB) quanto em tecido maligno (CaP). Desta forma, estes resultados permitem assumir que estas isoformas constitutivamente ativas estejam envolvidas no desenvolvimento destas doenças prostáticas. E, ainda, a expressão do AR4 pode ser associada com a recidiva do CaP após o tratamento cirúrgico. / Prostate cancer (PCa) and benign prostatic hyperplasia (BPH) are the most common prostatic diseases and both are disorders in prostatic growth, whose prevalence increase with age. The androgen deprivation is one of the most common therapies for PCa, and, although there is a period of clinical remission, many patients occasionally progress to a condition refractory to hormone therapy, known as androgen-independent CaP (castration-resistant). Molecular changes in the androgen receptor (AR) have been associated with progression of PCa. This study aimed at identifying the presence of AR isoforms derived from alternative splicing both in benign tissue of BPH (n = 30) and in malignant tissue of PCa (n = 27). The isoforms studied were AR3, AR4, AR5 and AR6. AR gene expression did not differ between the studied groups (P = 0.160). AR4 showed higher expression in PCa patients (P = 0.029) and, among these, the expression levels were higher in patients with biochemical recurrence (P = 0.049). Given the similarity between the molecules of cDNA from AR3, AR5 and AR6, their detection was performed using a different strategy for mRNA amplification. The expression of AR3, AR5 and AR6 (AR3/5/6), together, was higher in PCa group (P = 0.021), while the expression of only AR5 and AR6 (AR5/6) was not different between the groups (P = 0.184). Aiming at inferring a value for the expression of AR3, it was also analyzed the ratio (AR3/5/6) / (AR5/6), which showed higher expression levels in PCa group compared to BPH group (P <0.001). In PCa samples, we found a positive correlation between the Gleason score and the levels of mRNA isoforms AR5/6 (0,524; P = 0,006), and a negative correlation between the Gleason score and the ratio (AR3/5/6) / (AR5/6) (-0.429, P = 0.029). AR4 gene expression was positively correlated with the expression of gene isoforms AR3/5/6 and AR5/6 (0.646, P < 0.001 and 0.518, P = 0.006) in this group. In the BPH group, we found a positive correlation between the gene expression of AR and plasmatic levels of preoperative PSA (0.479, P = 0.013). We also found a positive correlation between AR4 and AR3/5/6 gene expression (0.818, P = 0.0001), AR5/6 (0.387, P = 0.035) and the reason (AR3/5/6) / (AR5/6) (0.394, P = 0.031) in this group. Although at different levels, all investigated isoforms were expressed both in benign tissue (BPH) and in malignant tissue (PCa). These results support the assumption that these constitutively active isoforms of AR are involved in the development of prostatic diseases. Furthermore, AR4 expression may be associated with recurrence after radical prostatectomy.

Introdução: O câncer de próstata atinge cerca de três quartos da população masculina acima de 65 anos, sendo esta neoplasia o sexto tipo de câncer mais comum no mundo, e o mais prevalente em homens. O receptor de androgênios (AR) desempenha um papel crítico no desenvolvimento normal da próstata, bem como no câncer prostático. Sua atividade transcricional é regulada através da interação com diversas proteínas. O NCoR1 (correpressor de receptores nucleares) está envolvido na diminuição da atividade do AR sobre a transcrição de genes alvo. Objetivos: Desenvolver um modelo de cultura celular de câncer prostático a partir de fragmentos tumorais; identificar o melhor gene normalizador para estudos de expressão gênica em amostras das células em cultivo; avaliar os efeitos do silenciamento do AR e seu corregulador, NCoR1, sobre a proliferação celular e expressão gênica de PSA, um gene alvo do AR, em células de cultura primária e em células de uma linhagem de câncer prostático (LNCaP – Lymph Node Carcinoma of the Prostate). Métodos: Fragmentos de tumores prostáticos coletados após prostatectomia radical ou prostatovesiculectomia foram plaqueados e mantidos em cultivo. As células que proliferaram a partir dos explants foram testadas para marcadores de epitélio (citoqueratinas) e de malignidade (racemase). Após 10 dias, as células foram silenciadas para o AR e, posteriormente, lisadas para a extração de RNA total ou de proteínas. Células LNCaP foram mantidas em cultura e silenciadas para o AR e o NCoR1, sendo avaliada também a proliferação celular nesta última condição. O cDNA obtido a partir das culturas primárias de CaP foi usado para a amplificação do mRNA de oito genes candidatos a normalizadores, além dos mRNAs do AR e PSA. O cDNA das células LNCaP foi usado para amplificação do mRNA do PSA, e o sobrenadante das células coletado para a dosagem do PSA secretado. Resultados: Apenas 47,7% do total de culturas primárias apresentaram adesão dos fragmentos e proliferação de células. Não foi observada associação entre a adesão dos fragmentos e o escore de Gleason dos tumores. As células cultivadas apresentaram positividade para os marcadores de células epiteliais e de malignidade de células prostáticas, indicando que as células em cultivo se tratavam de células tumorais prostáticas. Para análise da expressão gênica nestas células, o gene que mostrou os melhores parâmetros de estabilidade de expressão foi o gene SDHA, e a melhor combinação de dois genes sugerida neste estudo foi SDHA e ALAS1. O silenciamento do receptor de androgênios foi observado 48 horas após a transfecção com siRNAs, sendo observada uma diminuição nos níveis do mRNA já em 24 horas após a transfecção. Observou-se uma diminuição da expressão gênica do PSA em 24 horas, em resposta à diminuição dos níveis do AR, tanto em cultura primária de CaP quanto na linhagem LNCaP. Em células LNCaP, a transfecção com siRNAs específicos para o NCoR1 não depletou completamente os níveis proteicos, porém estes diminuíram em 24, 48 e 72 horas após a transfecção. Foi verificado um aumento da expressão gênica de PSA 48 horas após o silenciamento do NCoR1, em células tradadas com diidrotestosterona. Não foi observado aumento da secreção de PSA no sobrenadante das células em cultivo 48 horas após o silenciamento. A proliferação das células LNCaP foi diminuída nos grupos transfectados com siRNAs específicos para o NCoR1 e siRNAs inespecíficos, em relação com grupo controle. Conclusões: O modelo de cultura celular a partir de fragmentos tumorais prostáticos é viável, e proporciona uma boa amostragem de células para análises moleculares de câncer de próstata sob diferentes condições experimentais. No entanto, a taxa de sucesso dos cultivos é moderada. Neste modelo, em que foram testados diversos genes em relação à sua estabilidade de expressão, o gene SDHA apresentou uma boa estabilidade, ao contrário de outros genes frequentemente utilizados como genes de referência sem nenhuma análise prévia de sua expressão, como beta-actina, GAPDH e beta-2-microglobulina. Assim, o SDHA, ou ainda a combinação SDHA e ALAS1, é indicado para as estratégias de normalização neste tipo de amostra. O silenciamento do AR em células tumorais prostáticas diminuiu a expressão gênica de PSA, como esperado. O silenciamento de seu correpressor, NCoR1, aumentou os níveis de mRNA do PSA, indicando que sua ausência resulta em um aumento da atividade transcricional do AR. A menor taxa de proliferação nos grupos transfectados pode estar mais relacionada ao estresse da transfecção do que à ausência de NCoR1 nas células. Mais análises poderão confirmar os efeitos da ausência deste correpressor sobre a resposta das células tumorais prostáticas, o que abrirá caminho para um melhor entendimento da fisiopatologia dos tumores prostáticos. / Introduction: Prostate cancer (PCa) occurs in seventy-five percent of men over 65 years old, and it is the sixth most common type of cancer in the world and the most prevalent in men. Androgen receptor (AR) plays a critical role in normal prostate gland development and also in prostate cancer. Its transcriptional activity is regulated by protein interaction and NCoR1 (nuclear receptor co-repressor) decreases the AR activity on target genes transcription. Objectives: To develop a prostate cancer cell culture model from tumor fragments; to identify the best housekeeping gene for gene expression studies in that cultured cells; to evaluate the effects of AR and NCoR1 silencing on cell proliferation and PSA gene expression, a AR target gene, in cells of primary culture of PCa and in a prostate cancer cell line, LNCaP. Methods: PCa fragments obtained from radical prostatectomy or prostatovesiculectomy were plated and maintained in culture. Proliferating cells were tested for markers of epithelium (cytokeratin) and malignancy (racemase). After ten days, cells were transfected with AR siRNAs and then lysed for total RNA or protein extraction. LNCaP cells were silenced for AR and NCoR1, and proliferation rate was also measured in the last condition. cDNA obtained from primary culture was used to amplify eight candidate to housekeeping genes mRNA, and also AR and PSA mRNA. cDNA from LNCaP cells was used to amplify PSA mRNA, and the cells supernatant was collected to dose secreted PSA. Results: Only 47.7% of the total number of primary cultures had fragment adhesion and cell proliferation. There was no association between explants adhesion and tumor Gleason’s score. Cells were positive for epithelium and malignancy markers, confirming the growth of prostate cancer cells. For gene expression analysis in these cells, the gene showing the best parameters of stability of expression was SDHA, and the best combination of two genes was SDHA and ALAS1. AR silencing was observed in 48 hours after siRNA transfection, with a decrease of mRNA levels in 24 hours after transfection. There was a decrease of PSA gene expression in 24 hours, either in primary culture or in LNCaP cells. In LNCaP cells, transfection with NCoR1 siRNA did not depleted entirely the protein levels. However, the levels of NCoR1 decreased in 24, 48, and 72 hours after transfection in relation to control group. There was an increase of PSA gene expression in 48 hours after NCoR1 siRNA transfection in cells treated with dihydrotestosterone. There was no increase in PSA secretion in cells supernatant in response to NCoR1 silencing. LNCaP cell proliferation was decreased in both transfected groups, the specific siRNA to NCoR1 and the unspecific control, in relation to control group. Conclusions: the culture cell model from explants of prostate cancer is practicable, and provides a good cell sampling to molecular analysis of prostate cancer under different experimental conditions. Nevertheless, the successful rate of cultures is moderate. In this model, several genes were tested for expression stability, and SDHA had presented the best values, unlike others classical housekeeping genes, as beta-actin, GAPDH and beta-2-microglobulin. Thus, SDHA, or the combination of SDHA and ALAS1, is indicated to normalization strategies in these samples. The silencing of AR in prostate cancer cells had decreased PSA gene expression, as expected. The silencing of its co-repressor, NCoR1, had increased the PSA mRNA levels, indicating that the absence of this coregulator results in an increase of AR transcriptional activity. The smaller proliferation of transfected groups in relation to control group could be related to the transfection stress, more than to the absence of NCoR1. More analysis can confirm the effects of NCoR1 silencing on tumor cells proliferation rate, and contribute to a better understanding of prostate tumors pathophysiology.

Introdução. O câncer de próstata (CaP) é o mais comum em homens nos Estados Unidos. Em 2010, formam estimados 192.280 novos casos de CaP e 27.360 mortes nos Estados Unidos. A incidência estimada de CaP no Brasil é de 52.350 novos casos em 2010, principalmente na região sul. A hiperplasia prostática benigna (HPB) é uma anormalidade proliferativa associada à idade em homens. A prevalência de HPB é em torno de 14% entre 40 e 50 anos e 43% acima de 60 anos. A patogênese do desenvolvimento tumoral tem sido associada com a ação dos hormônios esteróides. Os efeitos dos androgênios são mediados pela testosterona e pela dihidrotestosterona (DHT) nas células alvo. Suas ações têm sido demonstradas na morfogênese, diferenciação, proliferação e secreção da glândula prostática. A ligação do androgênio promove a ativação do receptor de androgênio (AR), recrutamento de cofatores, promovendo a transcrição dos genes alvos hormônio-dependentes. Numerosos correguladores do AR têm sido descritos como sendo essenciais para a ativação do AR durante a progressão da doença. SHP, FHL2 e o complexo P160 (SRC1, GRIP1 e AIB1) parecem ser importantes correguladores do AR. O polimorfismo CAG e GGC do AR pode alterar a transcrição dos genes responsivos aos androgênios e, potencialmente, atuar no desenvolvimento da HPB e do CaP. Objetivo. 1. Investigar a associação entre o número de repetições CAG e GGC do AR, os níveis de testosterona e a chance de desenvolver CaP ou HPB em nossa população. 2. Investigar a expressão de SHP, FHL2, do complexo P160 e do AR em tecidos HPB, CaP e ZPU (zona periuretral proveniente das amostras CaP). Materiais e Métodos. Foram analisados 344 pacientes oriundos do Hospital de Clínicas de Porto Alegre, sendo 130 CaP, 126 HPB e 88 controles, para analisar o polimorfismo CAG e GGC. O DNA foi extraído a partir do sangue periférico e o gene do AR foi analisado através de análise de fragmento. Cento e dois pacientes submetidos à cirurgia foram utilizados para avaliar as expressões gênicas. Foram avaliados 36 HPB, 66 CaP e 33 ZPU. O RNA foi extraído e as expressões gênicas foram analisadas por PCR em tempo real. Os protocolos e os termos de consentimento foram aprovados pelo comitê de ética local e nacional. Resultados. As médias do número de repetições CAG e GGC foram semelhantes entre os grupos CaP, HPB e controles. A chance de desenvolver CaP nos indivíduos que possuem um longo alelo para o polimorfismo GGC (GGC > 18 e GGC >19) é de 1,96 e 3,30 vezes maior do que o alelo curto (GGC ≤ 18 e GGC ≤ 19) (p=0,035 e p=0,007), respectivamente. A chance de desenvolver HPB em indivíduos que possuem o alelo longo para o polimorfismo GGC (GGC > 18) é 2,33 vezes maior (p=0,008) do que o alelo curto (GGC ≤ 18). O risco de desenvolver CaP e HPB em pacientes com a testosterona total < 4ng/mL foram de 2,80 (P=0,005) e 2,78 vezes maior (P=0,002), respectivamente, comparado com os pacientes com testosterona total > 4ng/mL. Os níveis séricos de testosterona total em pacientes com GGC > 19 foram significativamente menor comparados com pacientes com GGC ≤ 19 (P=0,001). A expressão gênica de AR foi maior no grupo ZPU e CaP em relação ao grupo HPB (P=0,033 e P<0.001, respectivamente). A expressão de SHP foi maior no grupo CaP comparado com o HPB (P=0,039). A expressão de FHL2 foi maior no grupo ZPU comparado com o CaP e HPB (P<0.001 e P=0.007, respectivamente). Dos genes que formam o complexo P160, a expressão de SRC1 foi maior no grupo ZPU comparado com o CaP (P<0.001) e HPB (P=0,005). GRIP1 foi mais expresso nos grupos CaP e ZPU em relação ao grupo HPB (P<0,001 e P=0.006, respectivamente) e a expressão de AIB1 foi maior nos grupos CaP e ZPU comparados ao grupo HPB (P=0,030 e P=0.001, respectivamente). A expressão protéica de FHL2 foi maior no grupo CaP comparado com o grupo HPB (P=0.023). As análises moleculares de AR, GRIP1 e AIB1, monstraram melhores parâmetros diagnósticos do que a análise dos níveis séricos de PSA. Conclusões. A presença de um número de repetições GGC>18 e GGC>19 do AR foi associada com o aumento da chance de desenvolver CaP. As repetições de GGC>18 também foram associadas com a chance de desenvolver HPB. Níveis baixos de testosterona sérica foram encontrados nos grupos CaP e HPB comparados com os controles. Baixos níveis de testosterona podem aumentar a chance de desenvolver CaP e HPB. Este estudo demonstra a participação dos genes AR, SHP, FHL2 e do complexo P160 no aumento de proliferação da glândula prostática. AR, FHL2, SRC1, GRIP1 e AIB1 poderão ser uma boa alternativa para acompanhar os pacientes que possuem níveis elevados de PSA, toque alterado e biópsia negativa. / Introduction. Prostate cancer (PCa) is the most common cancer in men within the U.S. In 2010, 192,280 new cases were estimated in the U.S., and 27,360 deaths were due to this disease. The estimated incidence of prostate cancer in Brazil is of 52,350 new cases in 2010, mainly in southern regions. Benign Prostatic Hyperplasia (BPH) is a very frequent age-related proliferative abnormality in men. The prevalence of BPH is around 14 % at the age of 40 to 50 years, and 43% among those 60+. The pathogenesis of tumor development has been closely associated to the action of steroid hormones. The androgenic effects are mediated by testosterone and dihydrotestosterone (DHT) in the target cells and their action have been demonstrated in morphogenesis, differentiation, cell proliferation and secretions of the prostate gland. The androgen binding promotes the activation of the androgen receptor, recruitment of co-factors, promoting the transcription of hormone-dependent target genes. Several AR-associated coregulators have been shown to be essential for AR activation during disease progression. SHP, FHL2 and P160 complex (SRC1, GRIP1 and AIB1) has been shown as important AR coregulators. Polymorphic CAG and GGC repeats in the androgen receptor (AR) can alter transactivation of androgen-responsive genes and, potentially, act over BPH and PCa risks. Purposes. 1. To investigate the association between CAG and GGC repeat length, testosterone levels and the risks of PCa and BPH in a case-control study from a Brazilian population. 2. To investigate the SHP, FHL2, P160 and AR expressions in BPH, PCa and PUZ (periurethral zone tissue from PCa sample) tissues. Material and Methods. At Hospital de Clínicas de Porto Alegre, 344 patients were evaluated; 130 PCa, 126 BPH and 88 healthy controls, to analyze CAG and GGC polymorphisms. DNA was extracted from peripheral leukocytes and the AR gene was analyzed by fragment analysis. Hazard Ratio (HR) and 95% confidence limits were estimated. 102 men undergoing surgical removal were evaluated to analyze gene expressions; 36 BPH, 66 PCa and 33 PUZ. RNA was extracted and gene expression was analyzed by real time RT-PCR. Protocols and informed consent were approved by the local and national ethics committee. Results. CAG and GGC mean lengths were not different between PCa, BPH and controls. The risk of developing PCa in individuals who have the long allele for GGC polymorphism (GGC > 18 and GGC >19) was 1.96 and 3.30 times higher compared to the short allele (GGC ≤ 18 and GGC ≤ 19) (P=0.035 and P=0.007), respectively. The risk of developing BPH in individuals who have the long allele for GGC polymorphism (GGC > 18) was 2.33 times higher compared to the short allele (GGC ≤ 18) (P=0.008). The risk of developing PCa and BPH in individuals who have the total testosterone < 4ng/mL were 2.80 (P=0.005) and 2.78 times higher (P=0.002), respectively, compared to individuals with testosterone levels > 4ng/mL. The total testosterone level in patients with GGC >19 was significantly lower in comparison to patients with GGC ≤ 19 (P=0.001). AR mRNA level was higher in PCa and PUZ group than BPH (P=0.033 and P<0.001, respectively). SHP level was higher in PCa group compared to BPH (P=0.039). FHL2 level was higher in PUZ group compared to PCa and HPB (P<0.001 and P=0.007, respectively). SRC1 showed no difference between PCa and BPH, but PUZ group SRC1 levels was higher compared to PCa (P<0.001) and BPH (P=0,005). GRIP1 levels were higher in PCa and PUZ group than BPH (P<0.001 and P=0.006, respectively). AIB1 level was higher in PCa and PUZ group compared to BPH (P=0.030 and P=0.001, respectively). FHL2 protein expression was higher in PCa group compared to HPB (P=0.023). Molecular analysis of AR, GRIP1 and AIB1 demonstrated better diagnosis parameters compared to serum PSA levels. Conclusions. Our data suggest that the presence of a long number of GGC polymorphic repeats in the androgen receptor gene is associated with the increased risk of developing PCa and BPH. Serum testosterone levels were lower in PCA and BPH groups when compared to control groups. Low levels of testosterone can increase the risk of PCa and BPH. This study indicates a larger participation of AR, SHP, FHL2 and P160 genes in the prostate proliferation. AR, FHL2, SRC1, GRIP1 and AIB1 might be analyzed on the future to accomplish some patients who have higher PSA levels, altered digital rectal examination, and negative biopsy.

Introdução: O câncer de próstata atinge cerca de três quartos da população masculina acima de 65 anos, sendo esta neoplasia o sexto tipo de câncer mais comum no mundo, e o mais prevalente em homens. O receptor de androgênios (AR) desempenha um papel crítico no desenvolvimento normal da próstata, bem como no câncer prostático. Sua atividade transcricional é regulada através da interação com diversas proteínas. O NCoR1 (correpressor de receptores nucleares) está envolvido na diminuição da atividade do AR sobre a transcrição de genes alvo. Objetivos: Desenvolver um modelo de cultura celular de câncer prostático a partir de fragmentos tumorais; identificar o melhor gene normalizador para estudos de expressão gênica em amostras das células em cultivo; avaliar os efeitos do silenciamento do AR e seu corregulador, NCoR1, sobre a proliferação celular e expressão gênica de PSA, um gene alvo do AR, em células de cultura primária e em células de uma linhagem de câncer prostático (LNCaP – Lymph Node Carcinoma of the Prostate). Métodos: Fragmentos de tumores prostáticos coletados após prostatectomia radical ou prostatovesiculectomia foram plaqueados e mantidos em cultivo. As células que proliferaram a partir dos explants foram testadas para marcadores de epitélio (citoqueratinas) e de malignidade (racemase). Após 10 dias, as células foram silenciadas para o AR e, posteriormente, lisadas para a extração de RNA total ou de proteínas. Células LNCaP foram mantidas em cultura e silenciadas para o AR e o NCoR1, sendo avaliada também a proliferação celular nesta última condição. O cDNA obtido a partir das culturas primárias de CaP foi usado para a amplificação do mRNA de oito genes candidatos a normalizadores, além dos mRNAs do AR e PSA. O cDNA das células LNCaP foi usado para amplificação do mRNA do PSA, e o sobrenadante das células coletado para a dosagem do PSA secretado. Resultados: Apenas 47,7% do total de culturas primárias apresentaram adesão dos fragmentos e proliferação de células. Não foi observada associação entre a adesão dos fragmentos e o escore de Gleason dos tumores. As células cultivadas apresentaram positividade para os marcadores de células epiteliais e de malignidade de células prostáticas, indicando que as células em cultivo se tratavam de células tumorais prostáticas. Para análise da expressão gênica nestas células, o gene que mostrou os melhores parâmetros de estabilidade de expressão foi o gene SDHA, e a melhor combinação de dois genes sugerida neste estudo foi SDHA e ALAS1. O silenciamento do receptor de androgênios foi observado 48 horas após a transfecção com siRNAs, sendo observada uma diminuição nos níveis do mRNA já em 24 horas após a transfecção. Observou-se uma diminuição da expressão gênica do PSA em 24 horas, em resposta à diminuição dos níveis do AR, tanto em cultura primária de CaP quanto na linhagem LNCaP. Em células LNCaP, a transfecção com siRNAs específicos para o NCoR1 não depletou completamente os níveis proteicos, porém estes diminuíram em 24, 48 e 72 horas após a transfecção. Foi verificado um aumento da expressão gênica de PSA 48 horas após o silenciamento do NCoR1, em células tradadas com diidrotestosterona. Não foi observado aumento da secreção de PSA no sobrenadante das células em cultivo 48 horas após o silenciamento. A proliferação das células LNCaP foi diminuída nos grupos transfectados com siRNAs específicos para o NCoR1 e siRNAs inespecíficos, em relação com grupo controle. Conclusões: O modelo de cultura celular a partir de fragmentos tumorais prostáticos é viável, e proporciona uma boa amostragem de células para análises moleculares de câncer de próstata sob diferentes condições experimentais. No entanto, a taxa de sucesso dos cultivos é moderada. Neste modelo, em que foram testados diversos genes em relação à sua estabilidade de expressão, o gene SDHA apresentou uma boa estabilidade, ao contrário de outros genes frequentemente utilizados como genes de referência sem nenhuma análise prévia de sua expressão, como beta-actina, GAPDH e beta-2-microglobulina. Assim, o SDHA, ou ainda a combinação SDHA e ALAS1, é indicado para as estratégias de normalização neste tipo de amostra. O silenciamento do AR em células tumorais prostáticas diminuiu a expressão gênica de PSA, como esperado. O silenciamento de seu correpressor, NCoR1, aumentou os níveis de mRNA do PSA, indicando que sua ausência resulta em um aumento da atividade transcricional do AR. A menor taxa de proliferação nos grupos transfectados pode estar mais relacionada ao estresse da transfecção do que à ausência de NCoR1 nas células. Mais análises poderão confirmar os efeitos da ausência deste correpressor sobre a resposta das células tumorais prostáticas, o que abrirá caminho para um melhor entendimento da fisiopatologia dos tumores prostáticos. / Introduction: Prostate cancer (PCa) occurs in seventy-five percent of men over 65 years old, and it is the sixth most common type of cancer in the world and the most prevalent in men. Androgen receptor (AR) plays a critical role in normal prostate gland development and also in prostate cancer. Its transcriptional activity is regulated by protein interaction and NCoR1 (nuclear receptor co-repressor) decreases the AR activity on target genes transcription. Objectives: To develop a prostate cancer cell culture model from tumor fragments; to identify the best housekeeping gene for gene expression studies in that cultured cells; to evaluate the effects of AR and NCoR1 silencing on cell proliferation and PSA gene expression, a AR target gene, in cells of primary culture of PCa and in a prostate cancer cell line, LNCaP. Methods: PCa fragments obtained from radical prostatectomy or prostatovesiculectomy were plated and maintained in culture. Proliferating cells were tested for markers of epithelium (cytokeratin) and malignancy (racemase). After ten days, cells were transfected with AR siRNAs and then lysed for total RNA or protein extraction. LNCaP cells were silenced for AR and NCoR1, and proliferation rate was also measured in the last condition. cDNA obtained from primary culture was used to amplify eight candidate to housekeeping genes mRNA, and also AR and PSA mRNA. cDNA from LNCaP cells was used to amplify PSA mRNA, and the cells supernatant was collected to dose secreted PSA. Results: Only 47.7% of the total number of primary cultures had fragment adhesion and cell proliferation. There was no association between explants adhesion and tumor Gleason’s score. Cells were positive for epithelium and malignancy markers, confirming the growth of prostate cancer cells. For gene expression analysis in these cells, the gene showing the best parameters of stability of expression was SDHA, and the best combination of two genes was SDHA and ALAS1. AR silencing was observed in 48 hours after siRNA transfection, with a decrease of mRNA levels in 24 hours after transfection. There was a decrease of PSA gene expression in 24 hours, either in primary culture or in LNCaP cells. In LNCaP cells, transfection with NCoR1 siRNA did not depleted entirely the protein levels. However, the levels of NCoR1 decreased in 24, 48, and 72 hours after transfection in relation to control group. There was an increase of PSA gene expression in 48 hours after NCoR1 siRNA transfection in cells treated with dihydrotestosterone. There was no increase in PSA secretion in cells supernatant in response to NCoR1 silencing. LNCaP cell proliferation was decreased in both transfected groups, the specific siRNA to NCoR1 and the unspecific control, in relation to control group. Conclusions: the culture cell model from explants of prostate cancer is practicable, and provides a good cell sampling to molecular analysis of prostate cancer under different experimental conditions. Nevertheless, the successful rate of cultures is moderate. In this model, several genes were tested for expression stability, and SDHA had presented the best values, unlike others classical housekeeping genes, as beta-actin, GAPDH and beta-2-microglobulin. Thus, SDHA, or the combination of SDHA and ALAS1, is indicated to normalization strategies in these samples. The silencing of AR in prostate cancer cells had decreased PSA gene expression, as expected. The silencing of its co-repressor, NCoR1, had increased the PSA mRNA levels, indicating that the absence of this coregulator results in an increase of AR transcriptional activity. The smaller proliferation of transfected groups in relation to control group could be related to the transfection stress, more than to the absence of NCoR1. More analysis can confirm the effects of NCoR1 silencing on tumor cells proliferation rate, and contribute to a better understanding of prostate tumors pathophysiology.

O câncer de próstata (CaP) e a hiperplasia prostática benigna (HPB) são as doenças da próstata mais comuns, e ambas são alterações do controle do crescimento prostático, compartilhando uma prevalência aumentada com o avanço da idade. A deprivação androgênica é uma das opções de tratamento mais comuns para o CaP e, embora resulte em um período de regressão clínica, muitos pacientes acabam progredindo para uma condição refratária à terapia hormonal, conhecida como CaP independente de androgênios (resistente à castração). Alterações moleculares no receptor de androgênios (AR) têm sido associadas à progressão do CaP. Neste estudo, buscamos identificar a presença de isoformas do AR derivadas de splicing alternativo tanto em tecido benigno de HPB (n = 30) quanto em tecido maligno de CaP (n = 27). As isoformas estudadas foram o AR3, AR4, AR5 e AR6. A expressão gênica do AR não apresentou diferença entre os tecidos estudados (P = 0,160). O AR4 apresentou maior expressão nos pacientes com CaP (P = 0,029) e, dentre estes, os níveis de expressão foram maiores nos pacientes que apresentaram recidiva bioquímica (P = 0,049). Dada a similaridade entre as moléculas de cDNA das isoformas AR3, AR5 e AR6, diferentes estratégias de detecção do mRNA foram utilizadas. A amplificação conjunta do AR3, AR5 e AR6 (AR3/5/6) foi maior no grupo CaP (P = 0,021), enquanto que a expressão das isoformas AR5 e AR6 (AR5/6) não foi diferente entre os grupos (P = 0,184). Com o objetivo de inferir um valor para a expressão do AR3, também foi analisada a razão (AR3/5/6) / (AR5/6), que apresentou maiores níveis de expressão no grupo CaP em relação ao grupo HPB (P < 0,0001). Nas amostras de CaP, foi encontrada uma correlação positiva entre o escore de Gleason e os níveis de mRNA das isoformas AR5/6 (0,524; P = 0,006) e uma correlação negativa entre o escore de Gleason e a razão (AR3/5/6) / (AR5/6) (-0,429; P = 0,029). A expressão gênica do AR4 correlacionou-se positivamente com a expressão gênica das isoformas AR3/5/6 e AR5/6 (0,646; P < 0,001 e 0,518; P = 0,006). Nas amostras de HPB, foi encontrada uma correlação positiva entre a expressão gênica do AR e os níveis plasmáticos de PSA pré-operatório (0,479; P = 0,013). Também foi encontrada uma correlação positiva entre a expressão gênica do AR4 e a expressão gênica do AR3/5/6 (0,818; P < 0,001), do AR5/6 (0,387; P = 0,035) e a razão (AR3/5/6) / (AR5/6) (0,394; P = 0,031) nesse grupo. Embora em níveis diferentes, todas as isoformas estudadas foram expressas tanto em tecido benigno (HPB) quanto em tecido maligno (CaP). Desta forma, estes resultados permitem assumir que estas isoformas constitutivamente ativas estejam envolvidas no desenvolvimento destas doenças prostáticas. E, ainda, a expressão do AR4 pode ser associada com a recidiva do CaP após o tratamento cirúrgico. / Prostate cancer (PCa) and benign prostatic hyperplasia (BPH) are the most common prostatic diseases and both are disorders in prostatic growth, whose prevalence increase with age. The androgen deprivation is one of the most common therapies for PCa, and, although there is a period of clinical remission, many patients occasionally progress to a condition refractory to hormone therapy, known as androgen-independent CaP (castration-resistant). Molecular changes in the androgen receptor (AR) have been associated with progression of PCa. This study aimed at identifying the presence of AR isoforms derived from alternative splicing both in benign tissue of BPH (n = 30) and in malignant tissue of PCa (n = 27). The isoforms studied were AR3, AR4, AR5 and AR6. AR gene expression did not differ between the studied groups (P = 0.160). AR4 showed higher expression in PCa patients (P = 0.029) and, among these, the expression levels were higher in patients with biochemical recurrence (P = 0.049). Given the similarity between the molecules of cDNA from AR3, AR5 and AR6, their detection was performed using a different strategy for mRNA amplification. The expression of AR3, AR5 and AR6 (AR3/5/6), together, was higher in PCa group (P = 0.021), while the expression of only AR5 and AR6 (AR5/6) was not different between the groups (P = 0.184). Aiming at inferring a value for the expression of AR3, it was also analyzed the ratio (AR3/5/6) / (AR5/6), which showed higher expression levels in PCa group compared to BPH group (P <0.001). In PCa samples, we found a positive correlation between the Gleason score and the levels of mRNA isoforms AR5/6 (0,524; P = 0,006), and a negative correlation between the Gleason score and the ratio (AR3/5/6) / (AR5/6) (-0.429, P = 0.029). AR4 gene expression was positively correlated with the expression of gene isoforms AR3/5/6 and AR5/6 (0.646, P < 0.001 and 0.518, P = 0.006) in this group. In the BPH group, we found a positive correlation between the gene expression of AR and plasmatic levels of preoperative PSA (0.479, P = 0.013). We also found a positive correlation between AR4 and AR3/5/6 gene expression (0.818, P = 0.0001), AR5/6 (0.387, P = 0.035) and the reason (AR3/5/6) / (AR5/6) (0.394, P = 0.031) in this group. Although at different levels, all investigated isoforms were expressed both in benign tissue (BPH) and in malignant tissue (PCa). These results support the assumption that these constitutively active isoforms of AR are involved in the development of prostatic diseases. Furthermore, AR4 expression may be associated with recurrence after radical prostatectomy.

O desenvolvimento de doenças que acometem a próstata está associado ao eixo de sinalização androgênica, o qual é altamente dependente do receptor de androgênios (AR) e dos níveis de androgênios circulantes. O AR atua como fator de transcrição, mediando a ativação ou repressão da transcrição de inúmeros genes. Deste modo, o AR apresenta um importante papel na regulação da proliferação e diferenciação de células prostáticas. Nesse estudo, buscamos identificar a expressão gênica de diversos genes associados à via de sinalização androgênica em amostras microdissecadas de tecido epitelial de hiperplasia prostática benigna (HPB) (n=3) e câncer de próstata (CaP) (n=3) através do ensaio TaqManArrayHumanAndrogens pela técnica de RT-qPCR, além da expressão proteica de alguns genes diferentemente expressos. A expressão gênica mostrou que 17 genes (AIG1, APPL1, BRCA1, BRCA2, CDC25B, ESR2, HSD17B3, HSD17B8, IL8, MED17, MED24, PAK6, PIM1, POR, SHH, SOAT1 e WDR19) apresentaram expressão somente no grupo CaP, 7 genes (MED13, SPDEF, RDH11, CALR, NKX3-1, KLK4 e PMEPA1) apresentaram expressão aumentada no grupo CaP em relação ao grupo HPB, 40 genes (HSD11B1, TGFB1I1, BCL2, UGT2B17, SRY, UGT2B15, MED1, RCHY1, PA2G4, KAT2B, FOXO3, MED14, SUMO1, PIAS2, CALCOCO1, HSD17B6, DAXX, MED4, PARK7, PATZ1, NR2C1, TMPRSS2, PIAS1, AR, MED12, SCARB1, PART1, PIAS3, NSD1, MED16, AOF2, ZMIZ1, NCOA1, MYST2, IGFBP5, SART3, CREBBP, TGIF1, CLDN3 e FKBP4) apresentaram expressão diminuída no grupo CaP em relação ao grupo HPB, 21 genes (AKR1C4, BMX, CRISP1, CYP11A1, CYP11B1, CYP19A1, CYP21A1, DHRS9, FGF8, GPX5, GRP, HSD3B1, IL4, INFG, SHBG, STS, SPAG11B, TGM4, UGT1A8, UGT2A1 e UGT2B7) não apresentaram expressão em nenhum dos grupos e 7 genes (ESR1, IL6, NCOA2, NCOA4, PDS5B, SRD5A1 e SRD5A2) apresentaram expressão em ambos os grupos, mas não foi possível analisá-los. Na expressão proteica do AR encontramos que este está mais expresso no núcleo de células hiperplásicas e no citoplasma em células tumorais. O BRCA1 predomina no citoplasma de células tumorais, enquanto uma pequena fração de células hiperplásicas apresenta positividade no núcleo e o NKX3-1 apresenta maior expressão citoplasmática no CaP e semelhante expressão no núcleo de ambos os grupos. Assim, este trabalho mostra a grande heterogeneidade tumoral através da variação na expressão gênica e proteica tanto de genes que favorecem como que os que impedem a permanência tumoral no tecido tumoral específico, e, acredita-se que por se tratar de um CaP primário, ainda estejam ativadas vias regulatórias que tendem a contensão tumoral. / The development of diseases affecting the prostate is associated with the androgenic signaling axis, which is highly dependent on the androgen receptor (AR) and circulating levels of androgens. The AR acts as a transcription factor, mediating the activation or repression of the transcription of innumerable genes. Thus, AR plays an important role in the regulation of prostate cell proliferation and differentiation. In this study, we sought to identify the gene expression of several genes associated with the androgenic signaling pathway in microdissected samples of benign prostatic hyperplasia (BPH) (n = 3) and prostate cancer (PC) (n = 3) by RT-qPCR , as also the protein expression of some differentially expressed genes. Gene expression showed that 17 genes (AIG1, APPL1, BRCA1, BRCA2, CDC25B, ESR2, HSD17B3, HSD17B8, IL8, MED17, MED24, PAK6, PIM1, POR, SHH, SOAT1 and WDR19) Presented expression only in the CaP group Seven genes (MED13, SPDEF, RDH11, CALR, NKX3-1, KLK4 and PMEPA1) presented increased expression in the CaP group compared to the HPB group; 40 genes (HSD11B1, TGFB1I1, BCL2, UGT2B17, SRY, UGT2B15, MED1, RCHY1, PA2G4, KAT2B, FOXO3, MED14, SUMO1, PIAS2, CALCOCO1, HSD17B6, DAXX, MED4, PARK7, PATZ1, NR2C1, TMPRSS2, PIAS1, AR, MED12 , SCARB1, PART1, PIAS3, NSD1, MED16, AOF2, ZMIZ1, NCOA1, MYST2, IGFBP5, SART3, CREBBP, TGIF1, CLDN3 and FKBP4) had decreased expression in the CaP group compared to the HPB group; 21 genes (AKR1C4, BMX, CRISP1, CYP11B1, CYP19A1, CYP21A1, DHRS9, FGF8, GPX5, GRP, HSD3B1, IL4, INFG, SHBG, STS, SPAG11B, TGM4, UGT1A8, UGT2A1 and UGT2B7) did not show expression in any of the groups and 7 genes (ESR1, IL6, NCOA2, NCOA4, PDS5B, SRD5A1 and SRD5A2) presented expression in both groups, but it was not possible to analyze them. In the protein expression of AR we find that it is more expressed in the nucleus of hyperplastic cells and in the cytoplasm in tumor cells. BRCA1 predominates in the cytoplasm of tumor cells, whereas a small fraction of hyperplastic cells is positive in the nucleus, and NKX3-1 shows greater cytoplasmic expression in CaP and similar expression in the nucleus of both groups. Thus, this work shows the great tumor heterogeneity through the variation in the gene and protein expression of both genes that favor as well as those that prevent tumor permanence in the specific tumor tissue, and it is believed to be the primary CaP, regulatory pathways that tend to contain tumor are activated.

Introdução. O câncer de próstata (CaP) é o mais comum em homens nos Estados Unidos. Em 2010, formam estimados 192.280 novos casos de CaP e 27.360 mortes nos Estados Unidos. A incidência estimada de CaP no Brasil é de 52.350 novos casos em 2010, principalmente na região sul. A hiperplasia prostática benigna (HPB) é uma anormalidade proliferativa associada à idade em homens. A prevalência de HPB é em torno de 14% entre 40 e 50 anos e 43% acima de 60 anos. A patogênese do desenvolvimento tumoral tem sido associada com a ação dos hormônios esteróides. Os efeitos dos androgênios são mediados pela testosterona e pela dihidrotestosterona (DHT) nas células alvo. Suas ações têm sido demonstradas na morfogênese, diferenciação, proliferação e secreção da glândula prostática. A ligação do androgênio promove a ativação do receptor de androgênio (AR), recrutamento de cofatores, promovendo a transcrição dos genes alvos hormônio-dependentes. Numerosos correguladores do AR têm sido descritos como sendo essenciais para a ativação do AR durante a progressão da doença. SHP, FHL2 e o complexo P160 (SRC1, GRIP1 e AIB1) parecem ser importantes correguladores do AR. O polimorfismo CAG e GGC do AR pode alterar a transcrição dos genes responsivos aos androgênios e, potencialmente, atuar no desenvolvimento da HPB e do CaP. Objetivo. 1. Investigar a associação entre o número de repetições CAG e GGC do AR, os níveis de testosterona e a chance de desenvolver CaP ou HPB em nossa população. 2. Investigar a expressão de SHP, FHL2, do complexo P160 e do AR em tecidos HPB, CaP e ZPU (zona periuretral proveniente das amostras CaP). Materiais e Métodos. Foram analisados 344 pacientes oriundos do Hospital de Clínicas de Porto Alegre, sendo 130 CaP, 126 HPB e 88 controles, para analisar o polimorfismo CAG e GGC. O DNA foi extraído a partir do sangue periférico e o gene do AR foi analisado através de análise de fragmento. Cento e dois pacientes submetidos à cirurgia foram utilizados para avaliar as expressões gênicas. Foram avaliados 36 HPB, 66 CaP e 33 ZPU. O RNA foi extraído e as expressões gênicas foram analisadas por PCR em tempo real. Os protocolos e os termos de consentimento foram aprovados pelo comitê de ética local e nacional. Resultados. As médias do número de repetições CAG e GGC foram semelhantes entre os grupos CaP, HPB e controles. A chance de desenvolver CaP nos indivíduos que possuem um longo alelo para o polimorfismo GGC (GGC > 18 e GGC >19) é de 1,96 e 3,30 vezes maior do que o alelo curto (GGC ≤ 18 e GGC ≤ 19) (p=0,035 e p=0,007), respectivamente. A chance de desenvolver HPB em indivíduos que possuem o alelo longo para o polimorfismo GGC (GGC > 18) é 2,33 vezes maior (p=0,008) do que o alelo curto (GGC ≤ 18). O risco de desenvolver CaP e HPB em pacientes com a testosterona total < 4ng/mL foram de 2,80 (P=0,005) e 2,78 vezes maior (P=0,002), respectivamente, comparado com os pacientes com testosterona total > 4ng/mL. Os níveis séricos de testosterona total em pacientes com GGC > 19 foram significativamente menor comparados com pacientes com GGC ≤ 19 (P=0,001). A expressão gênica de AR foi maior no grupo ZPU e CaP em relação ao grupo HPB (P=0,033 e P<0.001, respectivamente). A expressão de SHP foi maior no grupo CaP comparado com o HPB (P=0,039). A expressão de FHL2 foi maior no grupo ZPU comparado com o CaP e HPB (P<0.001 e P=0.007, respectivamente). Dos genes que formam o complexo P160, a expressão de SRC1 foi maior no grupo ZPU comparado com o CaP (P<0.001) e HPB (P=0,005). GRIP1 foi mais expresso nos grupos CaP e ZPU em relação ao grupo HPB (P<0,001 e P=0.006, respectivamente) e a expressão de AIB1 foi maior nos grupos CaP e ZPU comparados ao grupo HPB (P=0,030 e P=0.001, respectivamente). A expressão protéica de FHL2 foi maior no grupo CaP comparado com o grupo HPB (P=0.023). As análises moleculares de AR, GRIP1 e AIB1, monstraram melhores parâmetros diagnósticos do que a análise dos níveis séricos de PSA. Conclusões. A presença de um número de repetições GGC>18 e GGC>19 do AR foi associada com o aumento da chance de desenvolver CaP. As repetições de GGC>18 também foram associadas com a chance de desenvolver HPB. Níveis baixos de testosterona sérica foram encontrados nos grupos CaP e HPB comparados com os controles. Baixos níveis de testosterona podem aumentar a chance de desenvolver CaP e HPB. Este estudo demonstra a participação dos genes AR, SHP, FHL2 e do complexo P160 no aumento de proliferação da glândula prostática. AR, FHL2, SRC1, GRIP1 e AIB1 poderão ser uma boa alternativa para acompanhar os pacientes que possuem níveis elevados de PSA, toque alterado e biópsia negativa. / Introduction. Prostate cancer (PCa) is the most common cancer in men within the U.S. In 2010, 192,280 new cases were estimated in the U.S., and 27,360 deaths were due to this disease. The estimated incidence of prostate cancer in Brazil is of 52,350 new cases in 2010, mainly in southern regions. Benign Prostatic Hyperplasia (BPH) is a very frequent age-related proliferative abnormality in men. The prevalence of BPH is around 14 % at the age of 40 to 50 years, and 43% among those 60+. The pathogenesis of tumor development has been closely associated to the action of steroid hormones. The androgenic effects are mediated by testosterone and dihydrotestosterone (DHT) in the target cells and their action have been demonstrated in morphogenesis, differentiation, cell proliferation and secretions of the prostate gland. The androgen binding promotes the activation of the androgen receptor, recruitment of co-factors, promoting the transcription of hormone-dependent target genes. Several AR-associated coregulators have been shown to be essential for AR activation during disease progression. SHP, FHL2 and P160 complex (SRC1, GRIP1 and AIB1) has been shown as important AR coregulators. Polymorphic CAG and GGC repeats in the androgen receptor (AR) can alter transactivation of androgen-responsive genes and, potentially, act over BPH and PCa risks. Purposes. 1. To investigate the association between CAG and GGC repeat length, testosterone levels and the risks of PCa and BPH in a case-control study from a Brazilian population. 2. To investigate the SHP, FHL2, P160 and AR expressions in BPH, PCa and PUZ (periurethral zone tissue from PCa sample) tissues. Material and Methods. At Hospital de Clínicas de Porto Alegre, 344 patients were evaluated; 130 PCa, 126 BPH and 88 healthy controls, to analyze CAG and GGC polymorphisms. DNA was extracted from peripheral leukocytes and the AR gene was analyzed by fragment analysis. Hazard Ratio (HR) and 95% confidence limits were estimated. 102 men undergoing surgical removal were evaluated to analyze gene expressions; 36 BPH, 66 PCa and 33 PUZ. RNA was extracted and gene expression was analyzed by real time RT-PCR. Protocols and informed consent were approved by the local and national ethics committee. Results. CAG and GGC mean lengths were not different between PCa, BPH and controls. The risk of developing PCa in individuals who have the long allele for GGC polymorphism (GGC > 18 and GGC >19) was 1.96 and 3.30 times higher compared to the short allele (GGC ≤ 18 and GGC ≤ 19) (P=0.035 and P=0.007), respectively. The risk of developing BPH in individuals who have the long allele for GGC polymorphism (GGC > 18) was 2.33 times higher compared to the short allele (GGC ≤ 18) (P=0.008). The risk of developing PCa and BPH in individuals who have the total testosterone < 4ng/mL were 2.80 (P=0.005) and 2.78 times higher (P=0.002), respectively, compared to individuals with testosterone levels > 4ng/mL. The total testosterone level in patients with GGC >19 was significantly lower in comparison to patients with GGC ≤ 19 (P=0.001). AR mRNA level was higher in PCa and PUZ group than BPH (P=0.033 and P<0.001, respectively). SHP level was higher in PCa group compared to BPH (P=0.039). FHL2 level was higher in PUZ group compared to PCa and HPB (P<0.001 and P=0.007, respectively). SRC1 showed no difference between PCa and BPH, but PUZ group SRC1 levels was higher compared to PCa (P<0.001) and BPH (P=0,005). GRIP1 levels were higher in PCa and PUZ group than BPH (P<0.001 and P=0.006, respectively). AIB1 level was higher in PCa and PUZ group compared to BPH (P=0.030 and P=0.001, respectively). FHL2 protein expression was higher in PCa group compared to HPB (P=0.023). Molecular analysis of AR, GRIP1 and AIB1 demonstrated better diagnosis parameters compared to serum PSA levels. Conclusions. Our data suggest that the presence of a long number of GGC polymorphic repeats in the androgen receptor gene is associated with the increased risk of developing PCa and BPH. Serum testosterone levels were lower in PCA and BPH groups when compared to control groups. Low levels of testosterone can increase the risk of PCa and BPH. This study indicates a larger participation of AR, SHP, FHL2 and P160 genes in the prostate proliferation. AR, FHL2, SRC1, GRIP1 and AIB1 might be analyzed on the future to accomplish some patients who have higher PSA levels, altered digital rectal examination, and negative biopsy.

O desenvolvimento de doenças que acometem a próstata está associado ao eixo de sinalização androgênica, o qual é altamente dependente do receptor de androgênios (AR) e dos níveis de androgênios circulantes. O AR atua como fator de transcrição, mediando a ativação ou repressão da transcrição de inúmeros genes. Deste modo, o AR apresenta um importante papel na regulação da proliferação e diferenciação de células prostáticas. Nesse estudo, buscamos identificar a expressão gênica de diversos genes associados à via de sinalização androgênica em amostras microdissecadas de tecido epitelial de hiperplasia prostática benigna (HPB) (n=3) e câncer de próstata (CaP) (n=3) através do ensaio TaqManArrayHumanAndrogens pela técnica de RT-qPCR, além da expressão proteica de alguns genes diferentemente expressos. A expressão gênica mostrou que 17 genes (AIG1, APPL1, BRCA1, BRCA2, CDC25B, ESR2, HSD17B3, HSD17B8, IL8, MED17, MED24, PAK6, PIM1, POR, SHH, SOAT1 e WDR19) apresentaram expressão somente no grupo CaP, 7 genes (MED13, SPDEF, RDH11, CALR, NKX3-1, KLK4 e PMEPA1) apresentaram expressão aumentada no grupo CaP em relação ao grupo HPB, 40 genes (HSD11B1, TGFB1I1, BCL2, UGT2B17, SRY, UGT2B15, MED1, RCHY1, PA2G4, KAT2B, FOXO3, MED14, SUMO1, PIAS2, CALCOCO1, HSD17B6, DAXX, MED4, PARK7, PATZ1, NR2C1, TMPRSS2, PIAS1, AR, MED12, SCARB1, PART1, PIAS3, NSD1, MED16, AOF2, ZMIZ1, NCOA1, MYST2, IGFBP5, SART3, CREBBP, TGIF1, CLDN3 e FKBP4) apresentaram expressão diminuída no grupo CaP em relação ao grupo HPB, 21 genes (AKR1C4, BMX, CRISP1, CYP11A1, CYP11B1, CYP19A1, CYP21A1, DHRS9, FGF8, GPX5, GRP, HSD3B1, IL4, INFG, SHBG, STS, SPAG11B, TGM4, UGT1A8, UGT2A1 e UGT2B7) não apresentaram expressão em nenhum dos grupos e 7 genes (ESR1, IL6, NCOA2, NCOA4, PDS5B, SRD5A1 e SRD5A2) apresentaram expressão em ambos os grupos, mas não foi possível analisá-los. Na expressão proteica do AR encontramos que este está mais expresso no núcleo de células hiperplásicas e no citoplasma em células tumorais. O BRCA1 predomina no citoplasma de células tumorais, enquanto uma pequena fração de células hiperplásicas apresenta positividade no núcleo e o NKX3-1 apresenta maior expressão citoplasmática no CaP e semelhante expressão no núcleo de ambos os grupos. Assim, este trabalho mostra a grande heterogeneidade tumoral através da variação na expressão gênica e proteica tanto de genes que favorecem como que os que impedem a permanência tumoral no tecido tumoral específico, e, acredita-se que por se tratar de um CaP primário, ainda estejam ativadas vias regulatórias que tendem a contensão tumoral. / The development of diseases affecting the prostate is associated with the androgenic signaling axis, which is highly dependent on the androgen receptor (AR) and circulating levels of androgens. The AR acts as a transcription factor, mediating the activation or repression of the transcription of innumerable genes. Thus, AR plays an important role in the regulation of prostate cell proliferation and differentiation. In this study, we sought to identify the gene expression of several genes associated with the androgenic signaling pathway in microdissected samples of benign prostatic hyperplasia (BPH) (n = 3) and prostate cancer (PC) (n = 3) by RT-qPCR , as also the protein expression of some differentially expressed genes. Gene expression showed that 17 genes (AIG1, APPL1, BRCA1, BRCA2, CDC25B, ESR2, HSD17B3, HSD17B8, IL8, MED17, MED24, PAK6, PIM1, POR, SHH, SOAT1 and WDR19) Presented expression only in the CaP group Seven genes (MED13, SPDEF, RDH11, CALR, NKX3-1, KLK4 and PMEPA1) presented increased expression in the CaP group compared to the HPB group; 40 genes (HSD11B1, TGFB1I1, BCL2, UGT2B17, SRY, UGT2B15, MED1, RCHY1, PA2G4, KAT2B, FOXO3, MED14, SUMO1, PIAS2, CALCOCO1, HSD17B6, DAXX, MED4, PARK7, PATZ1, NR2C1, TMPRSS2, PIAS1, AR, MED12 , SCARB1, PART1, PIAS3, NSD1, MED16, AOF2, ZMIZ1, NCOA1, MYST2, IGFBP5, SART3, CREBBP, TGIF1, CLDN3 and FKBP4) had decreased expression in the CaP group compared to the HPB group; 21 genes (AKR1C4, BMX, CRISP1, CYP11B1, CYP19A1, CYP21A1, DHRS9, FGF8, GPX5, GRP, HSD3B1, IL4, INFG, SHBG, STS, SPAG11B, TGM4, UGT1A8, UGT2A1 and UGT2B7) did not show expression in any of the groups and 7 genes (ESR1, IL6, NCOA2, NCOA4, PDS5B, SRD5A1 and SRD5A2) presented expression in both groups, but it was not possible to analyze them. In the protein expression of AR we find that it is more expressed in the nucleus of hyperplastic cells and in the cytoplasm in tumor cells. BRCA1 predominates in the cytoplasm of tumor cells, whereas a small fraction of hyperplastic cells is positive in the nucleus, and NKX3-1 shows greater cytoplasmic expression in CaP and similar expression in the nucleus of both groups. Thus, this work shows the great tumor heterogeneity through the variation in the gene and protein expression of both genes that favor as well as those that prevent tumor permanence in the specific tumor tissue, and it is believed to be the primary CaP, regulatory pathways that tend to contain tumor are activated.

O câncer de próstata (CaP) e a hiperplasia prostática benigna (HPB) são as doenças da próstata mais comuns, e ambas são alterações do controle do crescimento prostático, compartilhando uma prevalência aumentada com o avanço da idade. A deprivação androgênica é uma das opções de tratamento mais comuns para o CaP e, embora resulte em um período de regressão clínica, muitos pacientes acabam progredindo para uma condição refratária à terapia hormonal, conhecida como CaP independente de androgênios (resistente à castração). Alterações moleculares no receptor de androgênios (AR) têm sido associadas à progressão do CaP. Neste estudo, buscamos identificar a presença de isoformas do AR derivadas de splicing alternativo tanto em tecido benigno de HPB (n = 30) quanto em tecido maligno de CaP (n = 27). As isoformas estudadas foram o AR3, AR4, AR5 e AR6. A expressão gênica do AR não apresentou diferença entre os tecidos estudados (P = 0,160). O AR4 apresentou maior expressão nos pacientes com CaP (P = 0,029) e, dentre estes, os níveis de expressão foram maiores nos pacientes que apresentaram recidiva bioquímica (P = 0,049). Dada a similaridade entre as moléculas de cDNA das isoformas AR3, AR5 e AR6, diferentes estratégias de detecção do mRNA foram utilizadas. A amplificação conjunta do AR3, AR5 e AR6 (AR3/5/6) foi maior no grupo CaP (P = 0,021), enquanto que a expressão das isoformas AR5 e AR6 (AR5/6) não foi diferente entre os grupos (P = 0,184). Com o objetivo de inferir um valor para a expressão do AR3, também foi analisada a razão (AR3/5/6) / (AR5/6), que apresentou maiores níveis de expressão no grupo CaP em relação ao grupo HPB (P < 0,0001). Nas amostras de CaP, foi encontrada uma correlação positiva entre o escore de Gleason e os níveis de mRNA das isoformas AR5/6 (0,524; P = 0,006) e uma correlação negativa entre o escore de Gleason e a razão (AR3/5/6) / (AR5/6) (-0,429; P = 0,029). A expressão gênica do AR4 correlacionou-se positivamente com a expressão gênica das isoformas AR3/5/6 e AR5/6 (0,646; P < 0,001 e 0,518; P = 0,006). Nas amostras de HPB, foi encontrada uma correlação positiva entre a expressão gênica do AR e os níveis plasmáticos de PSA pré-operatório (0,479; P = 0,013). Também foi encontrada uma correlação positiva entre a expressão gênica do AR4 e a expressão gênica do AR3/5/6 (0,818; P < 0,001), do AR5/6 (0,387; P = 0,035) e a razão (AR3/5/6) / (AR5/6) (0,394; P = 0,031) nesse grupo. Embora em níveis diferentes, todas as isoformas estudadas foram expressas tanto em tecido benigno (HPB) quanto em tecido maligno (CaP). Desta forma, estes resultados permitem assumir que estas isoformas constitutivamente ativas estejam envolvidas no desenvolvimento destas doenças prostáticas. E, ainda, a expressão do AR4 pode ser associada com a recidiva do CaP após o tratamento cirúrgico. / Prostate cancer (PCa) and benign prostatic hyperplasia (BPH) are the most common prostatic diseases and both are disorders in prostatic growth, whose prevalence increase with age. The androgen deprivation is one of the most common therapies for PCa, and, although there is a period of clinical remission, many patients occasionally progress to a condition refractory to hormone therapy, known as androgen-independent CaP (castration-resistant). Molecular changes in the androgen receptor (AR) have been associated with progression of PCa. This study aimed at identifying the presence of AR isoforms derived from alternative splicing both in benign tissue of BPH (n = 30) and in malignant tissue of PCa (n = 27). The isoforms studied were AR3, AR4, AR5 and AR6. AR gene expression did not differ between the studied groups (P = 0.160). AR4 showed higher expression in PCa patients (P = 0.029) and, among these, the expression levels were higher in patients with biochemical recurrence (P = 0.049). Given the similarity between the molecules of cDNA from AR3, AR5 and AR6, their detection was performed using a different strategy for mRNA amplification. The expression of AR3, AR5 and AR6 (AR3/5/6), together, was higher in PCa group (P = 0.021), while the expression of only AR5 and AR6 (AR5/6) was not different between the groups (P = 0.184). Aiming at inferring a value for the expression of AR3, it was also analyzed the ratio (AR3/5/6) / (AR5/6), which showed higher expression levels in PCa group compared to BPH group (P <0.001). In PCa samples, we found a positive correlation between the Gleason score and the levels of mRNA isoforms AR5/6 (0,524; P = 0,006), and a negative correlation between the Gleason score and the ratio (AR3/5/6) / (AR5/6) (-0.429, P = 0.029). AR4 gene expression was positively correlated with the expression of gene isoforms AR3/5/6 and AR5/6 (0.646, P < 0.001 and 0.518, P = 0.006) in this group. In the BPH group, we found a positive correlation between the gene expression of AR and plasmatic levels of preoperative PSA (0.479, P = 0.013). We also found a positive correlation between AR4 and AR3/5/6 gene expression (0.818, P = 0.0001), AR5/6 (0.387, P = 0.035) and the reason (AR3/5/6) / (AR5/6) (0.394, P = 0.031) in this group. Although at different levels, all investigated isoforms were expressed both in benign tissue (BPH) and in malignant tissue (PCa). These results support the assumption that these constitutively active isoforms of AR are involved in the development of prostatic diseases. Furthermore, AR4 expression may be associated with recurrence after radical prostatectomy.