Grado de doctor en ciencias biomédicas. / La familia de proteínas de andamio MAGUK-DLG participa en la formación de complejos proteicos en uniones intercelulares y juega un importante papel en la fisiología sináptica particularmente en la plasticidad. En vertebrados se conocen 4 miembros de esta familia: SAP90/PSD95, SAP102/NEDLG, SAP97/hDLG y PSD93/Chapsyn-110. El papel in vivo de estas proteínas ha sido difícil de estudiar debido al alto grado de redundancia que poseen. En Drosophila melanogaster solo existe un gen MAGUK-DLG, dlg. Este gen codifica 2 proteínas: DLGS97 y DLGA. Ambas se encuentran presentes en la unión neuromuscular de la larva de Drosophila (UNMDL) modelo de estudio de sinapsis glutamatérgicas que comparte componentes moleculares básicos con las sinapsis centrales de vertebrados. En este trabajo con el propósito de tener una mejor comprensión de la función de las MAGUK-DLGs, se hizo uso de mutantes específicos para cada isoforma (dlgS975 y dlgA40.2) y se combinó estudios electrofisiológicos e inmunohistoquímicos con herramientas genéticas. De esta manera se demostró que solo la ausencia postsináptica de DLGS97 se asocia con un incremento en las corrientes excitatorias de juntura en miniatura (mEJCs)y a un mayor tamaño de los campos de receptores de glutamato. La ausencia presináptica de ambas isoformas presenta alteraciones en las corrientes excitatorias de juntura evocadas (eEJCs) y en distintos procesos de plasticidad sináptica, sugiriendo una menor probabilidad de liberación, la que, se pudo demostrar que correlaciona con una pérdida de la distribución normal del canal de Ca+2 dependiente de voltaje “Cacophony”. / The DLG-MAGUK family of scaffolding proteins participates in the formation of multiprotein complexes in cell-cell interaction domains and plays an important role in the synaptic physiology, particularly in synaptic plasticity. In vertebrates this family has four members: SAP90/PSD95, SAP102/NEDLG, SAP97/hDLG y PSD93/Chapsyn-110. The in vivo role of these proteins has been difficult to study due to their high degree of redundancy. In Drosophila melanogaster there is only one DLG-MAGUK, dlg. This gene encodes two proteins: DLGS97 and DLGA. Both are at the Drosophila larvae neuromuscular junction (UNMDL) a glutamatergic synapse that shares the basic molecular components with the synapses of the central nervous system of vertebrates. In order to get a better understanding of the role of the DLG-MAGUKs using specific isoform mutants (dlgS975 y dlgA40.2) we combined the use of electrophysiology, immunohistochemistry and genetic tools to show that only the postsynaptic absence of DLGS97 can be associated with an increase in the miniature excitatory junction currents (mEJCs), due to a bigger size in the glutamate receptor fields; moreover, the lack of both dlg isoforms affects the evoked excitatory junction currents (eEJCs) and synaptic plasticity, suggesting a smaller probability of release, which can be attributed to an abnormal distribution of the voltage dependant Ca+2 channel cacophony.

Tesis para optar al grado académico de Magíster en Bioquímica. Área de especialización: Bioquímica Clínica / Introducción: El Cáncer de Ovario Epitelial (COE) es el cáncer ginecológico con mayor mortalidad en mujeres post-menopáusica. Su carcinogénesis y progresión neoplásica es atribuida a múltiples moléculas relacionadas con la proliferación, diferenciación y angiogénesis; entre las cuales, se ha estudiado el factor de crecimiento neuronal (NGF), su receptor de alta afinidad (TrkA) y el factor de crecimiento de endotelio vascular (VEGF), que aumentan su expresión a medida que COE pierde su diferenciación. Además, las isoformas del Receptor de Estrógenos α y β (REα y REβ), que poseen efectos antagónicos de proliferación celular, modifican su expresión en COE al compararla con epitelio ovárico normal. Esto sugiere que los cambios en la expresión de ambos RE es un evento importante en la progresión de COE. Objetivos:1)Determinar la localización subcelular de REα, p-REα ser 118 y REβ y semicuantificar su expresión, en el epitelio superficial de ovario normal funcional e inactivo, tumores ováricos benignos, borderline y COE seroso grado I, II y III. 2) Evaluar si NGF modifica la inmunodetección de REα, p-REα ser 118 y REβ en explantes de COE. 3)Analizar si las gonadotrofinas (LH y FSH) modifican la inmunodetección de REα, p-REα ser 118 y REβ en explantes de COE Metodología: Estudio ex-vivo: Se utilizaron biopsias de ovario pertenecientes a los siete grupos de estudio que siguen una progresión neoplásica de COE, incluidas en parafina para evaluación histológica y posterior estudio de Inmunodetección de las isoformas de RE por Inmunohistoquímica (IHQ). Estudio in-vitro: Se utilizaron explantes de COE estimulados por dos horas con NGF, FSH, LH y la mezcla de ambas gonadotrofinas. Luego se incluyeron en parafinas para su posterior análisis de Inmunodetección de las isoformas de RE por IHQ. Resultados: Estudio ex–vivo: REα se localiza en el núcleo de células epiteliales y estromales de todos los grupos de estudio, manteniendo constante su detección durante la progresión neoplásica de COE. pREα se localiza a nivel nuclear en ambos compartimentos de los grupos de estudio, aumentando su expresión en forma significativa desde Ovario normal funcional hasta Borderline (p < 0.01), sin embargo su expresión disminuye drásticamente en COE I, para volver a aumentar en forma significativa hasta COE III (p < 0.01). REβ se localiza principalmente en el citoplasma de células epiteliales y estromales de todos los grupos de estudio, sin hacer un cambio en su inmunodeteccion entre los grupos estudiados. REβ se expresa también en el núcleo de las células epiteliales y estromales de Ovario normal funcional hasta Tumor ovárico benigno con una expresión ascendente (p < 0,05), y luego desaparece su expresión nuclear en los tres grados de diferenciación de COE (p < 0.01). Estudio in– vitro: Existe un aumento de la Inmunodetección de pREα en células epiteliales de explantes de COE al estimularlos con concentraciones crecientes de NGF. No existen cambios significativos de la expresión de las tres isoformas de RE al estimularlos con FSH, LH y la mezcla de ambas gonadotrofinas. Conclusión: La Inmunodetección de REα total no se modifica durante la progresión neoplásica de COE, mientras que REβ disminuye desde tumor benigno hasta COE II; aumentando así la relación REα/REβ. La Inmunodetección de pREα aumenta significativamente desde COE I hasta COE III. Este último resultado, junto al aumento de pREα por efecto de NGF en explantes de COE, podría sugerir que existe una activación de REα por vía no clásica ligando independiente, a través de la transducción vía MAPK/ERK desencadenada por la unión de factores de crecimiento y sus respectivos receptores, entre ellos NGF a través de TrkA

Ingeniera Civil en Biotecnología / En distintos estudios se ha determinado que mutaciones en la proteína transportadora DMT1, encargada de transportar hierro desde el lumen intestinal hacia los enterocitos, son causantes de distintos tipos de anemia, no obstante, poco se conoce sobre su estructura tridimensional y su mecanismo de transporte. Por esta razón, el objetivo del presente trabajo es obtener un modelo estructural de la isoforma 1A/IRE(+) de la proteína DMT1 humana y a partir de éste estudiar el posible comportamiento de la proteína inserta en membrana. La predicción de dominios transmembrana para la proteína de interés estableció la presencia de 12 dominios transmembrana, 6 loops extracelulares, 5 loops intracelulares y los extremos amino y carboxilo terminales al interior del citoplasma de los enterocitos, lo cual concuerda totalmente con lo expuesto en bibliografía. Se obtuvieron 100 modelos de la proteína mediante modelamiento comparativo, utilizando el cristal de la familia de la proteína, ScaDMT, como plantilla principal. El mejor modelo se obtuvo a través de un análisis energético y estructural. Este modelo obtuvo un z-score de -4.3, dentro de la densidad de puntajes obtenidos por estructuras cristalinas, un perfil energético por residuo similar al del cristal de ScaDMT, y un gráfico de Ramachandran con tan solo 2 residuos dentro de zonas no permitidas. Se realizaron cuatro dinámicas moleculares para estudiar el comportamiento del modelo en membrana, las cuales fueron analizadas para estudiar las características de la proteína. A partir del análisis de los modos normales, se observó un movimiento de apertura y cierre, el cual podría representar el movimiento principal de captura y liberación del ion de hierro. Por otro lado, se presentó una variación en el potencial electrostático en las regiones superior e inferior de la proteína, lo que podría estar relacionado al mecanismo de interacción de la proteína con hierro. A partir del análisis del comportamiento de las moléculas de agua en el sistema, se determinó que éstas ingresan a la proteína por la zona orientada hacia el citoplasma, posicionándose entre las hélices TM1 y TM6, donde se ubica el ion de hierro. Finalmente, en cuanto a la interacción de la proteína con hierro, se proponen los residuos Asp115, Asn118, Ala291 y Met294 como principales candidatos a interaccionar con él, y se observa un posible rol del agua en la estabilización de éste. De esta manera, los resultados y discusiones aquí expuestos representan los primeros avances para un mejor conocimiento de la estructura y características de la proteína DMT1 humana. Se requiere profundizar y extender estos análisis para poder establecer bases más sólidas respecto a la relación estructura-función y dilucidar el mecanismo de transporte asociado a la proteína. Esto resultaría de gran utilidad para comprender la causa de las enfermedades asociadas a mutaciones en DMT1 y posteriormente proponer tratamientos más efectivos para estas enfermedades.

O câncer de próstata (CaP) e a hiperplasia prostática benigna (HPB) são as doenças da próstata mais comuns, e ambas são alterações do controle do crescimento prostático, compartilhando uma prevalência aumentada com o avanço da idade. A deprivação androgênica é uma das opções de tratamento mais comuns para o CaP e, embora resulte em um período de regressão clínica, muitos pacientes acabam progredindo para uma condição refratária à terapia hormonal, conhecida como CaP independente de androgênios (resistente à castração). Alterações moleculares no receptor de androgênios (AR) têm sido associadas à progressão do CaP. Neste estudo, buscamos identificar a presença de isoformas do AR derivadas de splicing alternativo tanto em tecido benigno de HPB (n = 30) quanto em tecido maligno de CaP (n = 27). As isoformas estudadas foram o AR3, AR4, AR5 e AR6. A expressão gênica do AR não apresentou diferença entre os tecidos estudados (P = 0,160). O AR4 apresentou maior expressão nos pacientes com CaP (P = 0,029) e, dentre estes, os níveis de expressão foram maiores nos pacientes que apresentaram recidiva bioquímica (P = 0,049). Dada a similaridade entre as moléculas de cDNA das isoformas AR3, AR5 e AR6, diferentes estratégias de detecção do mRNA foram utilizadas. A amplificação conjunta do AR3, AR5 e AR6 (AR3/5/6) foi maior no grupo CaP (P = 0,021), enquanto que a expressão das isoformas AR5 e AR6 (AR5/6) não foi diferente entre os grupos (P = 0,184). Com o objetivo de inferir um valor para a expressão do AR3, também foi analisada a razão (AR3/5/6) / (AR5/6), que apresentou maiores níveis de expressão no grupo CaP em relação ao grupo HPB (P < 0,0001). Nas amostras de CaP, foi encontrada uma correlação positiva entre o escore de Gleason e os níveis de mRNA das isoformas AR5/6 (0,524; P = 0,006) e uma correlação negativa entre o escore de Gleason e a razão (AR3/5/6) / (AR5/6) (-0,429; P = 0,029). A expressão gênica do AR4 correlacionou-se positivamente com a expressão gênica das isoformas AR3/5/6 e AR5/6 (0,646; P < 0,001 e 0,518; P = 0,006). Nas amostras de HPB, foi encontrada uma correlação positiva entre a expressão gênica do AR e os níveis plasmáticos de PSA pré-operatório (0,479; P = 0,013). Também foi encontrada uma correlação positiva entre a expressão gênica do AR4 e a expressão gênica do AR3/5/6 (0,818; P < 0,001), do AR5/6 (0,387; P = 0,035) e a razão (AR3/5/6) / (AR5/6) (0,394; P = 0,031) nesse grupo. Embora em níveis diferentes, todas as isoformas estudadas foram expressas tanto em tecido benigno (HPB) quanto em tecido maligno (CaP). Desta forma, estes resultados permitem assumir que estas isoformas constitutivamente ativas estejam envolvidas no desenvolvimento destas doenças prostáticas. E, ainda, a expressão do AR4 pode ser associada com a recidiva do CaP após o tratamento cirúrgico. / Prostate cancer (PCa) and benign prostatic hyperplasia (BPH) are the most common prostatic diseases and both are disorders in prostatic growth, whose prevalence increase with age. The androgen deprivation is one of the most common therapies for PCa, and, although there is a period of clinical remission, many patients occasionally progress to a condition refractory to hormone therapy, known as androgen-independent CaP (castration-resistant). Molecular changes in the androgen receptor (AR) have been associated with progression of PCa. This study aimed at identifying the presence of AR isoforms derived from alternative splicing both in benign tissue of BPH (n = 30) and in malignant tissue of PCa (n = 27). The isoforms studied were AR3, AR4, AR5 and AR6. AR gene expression did not differ between the studied groups (P = 0.160). AR4 showed higher expression in PCa patients (P = 0.029) and, among these, the expression levels were higher in patients with biochemical recurrence (P = 0.049). Given the similarity between the molecules of cDNA from AR3, AR5 and AR6, their detection was performed using a different strategy for mRNA amplification. The expression of AR3, AR5 and AR6 (AR3/5/6), together, was higher in PCa group (P = 0.021), while the expression of only AR5 and AR6 (AR5/6) was not different between the groups (P = 0.184). Aiming at inferring a value for the expression of AR3, it was also analyzed the ratio (AR3/5/6) / (AR5/6), which showed higher expression levels in PCa group compared to BPH group (P <0.001). In PCa samples, we found a positive correlation between the Gleason score and the levels of mRNA isoforms AR5/6 (0,524; P = 0,006), and a negative correlation between the Gleason score and the ratio (AR3/5/6) / (AR5/6) (-0.429, P = 0.029). AR4 gene expression was positively correlated with the expression of gene isoforms AR3/5/6 and AR5/6 (0.646, P < 0.001 and 0.518, P = 0.006) in this group. In the BPH group, we found a positive correlation between the gene expression of AR and plasmatic levels of preoperative PSA (0.479, P = 0.013). We also found a positive correlation between AR4 and AR3/5/6 gene expression (0.818, P = 0.0001), AR5/6 (0.387, P = 0.035) and the reason (AR3/5/6) / (AR5/6) (0.394, P = 0.031) in this group. Although at different levels, all investigated isoforms were expressed both in benign tissue (BPH) and in malignant tissue (PCa). These results support the assumption that these constitutively active isoforms of AR are involved in the development of prostatic diseases. Furthermore, AR4 expression may be associated with recurrence after radical prostatectomy.

O câncer de próstata (CaP) e a hiperplasia prostática benigna (HPB) são as doenças da próstata mais comuns, e ambas são alterações do controle do crescimento prostático, compartilhando uma prevalência aumentada com o avanço da idade. A deprivação androgênica é uma das opções de tratamento mais comuns para o CaP e, embora resulte em um período de regressão clínica, muitos pacientes acabam progredindo para uma condição refratária à terapia hormonal, conhecida como CaP independente de androgênios (resistente à castração). Alterações moleculares no receptor de androgênios (AR) têm sido associadas à progressão do CaP. Neste estudo, buscamos identificar a presença de isoformas do AR derivadas de splicing alternativo tanto em tecido benigno de HPB (n = 30) quanto em tecido maligno de CaP (n = 27). As isoformas estudadas foram o AR3, AR4, AR5 e AR6. A expressão gênica do AR não apresentou diferença entre os tecidos estudados (P = 0,160). O AR4 apresentou maior expressão nos pacientes com CaP (P = 0,029) e, dentre estes, os níveis de expressão foram maiores nos pacientes que apresentaram recidiva bioquímica (P = 0,049). Dada a similaridade entre as moléculas de cDNA das isoformas AR3, AR5 e AR6, diferentes estratégias de detecção do mRNA foram utilizadas. A amplificação conjunta do AR3, AR5 e AR6 (AR3/5/6) foi maior no grupo CaP (P = 0,021), enquanto que a expressão das isoformas AR5 e AR6 (AR5/6) não foi diferente entre os grupos (P = 0,184). Com o objetivo de inferir um valor para a expressão do AR3, também foi analisada a razão (AR3/5/6) / (AR5/6), que apresentou maiores níveis de expressão no grupo CaP em relação ao grupo HPB (P < 0,0001). Nas amostras de CaP, foi encontrada uma correlação positiva entre o escore de Gleason e os níveis de mRNA das isoformas AR5/6 (0,524; P = 0,006) e uma correlação negativa entre o escore de Gleason e a razão (AR3/5/6) / (AR5/6) (-0,429; P = 0,029). A expressão gênica do AR4 correlacionou-se positivamente com a expressão gênica das isoformas AR3/5/6 e AR5/6 (0,646; P < 0,001 e 0,518; P = 0,006). Nas amostras de HPB, foi encontrada uma correlação positiva entre a expressão gênica do AR e os níveis plasmáticos de PSA pré-operatório (0,479; P = 0,013). Também foi encontrada uma correlação positiva entre a expressão gênica do AR4 e a expressão gênica do AR3/5/6 (0,818; P < 0,001), do AR5/6 (0,387; P = 0,035) e a razão (AR3/5/6) / (AR5/6) (0,394; P = 0,031) nesse grupo. Embora em níveis diferentes, todas as isoformas estudadas foram expressas tanto em tecido benigno (HPB) quanto em tecido maligno (CaP). Desta forma, estes resultados permitem assumir que estas isoformas constitutivamente ativas estejam envolvidas no desenvolvimento destas doenças prostáticas. E, ainda, a expressão do AR4 pode ser associada com a recidiva do CaP após o tratamento cirúrgico. / Prostate cancer (PCa) and benign prostatic hyperplasia (BPH) are the most common prostatic diseases and both are disorders in prostatic growth, whose prevalence increase with age. The androgen deprivation is one of the most common therapies for PCa, and, although there is a period of clinical remission, many patients occasionally progress to a condition refractory to hormone therapy, known as androgen-independent CaP (castration-resistant). Molecular changes in the androgen receptor (AR) have been associated with progression of PCa. This study aimed at identifying the presence of AR isoforms derived from alternative splicing both in benign tissue of BPH (n = 30) and in malignant tissue of PCa (n = 27). The isoforms studied were AR3, AR4, AR5 and AR6. AR gene expression did not differ between the studied groups (P = 0.160). AR4 showed higher expression in PCa patients (P = 0.029) and, among these, the expression levels were higher in patients with biochemical recurrence (P = 0.049). Given the similarity between the molecules of cDNA from AR3, AR5 and AR6, their detection was performed using a different strategy for mRNA amplification. The expression of AR3, AR5 and AR6 (AR3/5/6), together, was higher in PCa group (P = 0.021), while the expression of only AR5 and AR6 (AR5/6) was not different between the groups (P = 0.184). Aiming at inferring a value for the expression of AR3, it was also analyzed the ratio (AR3/5/6) / (AR5/6), which showed higher expression levels in PCa group compared to BPH group (P <0.001). In PCa samples, we found a positive correlation between the Gleason score and the levels of mRNA isoforms AR5/6 (0,524; P = 0,006), and a negative correlation between the Gleason score and the ratio (AR3/5/6) / (AR5/6) (-0.429, P = 0.029). AR4 gene expression was positively correlated with the expression of gene isoforms AR3/5/6 and AR5/6 (0.646, P < 0.001 and 0.518, P = 0.006) in this group. In the BPH group, we found a positive correlation between the gene expression of AR and plasmatic levels of preoperative PSA (0.479, P = 0.013). We also found a positive correlation between AR4 and AR3/5/6 gene expression (0.818, P = 0.0001), AR5/6 (0.387, P = 0.035) and the reason (AR3/5/6) / (AR5/6) (0.394, P = 0.031) in this group. Although at different levels, all investigated isoforms were expressed both in benign tissue (BPH) and in malignant tissue (PCa). These results support the assumption that these constitutively active isoforms of AR are involved in the development of prostatic diseases. Furthermore, AR4 expression may be associated with recurrence after radical prostatectomy.

Submitted by Maykon Nascimento (maykon.albani@hotmail.com) on 2016-04-18T19:53:42Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Dissertacao Lacerda CD.pdf: 1763421 bytes, checksum: 9db822a6306602d4f7c830ea507fcc4a (MD5) / Approved for entry into archive by Patricia Barros (patricia.barros@ufes.br) on 2016-06-27T18:49:55Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Dissertacao Lacerda CD.pdf: 1763421 bytes, checksum: 9db822a6306602d4f7c830ea507fcc4a (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-27T18:49:55Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Dissertacao Lacerda CD.pdf: 1763421 bytes, checksum: 9db822a6306602d4f7c830ea507fcc4a (MD5) / Uma nova isoforma tripsina bovina foi purificada a partir de amostras comerciais por cromatografia de troca iônica por Sephadex SP C50®. A nova isoforma contém, além da perda do hexapeptídeo N-terminal (como encontrado na molécula progenitora β-tripsina) uma clivagem intra-cadeia entre o Lys-155 e Ser-156. A nova enzima denominada -tripsina mostrou propriedades similares com a isoforma α-tripsina que contém o mesmo número de cadeia polipeptídica (duas cadeias), massa molecular (23312 Da), estrutura secundária, volume hidrodinâmico e outros. Apesar das semelhanças estruturais e enzimáticas dessas duas isoformas, -tripsina tem uma taxa de formação inferior a partir da β-tripsina, carga superficial inferior, mas a -tripsina tem estabilidade térmica mais elevada do que a α-tripsina. Devido à facilidade de purificação das isoformas a partir de tripsina bovina de fonte comercial, e as propriedades descritas acima, esta enzima tornar-se uma alternativa interessante para a indústria de alimentos e de detergente, bem como para pesquisa de biocatalisadores. / A novel bovine trypsin isoform was purified from commercial sample by ion exchange chromatography by Sephadex SP C50®. New isoform contain in addition of loss of N- terminus hexapeptide (as found in parent molecule β-trypsin) an intra-chain split between Lys-155 and Ser-156. The novel enzyme denominate gamma-trypsin showed similar properties with α-trypsin isoform in: polypeptide number chain (two chain), molecular masses (23,312 Da), secondary structure, hydrodynamic radius and others. In spite of enzymatic and structural similarities of both isoforms, -trypsin preferably has a lower rate formation from β-trypsin, a lower surface charge, but the gamma-trypsin has a higher thermal stability than α-trypsin. Due to obtaining facility of purification of bovine trypsin isoforms from commercial font, and properties described above, become this enzyme an interesting alternative for the food industry, detergent and biocatalysis research.

O câncer de próstata (CaP) e a hiperplasia prostática benigna (HPB) são as doenças da próstata mais comuns, e ambas são alterações do controle do crescimento prostático, compartilhando uma prevalência aumentada com o avanço da idade. A deprivação androgênica é uma das opções de tratamento mais comuns para o CaP e, embora resulte em um período de regressão clínica, muitos pacientes acabam progredindo para uma condição refratária à terapia hormonal, conhecida como CaP independente de androgênios (resistente à castração). Alterações moleculares no receptor de androgênios (AR) têm sido associadas à progressão do CaP. Neste estudo, buscamos identificar a presença de isoformas do AR derivadas de splicing alternativo tanto em tecido benigno de HPB (n = 30) quanto em tecido maligno de CaP (n = 27). As isoformas estudadas foram o AR3, AR4, AR5 e AR6. A expressão gênica do AR não apresentou diferença entre os tecidos estudados (P = 0,160). O AR4 apresentou maior expressão nos pacientes com CaP (P = 0,029) e, dentre estes, os níveis de expressão foram maiores nos pacientes que apresentaram recidiva bioquímica (P = 0,049). Dada a similaridade entre as moléculas de cDNA das isoformas AR3, AR5 e AR6, diferentes estratégias de detecção do mRNA foram utilizadas. A amplificação conjunta do AR3, AR5 e AR6 (AR3/5/6) foi maior no grupo CaP (P = 0,021), enquanto que a expressão das isoformas AR5 e AR6 (AR5/6) não foi diferente entre os grupos (P = 0,184). Com o objetivo de inferir um valor para a expressão do AR3, também foi analisada a razão (AR3/5/6) / (AR5/6), que apresentou maiores níveis de expressão no grupo CaP em relação ao grupo HPB (P < 0,0001). Nas amostras de CaP, foi encontrada uma correlação positiva entre o escore de Gleason e os níveis de mRNA das isoformas AR5/6 (0,524; P = 0,006) e uma correlação negativa entre o escore de Gleason e a razão (AR3/5/6) / (AR5/6) (-0,429; P = 0,029). A expressão gênica do AR4 correlacionou-se positivamente com a expressão gênica das isoformas AR3/5/6 e AR5/6 (0,646; P < 0,001 e 0,518; P = 0,006). Nas amostras de HPB, foi encontrada uma correlação positiva entre a expressão gênica do AR e os níveis plasmáticos de PSA pré-operatório (0,479; P = 0,013). Também foi encontrada uma correlação positiva entre a expressão gênica do AR4 e a expressão gênica do AR3/5/6 (0,818; P < 0,001), do AR5/6 (0,387; P = 0,035) e a razão (AR3/5/6) / (AR5/6) (0,394; P = 0,031) nesse grupo. Embora em níveis diferentes, todas as isoformas estudadas foram expressas tanto em tecido benigno (HPB) quanto em tecido maligno (CaP). Desta forma, estes resultados permitem assumir que estas isoformas constitutivamente ativas estejam envolvidas no desenvolvimento destas doenças prostáticas. E, ainda, a expressão do AR4 pode ser associada com a recidiva do CaP após o tratamento cirúrgico. / Prostate cancer (PCa) and benign prostatic hyperplasia (BPH) are the most common prostatic diseases and both are disorders in prostatic growth, whose prevalence increase with age. The androgen deprivation is one of the most common therapies for PCa, and, although there is a period of clinical remission, many patients occasionally progress to a condition refractory to hormone therapy, known as androgen-independent CaP (castration-resistant). Molecular changes in the androgen receptor (AR) have been associated with progression of PCa. This study aimed at identifying the presence of AR isoforms derived from alternative splicing both in benign tissue of BPH (n = 30) and in malignant tissue of PCa (n = 27). The isoforms studied were AR3, AR4, AR5 and AR6. AR gene expression did not differ between the studied groups (P = 0.160). AR4 showed higher expression in PCa patients (P = 0.029) and, among these, the expression levels were higher in patients with biochemical recurrence (P = 0.049). Given the similarity between the molecules of cDNA from AR3, AR5 and AR6, their detection was performed using a different strategy for mRNA amplification. The expression of AR3, AR5 and AR6 (AR3/5/6), together, was higher in PCa group (P = 0.021), while the expression of only AR5 and AR6 (AR5/6) was not different between the groups (P = 0.184). Aiming at inferring a value for the expression of AR3, it was also analyzed the ratio (AR3/5/6) / (AR5/6), which showed higher expression levels in PCa group compared to BPH group (P <0.001). In PCa samples, we found a positive correlation between the Gleason score and the levels of mRNA isoforms AR5/6 (0,524; P = 0,006), and a negative correlation between the Gleason score and the ratio (AR3/5/6) / (AR5/6) (-0.429, P = 0.029). AR4 gene expression was positively correlated with the expression of gene isoforms AR3/5/6 and AR5/6 (0.646, P < 0.001 and 0.518, P = 0.006) in this group. In the BPH group, we found a positive correlation between the gene expression of AR and plasmatic levels of preoperative PSA (0.479, P = 0.013). We also found a positive correlation between AR4 and AR3/5/6 gene expression (0.818, P = 0.0001), AR5/6 (0.387, P = 0.035) and the reason (AR3/5/6) / (AR5/6) (0.394, P = 0.031) in this group. Although at different levels, all investigated isoforms were expressed both in benign tissue (BPH) and in malignant tissue (PCa). These results support the assumption that these constitutively active isoforms of AR are involved in the development of prostatic diseases. Furthermore, AR4 expression may be associated with recurrence after radical prostatectomy.

A macroprolactinemia é condição freqüente na hiperprolactinemia e em geral, sem impacto clínico. Os dados sobre a atividade biológica da macroprolactina (bbPRL) são controversos e baseados em bioensaio heterólogo com células de rato Nb2. A atividade biológica da bbPRL é observada in vitro e não in vivo, provavelmente porque seu alto peso molecular evita sua passagem pelos capilares. A bioatividade da bbPRL talvez varie de acordo com a especificidade do receptor de prolactina (PRLR). Avaliamos a bioatividade da bbPRL de indivíduos macroprolactinêmicos (Grupo I, n = 18) e da PRL monomérica (mPRL) de pacientes hiperprolactinêmicos sem bbPRL (Grupo II, n = 5) em Nb2 e em células Ba/F-LLP, transfectadas com o PRLR humano. Enquanto ambos ensaios apresentam resultados similares para a atividade de mPRL, nossos resultados indicam que a atividade da bbPRL é presente em ensaio heterólogo e não em ensaio homólogo. O ensaio Ba/F-LLP é sensível e apresenta melhor correlação com a atividade in vivo da bbPRL / Macroprolactinemia is a frequent finding in hyperprolactinemic individuals, usually without clinical impact. Data on biological activity of macroprolactin (bbPRL) is mostly based on a heterologous bioassay (Nb2 cell). Biological activity of bbPRL observed in vitro but not in vivo maybe due to its high molecular weight preventing its passage through capillary barrier. Alternatively, bbPRL bioactivity may differ depending on the PRL receptor species specificity. BbPRL from macroprolactinemic individuals and monomeric PRL (mPRL) from hyperprolactinemic patients without macroprolactinemia were tested in two bioassays: Nb2 and in Ba/F-LLP, which expresses human prolactin receptor. While both bioassays achieve similar results considering mPRL activity, our results indicate that bbPRL displays activity in a heterologous but not in a homologous bioassay, consistently with the apparent absence of bbPRL bioactivity in vivo

A macroprolactinemia é condição freqüente na hiperprolactinemia e em geral, sem impacto clínico. Os dados sobre a atividade biológica da macroprolactina (bbPRL) são controversos e baseados em bioensaio heterólogo com células de rato Nb2. A atividade biológica da bbPRL é observada in vitro e não in vivo, provavelmente porque seu alto peso molecular evita sua passagem pelos capilares. A bioatividade da bbPRL talvez varie de acordo com a especificidade do receptor de prolactina (PRLR). Avaliamos a bioatividade da bbPRL de indivíduos macroprolactinêmicos (Grupo I, n = 18) e da PRL monomérica (mPRL) de pacientes hiperprolactinêmicos sem bbPRL (Grupo II, n = 5) em Nb2 e em células Ba/F-LLP, transfectadas com o PRLR humano. Enquanto ambos ensaios apresentam resultados similares para a atividade de mPRL, nossos resultados indicam que a atividade da bbPRL é presente em ensaio heterólogo e não em ensaio homólogo. O ensaio Ba/F-LLP é sensível e apresenta melhor correlação com a atividade in vivo da bbPRL / Macroprolactinemia is a frequent finding in hyperprolactinemic individuals, usually without clinical impact. Data on biological activity of macroprolactin (bbPRL) is mostly based on a heterologous bioassay (Nb2 cell). Biological activity of bbPRL observed in vitro but not in vivo maybe due to its high molecular weight preventing its passage through capillary barrier. Alternatively, bbPRL bioactivity may differ depending on the PRL receptor species specificity. BbPRL from macroprolactinemic individuals and monomeric PRL (mPRL) from hyperprolactinemic patients without macroprolactinemia were tested in two bioassays: Nb2 and in Ba/F-LLP, which expresses human prolactin receptor. While both bioassays achieve similar results considering mPRL activity, our results indicate that bbPRL displays activity in a heterologous but not in a homologous bioassay, consistently with the apparent absence of bbPRL bioactivity in vivo

Orientadores: Fernanda Klein Marcondes, Tatiana de Sousa da Cunha / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-19T11:33:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Briet_LarissadaSilva_M.pdf: 864520 bytes, checksum: ce24e35f8a1a6a6501fb9a3ae6af77f4 (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: O modelo de natação associado à sobrecarga de peso é um modelo experimental de treinamento físico, mas o desconhecimento da intensidade de esforço que esta sobrecarga representa tem dificultado a padronização de protocolos de condicionamento físico para animais de laboratório. Além disso, pouco se sabe a respeito das respostas musculares e o estresse que pode estar associado à realização deste tipo de treinamento. O objetivo deste estudo foi avaliar, em ratos, os efeitos do treinamento físico diário de alta intensidade, por saltos em água com sobrecarga, na evolução temporal da concentração sangüínea de lactato; na concentração plasmática de corticosterona; na atividade sérica da creatina quinase (CK); na área de secção transversa da fibra muscular (ASTFM) do músculo sóleo e extensor longo dos dedos (EDL); e na expressão das isoformas da cadeia pesada de miosina (MHC) do músculo sóleo. Ratos Wistar machos foram aleatoriamente divididos em dois grupos: treinado e não treinado, e cada grupo foi composto por cinco subgrupos, que correspondiam a cada semana de treinamento. Os animais treinados foram submetidos a 5 semanas de treinamento que consistiu em 4 séries, 10 repetições, 30 segundos de repouso entre as séries, sobrecarga de 50-70% do peso corporal (PC), 5 dias/semana. No final de cada semana, a concentração sanguínea de lactato foi determinada antes, imediatamente após, 20, 40 e 60 minutos após o exercício. O treinamento aumentou a concentração sanguínea de lactato, em relação ao repouso, nas cinco semanas (semana 1=7.2±0.4 vs 2.2±0.3; semana 2=8.1±0.5 vs 2.1±0.1; semana 3=7.9±0.6 vs 2.0±0.2; semana 4=8.2±0.3 vs 1.9±0.1; semana 5=7.7±0.5 vs 1.5±0.1 mmol/L). Os animais treinados apresentaram aumento da concentração plasmática da corticosterona (semana 1=11.4±3.2 vs 3.2±2.1; semana 3=13.0±3.5 vs 2.1±0.9; semana 5=22.6±4.8 vs 6.4±3.2 ng/mL) e diminuição da atividade sérica da CK (semana 1=3191±310 vs 4187±414; semana 3=2828±247 vs 3680±643; semana 5=3330±225 vs 4254±602 U/L) em todas as semanas em relação aos animais não treinados. O treinamento diminui o PC (semana 3=297±7 vs 371±9; semana 5=365±13 vs 401±16 g), a razão peso muscular/PC dos músculos sóleo (semana 3=0.35±0.02 vs 0.57±0.03; semana 5=0.50±0.03 vs 0.61±0.04 g/100g) e EDL (semana 3=0.43±0.02 vs 0.66±0.03; semana 5=0.53±0.02 vs 0.67±0.05 g/100g), e a ASTFM do músculo sóleo (semana 3=2362±144 vs 3031±132; semana 5=2385±104 vs 2918±128 ?m2) a partir da terceira semana em comparação com animais não treinados. Os animais treinados apresentaram diminuição da MHCI (90.3±1.8 vs 99.2±0.80%) e aumento da MHCII (9.8±1.8 vs 0.8±0.8%) no músculo sóleo na quinta semana em comparação com animais não treinados. Os resultados obtidos mostraram que o protocolo de treinamento por saltos em água com sobrecarga empregado é predominantemente anaeróbio, e que a realização deste treinamento, diariamente, sem respeitar o intervalo de recuperação entre as sessões, não promove hipertrofia muscular e constitui-se num estímulo estressor para os animais. Porém, apesar destes efeitos, o treinamento promoveu adaptações no que diz respeito às respostas de lesão muscular (CK) e ao delineamento dos tipos de fibras musculares (MHC), permitindo maior capacidade do músculo em suportar o aumento da carga durante as sessões de treinamento / Abstract: The swimming model associated with weight lift is an experimental model of physical training, but the lack of knowledge about the intensity of this effort difficults the standardization of fitness protocols for laboratory animals. Furthermore, little is known about muscular responses and stress that may be associated with it. The aim of this study was to evaluate, in rats, the effect of jump training into water, carrying an overload, performed daily, on time-course of blood lactate concentration; plasma corticosterone concentration; serum creatine kinase (CK) activity; cross-sectional area of muscle fiber (CSAMF) of soleus and extensor digitorum longus (EDL) muscles; and expression of myosin heavy chain (MHC) isoforms on soleus muscle. Male Wistar rats were randomly divided into two groups: trained and untrained, with five subgroups each one, corresponding to each week of training protocol. Trained animals were submitted for 5 weeks of training that consisted in 4 sets, 10 repetitions, 30 seconds of rest between the sets, 50-70% body weight-load, 5 days/week. At the end of each week, blood lactate concentration was determined before, immediately after, 20, 40 and 60 minutes after exercise training. Physical training increased blood lactate concentration as compared with resting period, in all five weeks (week 1=7.2±0.4 vs 2.2±0.3; week 2=8.1±0.5 vs 2.1±0.1; week 3=7.9±0.6 vs 2.0±0.2; week 4=8.2±0.3 vs 1.9±0.1; week 5=7.7±0.5 vs 1.5±0.1 mmol/L). Corticosterone levels were increased in trained group (week 1=11.4±3.2 vs 3.2±2.1; week 3=13.0±3.5 vs 2.1±0.9; week 5=22.6±4.8 vs 6.4±3.2 ng/mL), and CK activity was decreased (week 1=3191±310 vs 4187±414; week 3=2828±247 vs 3680±643; week 5=3330±225 vs 4254±602 U/L) in all weeks as compared with untrained animals. Physical training decreased body weight (week 3=297±7 vs 371±9; week 5=365±13 vs 401±16 g), muscle weight/body weight ratio of soleus (week 3=0.35±0.02 vs 0.57±0.03; week 5=0.50±0.03 vs 0.61±0.04 g/100g) and EDL muscles (week 3=0.43±0.02 vs 0.66±0.03; week 5=0.53±0.02 vs 0.67±0.05 g/100g), and CSAMF of soleus muscle (week 3=2362±144 vs 3031±132; week 5=2385±104 vs 2918±128 ?m2) on the third and fifth weeks in comparison with untrained groups. Trained animals presented lower MHCI (90.3±1.8 vs 99.2±0.80%) and higher MHCII content (9.8±1.8 vs 0.8± 0.8%) in soleus muscle in the fifth week in comparison to untrained ones. Data showed that the jump training into water, carrying an overload is predominantly anaerobic, and when it is performed daily, without recovery intervals between sessions, there is no muscle hypertrophy and it constitutes a stressor stimulus for animals. However, despite these effects, training protocol promoted adaptations regarding muscle damage (CK) and also muscle fiber type transitions (MHC), increasing muscle ability to support overload increases during training sessions / Mestrado / Fisiologia / Mestre em Biologia Funcional e Molecular