Orientador : Antonio Sergio Ramalho / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-17T14:14:44Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Sena_LedaLuziaAlvesde_D.pdf: 2207879 bytes, checksum: 732092d12db9c458ec5660a5c0df9019 (MD5) Previous issue date: 1983 / Resumo: Apesar de a deficiência da desidrogenase de 6-fosfato de glicose (G6-PD) ser uma alteração genética freqüente em populações brasileiras, ainda se dispõe de poucas informações a respeito do significado clínico dessa enzimopenia em nosso meio. Assim sendo, pretendeu-se com o presente trabalho iniciar o estudo sistemático da deficiência de G6-PD na região de Campinas, SP, investigando vários aspectos dessa enzimopenia importantes do ponto de vista genetico-clínico. Para tanto, a deficiência de G6-PD foi investigada em uma amostra de 3.339 indivíduos do sexo masculino residentes na região de Campinas, representados por doadores de sangue, pacientes internados em hospitais e hansenianos medicados com sulfona. Foram detectados 104 deficientes de G6-PD, a partir dos quais foram investigados os objetivos propostos) ou seja: 1) verificar a validade do uso do teste de redução da metemoglobina (BREWER et al., 1962) na identificação da deficiência de G6-PD, já que esse teste, por ser simples e econômico, ê passível de ser usado em larga escala em nossas populações; 2) caracterizar uma amostra de deficientes de G6-PD detectados na região de Campinas quanto á sua procedência e grau de exposição a fatores potencialmente hemolíticos do meio ambiente; 3) avaliar a morbidade da enzimopenia em nosso meio: a) verificando a freqüência de antecedentes sugestivos de hemólise em uma amostra de deficientes, comparando-a com a de um grupo controle; b) investigando clínica e laboratorialmente uma amostra de deficientes que já estavam sendo submetidos, no momento da detecção, à terapêutica potencialmente hemolítica, ou seja uma amostra de hansenianos medicados com diaminodifenilsulfona (DDS); 4) caracterizar uma amostra de deficientes quanto às variantes de G6-PD; 5) investigar as conseqüências clínicas da transfusão sangues deficientes de G6-PD; 6) verificar a eventual associação entre a deficiência G6-PD e a hemoglobina S. Para atender a esses objetivos, os enzimopênico seus controles normais e pacientes transfundidos com sangues deficientes de G6-PD foram submetidos a vários exames clínicos e/ ou laboratoriais, que permitiram à autora chegar às seguintes conclusões:1 ) O teste de redução da metemoglobina é um método confiável de triagem dos deficientes de G6-PD, desde que observados os pré-requisito necessários para a realização desse exame. Não foram observados no presente trabalho os casos falsamente deficientes de G6-PD referidos por BAPAT et al.(1976), razão pela qual não se constatou nenhuma vantagem em modificar esse teste ou em substituí-lo por outros exames mais dispendiosos, como o teste do descaramento do azul cresil brilhante; 2) grande parte dos deficientes de G6-PD na região de Campinas são imigrantes, oriundos, sobretudo, dos Estados Nordestinos e de Minas Gerais; 3) os deficientes de G6-D na região de Campinas mantêm contato freqüente com fatores ambientes capazes de desencadear hemólise, tais como a naftalina, a sulfa e outros medicamentos. A intensidade de contato dos enzimopênicos com essas substâncias, no entanto, parece ser insuficiente para desencadear, na maioria dos casos, hemólise importante; 4) a maioria dos deficientes de G6-PD da região de Campinas, sejam negróides ou caucasóides, apresenta a variante A- dessa enzima, mais benigna do ponto de vista clínico; 5) a deficiência de G6-PD não determina o aparecimento de alterações clinicas graves na maioria dos enzimopênicos da região de Campinas. Assim sendo, essa enzimopenia não deve constituir um problema de Saúde Pública em nosso meio, embora, seja importante a nível individual e familial, já que não pode ser excluída a possibilidade de um ou outro deficiente manifestar, esporadicamente, complicações clinicas graves, ou até mesmo fatais; 6) na maioria das transfusões de sangues deficientes de G6-PD realizadas em nosso meio não devem ocorrer complicações hemolíticas importantes no receptor. Isso talvez se deva ao fato de a maioria dos doadores de sangue apresentar a variante A-de G6-PD. Aqui também é importante ressaltar que a possibilidade de ocorrência de reações pós-transfusionais graves em casos esporádicos do uso de sangues deficientes de G6PD não está excluída, sobretudo se o doador apresentar a variante Mediterrânea e o receptor estiver sendo medicado com drogas incompatíveis; 7) a deficiência de G6-PD não deve estar associada, em nosso meio, à hemoglobina S / Doutorado / Doutor em Ciências Biológicas

Made available in DSpace on 2018-08-01T22:57:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_10774_025 - DAYANNE PINHO ROSA - DISSERTAÇÃO DE MESTRADO - FINAL.pdf: 805134 bytes, checksum: a0838bf2c2101acc6105315b494bc58a (MD5) Previous issue date: 2017-02-23 / Os solventes orgânicos são comuns em processos industriais que utilizam enzimas, mas, ao mesmo tempo, sabe-se que alteram suas propriedades. Assim, os efeitos do solvente orgânico aquoso (etanol) em diferentes concentrações na estrutura α- tripsina foram investigadas por técnicas espectroscópicas e análise de dados termodinâmicos. A espectroscopia de absorção UV-Vis, a fluorescência intrínseca do triptofano e o espalhamento dinâmico da luz (DLS) sugerem a formação de estados parcialmente dobrados, em vez de estados agregados, em alta concentração de etanol (> 60% v/v de etanol/tampão), exibindo pouca perda de estrutura secundária, mas alterações significativas na estrutura terciária. Os dados termodinâmicos (Tm e ∆H) sugerem um afrouxamento de interações intramoleculares fracas, o que se reflete em um aumento de flexibilidade de tal forma que a capacidade catalítica pode ser aumentada ou diminuída de acordo com a concentração de etanol no sistema. Os resultados globais sugerem que na faixa de 0-60% v/v de etanol/tampão, a α- tripsina sofre fenômenos de multimerização reversíveis, mantendo a sua atividade catalítica. No entanto a partir de 60% v/v de etanol/tampão, a população de estados parcialmente enovelados com menor atividade catalítica é predominante. Palavras chaves: tripsina, isoformas, enzimologia, solventes orgânicos, estrutura, termodinâmica.

Duas variações de resíduo agroindustrial foram analisadas como meio de cultura para o bioprocesso de fermentação semissólida pelo fungo Fusarium oxysporum, com o objetivo de obter a melhor produção de peptidases e lipases. Essas enzimas foram microencapsuladas por spray drying, visando garantir sua estabilidade e investigar outros prováveis benefícios obtidos pela técnica. A utilização de planejamento experimental permitiu analisar os efeitos e interações entre as variáveis operacionais do processo (temperatura de secagem, proporção de adjuvantes e relação entre adjuvantes). A caracterização bioquímica e físico-química do extrato enzimático e das micropartículas também foram estudadas. O emprego de farelo de trigo como substrato demonstrou maior produção enzimática que o uso de farelo de algodão. A fermentação produziu uma serinopeptidase e uma lipase, ambas com característica alcalina, com alta estabilidade em ampla faixa de pH e certa estabilidade em diferentes temperaturas. Para ambas as enzimas, observou-se modulação positiva da atividade frente à maioria dos íons estudados e forte inibição pelo surfactante SDS, enquanto a lipase demonstrou superatividade frente a CTAB. A caracterização enzimática permite sugerir a aplicação dessas enzimas na formulação de detergentes enzimáticos, indústria de couro, indústria de papel, agroquímicos, síntese de biopolímeros e biodísel. No processo de microencapsulação, a temperatura foi a variável operacional mais importante para a estabilidade, enquanto a quantidade de adjuvantes em relação à quantidade de extrato enzimático influenciou nas condições de manipulação. O estudo demonstrou que a técnica de microencapsulação por spray drying resultou em grande benefício no armazenamento das enzimas, por aumentar consideravelmente sua estabilidade e melhorar as propriedades físicas do extrato. / Two variations of agroindustrial residue were analyzed as culture medium for the bioprocess of solid-state fermentation by the fungus Fusarium oxysporum, in order to achieve the best production of peptidases and lipases. These enzymes were microencapsulated by spray drying in order to ensure its stability and investigate other potential benefits obtained by the technique. The use of experimental design allowed us to analyze the effects and interactions between the operating variables of the process (drying temperature, proportion of adjuvants and relation among adjuvants). Biochemical and physico-chemical characterization of the enzymatic extract and of the microparticles were also studied. The use of wheat bran as substrate demonstrated a greater enzyme production then the use of cottonseed meal. The fermentation produced serinepeptidases and lipases, both alkaline, with high stability over a wide pH range and some stability at different temperatures. For both enzymes, there was up regulation of activity with most of the ions analyzed and strong inhibition against the surfactant SDS, whereas lipase demonstrated superactivity against CTAB. The enzymatic characterization suggests the application of these enzymes in the formulation of enzymatic detergents, leather industry, paper industry, agrochemicals, synthesis of biopolymers and biodiesel. In the microencapsulation process, the temperature was the most important operating variable for stability, while the amount of adjuvants in relation to the amount of enzymatic extract influenced in terms of handling. The study demonstrated that the technique of microencapsulation by spray drying resulted in benefits for the storage of enzymes, by increasing considerably its stability and improve the physical properties of the extract.

Per primer cop, el nostre grup va identificar un enzim de la superfamilia de les aldo-ceto reductases (AKR) actiu amb retinoides. Atès que l'AKR1B12 presenta una identitat seqüencial pròxima al 70% amb l'AKR1B1 i l'AKR1B10 humanes, es va decidir ampliar l'estudi de l'activitat retinoide oxidoreductasa entre les AKR. En la present Tesi Doctoral, hem aprofundit en l'estudi de l'activitat retinal reductasa de membres de la superfamilia de les aldo-ceto reductases (AKR). El treball es va iniciar amb la caracterització in vitro de l'activitat amb retinoides d'AKR humanes de la família AKR1. En col·laboració amb el grup de la Dra. Natalia Kedishvili (actualment en el Department of Biochemistry and Molecular Genetics, Schools of Medicine and Dentistry, University of Alabama at Birmingham, EUA) es va realitzar una anàlisi comparativa de l'activitat retinol oxidoreductasa d'enzims de les superfamílies de les deshidrogenases/reductases de cadena mitjana (MDR), deshidrogenases/reductases de cadena curta (SDR) i AKR. Es va emprar un nou mètode basat en la solubilització de retinoides amb BSA, i anàlisi mitjançant HPLC. Així, es van poder determinar els valors de les constants cinètiques per a enzims humans de les tres superfamílies sense l'efecte d'inhibició del Tween-80, detergent utilitzat tradicionalment per a l'estudi cinètic de les MDR i AKR (Capítol I). Aquests resultats van posar de relleu que el valor de Km per a retinoides és similar (0,1-1 μM) en els enzims estudiats. Les principals diferències es centren en el valor de kcat, el qual va variar fins a tres ordres de magnitud entre els diferents enzims. Un altre resultat destacable, va ser la desmostració que cap dels enzims era capaç d'utilitzar com a substrat retinol, o retinal, unit a la proteïna cel·lular unidora de retinol (CRBPI). Fins el present treball, s'utilitzaven dos arguments per defensar un paper principal de les SDR en l'oxidació de retinol a retinal, primera etapa de síntesi de l'àcid retinoic: 1) Valors de Km inferiors de les SDR per als retinoides (fins a dos ordres de magnitud respecte les ADH). 2) Capacitat de reconèixer l'holoCRBPI com a substrat, una propietat aparentment exclusiva d'algunes SDR. El nostre estudi, a part de descartar aquests dos arguments, ha introduït les AKR com a tercer grup enzimàtic implicat en el metabolisme de retinoides. La segona part de la Tesi es centra en l'estudi estructural i funcional de l'AKR1B10, l'AKR que presenta una major eficiència catalítica per a la reducció del retinal. Aquest enzim és sobrexpressat en diferents tipus de càncers humans, el que va fer augmentar el nostre interès per determinar el seu paper en la ruta de síntesi de l'àcid retinoic. A part de l'estudi in vitro de l'activitat retinoide oxidoreductasa de l'enzim, també es va dur a terme un estudi in vivo. Utilitzant cèl·lules COS-1 com a model, i mitjançant transfecció transitòria, es va poder observar que AKR1B10 també participava en la reducció de retinal in vivo, però que en canvi no era capaç d'oxidar retinol. Finalment, i en col·laboració amb el grup de cristal·lografia de proteïnes del Dr. Ignasi Fita (Parc Científic de Barcelona-CSIC), es va obtenir l'estructura tridimencional del complex ternari AKR1B10-NADP+-tolrestat. El tolrestat és un inhibidor d'AKR1B1 àmpliament estudiat com a fàrmac en el tractament de les complicacions de la diabetis, però que també inhibeix AKR1B10 tant in vitro com in vivo. Tot i l'elevada identitat seqüencial entre AKR1B1 i AKR1B10, aquests enzims presenten constants cinètiques molt diferents per a la reducció del retinal. Així, gràcies a la resolució de l'estructura d'AKR1B10, esperem poder estudiar els determinants estructurals que confereixen a cada enzim les seves propietats cinètiques característiques, així com establir les bases per al disseny de nous inhibidors específics per a cadascun d'ells. / Our group was the first to identify an enzyme from the aldo-keto reductase (AKR) superfamily, AKR1B12, active with retinoids (Crosas et al., 2001). Due to the fact that AKR1B12 shows a 70% sequence identity with the human enzymes AKR1B1 and AKR1B10, we decided to study more deeply the retinoid oxidoreductase activity within the AKRs.Here, we extended the study on the retinal reductase activity of AKR superfamily members. The work was initiated with the in vitro characterization of retinoid activities of human AKRs from the AKR1 family. In collaboration with Dr Natalia Kedishvili's group (Department of Biochemistry and Molecular Genetics, Schools of Medicine and Dentistry, University of Alabama at Birmingham, USA) we carried out a comparative analysis of retinol oxidoreductase activity of the enzymes from the medium chain dehydrogenases/reductases (MDR), short chain dehydrogenases/reductases (SDR) and AKR. A new method based on a retinoid solubilisation with BSA and analysis by HPLC was employed. Kinetic constant values were determined for human enzymes from the three superfamilies, without the inhibitory effect of Tween-80, a detergent traditionally employed for MDR and AKR kinetic studies. The Km values obtained with retinoids (0,1-1 μM) were similar for all the enzymes tested. Main differences were found in the kcat values, which varied up to 10000-fold between the studied enzymes. Furthermore, none of the studied enzymes was able to use retinol, nor retinal, bound to cellular retinol binding protein (CRBPI). So far, a major role for SDR in retinol oxidation was supported by: 1) SDR had lower reported Km values with retinoid (up to 100-fold lower than ADHs). 2) SDR were the only enzymes with reported ability to recognize holoCRBPI as a substrate. Our group refused both arguments and introduced AKRs as the third enzymatic group implicated in retinoid metabolism.The second part of the thesis was focused on the structural and functional study of AKR1B10, which is the AKR with the highest catalytic efficiency reducing retinal. The enzyme is overexpressed in different human cancers, which increased our interest to determine its role in the retinoic acid synthesis pathway. In addition to the study on the retinoid oxidoreductase activity in vitro, we performed an in vivo study. COS-1 cells were used as a model, and transitional transfection experiments were carried out. We observed that AKR1B10 participates in the retinal reduction in vivo, but it was unable to oxidate retinol.Finally, in collaboration with Dr. Ignasi Fita's group (Parc Científic de Barcelona-CSIC), the threedimensional structure of the AKR1B10-NADP+-tolrestat complex was obtained. Tolrestat is an AKR1B1 inhibitor widely studied as a drug for diabetes treatment. It also inhibits AKR1B10 in vitro and in vivo. Despite the high sequential identity shared between AKR1B1 and AKR1B10, the two enzymes showed extremely different kinetic constant values for retinal reduction. The AKR1B10 structure resolution might help us to study structural features for the retinoid specificity showed, and to propose new fundamentals in order to design new specific inhibitors for each enzyme.

Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo a Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro / Quando as esterases acetilcolinesterase (AChE), butirilcolinesterase (BChE) e carboxilesterase (CarbE) hidrolisam ésteres de fosfato seus sítios ativos sofrem fosfatação inibitória. Por isto, tal fosfatação pode proteger seres vivos contra o espalhamento de xenobióticos organofosforados dentro de seus corpos, já que estas enzimas têm a capacidade de captar moléculas de pesticidas organofosforados estequiometricamente. Os organismos terrestres vivem em um ambiente com mais oxigênio do que os organismos aquáticos. Na água, quando o nível de oxigênio atinge aproximadamente 2,6 mg/L o ambiente está em hipoxia. Este fenômeno afeta ecossistemas aquáticos, uma vez que muitos organismos não conseguem se adaptar à baixa do oxigênio. Estudamos peixes em hipoxia e hiperoxia para entender melhor a bioquímica do funcionamento de suas enzimas captadoras de organofosforados quando eles estão expostos às variações físico-químicas de seus habitats. Dois grupos de no mínimo seis pacus (Piaractus mesopotamicus), seis peixes dourados (Carassius auratus auratus), seis tilápias (Oreochromis niloticus niloticus), seis piavussus (Leporinus macrocephalus), seis apaiaris (Astronotus ocellatus), ou seis carpas (Cyprinus carpio carpio) foram aclimatados à temperatura ambiente em dois aquários de 250 L. No primeiro aquário, pelo menos três animais ensaio de cada espécie sofreram hipoxia por diminuição da concentração de oxigênio até 0,5 mg/L através de borbulhamento de nitrogênio na água. Quando estes animais atingiram a hipoxia foram mantidos a 0,5 mg/L de oxigênio por 6, 8, 24 ou, no máximo, por 42 horas. Três peixes controle de cada espécie foram mantidos em normoxia (4,5 até 7,0 mg/L de oxigênio). Após estes tempos houve a retirada de cerca de 3,5 mL de sangue e dos fígados. Depois de coagular, o sangue foi centrifugado para retirada do soro sobrenadante, que foi usado como amostra para ensaios das esterases. Os fígados foram armazenados em freezer a -70 C e, no momento do ensaio, homogeneizados e centrifugados para obter as frações citosólica e microssomal. As atividades das esterases foram ensaiadas em espectrofotômetro com os substratos acetiltiocolina, butiriltiocolina ou p-nitrofenilacetato. As atividades sobre p-nitrofenilacetato (CarbE) do soro e do fígado sofreram queda em todos os exemplares das espécies submetidos à hipoxia. Tipicamente, esta atividade caiu cerca de 50% nos soros de pacus mantidos por 42 h sob concentrações de oxigênio abaixo de 1,0 mg/L. O tempo para que ocorresse a queda desta atividade enzimática variou de espécie para espécie. / When the esterases acetylcholinesterase (AChE), butyrylcholinesterase (BChE) and carboxylesterase (CarbE) hydrolyze phosphate esters their active sites undergo inhibition by phosphorylation. Therefore, such phosphorylation may protect living beings against the spreading of organophosphates xenobiotics into their bodies, since these enzymes are capable of collecting organophosphate pesticide molecules stoichiometrically. Terrestrial organisms live in an environmental with more oxygen than aquatics organisms. In water, once the level of oxygen reaches 2.6 mg/mL, the environment is a hypoxic one. This occurrence affects aquatic ecosystem, as many organisms cannot adapt to low oxygen availability. We have been studying fish exposed to hypoxia and hyperoxia in order to understand better the biochemistry of enzymes capable of picking up organophosphates when fish are exposed to changes in the physical-chemistry of their habitats. Two groups of at least six pacus (Piaractus mesopotamicus), six goldfishes (Carassius auratus auratus), six tilapias (Oreochromis niloticus niloticus), six piavussus (Leporinus macrocephalus), six oscars (Astronotus ocellatus) or six carps (Cyprinus carpio carpio) were acclimated in two aquariums of 250 L. In separate aquaria, at least three assay animals of each species suffered hypoxia by decreasing the concentration of oxygen up to 0.5 mg/mL by bubbling nitrogen in the water. Once these animals reached hypoxia they were maintained at 0.5 mg/mL of oxygen for 6, 8, 24 or no more than 42 hours. Three control fish of each species were kept in normoxia (4.5 to 7 mg/mL of oxygen). Then, 3.5 mL of blood were withdrawn, fishes were sacrificed and their liver removed. After clotting, blood was centrifuged to remove the supernatant serum, which was used as a sample for assaying esterase activities. Livers were stored at -70 C and, at the time of the enzyme assays, homogenized and centrifuged to obtain the cytosolic and microsomal fractions. Esterase activities were assayed using a spectrophotometer with the substrates acetylthiocholine, butyrylthiocholine or p-nitrophenylacetate. The serum and liver activities with p-nitrophenylacetate fell in all specimens subjected to hypoxia. Typically, in pacu kept for 42 h below 1.0 mg of oxygen per liter this activity dropped about 50%. The time required for the drop on enzyme activities varied from species to species.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2016-10-07T11:26:10Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1381844 bytes, checksum: f37c2685480834a1dd06580f7461ed33 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-10-07T11:26:10Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1381844 bytes, checksum: f37c2685480834a1dd06580f7461ed33 (MD5) Previous issue date: 2010-10-21 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A lagarta da soja, Anticarsia gemmatalis, por ser considerada uma das principais pragas da cultura da soja, tem sido alvo de estudos visando a busca de alternativas para o seu controle. A utilização de inibidores de proteases (IPs) como alternativa para o controle de pragas tem sido amplamente estudada. Sabe-se que uma rota de defesa vegetal, talvez a mais conhecida, é denominada rota octadecanóide (ou via das lipoxigenases), a qual culmina com a produção do ácido jasmônico: um hormônio vegetal que ativa genes que expressam inibidores de proteases, tidos como agentes anti-metabólicos, pois levam os insetos a uma deficiência protéica. Os IPs atuam no intestino médio dos herbívoros, inibindo a ação das proteases sobre as proteínas provindas da alimentação, havendo, portanto, uma redução na disponibilidade de aminoácidos ao inseto, podendo resultar no atraso do crescimento e reprodução desses herbívoros e, consequentemente, na sua morte. Este trabalho teve por objetivos avaliar a capacidade da planta da soja de responder ao ataque de A. gemmatalis através da via das lipoxigenases e as respostas bioquímica, comportamental e fisiológica da lagarta da soja a concentrações crescentes do inibidor sintético de serino-proteases, berenil. Para tal, as lagartas foram alimentadas com plantas de soja da variedade IAC-PL-1, pulverizadas com berenil nas doses 0,0; 0,008; 0,01; 0,20; 0,60; e 1,0% (p/v ) e com plantas de soja das variedades IAC-18, IAC-24 e FOSCARIN-31 contendo 0,0; 0,60; e 1,0% (p/v) de berenil. Nas quatro cultivares testadas, observou-se que após o ataque da lagarta da soja ocorreu um aumento no pool de lipoxigenases nas folhas, o que levou a uma alta produção de inibidores de protease. Nas lagartas que foram alimentadas com plantas da variedade IAC-PL-1, observou-se interferência de berenil na resposta comportamental desses insetos, que tiveram preferência por plantas que não receberam pulverizações com o inibidor, o mesmo não sendo observado para as mariposas com relação à preferência para oviposição. Com relação ao desenvolvimento pós-embrionário, ocorreu uma redução significativa no ganho de peso. Foi observada também uma significativa redução na sobrevivência e no tempo de vida das larvas alimentadas com as maiores doses do inibidor. Além disso, houve inibição das atividades proteolítica e tríptica do intestino das lagartas nas quatro cultivares de soja. Os resultados obtidos indicam que a utilização de berenil é uma estratégia promissora para o controle da lagarta da soja e possivelmente de outros insetos-praga que tenham a tripsina como principal enzima digestiva. / The caterpillar, Anticarsia gemmatalis, for being considered a pest of soybean, has been the target of studies aimed at finding alternatives to its control. The use of protease inhibitors (PIs) as an alternative for pest control has been widely studied. It is known that a plant defense route, perhaps the best known is called octadecanóide route (or lipoxygenase pathway), which culminates with the production of jasmonic acid: a plant hormone that activates genes expressing protease inhibitor, taken as anti-metabolic agents, since they bring the insects to a protein deficiency. IPs work in the midgut of herbivores, inhibiting the action of proteases on proteins originated from food, therefore there is a reduction in the availability of amino acids to the insect, which can result in delayed growth and reproduction of herbivores and hence in its death. This study aimed to evaluate the ability of the soybean plant to respond to the attack of A. gemmatalis through the lipoxygenase pathway and biochemical responses, behavioral and physiological soybean caterpillar to increasing concentrations of synthetic inhibitor of serine proteases, berenil. To this end, the larvae were fed with soybean variety IAC PL-1, treated with berenil doses 0.0, 0.008, 0.01, 0.20, 0.60, and 1.0% (w/v) and the soybean variety IAC-18, IAC-24 and Foscarin-31 containing 0.0, 0.60, and 1.0% (w/v) of berenil. In the four cultivars tested, it was observed that after the attack of soybean caterpillar was an increase in the pool of lipoxygenase in the leaves leading to a high production of protease inhibitors. In the caterpillars that were fed on plants of the variety IAC PAL-1, there was interference from berenil behavioral response of these insects, which had no preference for plants that received the inhibitor sprays, but these were not observed for moths in relation to oviposition preference. Regarding the post-embryonic development, there was a significant reduction in weight gain. There was also a significant reduction in the survival and life span of larvae fed the highest doses of the inhibitor. Furthermore, there was inhibition of the proteolytic and tryptic activities of the gut of caterpillars in the four cultivars. The results indicate that the use of berenil is a promising strategy for control of soybean caterpillar and possibly other insect pests that have the main digestive enzyme trypsin. / Tese importada do Alexandria

Made available in DSpace on 2015-06-08T13:58:12Z (GMT). No. of bitstreams: 2 157.pdf: 3353179 bytes, checksum: 886860343acd5f5da6e85e0f3a26a9f3 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2013 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães. Recife, PE, Brasil / A resistência de populações de Aedes aegypti a inseticidas químicos tem representado um desafio nos programas para seu controle. Este projeto teve como objetivos caracterizar o perfil de susceptibilidade de populações de A. aegypti de Pernambuco, relacionando-o ao histórico local de uso de tais compostos e aos mecanismos que podem estar associados à resistência. Amostras de A. aegypti de 17 municípios foram analisadas através de bioensaios com o temephos (larvicida) e diflubenzuron (regulador de crescimento) e um adulticida, a cipermetrina. Testes bioquímicos foram realizados para quantificar a atividade das enzimas acetilcolinesterase (ACE), glutationa S-transferase (GST), esterases (Alfa, Beta e PNPA) e oxidases de função mista (MFO). Também foram investigadas mutações no gene do canal de sódio: sítios 982, 1011, 1014, e 1016. Os resultados demonstraram que todas as populações estavam resistentes ao temephos, exceto a de Fernando de Noronha. A razão de resistência (RR) foi moderada apenas na população Recife, enquanto RR 100 vezes foram observadas em 10 populações. Houve uma correlação entre o consumo e a RR a este produto. Para o diflubenzuron foi construída uma linha de base dose resposta e as RR foram correlacionadas positivamente com as observadas para o temephos. A análise para a cipermetrina também apontou que todas as populações apresentam resistência a este composto. Os padrões enzimáticos se mostraram alterados para as GST, esterases alfa e PNPA. A análise molecular revelou que a mutação Ile1011Met está disseminada em todas as populações, em heterozigose, mas apenas para duas delas houve associação com a resistência. A mutação Val1016Ile esteve presente em sete populações em heterozigose, e não houve associação com a resistência Estes achados evidenciam uma situação critica para efetividade de controle do mosquito com inseticidas químicos, visto que a resistência ao temephos e à cipermetrina está disseminada nas populações pernambucanas de A. aegypti

Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo a Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro / Quando as esterases acetilcolinesterase (AChE), butirilcolinesterase (BChE) e carboxilesterase (CarbE) hidrolisam ésteres de fosfato seus sítios ativos sofrem fosfatação inibitória. Por isto, tal fosfatação pode proteger seres vivos contra o espalhamento de xenobióticos organofosforados dentro de seus corpos, já que estas enzimas têm a capacidade de captar moléculas de pesticidas organofosforados estequiometricamente. Os organismos terrestres vivem em um ambiente com mais oxigênio do que os organismos aquáticos. Na água, quando o nível de oxigênio atinge aproximadamente 2,6 mg/L o ambiente está em hipoxia. Este fenômeno afeta ecossistemas aquáticos, uma vez que muitos organismos não conseguem se adaptar à baixa do oxigênio. Estudamos peixes em hipoxia e hiperoxia para entender melhor a bioquímica do funcionamento de suas enzimas captadoras de organofosforados quando eles estão expostos às variações físico-químicas de seus habitats. Dois grupos de no mínimo seis pacus (Piaractus mesopotamicus), seis peixes dourados (Carassius auratus auratus), seis tilápias (Oreochromis niloticus niloticus), seis piavussus (Leporinus macrocephalus), seis apaiaris (Astronotus ocellatus), ou seis carpas (Cyprinus carpio carpio) foram aclimatados à temperatura ambiente em dois aquários de 250 L. No primeiro aquário, pelo menos três animais ensaio de cada espécie sofreram hipoxia por diminuição da concentração de oxigênio até 0,5 mg/L através de borbulhamento de nitrogênio na água. Quando estes animais atingiram a hipoxia foram mantidos a 0,5 mg/L de oxigênio por 6, 8, 24 ou, no máximo, por 42 horas. Três peixes controle de cada espécie foram mantidos em normoxia (4,5 até 7,0 mg/L de oxigênio). Após estes tempos houve a retirada de cerca de 3,5 mL de sangue e dos fígados. Depois de coagular, o sangue foi centrifugado para retirada do soro sobrenadante, que foi usado como amostra para ensaios das esterases. Os fígados foram armazenados em freezer a -70 C e, no momento do ensaio, homogeneizados e centrifugados para obter as frações citosólica e microssomal. As atividades das esterases foram ensaiadas em espectrofotômetro com os substratos acetiltiocolina, butiriltiocolina ou p-nitrofenilacetato. As atividades sobre p-nitrofenilacetato (CarbE) do soro e do fígado sofreram queda em todos os exemplares das espécies submetidos à hipoxia. Tipicamente, esta atividade caiu cerca de 50% nos soros de pacus mantidos por 42 h sob concentrações de oxigênio abaixo de 1,0 mg/L. O tempo para que ocorresse a queda desta atividade enzimática variou de espécie para espécie. / When the esterases acetylcholinesterase (AChE), butyrylcholinesterase (BChE) and carboxylesterase (CarbE) hydrolyze phosphate esters their active sites undergo inhibition by phosphorylation. Therefore, such phosphorylation may protect living beings against the spreading of organophosphates xenobiotics into their bodies, since these enzymes are capable of collecting organophosphate pesticide molecules stoichiometrically. Terrestrial organisms live in an environmental with more oxygen than aquatics organisms. In water, once the level of oxygen reaches 2.6 mg/mL, the environment is a hypoxic one. This occurrence affects aquatic ecosystem, as many organisms cannot adapt to low oxygen availability. We have been studying fish exposed to hypoxia and hyperoxia in order to understand better the biochemistry of enzymes capable of picking up organophosphates when fish are exposed to changes in the physical-chemistry of their habitats. Two groups of at least six pacus (Piaractus mesopotamicus), six goldfishes (Carassius auratus auratus), six tilapias (Oreochromis niloticus niloticus), six piavussus (Leporinus macrocephalus), six oscars (Astronotus ocellatus) or six carps (Cyprinus carpio carpio) were acclimated in two aquariums of 250 L. In separate aquaria, at least three assay animals of each species suffered hypoxia by decreasing the concentration of oxygen up to 0.5 mg/mL by bubbling nitrogen in the water. Once these animals reached hypoxia they were maintained at 0.5 mg/mL of oxygen for 6, 8, 24 or no more than 42 hours. Three control fish of each species were kept in normoxia (4.5 to 7 mg/mL of oxygen). Then, 3.5 mL of blood were withdrawn, fishes were sacrificed and their liver removed. After clotting, blood was centrifuged to remove the supernatant serum, which was used as a sample for assaying esterase activities. Livers were stored at -70 C and, at the time of the enzyme assays, homogenized and centrifuged to obtain the cytosolic and microsomal fractions. Esterase activities were assayed using a spectrophotometer with the substrates acetylthiocholine, butyrylthiocholine or p-nitrophenylacetate. The serum and liver activities with p-nitrophenylacetate fell in all specimens subjected to hypoxia. Typically, in pacu kept for 42 h below 1.0 mg of oxygen per liter this activity dropped about 50%. The time required for the drop on enzyme activities varied from species to species.

Made available in DSpace on 2018-08-02T00:16:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_6673_DISSERTAÇÃO VITOR L. NASCIMENTO.pdf: 8001279 bytes, checksum: e74d8d5c155376cb12f992605c34dc65 (MD5) Previous issue date: 2013-02-22 / RESUMO O abacaxizeiro (Ananas comosus var. comosus) é uma das frutíferas tropicais mais produzidas no mundo. O Brasil destaca-se mundialmente na produção desta fruta e o Espírito Santo vem mostrando potencial nacional de produtividade. Doenças e pragas constituem fatores restritivos para o alcance de uma produtividade ideal em qualquer cultura agrícola. O abacaxizeiro é uma planta que pode ser afetada por várias doenças causadas por fungos, bactérias e vírus, destacando-se em importância econômica a fusariose. As respostas de hipersensibilidade são os primeiros eventos que ocorrem nas células das plantas em resposta aos estresses bióticos e abióticos. Há síntese de espécies reativas de oxigênio (EROs) como peróxido de hidrogênio (H2O2), hidroxila (OH-) e superóxido (O2 -) que podem produzir danos oxidativos nos seres vivos como forma de proteção. As plantas possuem um sistema de defesa bem desenvolvido contra as EROs, constituído por uma complexa gama de antioxidantes enzimáticos e não enzimáticos que protegem as células dos danos oxidativos. O processo de infecção de diversos fungos, como o causador da fusariose do abacaxizeiro, é dependente de injúria nos tecidos da planta. O aumento da expressão e atividade das enzimas antioxidantes está correlacionado com a defesa de plantas à fitopatógenos e pragas. O objetivo foi caracterizar a resposta diferencial entre duas cvs de abacaxizeiro, Vitória (resistente à fusariose) e Pérola (susceptível à fusariose), ao estresse oxidativo gerado pela injúria foliar. Para isso foi determinada a concentração de proteínas solúveis totais das duas cvs, Vitória e Pérola, com e sem injúria foliar, quantificado e comparado à atividade das enzimas superóxido dismutase (SOD EC 1.15.1.1), peroxidase do ascorbato (APX EC 1.11.1.11) e catalase (CAT EC 1.11.1.6) após o tratamento de injúria foliar em diferentes tempos e caracterizado os perfis das proteínas solúveis totais e das isoenzimas de SOD e CAT em SDS-PAGE nos tempos em que houver melhor resposta. Como primeiro resultado, temos que não há diferença das proteínas solúveis totais entre as cultivares e os tratamentos nos tempos analisados. Também foi demonstrado que as enzimas antioxidantes da cv Vitória apresentam significativa diferença de atividade em relação às da Pérola. A SOD da cv. Vitória apresentou pico de resposta aos 15 minutos após a injúria. A APX apresentou resposta diferencial, para Vitória, aos 30 e 45 minutos após injúria foliar. Já a CAT da cv. Vitória apresentou um pico de resposta diferencial aos 45 minutos. As análises em SDS-PAGE com padrões de SOD e CAT, aos 15, 30 e 45 minutos após a injúria foliar demonstraram que não há diferença quantitativa entre as enzimas analisadas. Na cv Vitória há correlação entre a atividade de enzimas antioxidantes e a resposta à injúria foliar. Porém a atividade não está diretamente relacionada à concentração das enzimas. Por não haver grande diferença na expressão protéica sugere-se que reguladores e cofatores dessas

Duas variações de resíduo agroindustrial foram analisadas como meio de cultura para o bioprocesso de fermentação semissólida pelo fungo Fusarium oxysporum, com o objetivo de obter a melhor produção de peptidases e lipases. Essas enzimas foram microencapsuladas por spray drying, visando garantir sua estabilidade e investigar outros prováveis benefícios obtidos pela técnica. A utilização de planejamento experimental permitiu analisar os efeitos e interações entre as variáveis operacionais do processo (temperatura de secagem, proporção de adjuvantes e relação entre adjuvantes). A caracterização bioquímica e físico-química do extrato enzimático e das micropartículas também foram estudadas. O emprego de farelo de trigo como substrato demonstrou maior produção enzimática que o uso de farelo de algodão. A fermentação produziu uma serinopeptidase e uma lipase, ambas com característica alcalina, com alta estabilidade em ampla faixa de pH e certa estabilidade em diferentes temperaturas. Para ambas as enzimas, observou-se modulação positiva da atividade frente à maioria dos íons estudados e forte inibição pelo surfactante SDS, enquanto a lipase demonstrou superatividade frente a CTAB. A caracterização enzimática permite sugerir a aplicação dessas enzimas na formulação de detergentes enzimáticos, indústria de couro, indústria de papel, agroquímicos, síntese de biopolímeros e biodísel. No processo de microencapsulação, a temperatura foi a variável operacional mais importante para a estabilidade, enquanto a quantidade de adjuvantes em relação à quantidade de extrato enzimático influenciou nas condições de manipulação. O estudo demonstrou que a técnica de microencapsulação por spray drying resultou em grande benefício no armazenamento das enzimas, por aumentar consideravelmente sua estabilidade e melhorar as propriedades físicas do extrato. / Two variations of agroindustrial residue were analyzed as culture medium for the bioprocess of solid-state fermentation by the fungus Fusarium oxysporum, in order to achieve the best production of peptidases and lipases. These enzymes were microencapsulated by spray drying in order to ensure its stability and investigate other potential benefits obtained by the technique. The use of experimental design allowed us to analyze the effects and interactions between the operating variables of the process (drying temperature, proportion of adjuvants and relation among adjuvants). Biochemical and physico-chemical characterization of the enzymatic extract and of the microparticles were also studied. The use of wheat bran as substrate demonstrated a greater enzyme production then the use of cottonseed meal. The fermentation produced serinepeptidases and lipases, both alkaline, with high stability over a wide pH range and some stability at different temperatures. For both enzymes, there was up regulation of activity with most of the ions analyzed and strong inhibition against the surfactant SDS, whereas lipase demonstrated superactivity against CTAB. The enzymatic characterization suggests the application of these enzymes in the formulation of enzymatic detergents, leather industry, paper industry, agrochemicals, synthesis of biopolymers and biodiesel. In the microencapsulation process, the temperature was the most important operating variable for stability, while the amount of adjuvants in relation to the amount of enzymatic extract influenced in terms of handling. The study demonstrated that the technique of microencapsulation by spray drying resulted in benefits for the storage of enzymes, by increasing considerably its stability and improve the physical properties of the extract.