Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2015-10-29T14:03:01Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 583707 bytes, checksum: 20b2945972e80b046a9b7dfe20017e5c (MD5) / Made available in DSpace on 2015-10-29T14:03:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 583707 bytes, checksum: 20b2945972e80b046a9b7dfe20017e5c (MD5) Previous issue date: 2015-07-24 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / A defesa das plantas contra os insetos são processos complexos que envolvem a ativação ou repressão de diferentes vias de sinalização, permitindo assim a sobre- expressão de genes alvo com propriedades de defesa. O objetivo deste estudo foi determinar a relação entre a resposta defensiva de Coffea arabica mediante as vias das lipoxigenases e polifenoloxidases e o processo de herbivoria de Leucoptera coffeella. Foi realizado um experimento com dois tratamentos: 1) plantas de café infestadas e 2) plantas não infestadas com bicho–mineiro. Cada tratamento foi composto por 10 repetições e avaliou-se a atividade das lipoxigenases e polifenoloxidases; e a produção de inibidores de proteases no cafeeiro. Em L. coffeella a atividade de tripsina-like foi verificada usando os substratos L-BApNA e L-TAME e a quimotripsina-like foi determinada com BTpNA e ATEE. As cisteíno-proteases deste inseto foi obtida utilizando L-BApNA e proteases totais usando azocaseína como substrato. Todas as atividades enzimáticas foram determinadas por espectrofotometria. Houve um aumento nas atividades enzimáticas das plantas infestadas em relação as não infestadas nas vias estudas (lipoxigenase: F= 29,4; p= 0,00022 e polifenoloxidases: F= 8,41; p= 0,00022) e na produção de inibidores de proteases (F= 9,64; p= 0,0022). A partir das análises de correlação de Pearson, observou-se que a quimotripsina-like e os inibidores de proteases apresentaram uma relação inversa (r= -0,82; p= 0,03). Já a tripsina-like teve correlação direta com as atividades das lipoxigenases (r= 0,6; p= 0,03) e polifenoloxidases (r= 0,82; p= 0,03). Diante do exposto, nas larvas de L. coffeella existe atividade tanto serino como cisteíno-proteases, mas a atividade serino-proteases é a mais expressada no intestino destes insetos. A produção de inibidores de proteases e as atividades de lipoxigenases e polifenoloxidases nas plantas de C. arabica são aumentadas na presença de L. coffeella, o que indica a possível participação destas vias no processo de defesa da planta. Palavras chaves: inibidores, tripsina, bicho-mineiro. / The plant defense against insects is complex processes that involve the activation or repression of different signaling pathways, thus allowing over-expression of target genes with defense properties. The aim of this study was to determine the relationship between the defensive response of Coffea arabica through the lipoxygenases and polyphenol pathways and herbivory process Leucoptera coffeella. It conducted an experiment with two treatments: 1) infested coffee plants and 2) plants not infested with leaf miner-of-coffee. Each treatment consisted of 10 repetitions and evaluated the lipoxygenase and polyphenol activity; and the protease inhibitors production in coffee. In L. coffeella the trypsin-like activity was checked using the L-BApNA and L-TAME substrates and chymotrypsin-like was determined using BTpNA and ATEE. The cysteine proteases activity was obtained using L-BApNA and total protease using azocasein as substrate. All enzyme activities were determined by spectrophotometry. There was an increase in the activities of infested plants over non-infested in the studied routes (lipoxygenase: F = 29.4, p = 0.00022 and polyphenol: F = 8.41, p = 0.00022) and production of inhibitors proteases (F = 9.64; p = 0.0022). From the Pearson correlation analysis, it was observed that the chymotrypsin-like and proteases inhibitors showed an inverse relationship (r = -0.82; p = 0.03). Already trypsin-like had direct correlation with the activities of lipoxygenase (r = 0.6; p = 0.03) and polyphenol (r = 0.82; p = 0.03). Given the above, in the larvaes L. coffeella there is activity both serine and cysteine proteases, but the serine-protease activity is who characterized the intestine of these insects. The protease inhibitors production and lipoxygenase and polyphenol activities in C. arabica plants come up increased in the presence of L. coffeella, indicating a possible role of these pathways in plant defense process. / Sem lattes

Resumo: Nos organismos vivos aeróbios, processos fisiológicos produzem espécies reativas de oxigênio (ERO) como subprodutos ou com a finalidade de combater microorganismos invasores. Estas espécies têm sido estudadas, pois promovem mutações de DNA, processos de envelhecimento e várias patologias. A formação de espécies reativas e radicais livres são equilibradas naturalmente pela existência de compostos conhecidos como antioxidantes. Tais compostos na dieta, são agentes protetores do corpo humano na remoção dos radicais livres. Os cogumelos são fungos conhecidos, desde a antiguidade, devido sua utilização, pelo homem, como alimento de elevado valor nutritivo e terapêutico. Neste sentido, a busca por opções terapêuticas para diferentes patologias faz da pesquisa de produtos naturais um campo fértil em opções de moléculas com diferentes atividades biológicas. A relevância da pesquisa de produtos naturais proporciona a descoberta de novos fármacos e o estudo de cogumelos que apresentem substâncias que possam agir sobre as diferentes espécies oxidantes geradas em nosso organismo torna-se de grande importância. No estudo da avaliação do potencial antioxidante das amostras deve-se considerar que: um composto deve ser testado em concentrações disponíveis in vivo e ao avaliar os antioxidantes, deve-se utilizar pelo menos uma espécie relevante biologicamente. Deve-se perguntar como age o antioxidante, se ele age diretamente sobre a ERO ou ele inibe a sua geração e, ainda, se ele age indiretamente regulando defesas antioxidantes endógenas. Assim, este trabalho teve por objetivo a partição (usando técnicas cromatográficas como: CCD e CLAE) e validação, in vitro, das frações do cogumelo Agaricus blazei Murril como produtos antioxidantes (usando metodologias préestabelecidas, como: radical ABTS, radical DPPH, Radical Superóxido, TNB/HOCl e TNB/H2O2). / Abstract: In aerobic living organisms, physiologic processes produce reactive oxygen species (ROS) as by-products or to fight against microorganisms. This species have being studied, whereas promotes DNA mutation, aging process and several pathologies. Reactive species and free radicals generation are equilibrated by antioxidants. Thus, these antioxidants in diets, are protector agent to the human body in removal of free radicals. Since antiquity the mushrooms are consumed as a high nutritional meal and therapeutic worth. In this manner, the search of new medicines turns natural products research an important option for discovering molecules with different biological activities. Natural products research is relevant for discovering molecules able to fight against oxidant species. In evaluating the antioxidant potential of substances, it is important to considerate: a compound should be tested at concentrations achievable in vivo and in assaying antioxidants, one should use biologically relevant ROS. It is important to know if it works directly over the oxidant or if it works by regulating endogenous antioxidants defenses. Thus, this work had as objective the partition (using chromatografic techniques, as: TLC and HPLC) and validation, in vitro, of the Agaricus blazei Murril mushroom fractions as antioxidant products (using préestablished methodologies, as: ABTS radical, DPPH radical, Superoxide radical, TNB/HOCl and TNB/H2O2). It was also evaluated, the presence of peroxidase and polyphenoloxidase enzymes. The evaluated fractions showed antioxidant activity similar to the patterns (trolox and uric acid) in removal of ABTS radical and DPPH radical, except for the hexanic fraction. In the TNB/HOCl system, the samples presented small activity (it wasn't possible to determi ne IC50), and your activities were very inferior to the patterns. In the TNB/H2O2 system, the samples didn't presented activity to kidnap H2O2. / Orientador: Olga Maria Mascarenhas de Faria Oliveira / Coorientador: Maysa Furlan / Banca: Erna Elisabeth Bach / Banca: Mariza Pires de Melo / Mestre

Resumo: No presente trabalho, a atividade da enzima glicerol quinase (GK; EC 2.7.1.30; ATP: glicerol 3-fosfotransferase), proveniente de extratos de levedura seca de panificação, foi otimizada. A melhor preparação enzimática da GK foi obtida por rompimento celular com esferas de vidro, durante sete minutos, com lise de 54,2% das células. O extrato celular foi parcialmente purificado com 1% de sulfato de estreptomicina, antes da precipitação com igual volume de solução a 30% (m/v) de polietilenoglicol 3350, e posteriormente dialisado. A atividade máxima da GK foi obtida em pH 10,0, a 60ºC e 50mM de substrato, por metodologia clássica. A enzima apresentou alta estabilidade térmica ― a atividade foi completamente mantida até 50ºC, durante uma hora ― e em pH entre 6,0 e 8,0. Além disso, manteve-se estável, por quatro meses, a 4°C, na presença de azida de sódio 0,05% e cloreto de cobalto 10mM, e, por até oito meses, com o extrato liofilizado. Calculados pelos métodos de Lineweaver-Burk, Hanes-Woolf e Eadie-Hofstee, o valor da constante de Michaelis (Km) da enzima variou entre 1,99mM e 3,11mM, e a Vmax, entre 1,14U/mL e 1,19U/mL. Utilizou-se a metodologia de superfície de resposta (MSR) para melhor definição dos parâmetros da reação enzimática, observando-se valores ótimos de atividades a temperaturas entre 52ºC e 56ºC, pH entre 10,2 e 10,5 e concentração de substrato de 150mM a 170mM. A MSR mostrou-se adequada para modelar a reação e maximizar a atividade da glicerol quinase. Este método, de baixo custo, dosa a glicerol quinase em uma seqüência de reações, sendo de grande importância para diversas indústrias, como a de alimentos, açúcar e álcool. / Abstract: In the present study, the activity of the enzyme glycerol kinase (GK; EC 2.7.1.30; ATP: glycerol 3-phosphotransferase) from dry baker's yeast, was optimized. The best enzymatic preparation of GK was obtained by cell disruption with glass beads, for seven minutes, with 54.2% of lysed cells. Cell extract was partially purified with 1% of streptomycin sulphate, before the precipitation with equal volume of a 30% solution (m/v) of polyethylene glycol 3350, and then it was dialyzed. The maximum activity of GK was obtained with pH 10.0, at 60ºC and 50mM of substrate, by the classic methodology. The enzyme presented high thermal stability ― the activity was completely maintained up to 50ºC, during one hour ― and at pH between 6.0 and 8.0. Besides, it was stable, for four months, at 4°C, in the presence of sodium azide 0.05% and cobalt chloride 10mM, and, for up to eight months, with the lyophilized extract. The value of the Michaelis constant (Km) of the enzyme was calculated by the methods of Lineweaver-Burk, Hanes-Woolf and Eadie-Hofstee,and it varied between 1.99mM and 3.11mM, and Vmax, between 1.14U/mL and 1.19U/mL. Response surface methodology (RSM) was used for better definition of the parameters of the enzymatic reaction, being observed higher activity values at temperatures between 52ºC and 56ºC, pH between 10.2 and 10.5 and substrate concentration from 150mM to 170mM. RSM showed to be an adequate approach for modeling the reaction and maximizing the glycerol kinase activity. This low cost method doses glycerol kinase in a sequence of reactions, being of great importance for many industries, like food, sugar and alcohol. / Orientador: Maristela de Freitas Sanches Peres / Coorientador: Edwil Aparecida de Lucca Gattás / Banca: Luis Henrique Souza Guimarães / Banca: Rubens Monti / Mestre

Os insetos da ordem Hemiptera apresentam membranas lipoproteicas que revestem as microvilosidades das células intestinais, como se fossem dedos de luva, e formam expansões para o lúmen do intestino que parecem terminar em fundo cego. A presença das duas membranas no ápice dos enterócitos gera questões intrigantes de como se dá a formação da membrana perimicrovilar, como ocorre a absorção de nutrientes e como se dá o encaminhamento de enzimas digestivas para o lúmen intestinal. A digestão de proteínas baseada em enzimas originalmente lisossômicas é uma característica marcante nos Hemiptera, em especial os Heteroptera que evolutivamente voltaram a uma alimentação de polímeros. O presente estudo indica que os genes das proteinases tipicamente lisossômicas sofrem uma série de duplicações, havendo a manutenção de um gene para função puramente lisossômica e a divergência funcional dos demais genes para a função de digestão extracelular. O gene que mantém a função lisossômica não é modulado pela alimentação, além de ser expresso nos mais diversos tecidos. Já os genes que se especializaram na digestão extracelular têm a expressão aumentada com a ingestão de alimento, indicando sua função. Parece não haver diferença nas características relacionadas ao encaminhamento celular das proteínas produzidas por esses genes, indicando que o direcionamento para a rota secretória é devido à superexpressão dos genes relacionados à digestão. Enzimas como alfa-glicosidases, alfa-manosidases e aminopeptidases que participam da digestão extracelular seguem a rota secretória que envolve a formação de vesículas de dupla membrana. Foi possível ampliar o modelo de digestão incluindo a participação das catepsinas D, de uma alfa-glicosidase solúvel e a possível participação de uma tiolredutase além do definir o local de atuação das lipases. Temos agora uma visão global da participação das enzimas digestivas que atuam na digestão em D. peruvianus. / The insects of the order Hemiptera have lipoprotein membranes lining the microvilli of midgut cells, like glove fingers, and form expansions into the lumen of the intestine. The presence of two membranes on the apex of enterocytes thus generates intriguing questions about the formation of perimicrovillar membrane, the absorption of nutrients, and the targeting of digestive enzymes into the intestinal lumen. The digestion of proteins based on originally lysosomal enzymes is an important feature in Hemiptera, especially in Heteroptera that evolutionary returned to feed on polymers. The genes of typical lysosomal proteinases undergo a series of duplications followed by the maintenance of a gene for purely lysosomal function and functional divergence of other genes for extracellular digestion function. The gene that maintains the lysosomal function is not modulated by feeding, in addition to being expressed in diverse tissues. By the other hand, genes specialized in extracellular digestion are up regulated by food intake, indicating its function. No difference was found in the targeting in the proteins produced by these genes, which indicates that targeting to the secretory route is due to overexpression of digestion-related genes. Enzymes involved in extracellular digestion as alpha-glucosidase, alpha-mannosidase and aminopeptidase follow the secretory route that includes the formation of double membrane vesicles. In this study we increased the digestion model adding the participation of cathepsin D, a soluble alpha-glucosidase, and the possible participation of a tiolredutase, and also to defining the place of lipases operation. We now have a global view of the participation of digestive enzymes involved in digestion D. peruvianus.

O Brasil apresenta cerca de 10 a 17,6% da biodiversidade mundial e apenas uma fração dela é conhecida. Os fungos filamentosos são bons produtores de enzimas e despertam um grande interesse biotecnológico. O amido é o principal carboidrato de reserva das plantas. Dentre as enzimas amilolíticas estão as glucoamilases, que catalisam a hidrólise das ligações -1,4 e -1,6 das extremidades da cadeia do amido liberando glucose. Neste trabalho foram isolados 25 fungos filamentosos de amostras de materiais em decomposição da Mata Atlântica. Dos micro-organismos com alta atividade amilolítica foram selecionados e identificados Aspergillus brasiliensis e Rhizopus oryzae. Foi realizada a otimização do cultivo e caracterização das amilases do extrato bruto de ambos os fungos. Após a obtenção destes dados foi selecionado A. brasiliensis, pois, sua amilase é mais termoestável e ainda não reportada na literatura. Após purificação a enzima foi identificada como glucoamilase, a qual é monomérica com 69 kDa e contém aproximadamente 21% de carboidratos. Apresenta um domínio de ligação ao amido na porção terminal e estrutura secundária rica em -hélice. Sua atividade ótima ocorre em pH 4,5 a 60°C, seu pI é de 3,21, pode ser ativada com a adição de Mn2+, e é inibida por glucose em concentrações maiores que 0,1 M. A glucoamilase apresenta excelente estabilidade ao pH e boa estabilidade a temperatura (a 50°C mantém 67% de atividade após 7 horas; a 55°C a meia vida é de 147 minutos). Com amido de batata a enzima apresentou as seguintes constantes cinéticas (km 2,21 mg/mL; Vmáx 155 U/mg; kcat 179 s-1; kcat/km 81,06). A glucoamilase foi imobilizada em DEAE-PEG com ativação de 12 vezes e possibilidade de reuso de 10 vezes com perda de apenas 31% de atividade. O derivado demostrou maior facilidade para hidrolisar a amilopectina do que à amilose. Também foi realizada uma análise de neighbor joining, que agrupou a glucoamilase de A. brasiliensis próxima às glucoamilases de espécies de Aspergillus, que são consideradas as mais derivadas. / Brazil holds about 10-17.6% of the world\'s biodiversity and just a percentage of it is known. Filamentous fungi are enzyme producers that have great biotechnological application. Starch is the main reserve carbohydrate in plants. Among the amylolytic enzymes there are the glucoamylases, that catalyze the hydrolysis of -1,4 and -1,6 linkages of the end of starch chains, and releases glucose. In this research 25 filamentous fungi from Atlantic forest decaying material samples were isolated. Among microorganisms with high amylolytic activity Aspergillus brasiliensis and Rhizoupus oryzae were selected and identified. The cultivation parameters were optimized and the enzymes of crude extract were characterized. Considering the previous data Aspergillus brasiliensis was selected because its amylases are more thermostable and it has not been described in the literature yet. After purification the enzyme was identified as a glucoamylase, which is monomeric with 69 kDa and about 21% of carbohydrates in its composition. The enzyme has a starch binding domain in the terminal position and its secondary structure is rich in -helix. The optimum pH for glucoamylase activity is 4.5, the temperature is 60ºC and its pI is 3.21. The enzyme can be activated by the addition of Mn+2, and inhibited in concentrations above 0,1M glucose. The glucoamylase has an excellent pH stability and a good temperature stability (at 50ºC 67% of the activity was retained after 7 hours; at 55°C its half-life was 147 minutes). The best kinetic values were obtained with potato starch (km 2.21 mg/mL; Vmax 155 U/mg; kcat 179 s-1; kcat/km 81,06). The glucoamylase was immobilized on DEAE-PEG, with an activation of 12 times and enzyme reuse 10 times with just 31% loss of its activity. The immobilized enzyme has a greater activity on amylopectin than amylose. A neighbor joining analysis with glucoamylases from filamentous fungi species was made and Aspergillus brasiliensis glucoamylase was grouped close to the glucoamylases of Aspergillus species, which are considered the most derivative.

Submitted by MARCOS LEANDRO TEIXEIRA DE OLIVEIRA (marcosteixeira@ufv.br) on 2018-09-06T11:45:46Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1440010 bytes, checksum: cb2d4ec526e6d344066f457ac1dcb840 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-09-06T11:45:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1440010 bytes, checksum: cb2d4ec526e6d344066f457ac1dcb840 (MD5) Previous issue date: 2018-02-28 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A cigarrinha-das-pastagens, Mahanarva spectabilis (Distant,1909) é a principal praga em forrageiras na América Tropical. Este inseto entra em diapausa na fase de ovo durante as estações desfavoráveis do ano. Informações sobre os processos de desenvolvimento da diapausa das cigarrinhas das pastagens e a reprogramação de defesas das plantas durante a colonização do inseto são necessárias para auxiliar no desenvolvimento de táticas de seu controle. Por meio de análises proteômicas nós identificamos e caracterizamos proteínas envolvidas em ovo de M. spectabilis durante a diapausa, não-diapausa e pós-diapausa. Essas estão envolvidas no processamento de informações, sinalização celular e metabolismo dos ovos deste inseto. Na segunda etapa deste trabalho foi detectado a presença de efetores nas glândulas salivares de Mahanarva spectabilis, tais como ácidos graxos de cadeia longa e ácido salicílico que podem estar envolvidos no processo de infestação de plantas de capim- elefante. Também foi confirmado e caracterizado a presença de apirases nas glândulas salivares das M. spectabilis, evidenciando que esta enzima interfere na modulação de resistência da planta. As análises fitohormonais das folhas de capim elefante indicam uma flutuação nos níveis de hormônios em função do tempo de infestação. Estes resultados nos permitem propor que efetores presentes nas glândulas salivares de cigarrinha das pastagens são responsáveis por suprimir a resposta de defesa da planta, tornando-se uma estratégia bem sucedida do inseto na colonização do hospedeiro. / The spittlebugs, Mahanarva spectabilis (Distant, 1909) is a major pest in forages in tropical America. This insect enters diapausa in the egg phase during the unfavorable seasons of the year. Information on the processes of development of spittlebugs tasks and reprogramming of plants during livestock colonization are necessary to assist in the development of their control tactics. By means of proteotic proteins we identified and characterized the egg proteins of M. spectabilis during a diapause, non-diapause and post-diapause. Cells are involved in information processing, cell signaling and egg metabolism of this insect. On Monday of this year the presence of effectors in the salivary glands of M. spectabilis, such as long-lasting fatty acids and salicylic acid, that are involved in the infestation process of elephantgrass plants were detected. It was also confirmed and marked an apirinal presence in the salivary glands of M. spectabilis, evidencing that this enzyme interferes in the modulation of resistance of the plant. Phytohormonal analyzes of elephantgrass leaves are indicated for fluctuation in hormone levels as a function of time of infestation. The results in relation to the proportion that the indicators present in the spittlebugs salivary gland glands are responsible for suppressing a defense response of the plant, becoming a successful strategy in the fight against host colonization.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / The objective of this dissertation was to evaluate the impacts of aflatoxin in a concentration of 2,8mg/kg, and sodic montmorillonite on performance, enzyme activity and liver function in broilers from 1 to 21 days, as well as compare to other products already on the market. Were utilize 540 chickens housed in cages. Experimental design was completely randomized, with 9 treatments and 6 replications. The treatments were: Control (basal diet), Ads0,50 (basal diet + 0,50% Test adsorbent), Afla (basal diet + 2,8mg/kg of Aflatoxin), Ads0,25 + Afla (basal diet + 0,25% Test adsorbent + 2,8mg/kg of Aflatoxin), Ads0,50 + Afla (basal diet + 0,50% Test adsorbent + 2,8mg/kg of Aflatoxin), AdsA + Afla (basal diet + 0,50% A adsorbent + 2,8mg/kg of Aflatoxin), AdsB + Afla(basal diet + 0,50% B adsorbent + 2,8mg/kg of Aflatoxin), AdsC + Afla (basal diet + 0,50% C adsorbent + 2,8mg/kg of Aflatoxin), AdsD + Afla (basal diet + 0,50% D adsorbent + 2,8mg/kg of Aflatoxin). The adsorbents A, B, C, D are based sodic montmorillonite, but come from different companies. The data collected were subjected to analysis of variance and comparison of means by Tukey test (P ≤ 0.05). It is concluded that the test adsorbent in a concentration of 0,50% was effectively promoted and a reduction of toxic effects of aflatoxin on performance of broilers at 21 days of age but did not avoided changes in liver function and liver enzymes. And gave results similar to the products C and D, and higher than product B. / O objetivo desta dissertação foi avaliar os impactos da aflatoxina, na concentração de 2,8mg/kg, e da montmorilonita sódica sobre o desempenho, atividade enzimática e função do fígado em frangos de corte de 1 aos 21 dias, bem como comparar o produto à outros já existentes no mercado. Foram utilizados 540 frangos, alojados em baterias metálicas. O delineamento experimental foi inteiramente casualizado, composto por 9 tratamentos e 6 repetições. Os tratamentos utilizados foram: Controle (dieta basal), Ads0,50 (dieta basal + 0,50% adsorvente Teste), Afla (dieta basal + 2,8mg/kg de aflatoxina), Ads0,25+Afla (dieta basal + 0,25% adsorvente Teste + 2,8mg/kg de aflatoxina), Ads0,50+Afla (dieta basal + 0,50% adsorvente Teste + 2,8mg/kg de aflatoxina), AdsA+Afla (dieta basal + 0,50% adsorvente A + 2,8mg/kg de aflatoxina), AdsB+Afla (dieta basal + 0,50% adsorvente B + 2,8mg/kg de aflatoxina), AdsC+Afla (dieta basal + 0,50% adsorvente C + 2,8mg/kg de aflatoxina), AdsD + Afla (dieta basal + 0,50% adsorvente D + 2,8mg/kg de aflatoxina). Os adsorventes A, B, C, D são à base de montmorilonita sódica, porém oriundos de diferentes empresas. Os dados coletados foram submetidos à análise de variância, e a comparação entre médias pelo teste de Tukey (P≤0,05). Conclui-se que o adsorvente Teste na concentração de 0,50% foi eficaz e promoveu uma redução dos efeitos tóxicos da aflatoxina sobre o desempenho zootécnico de frangos de corte aos 21 dias de idade, porém não evitou alterações nas enzimas e função hepática. E ainda, apresentou resultados semelhantes aos produtos C e D, e superior ao produto B.

No tubo digestivo das larvas de Anastrepha fraterculus e Anastrepha pickeli há β-glicosidases capazes de clivar dissacarideos, β-glicosídeos tóxicos produzidos por plantas e substratos sintéticos. As β-glicosidases de A. fraterculus são pouco ativas e as de A. pickeli são bastante ativas sobre alguns compostos, entre eles linamarina, um glicosídeo cianogênico. Esse composto está presente, em altas concentrações, no fruto da mandioca do qual a larva se alimenta. A. fraterculus alimenta-se do fruto da goiaba e aparentemente consegue o carboidrato que necessita por ação de α-glicosidases, que são bem mais ativas do que as β. O fruto da mandioca não é tão nutritivo e A. pickeli deve aproveitar a glicose da linamarina para obter energia e consegue desintoxicar-se do aglicone tóxico. Rhynchosciara americana apresenta quatro β-glicosidases nas membranas microvilares intestinais, sendo três delas β-galactosidases. Dessas, duas são ativadas por Triton X-100 sendo que a glicosidase, de maior mobilidade eletroforética é ativada por este composto, com uma Ka de 4µM, um α de 0,5 e um β de 2. β-tioglicosidases foram demonstradas em afideos. Nós verificamos que ocorre a clivagem do tioglicosídeo sinigrina após separação das β-glicosidases digestivas do Lepidoptera Diatraea saccharalis por cromatografia hidrofóbica. Nesse inseto, a mesma enzima é capaz de clivar O- e S-glicosídeos com atividades semelhantes. Enzimas com essas características nunca foram descritas anteriormente. Esses experimentos ilustram a viabilidade das adaptações dos insetos na utilização de compostos formados for ligações β-glicosídicas, viabilizando a exploração de nutrientes normalmente inacessíveis a outros animais. / Anastrepha fraterculus and Anastrepha pickeli have in their midguts 13-glycosidases able to hydrolase dissaccharides, synthetic substrate and plant toxic β-glucosides. β-glycosidases from A. fraterculus have low activity and the enzymes from A. pickeli may be highly active depending on the substrate used. Linamarin, a cyanogenic β-glucoside present in A. pickeli food (Manihot fruit) is easly hydrolysed by A. pickeli β-glycosidases (A. fraterculus eats on guava fruits and may obtain carbohydrate through the action of α-glycosidases, that are much more active them the β-glycosidases). A. pickeli probably uses glucose derived from linamarinan avoiding the effects of the toxic aglycon. Rhynchosciara americana has 4 β-glycosidases (3 galactosidases and I glucosidase) in their intestinal microvilar membranes. Two of these enzymes are activated by Triton X-100. In β glucosidase the activation has Ka= 4µM, α=0,5 e β=2. β-thioglycosidases occur in Aphids. One digestive β-glucosidase from Diatraea saccharalis resolved by hydrofobic chrornatography hydrolyses sinigrin. The same enzyme may hydrolyse O- and S-glucosides with the same efficienly. Enzymes with this specificity have never been described before. In this study we shown some adaptations of insects to use substrates with β-glycosidic bonds, allowing these organisrns to explore nutrients usualy avoided by other animals.

Spiders and scorpions are efficient predators arachnid (PA) consuming preys larger than themselves. Few studies reported, molecularly, the digestion in PA. This work describes a biochemical, transcriptomic and proteomic analysis of the midgut and midgut glands (MMG) and digestive juice (DJ) from Nephilengys cruentata and Tityus serrulatus MMG. Cathepsin L, B, D and F, legumain, trypsin, astacin, carbohydrases and lipases were identified by these approaches. Peptide isomerase and ctenitoxins, which are venom proteins were identified, showing a correlation among digestive and venom enzymes. Summarily, PA relies in multi peptidase system mainly constituted of astacins for extracellular prey liquefaction and cathepsin L for intracellular digestion, describing a molecular model for digestion. Probably, during evolution, gene duplication led a diversification of astacins in the derived groups of Arachnida, like spiders, distinctly from what is observed in basal groups like scorpions. These data on Arachnida digestion will allow detailed multi disciplinary studies. / Aranhas e escorpiões são aracnídeos predadores eficientes (AP) consumindo presas maiores que eles mesmos. Poucos estudos descrevem molecularmente a digestão em AP. Neste trabalho caracterizamos bioquimicamente, por transcriptoma e proteoma o intestino e glândulas digestivas (IGD) e suco digestivo (SD) de Nephilengys cruentata e o IGD de Tityus serrulatus. Catepsinas L, B, D e F, legumaína, tripsinas, astacinas, carboidrases e lipases foram identificadas. Peptídeo isomerase e ctenitoxina foram identificadas no IGD. Estas proteínas podem indicar uma correlação entre enzimas digestivas e do veneno. Portanto, AP apresentam várias peptidases principalmente astacinas para liquefazer a presa extraoralmente e catepsinas L para digestão intracelular, descrevendo um modelo molecular para a digestão. Provavelmente, durante a evolução, eventos duplicação gênica levaram à diversificação das astacinas aracnídeos derivados, como as aranhas, diferentemente dos grupos basais, como os escorpiões. Estes dados sobre a digestão em Arachnida permitirão estudos multidisciplinares.

As L-asparaginases bacterianas (L-asparaginase amidohidrolase, E.C.3.S.1.1) são enzimas de alto valor terapêutico devido ao seu uso no tratamento de leucemia linfocítica aguda. A L-asparaginase da Escherichia coli por ser uma enzima periplásmica com alta afinidade, é particularmente efetiva em certas terapias de câncer infantil. Muitos agentes terapêuticos recentes são proteínas e peptídeos que surgiram do design molecular de drogas e tecnologia de DNA recombinante. Numerosos estudos têm demonstrado que aditivos preservam a estrutura e a atividade biológica de cada molécula destas proteínas. Entretanto, o mecanismo de proteção, pelo qual estes aditivos funcionam, não tem sido totalmente elucidado. O objetivo do presente trabalho é investigar detalhadamente o efeito da liofilização sobre a estrutura e a atividade enzimática da L-asparaginase, tanto em células íntegras de Escherichia coli, como na enzima purificada. Até recentemente a maneira para se avaliar o comportamento de um aditivo e o comportamento da água na estabilização de uma proteína durante a liofilização consistia na medida dos parâmetros de atividade após a reidratação, porém atualmente modernas técnicas de Ressonância Magnética Nuclear (RMN) de baixa resolução são utilizadas para se entender o comportamento da água nas interações com proteínas. E a Espectroscopia de Infravermelho por Transformada de Fourier apresenta grande potencial no estudo de estabilização de proteínas durante a liofilização. Utilizou-se o cálculo de porcentagem de retenção de atividade para expressar os valores de atividade enzimática estudados. Estes cálculos foram realizados para os sistemas congelados e para os sistemas congelados e liofilizados. Os sistemas foram tratados em velocidades de congelamento diferentes (20°C/min, SOC/min e 2°C/min), sendo em seguida liofilizados por 24 horas. São apresentados resultados sobre o efeito das diferentes velocidades de congelamento e o efeito da liofilização nos diferentes sistemas aditivo-enzima e aditivo-célula. Utilizaram-se os aditivos: sacarose, maltose, lactose, inositol, manitol e trealose testados em diferentes concentrações (30, 90 e 150mM). Para identificar quais as condições e os aditivos que apresentaram uma crioproteção satisfatória. Nos sistemas maltose-enzima e trealose-enzima observou-se um aumento da crioproteção com o aumento da concentração de aditivo. Para os sistemas maltose-enzima, congelados lentamente, os resultados de retenção de atividade foram: 8,67%, 14,02% e 30,80% respectivamente para 30, 90 e 150mM. O sistema enzima-maltose (150mM) congelado rapidamente e liofilizado apresentou a maior retenção de atividade (111,11 %) e também o maior valor de T2 (81µs) nos resultados referentes a RMN. Nos sistemas trealose-enzima nas concentrações de 90 e 150mM apresentaram retenção de atividade 89,93% e 79,74%, respectivamente. / Bacterial L-asparaginase (L-asparaginase amidohydrolase, E.C. 3.5.1.1) are enzymes of high therapeutic value due to their use in the treatment of lymphocytic acute leukemia. Escherichia coli L-asparaginase is a periplasmic enzyme of high affinity, particularly effective in some kinds of childhood cancer therapies. Several studies have showed that there are specific stabilizing additives preserve the structure and the biological activity of protein molecules (lyoprotectant). However, the protection mechanism for these excipients has not been totally elucidated yet. The aim of this work was investigate the effect of freeze-drying on the enzymatic activity of L-asparaginase using both the purified enzyme as well as intact cells of Escherichia coli. Until recently the way to evaluate the behavior of an addictive one and the behavior of the water in the stabilization of a protein during the freeze-drying consisted of the measure of the activity parameters after the reidratação, even so now modem techniques of the Nuclear Magnetic Resonance of low resolution have been used to understand the behavior of the water in the interactions with proteins. It is Infrared Spectroscopy for Fourier Transformed it presents a great potential in the study of stabilization of proteins during the freeze-drying. The calculation of percentage of activity retention was used to express the studied values of enzymatic activity. These calculations were accomplished for the frozen systems and for the frozen systems and freeze-dryied. The systems were treated in three speeds of different freezing (20°C/min, 5°C/min and 2°C/min), being the freeze-drying for 24 hours. Results are presented on the effect of the freeze-drying in the different systems addictive-enzyme and addictive-cell. The addictive ones were used: sucrose, maltose, lactose, inositol, manitol and trehalose tested in different concentrations (30, 90 and 150mM), to identify which the conditions and the addictive ones that presented a satisfactory cryoprotection. For the systems enzyme-maltose, frozen slowly, the results of activity retention were: 8,67%, 14,02% e 30,80% to 30,90 e 150mM,respectively . The system enzyme-maltose (150mM) frozen quickly and freeze-dryied presented the largest activity retention (111,11 %) and also the largest value of T2 (81 µs) in the referring results NMR. The systems enzyme-trealose in the concentrations of 90 and 150mM they presented retention of activity 89,93% and 79,74%, respectively.