Este trabalho consiste num estudo abrangente do sistema digestivo de espécies representativas da ordem Hemiptera, no qual dados de caráter morfológico foram integrados a informações bioquímicas e moleculares acerca das principais proteínas atuantes no processo digestivo destes animais. Para tanto, este projeto utilizou, como referência básica, um estudo prévio realizado com a espécie Bucephalogonia xanthophis (Hemiptera: Cicadellidae). As análises morfológicas desenvolvidas neste trabalho consistiram em um estudo comparativo ultraestrutural das espécies sugadoras de seiva Macugonalia leucomelas (subordem Auchenorrhyncha, Cicadellidae), Dalbulus maidis (subordem Auchenorrhyncha, Cicadellidae), Mahanarva fimbriolata (subordem Auchenorrhyncha, Cercopidae), Quesada gigas (subfamília Auchenorrhyncha, Cicadidae) e Diaphorina citri (subordem Sternorrhyncha, Psyllidae). Já a vertente molecular deste estudo buscou identificar, caracterizar e determinar a distribuição de transportadores de membrana, enzimas digestivas e outras proteínas atuantes no processo digestivo da espécie B. xanthophis. De um modo geral, as espécies da infraordem Cicadomorpha M. leucomelas, D. maidis, M. fimbriolata e Q. gigas apresentam uma organização anatômica do sistema digestivo muito semelhante ao descrito previamente para a cigarrinha B. xanthophis. Um esôfago conecta a boca ao intestino médio, que tem início na câmara de filtração (CF), que é composta pela aposição das porções anterior e posterior do intestino médio com as regiões proximais dos túbulos de Malpighi. Este órgão permite a excreção do excesso de água presente na seiva, permitindo a concentração dos nutrientes na porção mediana do intestino médio. O sistema digestivo segue por duas regiões anatomicamente distintas: o domínio cônico (DC) e o tubular (DT) do intestino médio. O intestino posterior é observado como um longo tubo livre pela hemocela a apresenta um reto dilatado, terminando em um ânus. De um modo geral, as espécies da família Cicadellidae (M. leucomelas e D. maidis) apresentam uma CF anatomicamente menos complexa do que se observa em M. fimbriolata e Q. gigas. Diferentemente das espécies da infraordem Cicadomorpha, o psilídeo D. citri exibe um sistema digestivo com uma CF relativamente ainda mais simples, sem a presença de túbulos de Malpighi. O intestino médio desta espécie também possui dois domínios distintos, mas apresentam caracteristicamente quatro apêndices de fundo cego que se projetam a partir do DT, cuja função ainda é desconhecida. Do ponto de vista ultraestrutural, as células da CF das espécies analisadas exibem adaptações relacionadas ao transporte de água e íons através da membrana, como microvilosidades apicais e invaginações da membrana plasmática basal associadas à mitocôndrias. As células da CF de D. citri possuem uma maior quantidade de organelas citoplasmáticas quando comparadas às espécies da infraordem Cicadomorpha., sugerindo uma menor atividade no processo digestivo Os enterócitos, principal tipo celular encontrado no DC e DT, exibem, em todas as espécies analisadas, microvilosidades apicais, invaginações da membrana plasmática basal associada a mitocôndrias e organelas associadas à rota intracelular de secreção. No caso particular de D. citri, as microvilosidades se mostram modificadas na forma de uma rede de lamelas, reforçadas entre si por trabéculas. Um complexo luminal de membranas pode ser observado associado às microvilosidades dos enterócitos de todas as espécies estudadas neste trabalho. Nas espécies da subordem Auchenorrhyncha, este complexo de membranas apresenta uma organização semelhante às membranas luminais em forma de chama (MLC). Este complexo se origina a partir de constrições do ápice das microvilosidades, que formam membranas que se projetam ao lúmen do intestino médio, delimitando compartimentos de acesso restrito. Por outro lado, na espécie D. citri, o complexo luminal de membranas observado é semelhante às membranas perimicrovilares modificadas (MPMm), descritos previamente em afídeos, que não forma compartimentos fechados. Os resultados apresentados neste trabalho, aliados às informações disponíveis na literatura, indicam que a organização do complexo luminal de membranas nos insetos da ordem Hemiptera é bem mais diversificada do que se presumia anteriormente, o que coloca em dúvida a visão tradicional sobre a origem evolutiva desse complexo. A compartimentalização do processo digestivo aparentemente deixou de existir no ancestral do grupo Paraneoptera, com a perda da membrana peritrófica. No entanto, o complexo luminal de membranas presente no lúmen do intestino médio de Hemiptera e Thysanoptera pode ter surgido ao longo da evolução desses grupos como um mecanismo alternativo que promova algum nível de compartimentalização da digestão. A análise do transcriptoma do intestino médio de B. xanthophis possibilitou a identificação de uma série de transportadores de nutrientes orgânicos, inorgânicos e água. A partir destes dados, foi criado um modelo para a absorção de aminoácidos baseado num cotransporte de H+ e aminoácidos através de toda a extensão do epitélio intestinal, que utiliza a energia de um gradiente eletroquímico de prótons, bombeados para o meio extracelular por V-ATPases. Tal modelo contrasta com o preconizado na literatura, que tem por base um cotransporte de aminoácidos com potássio. Os dados obtidos pelo transcriptoma também permitiram a identificação de transportadores de açúcar ao longo do intestino médio de B. xanthophis. Os açúcares absorvidos, provavelmente na forma de glicose, devem ser convertidos em trealose no citossol dos enterócitos antes de serem transportados para a hemolinfa. Os resultados apresentados neste trabalho também indicam a ocorrência de α-glicosidase no intestino médio de B. xanthophis, além de indícios de sua associação com as MLC. No entanto, sua função no processo digestivo desta espécie ainda não é conhecida. A identificação de proteinases digestivas ao longo de todo o intestino médio de B. xanthophis, principalmente catepsinas e quimotripsinas, foi surpreendente, considerando-se que sua dieta não apresenta proteínas em sua composição. Assim, estudos complementares são necessários para se averiguar a real função destas enzimas no processo digestivo desta cigarrinha. A análise molecular realizada neste trabalho permitiu uma melhor compreensão acerca do processo digestivo da espécie sugadora de xilema B. xanthophis. Os resultados obtidos sugerem a presença de diferenças funcionais significativas entre as diversas regiões do intestino médio que não se refletem na ultraestrutura dos enterócitos. A identificação de proteinases e transportadores de aminoácidos e açúcares na CF sugere que este órgão possua uma função bem mais abrangente no processo digestivo, indo além do transporte de água e concentração de nutrientes / This work presents a comprehensive study of the digestive system of representative species of the order Hemiptera, where morphological, biochemical, and molecular data are integrated for a better understanding of the digestive process occurring in these insects. This project is based on a previous study about the digestive system of the leafhopper Bucephalogonia xanthophis (Hemiptera: Cicadellidae). A comparative ultrastructural study is presented with the sap-sucking species Macugonalia leucomelas (suborder Auchenorrhyncha, Cicadellidae), Dalbulus maidis (suborder Auchenorrhyncha, Cicadellidae), Mahanarva fimbriolata (suborder Auchenorrhyncha, Cercopidae), Quesada gigas (suborder Auchenorrhyncha, Cicadidae), and Diaphorina citri (suborder Sternorrhyncha, Psyllidae). Moreover, a molecular analysis was performed regarding the identification, characterization, and distribution of significant proteins associated with the digestive process in B. xanthophis. The digestive system of the cicadomorphan species M. leucomelas, D. maidis, M fimbriolata, and Q. gigas is very similar to the one previosly described for the leafhopper B. xanthophis. The foregut is made up of a simple tube, the esophagus. The midgut starts at the filter chamber (FC) and progresses to a more posterior conical (CDM) and tubular regions (TDM). The FC is formed by the apposition between the anterior and posterior midgut, along withe the proximal segmentos of the Malpighian tubules, allowing the concentration of the nutrients in the middle midgut. The hindgut is formed by a long tube which presents a dilated rectum before ending in the anus. The FC of M. leucomelas and D. maidis are anatomically less complex than the observed in M. fimbriolata and Q. gigas. Unlike the cicadomorphan species, the CF of D. citri shows an even more simplified organization, lacking the Malpighian tubules. Although two domains of the midgut can be observed in the psyllid, four appendages with unknown function are identified projecting from the TDM. The FC cells of all studied species present ultrastructural adaptations related to the transport of ions and water, such as apical surfaces modified into microvilli, basal plasma membrane presenting several invaginations with associated mitochondria. However, the FC cells from D. citri exhibit more organelles compared to the cicadomorphan species, suggesting that its role in the digestive process is less relevant. The CDM and TDM regions are mainly formed by enterocytes, which shows, in all species, apical microvilli, basal plasma membrane infoldings with associated mitochondria and other organelles related to the secretory pathway. The microvilli of D. citri enterocytes form a complex network of lamellae, which are associated with one another through trabecullae. A luminal membrane complex can be observed associated with the microvillar tips of the enterocytes in all analysed species. The ones from the Auchenorrhyncha infraorder exhibit a membrane complex organization similar to the flame-like membrane complex. Such complex originates from constrictions of the microvillar apex which form membranes that project into the midgut lumen, delimitating restricted access compartments. Alternatively, the luminal membrane complex observed in D. citri is similar to the modified perimicrovillar membranes, previously described in aphids, which does not form closed compartments. The results presented in this work, along with available data in the literature, indicate that the organization of the digestive system in Hemipteran insects is more diverse than previously presumed, what makes the traditional view on the evolutionary origin of this complex questionable. The compartmentalization of the digestive process was apparently lost in the Paraneoptera ancestor, allied to the loss of the peritrophic membrane. However, the luminal membrane complex in the midgut lumen of Hemiptera and Thysanoptera would have evolved as an alternate mechanism promoting some degree of compartmentalization of the digestive process. The analysis of the transcriptome of B. xanthophis midgut allowed the identification of a series of organic, inorganic, and water transporters, leading to the proposal of an amino acid absorption model, based on a cotransport of H+ and amino acid. In this model, the active transport of amino acids occurs throughout the midgut and it is powered by an electrochemical gradient of protons, formed by a V-ATPase. This model is based on a different mechanism as the one proposed in the literature, which consists on a cotransport of potassium ions and amino acids. The transcriptome analysis also allowed the identification of sugar transporters along the midgut of B. xanthophis. Glucose is probably the main monosaccharide absorbed by the enterocytes, which are then converted into trehalose before being transported to the hemolymph. The results presented in this work still indicate the occurrence of α-glucosidase in the B. xanthophis midgut and show evidences of its association with the flame-like luminal membranes. However, the function of this enzyme in the digestive process of this species has yet to be discovered. The identification of digestive proteinases along the midgut of B. xanthophis, specially cathepsins and chymotrypsins, was surprising, considering that there are no proteins in xylem composition. Therefore, more studies are needed to verify the real function of those enzymes in the digestive process of this leafhopper. The molecular analysis performed in this work led to a better understanding of the digestive process in the xylem-sucker leafhopper B. xanthophis. Apparently, the detected functional differences among the midgut regions do not reflect on the enterocytes ultrastructure. The identification of proteinases and amino acid and sugar transporters in the FC suggests that this organ has a more general role in the digestive process besides the water transport and nutrient concentration

Os insetos da ordem Hemiptera apresentam membranas lipoproteicas que revestem as microvilosidades das células intestinais, como se fossem dedos de luva, e formam expansões para o lúmen do intestino que parecem terminar em fundo cego. A presença das duas membranas no ápice dos enterócitos gera questões intrigantes de como se dá a formação da membrana perimicrovilar, como ocorre a absorção de nutrientes e como se dá o encaminhamento de enzimas digestivas para o lúmen intestinal. A digestão de proteínas baseada em enzimas originalmente lisossômicas é uma característica marcante nos Hemiptera, em especial os Heteroptera que evolutivamente voltaram a uma alimentação de polímeros. O presente estudo indica que os genes das proteinases tipicamente lisossômicas sofrem uma série de duplicações, havendo a manutenção de um gene para função puramente lisossômica e a divergência funcional dos demais genes para a função de digestão extracelular. O gene que mantém a função lisossômica não é modulado pela alimentação, além de ser expresso nos mais diversos tecidos. Já os genes que se especializaram na digestão extracelular têm a expressão aumentada com a ingestão de alimento, indicando sua função. Parece não haver diferença nas características relacionadas ao encaminhamento celular das proteínas produzidas por esses genes, indicando que o direcionamento para a rota secretória é devido à superexpressão dos genes relacionados à digestão. Enzimas como alfa-glicosidases, alfa-manosidases e aminopeptidases que participam da digestão extracelular seguem a rota secretória que envolve a formação de vesículas de dupla membrana. Foi possível ampliar o modelo de digestão incluindo a participação das catepsinas D, de uma alfa-glicosidase solúvel e a possível participação de uma tiolredutase além do definir o local de atuação das lipases. Temos agora uma visão global da participação das enzimas digestivas que atuam na digestão em D. peruvianus. / The insects of the order Hemiptera have lipoprotein membranes lining the microvilli of midgut cells, like glove fingers, and form expansions into the lumen of the intestine. The presence of two membranes on the apex of enterocytes thus generates intriguing questions about the formation of perimicrovillar membrane, the absorption of nutrients, and the targeting of digestive enzymes into the intestinal lumen. The digestion of proteins based on originally lysosomal enzymes is an important feature in Hemiptera, especially in Heteroptera that evolutionary returned to feed on polymers. The genes of typical lysosomal proteinases undergo a series of duplications followed by the maintenance of a gene for purely lysosomal function and functional divergence of other genes for extracellular digestion function. The gene that maintains the lysosomal function is not modulated by feeding, in addition to being expressed in diverse tissues. By the other hand, genes specialized in extracellular digestion are up regulated by food intake, indicating its function. No difference was found in the targeting in the proteins produced by these genes, which indicates that targeting to the secretory route is due to overexpression of digestion-related genes. Enzymes involved in extracellular digestion as alpha-glucosidase, alpha-mannosidase and aminopeptidase follow the secretory route that includes the formation of double membrane vesicles. In this study we increased the digestion model adding the participation of cathepsin D, a soluble alpha-glucosidase, and the possible participation of a tiolredutase, and also to defining the place of lipases operation. We now have a global view of the participation of digestive enzymes involved in digestion D. peruvianus.

Este trabalho aborda um estudo detalhado sobre o sistema digestivo da cigarrinha sugadora de xilema, Bucephalogonia xanthophis (Hemiptera: Cicadellidae), num enfoque morfofuncional. Sob o ponto de vista anatômico, o sistema digestivo é constituído, como na maioria dos insetos, por três regiões: o intestino anterior, o intestino médio e o intestino posterior. O intestino anterior é formado por um tubo simples, o esôfago, sem qualquer diferenciação anatômica. O intestino médio tem início na câmara de filtração (CF) e segue por um ventrículo com dois domínios, o cônico (VC) e o tubular (VT), retornando para a câmara de filtração. A CF é uma estrutura característica principalmente de insetos sugadores de xilema de uma infraordem da ordem Hemiptera, a Cicadomorpha, e consiste na aposição entre o intestino médio anterior com o posterior, além dos segmentos proximais dos quatro túbulos de Malpighi. A função da CF é permitir a passagem do excesso de água presente no xilema diretamente do intestino médio anterior para o posterior, concentrando, assim, seus nutrientes no ventrículo. O sistema digestivo continua por um intestino posterior, apresentando, antes de terminar no ânus, um reto dilatado, ao qual se associam as extremidades distais dos quatro túbulos de Malpighi, livres na hemocela. Análises por microscopia de luz revelaram que o intestino anterior é formado por um epitélio simples, composto por células pavimentosas revestidas por cutícula. O epitélio da CF é bastante fino e não há diferenças significativas entre as células do ventrículo e dos túbulos de Malpighi. O VC e o VT são compostos por células cúbicas, os enterócitos, e células regenerativas. A transição do intestino médio para o posterior, denominada de piloro, ocorre no interior da CF. Nesta região, inserem-se os quatro túbulos de Malpighi, órgãos do sistema excretor. O intestino posterior é formado por um epitélio pavimentoso, recoberto por uma camada de quitina. Observadas através da microscopia eletrônica de transmissão, as células da CF possuem sua superfície apical modificada em microvilosidades e a membrana plasmática basal com invaginações desenvolvidas associadas a mitocôndrias, além de um citoplasma bastante reduzido. Estas características sugerem que se trata de células especializadas no transporte de água e íons, provavelmente a partir do intestino médio para os túbulos de Malpighi. O VC e o VT são formados por enterócitos e células regenerativas. Estas últimas são raras, estão localizadas na base do epitélio, sem formar agrupamentos (ninhos), e possuem características típicas de células indiferenciadas, com núcleos grandes e poucas organelas. Os enterócitos, as células mais importantes no processo digestivo, possuem sua membrana plasmática apical modificada em microvilosidades e invaginações da membrana plasmática basal, menos desenvolvidas do que as das células do CF. No que diz respeito à atividade de secreção observada nos enterócitos de B. xanthophis, verifica-se a existência de grandes quantidades de retículo endoplasmático granular, diversas áreas de Golgi e algumas vesículas de secreção concentradas no citoplasma apical. Parece haver apenas um mecanismo de secreção, o merócrino, ao longo de todo o ventrículo. No lúmen do ventrículo de B. xanthophis, não foi constatada a presença de uma membrana peritrófica, comum em insetos de diversas ordens, exceto Hemiptera e Thysanoptera. Ao invés disso, nas regiões do VC e nos dois terços iniciais do VT (o ventrículo tubular anterior VTA e o médio VTM), se observa um complexo sistema luminal de membranas associado às microvilosidades dos enterócitos, formando padrões em forma de chama, sendo denominados de membranas luminais em forma de chama (MLC). Este sistema se origina, aparentemente, a partir de constrições das extremidades das microvilosidades que formando membranas que avançam pelo lúmen ventricular, mantendo-se associadas às microvilosidades. Originalmente, acreditava-se que os insetos das ordens Hemiptera e Thysanoptera possuíam um sistema luminal de membranas associadas às microvilosidades, denominado de membranas perimicrovilares (MPM). Este modelo foi considerado como padrão para a ordem Hemiptera, sendo descrito, principalmente, em espécies da subordem Heteroptera. Estudos posteriores com o afídeo Acyrthosiphon pisum, revelaram um sistema luminal de membranas diferente das MPM, que foi denominado, na ocasião, de membranas perimicrovilares modificadas (MPMm). A ocorrência de um novo tipo de organização deste sistema luminal de membranas, as MLC, evidencia uma possível diversidade de tipos de organização destas membranas em Hemiptera. Acredita-se, com base nas características destes sistemas luminais de membranas, que as MLC sejam equivalentes às MPM e às MPMm. Preparações deste material utilizando o lantânio como traçador, revelaram que o MLC forma, aparentemente, compartimentos fechados. A descoberta de um terceiro sistema de organização de membranas em B. xanthophis, que difere significativamente das MPM e das MPMm, abre uma nova discussão sobre o panorama atual da morfofisiologia digestiva da ordem Hemiptera, que pode fornecer subsídios importantes no sentido de melhor compreender as relações filogenéticas entre os grupos de espécies que compõem esta ordem. Com base nos resultados obtidos neste e em outros trabalhos sobre a organização do sistema digestivo dos Hemiptera, fica evidente a importância de estudos mais abrangentes, sob este ponto de vista, envolvendo outras espécies integrantes das diferentes subordens de Hemiptera. Do mesmo modo, um maior detalhamento das funções exercidas por estes sistemas luminais de membrana mostra-se de extrema importância para uma melhor compreensão dos processos digestivos que ocorrem nestes insetos. / This work presents a detailed study concerning the digestive system of the xylem-sucking sharpshooter Bucephalogonia xanthophis (Hemiptera: Cicadellidae), in a morphofunctional approach. In the majority of insects, three anatomical regions constitute the digestive system: the foregut, the midgut, and the hindgut. A simple tube, the esophagus, without any anatomical differentiation, forms the foregut. The midgut starts in the filter chamber (FC) and proceeds in a ventriculum with two domains, the conical one (CV) and the tubular one (TV), returning to the filter chamber. The FC is a structure normally found in the xylem-sucking insects of the infraorder Cicadomorpha. It is formed by the apposition between the fore-midgut and the hind-midgut, along with the proximal segments of the four Malpighian tubules. The function of the FC is to allow the passage of the excess of water in the xylem directly from the fore-midgut to the hind-midgut, concentrating its nutrients in the mid-midgut. The digestive system proceeds through a hindgut, presenting, before ending in the anus, a dilated rectum, to which the distal ends of the Malpighian tubules associate. Light microscopy analysis revealed that the midgut is formed by a simple epithelium, composed of flattened cells covered by a cuticle. The epithelium of the FC is very thin and there are no significant differences between ventricular cells and Malpighian tubule cells. Cubic enterocytes and regenerative cells compose the CV and TV. The transition between the midgut and the hindgut occurs inside the FC and is called pylorus, where four Malpighian tubules insert, presenting excretory function. The hindgut is made up by flattened cells, covered by a layer of chithin. Observed by transmission electron microscopy, the FC cells have a reduced cytoplasm with their apical surface modified into microvilli, whereas the basal plasma membrane presents several invaginations associated with mitochondria. These features suggest that these cells are specialized in the transport of water and ions, probably from the midgut to the Malpighian tubules. The CV and TV are formed by enterocytes and regenerative cells. The latter are very rare and are localized at the base of the epithelium, without forming clusters (nests or nidi), and have typical undifferentiated cell features, such as large nuclei and few organelles. The enterocyte, the most important cell type in the digestive process, have their apical plasma membrane modified into microvilli and basal plasma membrane showing infoldings, less developed than the FC cells. The B. xanthophis enterocytes exhibit signs of secretory activity, with large amounts of rough endoplasmic reticulum, many Golgi areas and some secretory vesicles mainly clustered in the apical cytoplasm. This secretory vesicles seems to be eliminated by a merocrine secretion process throughout the ventriculum. In the ventricular lumen of B. xanthophis, a peritrophic membrane, observed in most insects other than Hemiptera and Thysanoptera, is note presente. Instead, in the CV and the two initial thirds of the TV (the anterior tubular ventriculum ATV and the medium tubular ventriculum MTV), a complex luminal membrane system associated with the enterocyte microvilli can be detected, forming flame-like patterns, named flame-like luminal membranes (FLM). This system originates, apparently, from constrictions of the microvillar tips, which form membranes that projects into the ventricular lumen, keeping their association with the microvilli. Formerly, it was assumed that Hemiptera and Thysanoptera insects have a luminal membrane system associated with the microvilli, called permicrovillar membranes (PMM). This membrane system was considered as a structure present in the whole order Hemiptera, mainly in Heteroptera suborder species. Posterior studies with the aphid Acyrthosiphon pisum, revealed the occurrence of a luminal membrane system very different from the PMM model. This system was called modified perimicrovillar membranes (MPM). The occurrence of a new kind of luminal membranes system, the FLM, suggests the existence of a not yet described diversity in these luminal membranes organizations in Hemiptera. Thus, it is assumed that FLM, PMM and MPM are probably homologous luminal membranes systems with similar function roles. The use of lanthanum as a tracer revealed that the FLM forms, apparently, closed compartments, as postulated to PMM. The discovery of a third type of luminal membrane organization system in B. xanthophis, which differs significantly from PMM and MPM, opens a new discussion concerning the actual origin and function of these complex luminal membranes system in the digestive system of Hemiptera. More detailed studies of the occurrence of different types of luminal membranes systems in Hemiptera species, may improve the knowledge about the phylogenetic relationships among the several groups, which constitutes this order. Furthermore, the actual role of the luminal membranes system in the digestive process has to be investigated in detail.

Os insetos da ordem Hemiptera apresentam membranas lipoproteicas que revestem as microvilosidades das células intestinais, como se fossem dedos de luva, e formam expansões para o lúmen do intestino que parecem terminar em fundo cego. A presença das duas membranas no ápice dos enterócitos gera questões intrigantes de como se dá a formação da membrana perimicrovilar, como ocorre a absorção de nutrientes e como se dá o encaminhamento de enzimas digestivas para o lúmen intestinal. A digestão de proteínas baseada em enzimas originalmente lisossômicas é uma característica marcante nos Hemiptera, em especial os Heteroptera que evolutivamente voltaram a uma alimentação de polímeros. O presente estudo indica que os genes das proteinases tipicamente lisossômicas sofrem uma série de duplicações, havendo a manutenção de um gene para função puramente lisossômica e a divergência funcional dos demais genes para a função de digestão extracelular. O gene que mantém a função lisossômica não é modulado pela alimentação, além de ser expresso nos mais diversos tecidos. Já os genes que se especializaram na digestão extracelular têm a expressão aumentada com a ingestão de alimento, indicando sua função. Parece não haver diferença nas características relacionadas ao encaminhamento celular das proteínas produzidas por esses genes, indicando que o direcionamento para a rota secretória é devido à superexpressão dos genes relacionados à digestão. Enzimas como alfa-glicosidases, alfa-manosidases e aminopeptidases que participam da digestão extracelular seguem a rota secretória que envolve a formação de vesículas de dupla membrana. Foi possível ampliar o modelo de digestão incluindo a participação das catepsinas D, de uma alfa-glicosidase solúvel e a possível participação de uma tiolredutase além do definir o local de atuação das lipases. Temos agora uma visão global da participação das enzimas digestivas que atuam na digestão em D. peruvianus. / The insects of the order Hemiptera have lipoprotein membranes lining the microvilli of midgut cells, like glove fingers, and form expansions into the lumen of the intestine. The presence of two membranes on the apex of enterocytes thus generates intriguing questions about the formation of perimicrovillar membrane, the absorption of nutrients, and the targeting of digestive enzymes into the intestinal lumen. The digestion of proteins based on originally lysosomal enzymes is an important feature in Hemiptera, especially in Heteroptera that evolutionary returned to feed on polymers. The genes of typical lysosomal proteinases undergo a series of duplications followed by the maintenance of a gene for purely lysosomal function and functional divergence of other genes for extracellular digestion function. The gene that maintains the lysosomal function is not modulated by feeding, in addition to being expressed in diverse tissues. By the other hand, genes specialized in extracellular digestion are up regulated by food intake, indicating its function. No difference was found in the targeting in the proteins produced by these genes, which indicates that targeting to the secretory route is due to overexpression of digestion-related genes. Enzymes involved in extracellular digestion as alpha-glucosidase, alpha-mannosidase and aminopeptidase follow the secretory route that includes the formation of double membrane vesicles. In this study we increased the digestion model adding the participation of cathepsin D, a soluble alpha-glucosidase, and the possible participation of a tiolredutase, and also to defining the place of lipases operation. We now have a global view of the participation of digestive enzymes involved in digestion D. peruvianus.

Este trabalho aborda um estudo detalhado sobre o sistema digestivo da cigarrinha sugadora de xilema, Bucephalogonia xanthophis (Hemiptera: Cicadellidae), num enfoque morfofuncional. Sob o ponto de vista anatômico, o sistema digestivo é constituído, como na maioria dos insetos, por três regiões: o intestino anterior, o intestino médio e o intestino posterior. O intestino anterior é formado por um tubo simples, o esôfago, sem qualquer diferenciação anatômica. O intestino médio tem início na câmara de filtração (CF) e segue por um ventrículo com dois domínios, o cônico (VC) e o tubular (VT), retornando para a câmara de filtração. A CF é uma estrutura característica principalmente de insetos sugadores de xilema de uma infraordem da ordem Hemiptera, a Cicadomorpha, e consiste na aposição entre o intestino médio anterior com o posterior, além dos segmentos proximais dos quatro túbulos de Malpighi. A função da CF é permitir a passagem do excesso de água presente no xilema diretamente do intestino médio anterior para o posterior, concentrando, assim, seus nutrientes no ventrículo. O sistema digestivo continua por um intestino posterior, apresentando, antes de terminar no ânus, um reto dilatado, ao qual se associam as extremidades distais dos quatro túbulos de Malpighi, livres na hemocela. Análises por microscopia de luz revelaram que o intestino anterior é formado por um epitélio simples, composto por células pavimentosas revestidas por cutícula. O epitélio da CF é bastante fino e não há diferenças significativas entre as células do ventrículo e dos túbulos de Malpighi. O VC e o VT são compostos por células cúbicas, os enterócitos, e células regenerativas. A transição do intestino médio para o posterior, denominada de piloro, ocorre no interior da CF. Nesta região, inserem-se os quatro túbulos de Malpighi, órgãos do sistema excretor. O intestino posterior é formado por um epitélio pavimentoso, recoberto por uma camada de quitina. Observadas através da microscopia eletrônica de transmissão, as células da CF possuem sua superfície apical modificada em microvilosidades e a membrana plasmática basal com invaginações desenvolvidas associadas a mitocôndrias, além de um citoplasma bastante reduzido. Estas características sugerem que se trata de células especializadas no transporte de água e íons, provavelmente a partir do intestino médio para os túbulos de Malpighi. O VC e o VT são formados por enterócitos e células regenerativas. Estas últimas são raras, estão localizadas na base do epitélio, sem formar agrupamentos (ninhos), e possuem características típicas de células indiferenciadas, com núcleos grandes e poucas organelas. Os enterócitos, as células mais importantes no processo digestivo, possuem sua membrana plasmática apical modificada em microvilosidades e invaginações da membrana plasmática basal, menos desenvolvidas do que as das células do CF. No que diz respeito à atividade de secreção observada nos enterócitos de B. xanthophis, verifica-se a existência de grandes quantidades de retículo endoplasmático granular, diversas áreas de Golgi e algumas vesículas de secreção concentradas no citoplasma apical. Parece haver apenas um mecanismo de secreção, o merócrino, ao longo de todo o ventrículo. No lúmen do ventrículo de B. xanthophis, não foi constatada a presença de uma membrana peritrófica, comum em insetos de diversas ordens, exceto Hemiptera e Thysanoptera. Ao invés disso, nas regiões do VC e nos dois terços iniciais do VT (o ventrículo tubular anterior VTA e o médio VTM), se observa um complexo sistema luminal de membranas associado às microvilosidades dos enterócitos, formando padrões em forma de chama, sendo denominados de membranas luminais em forma de chama (MLC). Este sistema se origina, aparentemente, a partir de constrições das extremidades das microvilosidades que formando membranas que avançam pelo lúmen ventricular, mantendo-se associadas às microvilosidades. Originalmente, acreditava-se que os insetos das ordens Hemiptera e Thysanoptera possuíam um sistema luminal de membranas associadas às microvilosidades, denominado de membranas perimicrovilares (MPM). Este modelo foi considerado como padrão para a ordem Hemiptera, sendo descrito, principalmente, em espécies da subordem Heteroptera. Estudos posteriores com o afídeo Acyrthosiphon pisum, revelaram um sistema luminal de membranas diferente das MPM, que foi denominado, na ocasião, de membranas perimicrovilares modificadas (MPMm). A ocorrência de um novo tipo de organização deste sistema luminal de membranas, as MLC, evidencia uma possível diversidade de tipos de organização destas membranas em Hemiptera. Acredita-se, com base nas características destes sistemas luminais de membranas, que as MLC sejam equivalentes às MPM e às MPMm. Preparações deste material utilizando o lantânio como traçador, revelaram que o MLC forma, aparentemente, compartimentos fechados. A descoberta de um terceiro sistema de organização de membranas em B. xanthophis, que difere significativamente das MPM e das MPMm, abre uma nova discussão sobre o panorama atual da morfofisiologia digestiva da ordem Hemiptera, que pode fornecer subsídios importantes no sentido de melhor compreender as relações filogenéticas entre os grupos de espécies que compõem esta ordem. Com base nos resultados obtidos neste e em outros trabalhos sobre a organização do sistema digestivo dos Hemiptera, fica evidente a importância de estudos mais abrangentes, sob este ponto de vista, envolvendo outras espécies integrantes das diferentes subordens de Hemiptera. Do mesmo modo, um maior detalhamento das funções exercidas por estes sistemas luminais de membrana mostra-se de extrema importância para uma melhor compreensão dos processos digestivos que ocorrem nestes insetos. / This work presents a detailed study concerning the digestive system of the xylem-sucking sharpshooter Bucephalogonia xanthophis (Hemiptera: Cicadellidae), in a morphofunctional approach. In the majority of insects, three anatomical regions constitute the digestive system: the foregut, the midgut, and the hindgut. A simple tube, the esophagus, without any anatomical differentiation, forms the foregut. The midgut starts in the filter chamber (FC) and proceeds in a ventriculum with two domains, the conical one (CV) and the tubular one (TV), returning to the filter chamber. The FC is a structure normally found in the xylem-sucking insects of the infraorder Cicadomorpha. It is formed by the apposition between the fore-midgut and the hind-midgut, along with the proximal segments of the four Malpighian tubules. The function of the FC is to allow the passage of the excess of water in the xylem directly from the fore-midgut to the hind-midgut, concentrating its nutrients in the mid-midgut. The digestive system proceeds through a hindgut, presenting, before ending in the anus, a dilated rectum, to which the distal ends of the Malpighian tubules associate. Light microscopy analysis revealed that the midgut is formed by a simple epithelium, composed of flattened cells covered by a cuticle. The epithelium of the FC is very thin and there are no significant differences between ventricular cells and Malpighian tubule cells. Cubic enterocytes and regenerative cells compose the CV and TV. The transition between the midgut and the hindgut occurs inside the FC and is called pylorus, where four Malpighian tubules insert, presenting excretory function. The hindgut is made up by flattened cells, covered by a layer of chithin. Observed by transmission electron microscopy, the FC cells have a reduced cytoplasm with their apical surface modified into microvilli, whereas the basal plasma membrane presents several invaginations associated with mitochondria. These features suggest that these cells are specialized in the transport of water and ions, probably from the midgut to the Malpighian tubules. The CV and TV are formed by enterocytes and regenerative cells. The latter are very rare and are localized at the base of the epithelium, without forming clusters (nests or nidi), and have typical undifferentiated cell features, such as large nuclei and few organelles. The enterocyte, the most important cell type in the digestive process, have their apical plasma membrane modified into microvilli and basal plasma membrane showing infoldings, less developed than the FC cells. The B. xanthophis enterocytes exhibit signs of secretory activity, with large amounts of rough endoplasmic reticulum, many Golgi areas and some secretory vesicles mainly clustered in the apical cytoplasm. This secretory vesicles seems to be eliminated by a merocrine secretion process throughout the ventriculum. In the ventricular lumen of B. xanthophis, a peritrophic membrane, observed in most insects other than Hemiptera and Thysanoptera, is note presente. Instead, in the CV and the two initial thirds of the TV (the anterior tubular ventriculum ATV and the medium tubular ventriculum MTV), a complex luminal membrane system associated with the enterocyte microvilli can be detected, forming flame-like patterns, named flame-like luminal membranes (FLM). This system originates, apparently, from constrictions of the microvillar tips, which form membranes that projects into the ventricular lumen, keeping their association with the microvilli. Formerly, it was assumed that Hemiptera and Thysanoptera insects have a luminal membrane system associated with the microvilli, called permicrovillar membranes (PMM). This membrane system was considered as a structure present in the whole order Hemiptera, mainly in Heteroptera suborder species. Posterior studies with the aphid Acyrthosiphon pisum, revealed the occurrence of a luminal membrane system very different from the PMM model. This system was called modified perimicrovillar membranes (MPM). The occurrence of a new kind of luminal membranes system, the FLM, suggests the existence of a not yet described diversity in these luminal membranes organizations in Hemiptera. Thus, it is assumed that FLM, PMM and MPM are probably homologous luminal membranes systems with similar function roles. The use of lanthanum as a tracer revealed that the FLM forms, apparently, closed compartments, as postulated to PMM. The discovery of a third type of luminal membrane organization system in B. xanthophis, which differs significantly from PMM and MPM, opens a new discussion concerning the actual origin and function of these complex luminal membranes system in the digestive system of Hemiptera. More detailed studies of the occurrence of different types of luminal membranes systems in Hemiptera species, may improve the knowledge about the phylogenetic relationships among the several groups, which constitutes this order. Furthermore, the actual role of the luminal membranes system in the digestive process has to be investigated in detail.

Este trabalho consiste num estudo abrangente do sistema digestivo de espécies representativas da ordem Hemiptera, no qual dados de caráter morfológico foram integrados a informações bioquímicas e moleculares acerca das principais proteínas atuantes no processo digestivo destes animais. Para tanto, este projeto utilizou, como referência básica, um estudo prévio realizado com a espécie Bucephalogonia xanthophis (Hemiptera: Cicadellidae). As análises morfológicas desenvolvidas neste trabalho consistiram em um estudo comparativo ultraestrutural das espécies sugadoras de seiva Macugonalia leucomelas (subordem Auchenorrhyncha, Cicadellidae), Dalbulus maidis (subordem Auchenorrhyncha, Cicadellidae), Mahanarva fimbriolata (subordem Auchenorrhyncha, Cercopidae), Quesada gigas (subfamília Auchenorrhyncha, Cicadidae) e Diaphorina citri (subordem Sternorrhyncha, Psyllidae). Já a vertente molecular deste estudo buscou identificar, caracterizar e determinar a distribuição de transportadores de membrana, enzimas digestivas e outras proteínas atuantes no processo digestivo da espécie B. xanthophis. De um modo geral, as espécies da infraordem Cicadomorpha M. leucomelas, D. maidis, M. fimbriolata e Q. gigas apresentam uma organização anatômica do sistema digestivo muito semelhante ao descrito previamente para a cigarrinha B. xanthophis. Um esôfago conecta a boca ao intestino médio, que tem início na câmara de filtração (CF), que é composta pela aposição das porções anterior e posterior do intestino médio com as regiões proximais dos túbulos de Malpighi. Este órgão permite a excreção do excesso de água presente na seiva, permitindo a concentração dos nutrientes na porção mediana do intestino médio. O sistema digestivo segue por duas regiões anatomicamente distintas: o domínio cônico (DC) e o tubular (DT) do intestino médio. O intestino posterior é observado como um longo tubo livre pela hemocela a apresenta um reto dilatado, terminando em um ânus. De um modo geral, as espécies da família Cicadellidae (M. leucomelas e D. maidis) apresentam uma CF anatomicamente menos complexa do que se observa em M. fimbriolata e Q. gigas. Diferentemente das espécies da infraordem Cicadomorpha, o psilídeo D. citri exibe um sistema digestivo com uma CF relativamente ainda mais simples, sem a presença de túbulos de Malpighi. O intestino médio desta espécie também possui dois domínios distintos, mas apresentam caracteristicamente quatro apêndices de fundo cego que se projetam a partir do DT, cuja função ainda é desconhecida. Do ponto de vista ultraestrutural, as células da CF das espécies analisadas exibem adaptações relacionadas ao transporte de água e íons através da membrana, como microvilosidades apicais e invaginações da membrana plasmática basal associadas à mitocôndrias. As células da CF de D. citri possuem uma maior quantidade de organelas citoplasmáticas quando comparadas às espécies da infraordem Cicadomorpha., sugerindo uma menor atividade no processo digestivo Os enterócitos, principal tipo celular encontrado no DC e DT, exibem, em todas as espécies analisadas, microvilosidades apicais, invaginações da membrana plasmática basal associada a mitocôndrias e organelas associadas à rota intracelular de secreção. No caso particular de D. citri, as microvilosidades se mostram modificadas na forma de uma rede de lamelas, reforçadas entre si por trabéculas. Um complexo luminal de membranas pode ser observado associado às microvilosidades dos enterócitos de todas as espécies estudadas neste trabalho. Nas espécies da subordem Auchenorrhyncha, este complexo de membranas apresenta uma organização semelhante às membranas luminais em forma de chama (MLC). Este complexo se origina a partir de constrições do ápice das microvilosidades, que formam membranas que se projetam ao lúmen do intestino médio, delimitando compartimentos de acesso restrito. Por outro lado, na espécie D. citri, o complexo luminal de membranas observado é semelhante às membranas perimicrovilares modificadas (MPMm), descritos previamente em afídeos, que não forma compartimentos fechados. Os resultados apresentados neste trabalho, aliados às informações disponíveis na literatura, indicam que a organização do complexo luminal de membranas nos insetos da ordem Hemiptera é bem mais diversificada do que se presumia anteriormente, o que coloca em dúvida a visão tradicional sobre a origem evolutiva desse complexo. A compartimentalização do processo digestivo aparentemente deixou de existir no ancestral do grupo Paraneoptera, com a perda da membrana peritrófica. No entanto, o complexo luminal de membranas presente no lúmen do intestino médio de Hemiptera e Thysanoptera pode ter surgido ao longo da evolução desses grupos como um mecanismo alternativo que promova algum nível de compartimentalização da digestão. A análise do transcriptoma do intestino médio de B. xanthophis possibilitou a identificação de uma série de transportadores de nutrientes orgânicos, inorgânicos e água. A partir destes dados, foi criado um modelo para a absorção de aminoácidos baseado num cotransporte de H+ e aminoácidos através de toda a extensão do epitélio intestinal, que utiliza a energia de um gradiente eletroquímico de prótons, bombeados para o meio extracelular por V-ATPases. Tal modelo contrasta com o preconizado na literatura, que tem por base um cotransporte de aminoácidos com potássio. Os dados obtidos pelo transcriptoma também permitiram a identificação de transportadores de açúcar ao longo do intestino médio de B. xanthophis. Os açúcares absorvidos, provavelmente na forma de glicose, devem ser convertidos em trealose no citossol dos enterócitos antes de serem transportados para a hemolinfa. Os resultados apresentados neste trabalho também indicam a ocorrência de α-glicosidase no intestino médio de B. xanthophis, além de indícios de sua associação com as MLC. No entanto, sua função no processo digestivo desta espécie ainda não é conhecida. A identificação de proteinases digestivas ao longo de todo o intestino médio de B. xanthophis, principalmente catepsinas e quimotripsinas, foi surpreendente, considerando-se que sua dieta não apresenta proteínas em sua composição. Assim, estudos complementares são necessários para se averiguar a real função destas enzimas no processo digestivo desta cigarrinha. A análise molecular realizada neste trabalho permitiu uma melhor compreensão acerca do processo digestivo da espécie sugadora de xilema B. xanthophis. Os resultados obtidos sugerem a presença de diferenças funcionais significativas entre as diversas regiões do intestino médio que não se refletem na ultraestrutura dos enterócitos. A identificação de proteinases e transportadores de aminoácidos e açúcares na CF sugere que este órgão possua uma função bem mais abrangente no processo digestivo, indo além do transporte de água e concentração de nutrientes / This work presents a comprehensive study of the digestive system of representative species of the order Hemiptera, where morphological, biochemical, and molecular data are integrated for a better understanding of the digestive process occurring in these insects. This project is based on a previous study about the digestive system of the leafhopper Bucephalogonia xanthophis (Hemiptera: Cicadellidae). A comparative ultrastructural study is presented with the sap-sucking species Macugonalia leucomelas (suborder Auchenorrhyncha, Cicadellidae), Dalbulus maidis (suborder Auchenorrhyncha, Cicadellidae), Mahanarva fimbriolata (suborder Auchenorrhyncha, Cercopidae), Quesada gigas (suborder Auchenorrhyncha, Cicadidae), and Diaphorina citri (suborder Sternorrhyncha, Psyllidae). Moreover, a molecular analysis was performed regarding the identification, characterization, and distribution of significant proteins associated with the digestive process in B. xanthophis. The digestive system of the cicadomorphan species M. leucomelas, D. maidis, M fimbriolata, and Q. gigas is very similar to the one previosly described for the leafhopper B. xanthophis. The foregut is made up of a simple tube, the esophagus. The midgut starts at the filter chamber (FC) and progresses to a more posterior conical (CDM) and tubular regions (TDM). The FC is formed by the apposition between the anterior and posterior midgut, along withe the proximal segmentos of the Malpighian tubules, allowing the concentration of the nutrients in the middle midgut. The hindgut is formed by a long tube which presents a dilated rectum before ending in the anus. The FC of M. leucomelas and D. maidis are anatomically less complex than the observed in M. fimbriolata and Q. gigas. Unlike the cicadomorphan species, the CF of D. citri shows an even more simplified organization, lacking the Malpighian tubules. Although two domains of the midgut can be observed in the psyllid, four appendages with unknown function are identified projecting from the TDM. The FC cells of all studied species present ultrastructural adaptations related to the transport of ions and water, such as apical surfaces modified into microvilli, basal plasma membrane presenting several invaginations with associated mitochondria. However, the FC cells from D. citri exhibit more organelles compared to the cicadomorphan species, suggesting that its role in the digestive process is less relevant. The CDM and TDM regions are mainly formed by enterocytes, which shows, in all species, apical microvilli, basal plasma membrane infoldings with associated mitochondria and other organelles related to the secretory pathway. The microvilli of D. citri enterocytes form a complex network of lamellae, which are associated with one another through trabecullae. A luminal membrane complex can be observed associated with the microvillar tips of the enterocytes in all analysed species. The ones from the Auchenorrhyncha infraorder exhibit a membrane complex organization similar to the flame-like membrane complex. Such complex originates from constrictions of the microvillar apex which form membranes that project into the midgut lumen, delimitating restricted access compartments. Alternatively, the luminal membrane complex observed in D. citri is similar to the modified perimicrovillar membranes, previously described in aphids, which does not form closed compartments. The results presented in this work, along with available data in the literature, indicate that the organization of the digestive system in Hemipteran insects is more diverse than previously presumed, what makes the traditional view on the evolutionary origin of this complex questionable. The compartmentalization of the digestive process was apparently lost in the Paraneoptera ancestor, allied to the loss of the peritrophic membrane. However, the luminal membrane complex in the midgut lumen of Hemiptera and Thysanoptera would have evolved as an alternate mechanism promoting some degree of compartmentalization of the digestive process. The analysis of the transcriptome of B. xanthophis midgut allowed the identification of a series of organic, inorganic, and water transporters, leading to the proposal of an amino acid absorption model, based on a cotransport of H+ and amino acid. In this model, the active transport of amino acids occurs throughout the midgut and it is powered by an electrochemical gradient of protons, formed by a V-ATPase. This model is based on a different mechanism as the one proposed in the literature, which consists on a cotransport of potassium ions and amino acids. The transcriptome analysis also allowed the identification of sugar transporters along the midgut of B. xanthophis. Glucose is probably the main monosaccharide absorbed by the enterocytes, which are then converted into trehalose before being transported to the hemolymph. The results presented in this work still indicate the occurrence of α-glucosidase in the B. xanthophis midgut and show evidences of its association with the flame-like luminal membranes. However, the function of this enzyme in the digestive process of this species has yet to be discovered. The identification of digestive proteinases along the midgut of B. xanthophis, specially cathepsins and chymotrypsins, was surprising, considering that there are no proteins in xylem composition. Therefore, more studies are needed to verify the real function of those enzymes in the digestive process of this leafhopper. The molecular analysis performed in this work led to a better understanding of the digestive process in the xylem-sucker leafhopper B. xanthophis. Apparently, the detected functional differences among the midgut regions do not reflect on the enterocytes ultrastructure. The identification of proteinases and amino acid and sugar transporters in the FC suggests that this organ has a more general role in the digestive process besides the water transport and nutrient concentration