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Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde, 2015. / Submitted by Ana Cristina Barbosa da Silva (annabds@hotmail.com) on 2015-07-08T14:33:33Z No. of bitstreams: 1 2015_RenataPaulaCoppinideAlmeida.pdf: 1664573 bytes, checksum: 51ea0723acf2145b26ea30df349b2848 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2015-07-17T14:06:07Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015_RenataPaulaCoppinideAlmeida.pdf: 1664573 bytes, checksum: 51ea0723acf2145b26ea30df349b2848 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-07-17T14:06:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015_RenataPaulaCoppinideAlmeida.pdf: 1664573 bytes, checksum: 51ea0723acf2145b26ea30df349b2848 (MD5) / A leucemia linfóide aguda (LLA) é uma neoplasia maligna de linfócitos, caracterizada pelo acúmulo de células sanguíneas imaturas na medula óssea. Um dos medicamentos utilizados no tratamento da LLA é a enzima L-Asparaginase. Algumas linhagens de células tumorais não são capazes de produzir asparagina, assim, a redução dos níveis plasmáticos do aminoácido implica na inibição da síntese de proteínas das células leucêmicas. Atualmente, estão disponíveis apenas enzimas de origem bacteriana para serem utilizadas na clínica, o que reflete na grande taxa de efeitos adversos relacionados ao tratamento. Neste sentido, a busca por novas fontes de L-Asparaginase torna-se imprescindível. O presente trabalho teve como objetivo principal avaliar a produção de L-Asparaginase por fungos filamentosos isolados do bioma Cerrado brasileiro. Inicialmente, foi realizada a padronização do preparo da amostra e da metodologia para determinação da atividade enzimática, onde foram utilizadas a enzima padrão (Sigma-Aldrich) e a cepa de um conhecido produtor de L-Asparaginase, o Aspergillus terreus. Posteriormente, foram isolados 42 cepas fúngicas a partir do bioma Cerrado brasileiro. Das 42 cepas isoladas, 22 apresentaram halo vermelho, o que pode indicar a produção de L-Asparaginase. Essas 22 espécies foram cultivadas em meio líquido e apenas 10 apresentaram resultados positivos para produção enzimática. Em seguida, as 3 melhores cepas produtoras foram cultivadas em diferentes condições de cultivo a fim de melhorar a produção de L-Asparaginase. Com relação às fontes de carbono, a utilização de glicose foi essencial para a produção enzimática. A L-Prolina parece ser a fonte de nitrogênio mais eficaz para que a produção de L-Asparaginase ocorra. Foram encontrados ainda, diferentes valores de pH ótimos de cultivo pelas diferentes cepas fúngicas. / Acute lymphoblastic leukemia (ALL) is a malignant neoplasm of lymphocytes, characterized by the accumulation of immature blood cells in the bone marrow. One of the drugs used in the treatment of ALL is L-Asparaginase enzyme. Some tumor cell lines are not capable of producing asparagine thus the reduction of plasma levels of amino acids involves the inhibition of protein synthesis of leukemic cells. Currently, the only enzymes available for use in the clinic are of bacterial origin, which reflects the high rate of adverse effects related to treatment. In this way, the search for new sources of L-Asparaginase becomes indispensable. This study is aimed at evaluating the production of L-Asparaginase by isolated filamentous fungi of the brazilian savanna biome. Initially, the standardization of sample preparation was performed as well as the methodology for determining the enzymatic activity where the standard enzyme (Sigma-Aldrich) and the Aspergillus terreus, which is a known L-Asparaginase strain producer, were used. Subsequently, 42 fungal strains from the brazilian savanna were isolated and a screening to assess the ability of the same for the production of L-Asparaginase was performed through the halo test. Out of the 42 isolated stains, 22 species showed red halo, which may indicate the production of L-Asparaginase. These 22 species were cultivated in the liquid medium under controlled agitation and temperature and only 10 were positive for enzyme production. Then, the top 3 producing strains were grown in different culture conditions to improve the production of L-Asparaginase. Regarding the carbon sources, glucose utilization was essential for enzyme production. L-Proline seems to be the most effective source of nitrogen for producing L-Asparaginase. In addition, were found different optimum pH values of the different fungal strains cultivation.

Submitted by MARINA VITTI VIANNA null (marinavvianna@gmail.com) on 2016-07-18T13:13:27Z No. of bitstreams: 1 dissert-Marina-vfinal-Marina-Lara.pdf: 1520355 bytes, checksum: 30f9fad60558010a60aa7aadc9c7f67f (MD5) / Approved for entry into archive by Felipe Augusto Arakaki (arakaki@reitoria.unesp.br) on 2016-07-18T17:06:15Z (GMT) No. of bitstreams: 1 vianna_mv_me_rcla.pdf: 1520355 bytes, checksum: 30f9fad60558010a60aa7aadc9c7f67f (MD5) / Made available in DSpace on 2016-07-18T17:06:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 vianna_mv_me_rcla.pdf: 1520355 bytes, checksum: 30f9fad60558010a60aa7aadc9c7f67f (MD5) Previous issue date: 2016-07-04 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Ambientes extremos são fontes potenciais para a descoberta de novos produtos naturais com propriedades específicas para aplicação biotecnológica, devido ao pouco conhecimento sobre a diversidade e os recursos genéticos dos micro-organismos que habitam esses locais. Micro-organismos do ambiente Antártico têm demonstrado potencial para produção de enzimas ativas em temperaturas brandas com aplicação em diversos setores de importância econômica. Neste contexto, o presente trabalho avaliou a produção de L-asparaginase e proteases produzidas por fungos filamentosos (n=161) e leveduras (n=137), isolados de oito diferentes amostras de solos da Antártica (coletados na expedição Antártica de nov/dez de 2013 no âmbito do INCT Criosfera). Os fungos filamentosos e as leveduras encontram-se preservados na coleção de pesquisa vinculada à Central de Recursos Microbianos da UNESP (CRM-UNESP). Um total de 101 (62,7%) fungos filamentosos apresentou potencial para produção da enzima L-asparaginase em meio sólido (triagem qualitativa), porém nos testes quantitativos em meio líquido a enzima não foi produzida nas condições utilizadas. Com relação às proteases, 121 (75,1%) fungos apresentaram halo de degradação em meio sólido e 30 (18.6%) isolados apresentaram resultados de atividade de proteases acima de 45,0 U/mL. Dentre eles, 13 (8,7%) foram capazes de produzir proteases acima 100,0 U/mL: sete isolados apresentaram atividade de proteases alcalina e seis de proteases ácidas. Os isolados 5BI (Aspergillus sp.) e 6 MP (Thelebolus sp.) se destacaram na produção de proteases ácidas e alcalinas, respectivamente, e foram submetidos ao planejamento experimental. Os resultados indicaram um aumento significativo na produção de proteases a 10ºC e 150 rpm: 7,41 vezes para a produção de proteases ácidas pelo fungo 5BI (1.810,0 U/mL) e 5,38 vezes (1.542,5 U/mL) para a produção de proteases alcalinas pelo fungo 6MP. Para ambos os isolados as condições aplicadas que resultaram nos valores máximos de produção de proteases foram validadas. Os resultados da avaliação da diversidade das 137 leveduras (MSP-PCR) revelaram a ocorrência de 22 táxons distintos distribuídos em 8 gêneros, com predominância de Cryptococcus (21,1%), Rhodotorula e Candida (20,4%). Outros gêneros menos predominantes encontrados foram: Cystofilobasidium (13,8%), Rhodosporidium (13,1%), Leucosporidium (8,7%), Guehomyces (6,5%), Debaryomyces (3,6%), Bulleromyces (2,9%) e Malassezia (2,1%). Com base nos índices de Simpson, Shannon e Chao o solo BI (solo de biofilme, Deception) foi o mais diverso e o que apresentou a maior riqueza. Análises dos parâmetros físico-quimicos dos solos e de diversidade revelaram proximidade entre os solos MP (solo embaixo de madeira podre, Deception), FE (solo embaixo de barra de ferro, Deception) e CG 4.0 (solo embaixo de camada de gelo, Rei George). O presente trabalho apresenta uma visão geral da diversidade de leveduras nos diferentes tipos de solos de Ilhas Antárticas e revela o potencial biotecnológico de fungos filamentosos para produção de proteases ácidas e alcalinas. / Extreme environments are potential sources for the discovery of new natural products with specific properties for biotechnological applications due to little knowledge about the diversity and genetic resources of microorganisms that inhabit these places. Microorganisms from the Antarctic environment have shown potential for producing active enzymes in mild temperatures with application in various sectors of economic importance. In this context, the present study evaluated the production of proteases and L-asparaginase by filamentous fungi (n= 161) and yeasts (n= 137) isolated from seven different samples of the Antarctic soils (collected in the Antarctic expedition Nov/Dec 2013 - INCT Cryosphere Project). The isolates are being maintained in the research collection linked to the Microbial Resource Center of UNESP (CRM-UNESP). A total of 101 (62.7%) filamentous fungi showed potential for production of L-asparaginase on solid medium (qualitative screening), but in the quantitative screening in liquid medium the enzyme was not produced. Concerning proteases production, 121 (75.1%) filamentous fungi presented halo of degradation on solid medium and 30 (18.6%) isolates showed protease activity above 45.0 U/mL Among them, thirteen (8.7%) isolates were able to produce protease above 100.0 U/mL: seven isolates produced alkaline proteases and six acid proteases. The isolates 5BI (Aspergillus sp.) and 6 MP (Thelebolus sp.) showed the best results in the production of acid and alkaline proteases, respectively, and were submitted to the experimental design. Results indicated a significant increase in protease production at 10 °C and 150 rpm: 7.41 times for the production of acid proteases by the fungus 5BI (1,810.0 U/mL) and 5.38 times (1,542.5 U/mL) for the production of alkaline proteases by the fungus 6MP. For both isolates the conditions applied for the maximum production of proteases were validated. Results related to the assessment of the diversity of the 137 yeasts (MSP-PCR) revealed the presence of 22 different taxa, especially the genera Cryptococcus (21.1%), Rhodotorula e Candida (20.4%). Other less prevalent genera found were: Cystofilobasidium (13.8%), Rhodosporidium (13.1%), Leucosporidium (8.7%), Guehomyces (6.5%), Debaryomyces (3.6%), Bulleromyces (2.9%), and Malassezia (2.1%). Based on the Simpson, Shannon and Chao indexes, the soil BI (biofilm soil, Deception Island) was the most diverse and presented the greatest richness. Analysis of physicochemical parameters of the soils and their diversity revealed that MP (soil under rotten wood, Deception), FE (soil under iron bar, Deception), and GC 4.0 (soil under layer ice, King George) are closed related. The present work presents an overview of the diversity of yeast in different types of soils from Antarctic Islands and reveals the biotechnological potential of filamentous fungi for the production of acid and alkaline proteases. / FAPESP: 2014/10207-4

L-asparaginase (EC 3.5.1.1), a therapeutic enzyme used in the treatment of childhood acute lymphoblastic leukemia (ALL). Hence, the goal of this work is study the expression and evaluation of hydrolysis activity of native sequence (X12746) encoding for L-asparaginase from Erwinia chrysanthemi NCPBB1125 in the popular expression system Pichia pastoris. The sequence of asn encoded for mature protein was expressed in P. pastoris SMD1168 and X33. SDS-PAGE analysis showed recombinant L-asparaginase was secreted efficiently. Stable and high hydrolysis activity of extracellular L-asparaginase in P. pastoris SMD1168 making it a potential candidate to produce recombinant protein. After purification, a specific band whose appearance approximately 45 kDa indicating the glycosylated protein with specific activity by 6.251 Umg-1 and about 3 folds purifications. / L-asparaginase (EC 3.5.1.1), một loại enzyme được sử dụng trong điều trị bệng ung thư bạch cầu mãn tính ở trẻ em. Mục tiêu của nghiên cứu này là biểu hiện và đánh giá hoạt tính thủy phân của L-asparaginase mã hóa bởi đoạn gene (X12746) tương ứng từ Erwinia chrysanthemi NCPBB1125 được biểu hiện trong nấm men Pichia pastoris. Gene đã được cắt signal peptide và biểu hiện trong P. pastoris SMD1168 and X33. Qua phân tích kết quả điện di SDS-PAGE của môi trường sau lên men, L-asparaginase tái tổ hợp được tìm thấy trong dịch ngoại bào của P. pastoris. Với khả năng sản xuất protein có hoạt tính cao hơn so với chủng P. pastoris X33, SMD1168 được lựa chọn để biểu hiện L-asparaginase tái tổ hợp. Sau khi tinh sạch, sự xuất hiện của một băng có kích khối lượng phân tử xấp xỉ 45 kDa trên điện di SDS-PAGE cho thấy protein tái tổ hợp đã bị glycosyl hóa với hoạt tính riêng 6.251 Umg-1 và đạt độ sạch 3.471 lần.

A enzima L-asparaginase é responsável por converter o aminoácido L-asparagina em ácido L-aspártico e amônio. Esta enzima possui importantes aplicações, principalmente na indústria farmacêutica, onde é empregada como um fármaco antileucêmico e na indústria de alimentos, como uma forma de mitigar a formação de acrilamida, um composto altamente tóxico, formado em alguns alimentos processados a altas temperaturas. Leveduras destacam-se como micro-organismos importantes para a produção da Lasparaginase, uma vez que possivelmente produzem enzimas com menores efeitos colaterais para humanos e são, em geral, organismos GRAS, sem restrições de aplicação na indústria de alimentos. O presente trabalho avaliou metodologias de seleção de novas leveduras produtoras de L-asparaginase, selecionando aquelas capazes de produzir destacadas quantidades desta enzima a partir de um banco contendo 40 cepas e verificando aspectos da sua produção. Foram empregadas metodologias de seleção de leveduras em meio sólido e em meio líquido, avaliando-se a aplicabilidade da quantificação da atividade enzimática pelo método de Nessler e pelo método da hidroxilamina. A produção de L-asparaginase foi posteriormente confirmada por cromatografia em camada delgada. As leveduras selecionadas foram avaliadas quanto à influência dos aminoácidos L-asparagina, L-prolina e L-glutamina como indutores na produção de L-asparaginase e quanto à cinética de produção enzimática. De acordo com os resultados, nenhuma das leveduras foi capaz de produzir L-asparaginase extracelular. Entretanto, duas novas leveduras, até então não citadas na literatura pertinente como produtoras de Lasparaginase, foram capazes de produzir L-asparaginase periplasmática: Issatchenkia orientalis e Rhodotorula glutinis. Verificou-se, também, que a metodologia de screening em meio sólido não foi correlacionável com a produção de L-asparaginase em meio líquido por leveduras. Foi necessária a adição de moléculas indutoras ao meio de cultivo, como os aminoácidos L-asparagina, L-prolina e L-glutamina, para que houvesse produção de Lasparaginase pelas leveduras I. orientalis e R. glutinis. Verificou-se a maior produção de L-asparaginase periplasmática em meio suplementado com L-asparagina e nitrato de amônio para a levedura I. orientalis (20,38 ± 3,55 U.g-1) e em meio suplementado com Lprolina para a levedura R. glutinis (57,05 ± 0,57 U.g-1). Durante os ensaios de cinética, verificou-se que a produção da enzima ocorreu principalmente durante a fase logarítmica do crescimento microbiano, observando-se também estabilidade da atividade enzimática durante as 144 horas do cultivo. Os resultados obtidos no presente trabalho permitiram verificar a viabilidade das metodologias de seleção de novas leveduras produtoras de Lasparaginase bem como selecionar, com sucesso, duas novas leveduras capazes de produzir a enzima L-asparaginase periplasmática, I. orientalis e R. glutinis, determinando aspectos importantes da sua produção em meio líquido. / L-asparaginase is the enzyme responsible for converting the amino acid L-asparagine into L-aspartic acid and ammonium. This enzyme has important applications, mainly in the pharmaceutical industry, where it is used as an antileukemic drug, and in the food industry, as a treatment for mitigating the formation of acrylamide, a highly toxic compound produced in some foods exposed to high temperatures. Yeasts are highlighted as important microorganisms for the production of L-asparaginase since they are capable of producing enzymes with fewer side effects for humans and are, in general, GRAS organisms, being applicable in the food industry without restrictions. This study evaluated screening methods for selecting new yeasts capable of producing L-asparaginase, selecting those capable of producing high amounts of this enzyme from a culture collection containing 40 strains, also verifying aspects of enzyme production. Methods for screening L-asparaginase producing organisms in solid and liquid medium were tested, evaluating the applicability of Nessler and hydroxylamine methods as means for enzyme activity quantification. The production of L-asparaginase was later confirmed through thin layer chromatography. The selected yeasts were evaluated to confirm the influence of the amino acids L-asparagine, L-proline and L-glutamine as inducers in the production of L-asparaginase, and the kinetics of Lasparaginase production were also evaluated. According to the results, none of the assessed yeasts were able to produce extracellular L-asparaginase. However, two novel yeasts, so far not cited in the pertinent literature as L-asparaginase producers, were able to produce periplasmic L-asparaginase: Issatchenkia orientalis and Rhodotorula glutinis. Tests also verified that the screening methods in solid medium did not correlate with the production of L-asparaginase in liquid medium by yeasts. It was necessary to add inducing molecules, such as the amino acids L-asparagine, L-proline and L-glutamine, to stimulate L-asparaginase production by the yeasts I. orientalis and R. glutinis. The highest production of periplasmic L-asparaginase was obtained in liquid medium supplemented with Lasparagine and ammonium nitrate for the yeast I. orientalis (20,38 ± 3,55 U.g-1) and in medium supplemented with L-proline for the yeast R. glutinis (57,05 ± 0,57 U.g-1). The production kinetics assay verified that the production of the enzyme took place mainly during the log phase of microbial growth, being stable after144 hours of cultivation. The results presented in this study were able to confirm the viability of the methods for the screening of novel L-asparaginase producing yeasts as well as to select two novel yeasts able to produce this enzyme, I. orientalis and R. glutinis, determining some important aspects in L-asparaginase production in liquid medium.

A L-Asparaginase (ASNase) é um importante agente quimioterapêutico utilizado para o tratamento da leucemia linfoblástica aguda (ALL) há mais de 40 anos. No entanto, devido à origem biológica da ASNase, enzima produzida por Escherichia coli, problemas como a imunogenicidade e baixa meia vida-plasmática devem ser considerados. Com o objetivo de minimizar essas desvantagens, várias ASNases homólogas bem como formulações de ASNase de E. coli foram investigadas. Nenhuma das formulações desenvolvidas, entretanto, foi capaz de resolver definitivamente esses problemas associados à sua origem. Nesse sentido, considerando os recentes avanços na ciência de polímeros com a possibilidade do obtenção de vesículas poliméricas usando copolímeros, este trabalho concentrou-se no desenvolvimento de polimerossomos de poli(etileno glicol)-b-poli(ε-caprolactona) (PEG-PCL) para encapsular a ASNase. Diversas condições experimentais foram investigadas e, ao final, os polimerossomos foram produzidos pela técnica de hidratação do filme polimérico utilizando a centrifugação como técnica de pós-filme para remoção de copolímero precipitado, produzindo assim vesículas polímericas de 120 a 200nm com PDI de aproximadamente 0,250. A eficiência de encapsulação da ASNase, utilizando as metodologias de centrifugação ou cromatografia de exclusão molecular, revelou taxas de encapsulação de 20-25% e 1 a 7%, repectivamente. Esses resultados apontam a importância de se determinar a eficiência de encapsulação por cromatografia de exclusão molecular ou método direto no caso de nanoestruturas auto-agregadas formadas por copolímeros, devido a valores superestimados com o emprego da centrifugação. Ainda que estudos complementares se façam necessários para liberação da enzima encapsulada ou penetração da L-asparagina nas vesículas, nossos resultados demonstram o potencial de polimerossomos para veiculação de ASNase, bem como de outras proteínas terapêuticas. / L-Asparaginase (ASNase) is an important chemotherapeutic agent used for the treatment of acute lymphoblastic leukemia (ALL) for more than 40 years. However, due to the biological origin of ASNase (produced by Escherichia coli) some drawbacks such as immunogenicity and low plasma half life are present. In order to minimize the disadvantages, several ASNases proteoforms and formulations of E. coli ASNase were investigated. However, none of this formulations completely solved the main drawbacks of ASNase. In this sense, considering the recents advances in polymers science with the possibility to develop polymeric vesicles using copolymers, this work aimed at the development of poly(ethylene glycol)-b-poly(ε-caprolactone) (PEG-PCL) vesicles to encapsulate ASNase. Different experimental conditions were investigated and, the final polymersomes formulation was prepared by film hydratation using centrifugation as a post-film technique to remove the bulky coplymer. Polymeric vesicles of 120 to 200nm with PDI of approximately, 0.250 were obtained. The encapsulation efficiency of ASNase was determined indirectly by centrifugation and directly by size exclusion chromatography, resulting in encapsulation rates of 20-25% and 1 to 7%, respectively. These results indicate the importance of determining the efficiency of encapsulation by size exclusion chromatography or direct method in the case of self-aggregated nanostructures formed by copolymers, due to values overestimated with the use of centrifugation. Our results point to the potential of polymersomes for ASNase delivery, as well as other therapeutic proteins. Nonetheless, complimentary studies are still necessary for ASNase release or L-asparagine penetration into the vesicles.

A L-asparaginase (EC 3.5.1.1) é uma enzima importante para o tratamento da leucemia linfoblástica aguda (LLA), neoplasia mais frequente em crianças e adolescentes. A L-asparaginase hidrolisa a L-asparagina resultando em ácido aspártico e amônio, impedindo que as células tumorais utilizem esse aminoácido para síntese proteica, ocasionando a morte celular apoptótica. Atualmente a enzima é obtida a partir de Escherichia coli e Erwinia chrysanthemi; no entanto, ambas as formulações estão associadas a um alto índice de efeitos adversos que comprometem a evolução e eficácia do tratamento. A levedura Saccharomyces cerevisiae tem o gene ASP1 responsável pela produção de L-asparaginase 1 (Sc_ASPase1) que tem sido pouco estudada. Para elucidar as características de Sc_ASPase1 nós expressamos a proteína em E. coli BL21(DE3) e a purificamos por cromatografia de afinidade. Sc_ASPase1 tem uma atividade especifica de 195,4 U/mg para L-asparagina e de 0,36 U/mg para L-glutamina, e um comportamento alostérico com um K0.5 de 75 µM para L-asparagina. Por meio de mutação sitio dirigida demonstramos a importância dos resíduos Thr64-Thy78-Th141-Lys215 para a catálise. As isoformas mutantes da proteína A331D, K335E, Y243S, S301N e ΔG77 não apresentaram melhoria nos parâmetros cinéticos ou atividade específica. Construímos e clonamos Sc_ASPase1 com a deleção dos primeiros 52 aminoácidos, porém nas condições testadas a proteína foi expressa na forma insolúvel. Demonstramos que Sc_ASPase1 possui potencial antineoplásico, pois com 10 U/mL de enzima foi capaz causar a 85% de mortalidade da linhagem leucêmica MOLT-4. Na mesma concentração, a enzima de E. coli é capaz de matar 95% de células dessa mesma linhagem. / L-Asparaginase (EC 3.5.1.1) is an important enzyme for the treatment of acute lymphoblastic leukemia (ALL), the most common malignancy in children and adolescents. L-asparaginase hydrolyzes L-asparagine resulting in ammonium and aspartic acid, preventing tumor cells of using such amino acid for protein synthesis, leading to apoptotic cell death. Currently, the enzyme is obtained from Escherichia coli and Erwinia chrysanthemi; however, both formulations are associated with a high incidence of side effects that compromise the progress and effectiveness of treatment. The yeast Saccharomyces cerevisiae has ASP1 gene responsible for the production of L-asparaginase 1 (Sc_ASPase1) that has been poor studied. To elucidate the characteristics of Sc_ASPase1, we expressed the protein in E. coli BL21 (DE3) cells and purified it by affinity chromatography. Sc_ASPase1 has a specific activity of 195.4 U/mg for L-asparagine and 0.36 U/mg for L-glutamine, and an allosteric behavior with a K0.5 of 75 µM for L-asparagine. Through site directed mutation, we demonstrated the importance of Thr64-Thy78-Th141-Lys215 residues for catalysis. The mutant protein isoforms A331D, K335E, Y243S, S301N and ΔG77 showed no improvement in kinetic parameters or specific activity. We build and cloned Sc_ASPase1 with the deletion of the first 52 amino acids, but under the conditions tested the protein was expressed in insoluble form. Sc_ASPase1 have demonstrated potential antineoplastic activityc, since 10 U/mL of enzyme lead to 85% of mortality in leukemia cell line MOLT-4. At the same concentration, the E. coli enzyme kills 95% of the cells of the same line.

Utilizada amplamente no tratamento de Leucemias Linfoblásticas Agudas, a L-Asparaginase é uma enzima que atua diminuindo a concentração de L-asparagina livre no plasma e, dessa forma, impede a proliferação de células cancerígenas. Isso ocorre porque tais células, ao contrário das células saudáveis, não conseguem sintetizar o aminoácido L-asparagina que necessitam para a síntese proteica por não possuírem a enzima asparagina sintetase devido a um silenciamento genético. A L-Asparaginase utilizada no Brasil era importada e produzida em bactéria, o que gerava problemas com custo e abastecimento, além de causar algumas reações imunológicas aos usuários. Isso impulsiona a encontrar alternativas para produção nacional de tal enzima e, se possível, com menor potencial alergênico. Para isso, foi estudada a produção da enzima L-Asparaginase do gene ASP1 de Saccharomyces cerevisiae em sistema de expressão heteróloga Pichia pastoris através da clonagem do gene sintético (ASP1), com códons otimizados para expressão em P. pastoris, estudo este nunca antes realizado ao que se sabe. Além disso, a produção da enzima foi realizada com auxílio de um planejamento experimental fatorial em agitador orbital levando em conta as variáveis: pH, temperatura e concentração do indutor. A melhor condição encontrada dentre as estudadas neste trabalho foi, a temperatura de 20°C, pH 6,0 e concentração de indutor de 1,5% que alcançou uma atividade de 6,9 U/g de célula e apesar do esforços, o peptídeo sinal utilizado (alfa da S. cerevisiae) não foi capaz de promover a secreção da enzima para o meio extracelular.Deve-se salientar que a realização de um maior número de ensaios através de um planejamento experimental fatorial fracionário para encontrar uma região de rendimentos máximos talvez melhore o ajuste dos modelos mostrados. Este trabalho foi a primeira tentativa de expressão do gene ASP1 de S. cerevisiae em Pichia pastoris até o momento, e pretende-se aprofundar mais este estudo. / Used widely in the treatment of Acute lymphoblastic leukemia, L-Asparaginase is an enzyme that acts by decreasing the concentration of L-asparagine free in the plasma and thus prevents the proliferation of cancer cells. This is because such cells, in contrast to healthy cells can not synthesize L-asparagine amino acid for protein synthesis need not possess the enzyme asparagine synthetase due to a gene silencing. The L-asparaginase used in Brazil was imported and produced in bacteria, which caused problems with cost and supply, as well as cause some immune responses to users. This boosts find alternatives to domestic production of this enzyme and, if possible, less allergenic potential. For this, the production of L-asparaginase enzyme ASP1 Saccharomyces cerevisiae gene heterologous to Pichia pastoris expression system was investigated by cloning the synthetic gene (ASP1), with codons optimized for expression in P. pastoris, this study never before achieved to what is known. Furthermore, the enzyme production was performed with the aid of a factorial design in an orbital shaker taking into account the following variables: pH, temperature and concentration of inducer. The best condition found among those studied in this work was a temperature of 20 ° C, pH 6.0 and concentration of 1.5% inductor attained an activity of 6.9 U / g cell and despite the efforts, used signal peptide (S. cerevisiae alpha) was not able to promote the secretion of the enzyme into the medium extracelular.Deve be noted that the achievement of a greater number of tests using a fractional factorial design yields to find a region maximum might improve the fit of the models shown. This work was the first attempt to ASP1 gene expression of S. cerevisiae in Pichia pastoris to date, and is intended to further deepen this study.

A enzima L-Asparaginase (ASNase) é um biofámaco utilizado no tratamento da leucemia linfoblástica aguda, no entanto, a evolução da produção da ASNase como um medicamento desde o final da década de 1970 resultou em apenas quatro alternativas disponíveis no mercado farmacêutico, com relatos de graves reações imunogênicas e toxicidade. Desse modo, a nanotecnologia é uma plataforma que pode ser explorada para administração dessa enzima diminuindo a exposição da mesma a proteases e aumentando a sua meia-vida aparente. Os polimerossomos (PL) são opções que pela nanoestrutura vesicular poderiam encapsular a ASNase em seu core aquoso e pela presença de uma membrana polimérica, são mais robustos que os lipossomos. Assim, neste trabalho objetivou-se desenvolver PL para encapsulação da ASNase como uma alternativa às formulações deste biofármaco existentes. Foram desenvolvidos PL de PEG-PLA, PMPC-PDPA, PEG-PDPA e Pluronic® L-21. Foram estudados fatores relacionados à composição dos copolímeros (fração hidrofílica, responsividade a fatores externos tais como pH e temperatura) e métodos de elaboração (hidratação do filme polimérico, troca de pH e temperatura) bem como foi feita a caracterização dos PL obtidos (tamanho, índice de polidispersão, espessura de membrana, formação de excessivo bulk polimérico, obtenção de micelas). Também foi feito um planejamento racional para encapsulação da ASNase (hidratação direta do filme polimérico e encapsulação por eletroporação, autoagregação com encapsulação por troca de pH ou de temperatura). Para os PL preparados com PEG-PLA, a extrusão resultou em distribuição de tamanhos mais estreitos correspondentes aos valores de PDI de 0,345, 0,144 e 0,081 para PEG45-PLA69, PEG114-PLA153 e PEG114-PLA180, respectivamente. Foi demonstrado que copolímeros com menor fração hidrofóbica resultam em maior eficiência de encapsulação para proteínas, já que possuem volumes aquosos maiores. Com o PMPC25-PDPA72 foi possível encapsular em média três unidades de ASNase por vesículas através da eletroporação ou troca de pH, sendo que no primeiro método houve formação de túbulos e no último método as micelas não foram completamente removidas. Para PEG100-PDPA80, grandes agregados permaneceram após a purificação levando a um PDI alto, mas não foi observada a formação de túbulos, já a troca de pH para este copolímero resultou em maior perda de copolímeros como bulk polimérico precipitado. Para o copolimero tribloco Pluronic® L-121, foi observado que as vesículas eram estáveis durante uma semana à temperatura ambiente, contrariando o que era descrito na literatura. Nesses sistemas, quando preparados por hidratação do filme, a encapsulação da ASNase foi realizada por eletroporação mas a proteína não foi detectada dentro das vesículas. Atribuímos a não-encapsulação à organização da bicamada Pluronic® L-121 sem conformação definida das cadeias poliméricas, dificultando a reorganização do bloco hidrofílico na porção interna do poro durante eletroporação. Por troca de temperatura, cerca de 5 % de ASNase foi encapsulada e o método resultou em total recuperação da atividade da enzima. Desse modo foram obtidos diferentes PL com diferentes características nanoestruturais de acordo com os copolímeros utilizados para carreamento da ASNase. / The enzyme L-Asparaginase (ASNase) is a biopharmaceutical used in the treatment of acute lymphoblastic leukemia, still the industrial production of ASNase as a marketable drug since the late 1970s has resulted in only four alternatives available in the pharmaceutical market, with reports of severe immunogenic reactions and toxicity. In this sense, nanotechnology is a platform that can be exploited to administer this enzyme by decreasing its exposure to proteases and increasing its apparent half-life. Polymerosomes (PL) are interesting routes which by its intrinsically vesicular nanostructure could encapsulate the ASNase in its aqueous core and by the presence of a polymeric membrane, being more robust than the liposomes. Thus, in this work it was intended to develop PL for ASNase encapsulation as an alternative to existing formulations of this biopharmaceutical. PL of PEG-PLA, PMPC-PDPA, PEG-PDPA and Pluronic® L-21 were developed. It was studied the copolymers composition (i.e. hydrophilic fraction, responsiveness to external factors such as pH and temperature), PL design (i.e. polymer film hydration, pH change and temperature) and PL characterization (i.e. size, polydispersity index - PDI, membrane thickness, formation of excessive polymer bulk, micelles production). A suitable experimental planning for ASNase encapsulation (i.e. direct hydration of the polymeric film and encapsulation by electroporation, self-aggregation with encapsulation by pH or temperature change) was also performed. For the PL prepared with PEG-PLA, the extrusion resulted in narrower size distribution corresponding to the PDI values of 0.345, 0.144 and 0.081 for PEG45-PLA69, PEG114-PLA153 and PEG114-PLA180, respectively. It has been shown that copolymers with lower hydrophobic fraction result in higher encapsulation efficiency for proteins, since they have larger aqueous volumes. With PMPC25-PDPA72 PL, it was possible to encapsulate three units of ASNase per vesicles through electroporation or pH change. In the first method, tubules were formed and in the latter one the micelles were not completely removed. For PEO100-PDPA80 PL, large aggregates remained after purification leading to a high PDI value, nevertheless no tubule formation was observed, since the pH change for this copolymer resulted in greater loss of copolymers as a precipitated polymer bulk. For the Pluronic® L-121 triblock copolymer PL, it was observed that the vesicles were stable for one week at room temperature, contrary to what was described in the literature. These PLs were prepared by film hydration method and ASNase encapsulation was performed by electroporation, nonetheless the protein was not detected within the vesicles. It is attributed the non-encapsulation to the organization of the Pluronic® L-121 bilayer without defined conformation of the polymer chains, making it difficult to reorganize the hydrophilic block in the internal portion of the pore during electroporation. By temperature change, about 5% of ASNase was encapsulated and the method resulted in complete recovery of enzyme activity. In conclusion, several PLs with a vast range of differential nanostructural characteristics were obtained according to the copolymers used for ASNase loading.

A L-Asparaginase (ASNase) é um importante agente quimioterapêutico utilizado para o tratamento da leucemia linfoblástica aguda (ALL) há mais de 40 anos. No entanto, devido à origem biológica da ASNase, enzima produzida por Escherichia coli, problemas como a imunogenicidade e baixa meia vida-plasmática devem ser considerados. Com o objetivo de minimizar essas desvantagens, várias ASNases homólogas bem como formulações de ASNase de E. coli foram investigadas. Nenhuma das formulações desenvolvidas, entretanto, foi capaz de resolver definitivamente esses problemas associados à sua origem. Nesse sentido, considerando os recentes avanços na ciência de polímeros com a possibilidade do obtenção de vesículas poliméricas usando copolímeros, este trabalho concentrou-se no desenvolvimento de polimerossomos de poli(etileno glicol)-b-poli(ε-caprolactona) (PEG-PCL) para encapsular a ASNase. Diversas condições experimentais foram investigadas e, ao final, os polimerossomos foram produzidos pela técnica de hidratação do filme polimérico utilizando a centrifugação como técnica de pós-filme para remoção de copolímero precipitado, produzindo assim vesículas polímericas de 120 a 200nm com PDI de aproximadamente 0,250. A eficiência de encapsulação da ASNase, utilizando as metodologias de centrifugação ou cromatografia de exclusão molecular, revelou taxas de encapsulação de 20-25% e 1 a 7%, repectivamente. Esses resultados apontam a importância de se determinar a eficiência de encapsulação por cromatografia de exclusão molecular ou método direto no caso de nanoestruturas auto-agregadas formadas por copolímeros, devido a valores superestimados com o emprego da centrifugação. Ainda que estudos complementares se façam necessários para liberação da enzima encapsulada ou penetração da L-asparagina nas vesículas, nossos resultados demonstram o potencial de polimerossomos para veiculação de ASNase, bem como de outras proteínas terapêuticas. / L-Asparaginase (ASNase) is an important chemotherapeutic agent used for the treatment of acute lymphoblastic leukemia (ALL) for more than 40 years. However, due to the biological origin of ASNase (produced by Escherichia coli) some drawbacks such as immunogenicity and low plasma half life are present. In order to minimize the disadvantages, several ASNases proteoforms and formulations of E. coli ASNase were investigated. However, none of this formulations completely solved the main drawbacks of ASNase. In this sense, considering the recents advances in polymers science with the possibility to develop polymeric vesicles using copolymers, this work aimed at the development of poly(ethylene glycol)-b-poly(ε-caprolactone) (PEG-PCL) vesicles to encapsulate ASNase. Different experimental conditions were investigated and, the final polymersomes formulation was prepared by film hydratation using centrifugation as a post-film technique to remove the bulky coplymer. Polymeric vesicles of 120 to 200nm with PDI of approximately, 0.250 were obtained. The encapsulation efficiency of ASNase was determined indirectly by centrifugation and directly by size exclusion chromatography, resulting in encapsulation rates of 20-25% and 1 to 7%, respectively. These results indicate the importance of determining the efficiency of encapsulation by size exclusion chromatography or direct method in the case of self-aggregated nanostructures formed by copolymers, due to values overestimated with the use of centrifugation. Our results point to the potential of polymersomes for ASNase delivery, as well as other therapeutic proteins. Nonetheless, complimentary studies are still necessary for ASNase release or L-asparagine penetration into the vesicles.