O glicerol pode ser aproveitado em processos biotecnológico como substrato, para a obtenção de diversos produtos, dentre eles os óleos microbianos. Desta forma, o presente estudo teve como objetivo avaliar a obtenção de lipídeos pela levedura Rhodotorula glutinis a partir de glicerol. Na etapa inicial deste estudo foram realizados ensaios em frascos agitados de 250 mL, contendo 50 mL de meio, segundo um planejamento experimental 24, com face centrada e repetições no ponto central, no qual foram avaliadas as influências das variáveis concentração de substrato (40 a 200 g/L), da razão carbono/nitrogênio (20:1 a 100:1), pH (5 a 7) e concentração de inóculo (1 a 5 g/L), sobre a produção de lipídeos. Verificou-se nesta etapa que, dentro da região avaliada, a concentração de substrato, o pH e a razão carbono/nitrogênio (C/N), apresentaram efeitos estatisticamente significativos sobre a produção de lipídeos. Dentre estas variáveis, a concentração de substrato e o pH apresentaram comportamento quadrático, com pontos de máximo acúmulo de lipídeos próximos a 140 g/L e pH 6,5, respectivamente. Quanto a razão C/N, esta variável mostrou um efeito positivo sobre o acúmulo de lipídeos, ou seja, dentro a região avaliada, o aumento da razão C/N levou a um aumento do acúmulo de lipídeos pela levedura. Nos cultivos realizados nas condições determinadas pelo modelo para maximizar o acúmulo de lipídeos foram alcançadas concentrações de células de 30 ± 1 g/L e lipídios de 15 ± 3 g/L, em 200 h de cultivo. Na segunda etapa deste estudo foi avaliada a ampliação de escala dos cultivos da levedura de frascos agitados para biorreatores de agitação pneumática do tipo coluna de bolhas (CB) e airlift (AL), com volumes de 0,5 e 1,8 L. Os cultivos em biorreatores foram realizados empregando-se as condições otimizadas na etapa anterior deste trabalho. De modo geral, os cultivos realizados em biorreatores de bancada aprestaram concentração de células (15 a 21 g/L) e de lipídeos (5 a 9 g/L), inferiores aos observados em frascos agitados (30 g/L de células e 15 g/L de lipídeos). Tal resultado pode estar relacionado a condição de disponibilidade de oxigênio uma vez que o coeficiente volumétrico de transferência de oxigênio (kLa) para os cultivos em frascos agitados (kLa 49 h-1) foi superior ao alcançado em biorreatores (kLa ente 20 e 30 h-1). Nesta etapa, verificou-se ainda que, os biorreatores do tipo CB possibilitaram alcançar uma concentração de lipídeos (8 a 9 g/L) superior à obtida nos reatores AL (5 a 7 g/L), além de proporcionar uma condição de mistura mais eficiente. Quanto a composição do óleo microbiano (OM) extraído da biomassa celular ao fim do cultivo, verificou-se elevados teores dos ácidos graxos palmítico (C16:0), esteárico (C18:0), oleico (C18:1) e linoleico (C18:2), os quais corresponderam a cerca de 95% de sua composição. A proporção de ácidos graxos de dezesseis e dezoito carbonos do óleo microbiano assemelha-se a encontrada no óleo de soja (cerca de 94% de C16 e C18), o que possibilita o emprego deste óleo para finalidades semelhantes às do óleo de soja, como por exemplo, produção de biodiesel. / Glycerol can be used in biotechnological processes as a substrate to obtain various products, among them microbial oils. In this way, the present study aims to evaluate the lipids production by the yeast Rhodotorula glutinis from glycerol. In the initial stage of this study, experiments were performed in 250 mL shaken flasks, containing 50 mL of medium, according to an experimental design 24, face centered and repetitions at the central point, in which the substrate concentration (40 to 200 g/L), carbon/nitrogen ratio (20:1 to 100:1), pH (5 to 7) and inoculum concentration (1 to 5 g/L) effects on lipid production were evaluated. It was verified that, within the evaluated region, the substrate concentration, pH and carbon/nitrogen ratio (C/N) had statistically significant effects on lipid production. Among these variables, the substrate concentration and pH presented a quadratic behavior, with maximum lipids accumulation points close to 140 g/L and pH 6.5, respectively. The C/N ratio presented a positive effect on the lipid accumulation, that is, within the region evaluated, the increase in the C/N ratio led to an increase in the lipid accumulation by yeast. Cultures performed under conditions determined by the model to maximize lipid accumulation reached cell concentrations of 30 ± 1 g/L and lipids of 15 ± 3 g/L in 200 h of culture. In the second stage of this study, the scale-up of the yeast shake flasks cultures for bubble column (CB) and airlift (AL) pneumatic agitation bioreactors, with volumes of 0.5 and 1.8 L, were evaluated. Cultures in bioreactors were performed using the optimized conditions in the previous stage of this work. In general, cultures in bioreactors presented cells concentrations (15 to 21 g / L) and lipids (5 to 9 g/L) lower than those observed in shaker flasks (30 g/L of cells and 15 g/L of lipid). This result may be related to the oxygen availability condition since the volumetric oxygen transfer coefficient (kLa) for cultures in shaker flasks (kLa 49 h-1) was higher than in bioreactors (kLa 20 and 30 h-1). In this stage, it was also verified that CB-type bioreactors achieve a lipid concentration (8 to 9 g/L) higher than that obtained in AL reactors (5 to 7 g/L), besides providing more efficient mixing conditions. About the composition of the microbial oil (MO), extracted from the cell biomass at the end of the cultivation, presented high levels of palmitic (C16: 0), stearic (C18: 0), oleic (C18:1) and linoleic (C18:2) fatty acids, which corresponded to about 95% of its composition. The proportion of microbial oil fatty acids of sixteen and eighteen carbons resembles that found in soybean oil (about 94% C16 and C18), which makes it possible to use this oil for similar purposes as soybean oil, such as biodiesel production, for example.

A enzima L-asparaginase é responsável por converter o aminoácido L-asparagina em ácido L-aspártico e amônio. Esta enzima possui importantes aplicações, principalmente na indústria farmacêutica, onde é empregada como um fármaco antileucêmico e na indústria de alimentos, como uma forma de mitigar a formação de acrilamida, um composto altamente tóxico, formado em alguns alimentos processados a altas temperaturas. Leveduras destacam-se como micro-organismos importantes para a produção da Lasparaginase, uma vez que possivelmente produzem enzimas com menores efeitos colaterais para humanos e são, em geral, organismos GRAS, sem restrições de aplicação na indústria de alimentos. O presente trabalho avaliou metodologias de seleção de novas leveduras produtoras de L-asparaginase, selecionando aquelas capazes de produzir destacadas quantidades desta enzima a partir de um banco contendo 40 cepas e verificando aspectos da sua produção. Foram empregadas metodologias de seleção de leveduras em meio sólido e em meio líquido, avaliando-se a aplicabilidade da quantificação da atividade enzimática pelo método de Nessler e pelo método da hidroxilamina. A produção de L-asparaginase foi posteriormente confirmada por cromatografia em camada delgada. As leveduras selecionadas foram avaliadas quanto à influência dos aminoácidos L-asparagina, L-prolina e L-glutamina como indutores na produção de L-asparaginase e quanto à cinética de produção enzimática. De acordo com os resultados, nenhuma das leveduras foi capaz de produzir L-asparaginase extracelular. Entretanto, duas novas leveduras, até então não citadas na literatura pertinente como produtoras de Lasparaginase, foram capazes de produzir L-asparaginase periplasmática: Issatchenkia orientalis e Rhodotorula glutinis. Verificou-se, também, que a metodologia de screening em meio sólido não foi correlacionável com a produção de L-asparaginase em meio líquido por leveduras. Foi necessária a adição de moléculas indutoras ao meio de cultivo, como os aminoácidos L-asparagina, L-prolina e L-glutamina, para que houvesse produção de Lasparaginase pelas leveduras I. orientalis e R. glutinis. Verificou-se a maior produção de L-asparaginase periplasmática em meio suplementado com L-asparagina e nitrato de amônio para a levedura I. orientalis (20,38 ± 3,55 U.g-1) e em meio suplementado com Lprolina para a levedura R. glutinis (57,05 ± 0,57 U.g-1). Durante os ensaios de cinética, verificou-se que a produção da enzima ocorreu principalmente durante a fase logarítmica do crescimento microbiano, observando-se também estabilidade da atividade enzimática durante as 144 horas do cultivo. Os resultados obtidos no presente trabalho permitiram verificar a viabilidade das metodologias de seleção de novas leveduras produtoras de Lasparaginase bem como selecionar, com sucesso, duas novas leveduras capazes de produzir a enzima L-asparaginase periplasmática, I. orientalis e R. glutinis, determinando aspectos importantes da sua produção em meio líquido. / L-asparaginase is the enzyme responsible for converting the amino acid L-asparagine into L-aspartic acid and ammonium. This enzyme has important applications, mainly in the pharmaceutical industry, where it is used as an antileukemic drug, and in the food industry, as a treatment for mitigating the formation of acrylamide, a highly toxic compound produced in some foods exposed to high temperatures. Yeasts are highlighted as important microorganisms for the production of L-asparaginase since they are capable of producing enzymes with fewer side effects for humans and are, in general, GRAS organisms, being applicable in the food industry without restrictions. This study evaluated screening methods for selecting new yeasts capable of producing L-asparaginase, selecting those capable of producing high amounts of this enzyme from a culture collection containing 40 strains, also verifying aspects of enzyme production. Methods for screening L-asparaginase producing organisms in solid and liquid medium were tested, evaluating the applicability of Nessler and hydroxylamine methods as means for enzyme activity quantification. The production of L-asparaginase was later confirmed through thin layer chromatography. The selected yeasts were evaluated to confirm the influence of the amino acids L-asparagine, L-proline and L-glutamine as inducers in the production of L-asparaginase, and the kinetics of Lasparaginase production were also evaluated. According to the results, none of the assessed yeasts were able to produce extracellular L-asparaginase. However, two novel yeasts, so far not cited in the pertinent literature as L-asparaginase producers, were able to produce periplasmic L-asparaginase: Issatchenkia orientalis and Rhodotorula glutinis. Tests also verified that the screening methods in solid medium did not correlate with the production of L-asparaginase in liquid medium by yeasts. It was necessary to add inducing molecules, such as the amino acids L-asparagine, L-proline and L-glutamine, to stimulate L-asparaginase production by the yeasts I. orientalis and R. glutinis. The highest production of periplasmic L-asparaginase was obtained in liquid medium supplemented with Lasparagine and ammonium nitrate for the yeast I. orientalis (20,38 ± 3,55 U.g-1) and in medium supplemented with L-proline for the yeast R. glutinis (57,05 ± 0,57 U.g-1). The production kinetics assay verified that the production of the enzyme took place mainly during the log phase of microbial growth, being stable after144 hours of cultivation. The results presented in this study were able to confirm the viability of the methods for the screening of novel L-asparaginase producing yeasts as well as to select two novel yeasts able to produce this enzyme, I. orientalis and R. glutinis, determining some important aspects in L-asparaginase production in liquid medium.

Atualmente há uma busca crescente por fontes energéticas renováveis motivada principalmente por razões ambientais e estratégicas, tais como o acúmulo de poluentes na atmosfera decorrente do uso de combustíveis fósseis e a diminuição de suas reservas. O biodiesel tem atraído atenção cada vez maior por sua capacidade em substituir o diesel do petróleo. A maior parte do biodiesel produzido utiliza como matéria-prima os óleos vegetais, os quais apresentam como principais desvantagens a sazonalidade na produção devido aos períodos de safra e a competição no uso de terras agrícolas com a produção de alimentos. Uma alternativa capaz de possibilitar a redução do uso de óleos vegetais são os óleos microbianos, como os produzidos por microalgas, fungos e leveduras. Os lipídeos produzidos por leveduras constituem uma fonte interessante de matéria-prima renovável para a produção de biocombustíveis, pois é independente das mudanças climáticas e sazonalidade, como as culturas vegetais. Desta forma, o presente trabalho tem por objetivo contribuir para o desenvolvimento de tecnologias voltadas para produção de óleos microbianos em cultivos heterotróficos. Neste sentido foram desenvolvidos estudos buscando selecionar leveduras capazes de produzir lipídeos tendo glicerol como substrato, bem como estabelecer as condições de cultivo mais favoráveis para a produção e acúmulo de lipídeos pela levedura selecionada. Para a seleção de microrganismos foram realizados ensaios visando comparar cinco diferentes leveduras (Cryptococcus curvatus Y -1511, Lipomyces starkeyi Y-27493, Rhodotorula glutinis Y- 12905, Rhodosporidium toruloides Y-1091 e Rhodotorula mucilaginosa Y-27053), neste estudo verificou-se que as cinco leveduras avaliadas foram capazes de consumir substrato, crescer e produzir lipídeos durante os cultivos. Dentre as leveduras avaliadas a Rhodotorula glutinis Y- 12905 e Cryptococcus curvatus Y -1511 foram as que apresentaram as maiores produtividades volumétricas em lipídeos, alcançando valores entre 0,20 e 0,23 g/L.dia, respectivamente. Quanto à capacidade de consumo de substrato a R. glutinis se destacou em relação as demais leveduras tendo sido capaz de consumir cerca de 59% do glicerol após 120 horas de cultivo, consumo este que representa quase duas vezes o valor alcançado pela C. curvatus, que apresentou o segundo maior consumo de substrato. Devido a sua elevada capacidade de assimilação de glicerol e apresentando uma das maiores produtividades volumétricas de lipídeos entre as leveduras avaliadas a levedura Rhodotorula glutinis foi considerada como uma das mais promissoras para a obtenção de óleos microbianos empregando glicerol como substrato. Nos ensaios realizados com diferentes agitações e razões de volume de frasco por volume de meio verificou-se que quanto maior a disponibilidade de oxigênio, maior foi o acúmulo de lipídeos, o crescimento celular e o consumo de glicerol. Quanto à avaliação da composição nutricional a presença de fontes de nitrogênio orgânico, tais como extrato de levedura e peptona mostraram-se fundamentais para o processo de produção de óleos microbianos juntamente com MgSO4.7H2O. Quando estes nutrientes estavam presentes de forma combinada foram obtidas concentrações de até 4,4 g/L de lipídeos e produtividades de 0,43 g/L.dia. Na avaliação da influência do pH inicial e da razão carbono/nitrogênio (C:N), verificou-se que o acúmulo de lipídeos pela levedura é favorecido para cultivos realizados em pH inicial entre 6 e 7, e com razão C:N entre 30:1 e 50:1. Em tais condições a levedura foi capaz de acumular até 8 g/L de lipídeos com produtividade de até 0,82 g/L.dia. A composição do óleo microbiano obtido pela levedura revelou elevados teores dos ácidos graxos palmítico (C16:0), esteárico (C18:0), oleico (C18:1) e linoleico (C18:2), os quais correspondem a 99% de sua composição. O óleo apresentou um comportamento de fluido newtoniano com viscosidade de 39,3 cP à 50ºC, tendo um índice de acidez de 5,8±0,2 mgKOH/góleo e teor de ácido graxos de 1,93±0,08 %. / Currently, there is a search for renewable energy sources motivated mainly by environmental and strategic reasons, such as the concept of solutions for the development of fossil fuel use and a decrease of its reserves. Biodiesel has attracted increasing attention for its ability to replace diesel oil. Most of the biodiesel produced uses vegetable oils as raw material, which has as main disadvantages the seasonality and a competition in the use of agricultural land with a food production. An alternative capable of reducing the use of vegetable oils is the use of microbial oils, such as those produced by microalgae, fungi and yeasts. The lipids produced by yeasts are an interesting source of renewable raw material for biofuel production, because it is independent of climatic changes and seasonality, such as vegetable crops. In this way, the present study aims to contribute to the development of technologies of microbial oils production in heterotrophic cultures. In this sense, studies were developed to select yeasts capable of producing lipids having glycerol as substrate, as well as to establish the culture conditions more favorable for the production and accumulation of lipids by the selected yeast. For a selection of microorganisms assays were carried out aiming to compare five different yeasts (Cryptococcus curvatus Y-1511, Lipomyces starkeyi Y-27493, Rhodotorula glutinis Y-12905, Rhodosporidium toruloides Y-1091 and Rhodotorula mucilaginosa Y-27053). In this step it was verified that the five yeasts evaluated were able to consume substrate, grow and produce lipids during the cultures. Among the evaluated yeasts, Rhodotorula glutinis Y-12905 and Cryptococcus curvatus Y-1511 has presented the highest volumetric lipid yields, reaching values between 0.20 and 0.23 g/L.day, respectively. Regarding the substrate consumption capacity, R. glutinis stood out in relation to other yeasts, being able to consume about 59% of glycerol after 120 hours of cultivation. Due to its high capacity for assimilation of glycerol and presenting one of the highest volumetric productivities of lipids among evaluated yeasts, Rhodotorula glutinis was considered as one of the most promising for the obtaining of microbial oils from glycerol as substrate. In the assays performed with different oxygenation levels, it was verified that higher oxygen availability higher the volume of lipids, cell growth and glycerol consumption. In the nutritional composition evaluation it was observed that the organic nitrogen source, such as yeast extract and peptone are essential for the production process of microbial oils together with MgSO4.7H2O. When these nutrients were presents in combination, concentrations of 4.4 g/L lipids and productivity of 0.43 g/L.day were obtained. In the evaluation of the influence of the initial pH and the carbon/nitrogen ratio (C:N), it was verified that the accumulation of lipids by yeast is favored for the cultures at initial pH between 6 and 7, and with C:N ratio between 30:1 and 50:1. In such conditions, it was obtained by yeast 8 g/L of lipids and volumetric productivity of 0.82 g/day. The composition of the microbial oil obtained by the yeast revealed high levels of palmitic (C16:0), stearic (C18:0), oleic (C18:1) and linoleic (C18:2) fatty acids, which correspond to 99% of composition. The oil exhibited a Newtonian fluid behavior and a viscosity of 39.3 cP at 50 °C, having an acid number of 5.8 ± 0.2 mgKOH/goil and a fatty acid content of 1.93 ± 0.08%.

Atualmente há uma busca crescente por fontes energéticas renováveis motivada principalmente por razões ambientais e estratégicas, tais como o acúmulo de poluentes na atmosfera decorrente do uso de combustíveis fósseis e a diminuição de suas reservas. O biodiesel tem atraído atenção cada vez maior por sua capacidade em substituir o diesel do petróleo. A maior parte do biodiesel produzido utiliza como matéria-prima os óleos vegetais, os quais apresentam como principais desvantagens a sazonalidade na produção devido aos períodos de safra e a competição no uso de terras agrícolas com a produção de alimentos. Uma alternativa capaz de possibilitar a redução do uso de óleos vegetais são os óleos microbianos, como os produzidos por microalgas, fungos e leveduras. Os lipídeos produzidos por leveduras constituem uma fonte interessante de matéria-prima renovável para a produção de biocombustíveis, pois é independente das mudanças climáticas e sazonalidade, como as culturas vegetais. Desta forma, o presente trabalho tem por objetivo contribuir para o desenvolvimento de tecnologias voltadas para produção de óleos microbianos em cultivos heterotróficos. Neste sentido foram desenvolvidos estudos buscando selecionar leveduras capazes de produzir lipídeos tendo glicerol como substrato, bem como estabelecer as condições de cultivo mais favoráveis para a produção e acúmulo de lipídeos pela levedura selecionada. Para a seleção de microrganismos foram realizados ensaios visando comparar cinco diferentes leveduras (Cryptococcus curvatus Y -1511, Lipomyces starkeyi Y-27493, Rhodotorula glutinis Y- 12905, Rhodosporidium toruloides Y-1091 e Rhodotorula mucilaginosa Y-27053), neste estudo verificou-se que as cinco leveduras avaliadas foram capazes de consumir substrato, crescer e produzir lipídeos durante os cultivos. Dentre as leveduras avaliadas a Rhodotorula glutinis Y- 12905 e Cryptococcus curvatus Y -1511 foram as que apresentaram as maiores produtividades volumétricas em lipídeos, alcançando valores entre 0,20 e 0,23 g/L.dia, respectivamente. Quanto à capacidade de consumo de substrato a R. glutinis se destacou em relação as demais leveduras tendo sido capaz de consumir cerca de 59% do glicerol após 120 horas de cultivo, consumo este que representa quase duas vezes o valor alcançado pela C. curvatus, que apresentou o segundo maior consumo de substrato. Devido a sua elevada capacidade de assimilação de glicerol e apresentando uma das maiores produtividades volumétricas de lipídeos entre as leveduras avaliadas a levedura Rhodotorula glutinis foi considerada como uma das mais promissoras para a obtenção de óleos microbianos empregando glicerol como substrato. Nos ensaios realizados com diferentes agitações e razões de volume de frasco por volume de meio verificou-se que quanto maior a disponibilidade de oxigênio, maior foi o acúmulo de lipídeos, o crescimento celular e o consumo de glicerol. Quanto à avaliação da composição nutricional a presença de fontes de nitrogênio orgânico, tais como extrato de levedura e peptona mostraram-se fundamentais para o processo de produção de óleos microbianos juntamente com MgSO4.7H2O. Quando estes nutrientes estavam presentes de forma combinada foram obtidas concentrações de até 4,4 g/L de lipídeos e produtividades de 0,43 g/L.dia. Na avaliação da influência do pH inicial e da razão carbono/nitrogênio (C:N), verificou-se que o acúmulo de lipídeos pela levedura é favorecido para cultivos realizados em pH inicial entre 6 e 7, e com razão C:N entre 30:1 e 50:1. Em tais condições a levedura foi capaz de acumular até 8 g/L de lipídeos com produtividade de até 0,82 g/L.dia. A composição do óleo microbiano obtido pela levedura revelou elevados teores dos ácidos graxos palmítico (C16:0), esteárico (C18:0), oleico (C18:1) e linoleico (C18:2), os quais correspondem a 99% de sua composição. O óleo apresentou um comportamento de fluido newtoniano com viscosidade de 39,3 cP à 50ºC, tendo um índice de acidez de 5,8±0,2 mgKOH/góleo e teor de ácido graxos de 1,93±0,08 %. / Currently, there is a search for renewable energy sources motivated mainly by environmental and strategic reasons, such as the concept of solutions for the development of fossil fuel use and a decrease of its reserves. Biodiesel has attracted increasing attention for its ability to replace diesel oil. Most of the biodiesel produced uses vegetable oils as raw material, which has as main disadvantages the seasonality and a competition in the use of agricultural land with a food production. An alternative capable of reducing the use of vegetable oils is the use of microbial oils, such as those produced by microalgae, fungi and yeasts. The lipids produced by yeasts are an interesting source of renewable raw material for biofuel production, because it is independent of climatic changes and seasonality, such as vegetable crops. In this way, the present study aims to contribute to the development of technologies of microbial oils production in heterotrophic cultures. In this sense, studies were developed to select yeasts capable of producing lipids having glycerol as substrate, as well as to establish the culture conditions more favorable for the production and accumulation of lipids by the selected yeast. For a selection of microorganisms assays were carried out aiming to compare five different yeasts (Cryptococcus curvatus Y-1511, Lipomyces starkeyi Y-27493, Rhodotorula glutinis Y-12905, Rhodosporidium toruloides Y-1091 and Rhodotorula mucilaginosa Y-27053). In this step it was verified that the five yeasts evaluated were able to consume substrate, grow and produce lipids during the cultures. Among the evaluated yeasts, Rhodotorula glutinis Y-12905 and Cryptococcus curvatus Y-1511 has presented the highest volumetric lipid yields, reaching values between 0.20 and 0.23 g/L.day, respectively. Regarding the substrate consumption capacity, R. glutinis stood out in relation to other yeasts, being able to consume about 59% of glycerol after 120 hours of cultivation. Due to its high capacity for assimilation of glycerol and presenting one of the highest volumetric productivities of lipids among evaluated yeasts, Rhodotorula glutinis was considered as one of the most promising for the obtaining of microbial oils from glycerol as substrate. In the assays performed with different oxygenation levels, it was verified that higher oxygen availability higher the volume of lipids, cell growth and glycerol consumption. In the nutritional composition evaluation it was observed that the organic nitrogen source, such as yeast extract and peptone are essential for the production process of microbial oils together with MgSO4.7H2O. When these nutrients were presents in combination, concentrations of 4.4 g/L lipids and productivity of 0.43 g/L.day were obtained. In the evaluation of the influence of the initial pH and the carbon/nitrogen ratio (C:N), it was verified that the accumulation of lipids by yeast is favored for the cultures at initial pH between 6 and 7, and with C:N ratio between 30:1 and 50:1. In such conditions, it was obtained by yeast 8 g/L of lipids and volumetric productivity of 0.82 g/day. The composition of the microbial oil obtained by the yeast revealed high levels of palmitic (C16:0), stearic (C18:0), oleic (C18:1) and linoleic (C18:2) fatty acids, which correspond to 99% of composition. The oil exhibited a Newtonian fluid behavior and a viscosity of 39.3 cP at 50 °C, having an acid number of 5.8 ± 0.2 mgKOH/goil and a fatty acid content of 1.93 ± 0.08%.

A enzima L-asparaginase é responsável por converter o aminoácido L-asparagina em ácido L-aspártico e amônio. Esta enzima possui importantes aplicações, principalmente na indústria farmacêutica, onde é empregada como um fármaco antileucêmico e na indústria de alimentos, como uma forma de mitigar a formação de acrilamida, um composto altamente tóxico, formado em alguns alimentos processados a altas temperaturas. Leveduras destacam-se como micro-organismos importantes para a produção da Lasparaginase, uma vez que possivelmente produzem enzimas com menores efeitos colaterais para humanos e são, em geral, organismos GRAS, sem restrições de aplicação na indústria de alimentos. O presente trabalho avaliou metodologias de seleção de novas leveduras produtoras de L-asparaginase, selecionando aquelas capazes de produzir destacadas quantidades desta enzima a partir de um banco contendo 40 cepas e verificando aspectos da sua produção. Foram empregadas metodologias de seleção de leveduras em meio sólido e em meio líquido, avaliando-se a aplicabilidade da quantificação da atividade enzimática pelo método de Nessler e pelo método da hidroxilamina. A produção de L-asparaginase foi posteriormente confirmada por cromatografia em camada delgada. As leveduras selecionadas foram avaliadas quanto à influência dos aminoácidos L-asparagina, L-prolina e L-glutamina como indutores na produção de L-asparaginase e quanto à cinética de produção enzimática. De acordo com os resultados, nenhuma das leveduras foi capaz de produzir L-asparaginase extracelular. Entretanto, duas novas leveduras, até então não citadas na literatura pertinente como produtoras de Lasparaginase, foram capazes de produzir L-asparaginase periplasmática: Issatchenkia orientalis e Rhodotorula glutinis. Verificou-se, também, que a metodologia de screening em meio sólido não foi correlacionável com a produção de L-asparaginase em meio líquido por leveduras. Foi necessária a adição de moléculas indutoras ao meio de cultivo, como os aminoácidos L-asparagina, L-prolina e L-glutamina, para que houvesse produção de Lasparaginase pelas leveduras I. orientalis e R. glutinis. Verificou-se a maior produção de L-asparaginase periplasmática em meio suplementado com L-asparagina e nitrato de amônio para a levedura I. orientalis (20,38 ± 3,55 U.g-1) e em meio suplementado com Lprolina para a levedura R. glutinis (57,05 ± 0,57 U.g-1). Durante os ensaios de cinética, verificou-se que a produção da enzima ocorreu principalmente durante a fase logarítmica do crescimento microbiano, observando-se também estabilidade da atividade enzimática durante as 144 horas do cultivo. Os resultados obtidos no presente trabalho permitiram verificar a viabilidade das metodologias de seleção de novas leveduras produtoras de Lasparaginase bem como selecionar, com sucesso, duas novas leveduras capazes de produzir a enzima L-asparaginase periplasmática, I. orientalis e R. glutinis, determinando aspectos importantes da sua produção em meio líquido. / L-asparaginase is the enzyme responsible for converting the amino acid L-asparagine into L-aspartic acid and ammonium. This enzyme has important applications, mainly in the pharmaceutical industry, where it is used as an antileukemic drug, and in the food industry, as a treatment for mitigating the formation of acrylamide, a highly toxic compound produced in some foods exposed to high temperatures. Yeasts are highlighted as important microorganisms for the production of L-asparaginase since they are capable of producing enzymes with fewer side effects for humans and are, in general, GRAS organisms, being applicable in the food industry without restrictions. This study evaluated screening methods for selecting new yeasts capable of producing L-asparaginase, selecting those capable of producing high amounts of this enzyme from a culture collection containing 40 strains, also verifying aspects of enzyme production. Methods for screening L-asparaginase producing organisms in solid and liquid medium were tested, evaluating the applicability of Nessler and hydroxylamine methods as means for enzyme activity quantification. The production of L-asparaginase was later confirmed through thin layer chromatography. The selected yeasts were evaluated to confirm the influence of the amino acids L-asparagine, L-proline and L-glutamine as inducers in the production of L-asparaginase, and the kinetics of Lasparaginase production were also evaluated. According to the results, none of the assessed yeasts were able to produce extracellular L-asparaginase. However, two novel yeasts, so far not cited in the pertinent literature as L-asparaginase producers, were able to produce periplasmic L-asparaginase: Issatchenkia orientalis and Rhodotorula glutinis. Tests also verified that the screening methods in solid medium did not correlate with the production of L-asparaginase in liquid medium by yeasts. It was necessary to add inducing molecules, such as the amino acids L-asparagine, L-proline and L-glutamine, to stimulate L-asparaginase production by the yeasts I. orientalis and R. glutinis. The highest production of periplasmic L-asparaginase was obtained in liquid medium supplemented with Lasparagine and ammonium nitrate for the yeast I. orientalis (20,38 ± 3,55 U.g-1) and in medium supplemented with L-proline for the yeast R. glutinis (57,05 ± 0,57 U.g-1). The production kinetics assay verified that the production of the enzyme took place mainly during the log phase of microbial growth, being stable after144 hours of cultivation. The results presented in this study were able to confirm the viability of the methods for the screening of novel L-asparaginase producing yeasts as well as to select two novel yeasts able to produce this enzyme, I. orientalis and R. glutinis, determining some important aspects in L-asparaginase production in liquid medium.

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Producing biodiesel from triacylglycerol (TAG) generates glycerol as a byproduct which could be recycled and used to grow the oleaginous yeast Rhodotorula glutinis. R. glutinis has the ability to produce up to 70% of its weight in the form of TAG. This study is designed to determine the effects of glycerol on the TAG and fatty acids produced by R. glutinis. After 24 hrs, R. glutinis cultured on medium containing dextrose, xylose, glycerol, dextrose and xylose, xylose and glycerol, or dextrose and glycerol accumulated 16, 12, 25, 10, 21, and 34% TAG on a dry weight basis, respectively. The fatty acids derived from R. glutinis were mostly saturated, however, cells cultivated on glycerol alone had the highest degree of unsaturated fatty acids (53%). Growth on dextrose may be enhanced by the addition of glycerol, but it cannot be determined if using glycerol as a secondary carbon substrate enhances lipid production.

Orientador: Delia Rodriguez-Amaya / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-19T01:25:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Sentanin_MichelleAndriati_D.pdf: 945275 bytes, checksum: 8006d9bfad9ddd336494867a2761a66f (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: Os carotenóides são corantes naturais, alguns dos quais são precursores de vitamina A. Desde a década passada, tem sido atribuído a estes compostos um importante papel na diminuição do risco de várias doenças degenerativas. Com estas funções vitais, a procura por fontes intensificou-se mundialmente. A produção biotecnológica de carotenóides específicos, utilizando bactérias, fungos e leveduras, vem despertando crescente interesse. O presente trabalho teve como objetivos otimizar a extração dos carotenóides de Rhodotorula glutinis, estimular a produção de carotenóides pela adição de ácido mevalônico, substituir o meio de cultivo por substrato de baixo custo e avaliar a estabilidade e degradação de toruleno. O capítulo 1 apresenta uma revisão bibliográfica sobre a biossíntese de carotenóides e a produção biotecnológica desses pigmentos nos últimos dez anos, destacando a produção por bactérias, algas e fungos. O segundo capítulo visa otimizar a extração dos carotenóides da levedura Rhodotorula glutinis e avaliar o efeito de diferentes concentrações de ácido mevalônico na produção de carotenóides. Por ser um precursor chave no caminho biossintético dos carotenóides em leveduras, este composto influenciou de modo significativo a produção dos pigmentos. Apesar da quantidade de biomassa não ter sido afetada, a produção de carotenóides totais aumentou em até 114% e o rendimento de toruleno e de b-caroteno aumentou 157% e 168%, respectivamente. O Capítulo 3 tem o intuito de baixar o custo de produção de carotenóides pela levedura em estudo, através da substituição do meio de cultura usual YM por um residuo da industria da mandioca, a manipueira, substrato rico em nutrientes. Para otimizar a producao dos pigmentos, realizou-se um planejamento fatorial completo de quatro variaveis, a saber pH, temperatura, agitacao e volume de inoculo. A condicao que melhor favoreceu o rendimento de carotenoides foi 26°C, 250 rpm de agitacao, pH 7,0 e 10% de volume de inoculo. Nessa condicao, a producao de carotenoides totais foi de 2068 ?g/L de meio de cultura. O tradicional meio YM proporcionou a producao de apenas 899 ?g/L de meio de cultura de carotenoides totais. O quarto capitulo tem por objetivo avaliar a estabilidade do carotenoide toruleno produzido por Rhodotorula, em comparacao com os carotenoides bem conhecidos licopeno e ?-caroteno. Para isso, foram montados sistemas modelos de baixa umidade, utilizando como matriz celulose microcristalina, que ficaram expostos durante 15 dias a luz ou ao abrigo da mesma. O carotenoide que mais sofreu degradacao foi o licopeno, seguido de ?-caroteno e toruleno. O Capitulo 5 visa investigar a degradacao oxidativa do toruleno e os compostos volateis produzidos durante esse processo. Para atingir esse objetivo, foram montados sistemas modelo de baixa umidade, com matriz de celulose microcristalina, em frascos de vidro, com injecao de fluxo de oxigenio. Houve a formacao de diversos compostos de degradacao, dos quais os que mais se destacaram, quantitativamente, foram metacroleina, prenal, 2,6- dimetil-hepta-2,4-dieno, 6-metil-hept-5-en-2-ona, 2-etil-hexanol, 2-etenil- 1,3,3-trimetil-ciclohexeno e 3,3-dimetil-acetaldeido-ciclohexilideno / Abstract: Carotenoids are natural colorants, some of which are precursors of vitamin A. Since the past decade, an important role in reducing the risk of various degenerative diseases was attributed to these compounds. With these vital functions, the search for sources has intensified worldwide. The biotechnological production of specific carotenoids, using bacteria, fungi and yeasts, have attracted increasing interest. This study had the objective of optimizing the extraction of carotenoids from Rhodotorula glutinis, stimulating the production of carotenoids with mevalonic acid, substituting the medium with low-cost substrate and evaluating the stability and degradation of torulene. Chapter 1 presents a review of the biosynthesis of carotenoids and biotechnological production of these pigments in the last ten years, highlighting the production by bacteria, algae and fungi. The second chapter aims to optimize the extraction of carotenoids from the yeast Rhodotorula glutinis and assessing the effect of different concentrations of mevalonic acid on the production of carotenoids. Being a key precursor in the biosynthetic pathway of carotenoids in yeasts, it significantly influenced the production of pigments. Although the amount of biomass was not affected, the production of total carotenoid increased by 114% and the yield of torulene and ?-carotene increased by 157% and 168%, respectively. Chapter 3 is intended to lower the cost of production of carotenoids by the yeast under investigation, by replacing the usual culture medium YM with a sub-product of the cassava industry, the nutrient-rich substrate manipueira. To optimize the production of pigments, a full factorial design was used with four variables: pH, temperature, agitation and inoculum volume. The condition that favored yield of carotenoids was: 26°C, 250 rpm agitation, pH 7.0 and 10% volume of inoculum. In this condition, the production of carotenoids was 2068 mg/L of culture medium. The traditional YM provided the production of only 899 mg/L of culture medium of carotenoids. The fourth chapter aims to evaluate the stability of torulene produced by Rhodotorula, compared with well-known carotenoids, lycopene and b-carotene. For this purpose, model systems of low moisture were mounted, using microcrystalline cellulose as the matrix, which were kept in the dark or exposed to light for 15 days. The carotenoid that suffered the most degradation was lycopene, followed by b-carotene and torulene. Chapter 5 investigates the oxidative degradation of torulene and the volatile compounds produced during this process. To achieve this goal, model systems of low moisture were mounted, with microcrystalline cellulose matrix, in glass bottle, with injection of oxygen flow. Several degradation compounds were formed, of which the following compounds stood out quantitatively: methacrolein, prenal, 2,6-dimethyl-hepta-2,4-diene, 6-methyl-hept-5-en-2- one, 2-ethylhexanol, 2-ethenyl-1,3,3-trimethyl-cyclohexene and 3,3-dimethylciclohexilideno acetaldehyde / Doutorado / Ciência de Alimentos / Doutor em Ciência de Alimentos

Carotenoids are natural pigments that have antioxidation and antimutagenic abilities. They are produced with the help of new technological methods. For example, carotenoid yeast Rhodotorula glutinis produces -carotene with the yield of up to 6 – 10 mg/g of the dry substance. The method of the mass spectrometry with the nanoelectrospray in the positive mode was optimized for the determination of -carotene, lycopene and astaxanthin in this project. Ionizing voltage of 4 kV and the sample flow rate of 15 – 80 nl/min through the spray silica fused capillary with the internal diameter of 25 µm were found to be the optimum parameters of the analysis. A mixture of chloroform with the addition of ammonia was used as a spray solvent for both standard and cellular samples. During the process of ionization by nanoelectrospray, -carotene and lycopene form cation radical [M] • + with the molecular mass to charge ratio (m/z) of 536, while asthaxanthin forms the protonated molecule [M + H]+ with the m/z of 597. The partial lysis of individual Rhodotorula glutinis cells was demonstrated under microscope in the organic solvents tetrahydrofuran and dimethylsulfoxide. Chloroform, acetone, acetonitrille, methanol and isopropanol did not affect the cells after a 15 min treatment.

Carotenoids are naturally occurring pigments produced by bacteria, yeasts, filamentous fungi and plants. They exhibit significant biological effects and are widely used in the food industry, pharmacy and cosmetics. The aim of this diploma thesis proposed as a comparative study was regulation of carotenoid and ergosterol production in red yeasts using several waste substrates as whey, corn germs, wheat, apple fiber and pasta. To selected production media extracellular hydrolytic enzymes degrading polysaccharide were added. These enzymes were obtained from the cultivation media of four fungal strains. In this study three carotenogenic yeast strains were used: Rhodotorula glutinis, Sporobolomyces roseus and Cystofilobasidium capitatum. All strains were cultivated simultaneously and changes in biomass and carotenoid production in different production media were monitored and compared. As the best waste substrate apple fiber was utilized, particularly in Rhodotorula glutinis, which exhibited mainly biomass production increase. In Sporobolomyces roseus increased production of biomass and carotenoids have been reported in media with hydrolyzed fiber and pasta as well. Beta-carotene production in this strain reached 4776,38 mg/g of dry weight. The strain Cystofilobasidium capitatum exhibited in waste media a decerase of biomass production accompanied with increased production of carotenoids, especially in wheat mush and pasta medium hydrolyzed by enzyme preparative from Aureobasidium pullulan. It can be concluded that hydrolyzed waste substrates are very hopeful as cheap nutrient sources for yeast strains producing carotenoids and ergosterol. Nevertheless, further study of substrate processing for individual strains is needed.