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Produção de glicerol quinase em Pichia pastoris /

Aizemberg, Raquel. January 2011 (has links)
Orientador: Edwil Aparecida de Lucca Gattás / Banca: Eleonora Cano Carmona / Banca: Rubens Monti / Resumo: A levedura Pichia pastoris vem sendo largamente utilizada como um eficiente sistema de expressão para a produção de proteínas heterólogas, pois é um sistema seguro, fácil e mais barato que sistemas de expressão de outros eucariotos. Neste trabalho, a enzima de interesse é a glicerol quinase (GK), que cataliza a transferência do fosfato terminal do ATP para o glicerol originando glicerol-3-fosfato e ADP. Esta reação pode ser utilizada na determinação da concentração de glicerol, subproduto da fermentação alcoólica. A leitura do consumo de glicerol é realizada pela determinação espectrofotométrica do NADH gerado na reação de oxido-redução catalizada pela enzima glicerol-3-fosfato desidrogenase. Este estudo de indução foi realizado em diferentes condições de crescimento da levedura Pichia pastoris. Os resultados mostraram a seleção do melhor clone da levedura Pichia pastoris para a expressão extracelular da enzima glicerol quinase, e a determinação das melhores condições do meio de cultura para a produção da enzima de interesse foram: concentração do meio de cultura BMMY (20 vezes), densidade inicial de célula (0,1 mg/mL), concentração de metanol na fase de indução (1%), natureza do tampão (fosfato de potássio), pH (6,0), suplementação de glicerol no meio BMMY (1%), peptona (marca Difco), sem adição de sulfato de amônio, caseína e glicina, uso do meio BMMY e liofilização do mesmo. Estudos de parâmetros cinéticos foram realizados e a atividade máxima da GK foi obtida em pH 9,8, a 50ºC e 2,5 μM de substrato, por metodologia clássica, além da presença de sulfato de magnésio e diluição da enzima de 30 vezes. A enzima apresentou alta estabilidade térmica ― a atividade foi completamente... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The yeast Pichia pastoris has been widely used as an efficient expression system for production of heterologous proteins because it is a safe, easy and cheaper than expression systems in other eukaryotes.In this studie, the enzyme of interest is glycerol kinase (GK), which catalizes the transfer of terminal phosphate from ATP to glycerol resulting glycerol-3-phosphate and ADP. This reaction can be used in determining the concentration of glycerol, a byproduct of fermentation. The reading of the consumption of glycerol is carried out by spectrophotometric determination of NADH generated in the redox reaction catalyzed by the enzyme glycerol-3-phosphate dehydrogenase. This study of induction was performed in different conditions of growth of the yeast Pichia pastoris. The results show that selecting the best clone of the yeast Pichia pastoris for the expression of extracellular enzyme glycerol kinase, and determining the best conditions of the culture medium for producing the enzyme of interest were: concentration of the culture medium BMMY (20 times), initial cell density (0.1 mg/mL), methanol concentration in the induction phase (1%), nature of buffer (potassium phosphate), pH (6.0), glycerol supplementation in BMMY medium (1%), peptone (Difco), without addition of ammonium sulfate, casein and glycine in BMMY and lyophilized medium. Studies of kinetic parameters were conducted and the GK maximum activity was obtained at pH 9.8 at 50°C and 2.5 μM substrate by conventional method, besides the presence of magnesium sulfate and diluting the enzyme 30 times. The enzyme showed high thermal stability - the activity was fully maintained up to 50°C for one hour - and at pH 7.0 for 7 days and kept under refrigeration, freeze-dried extract showed a decrease in enzymatic activity. Calculated by... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre
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Glicerol quinase de levedura de panificação /

Aragon, Caio Casale. January 2008 (has links)
Resumo: No presente trabalho, a atividade da enzima glicerol quinase (GK; EC 2.7.1.30; ATP: glicerol 3-fosfotransferase), proveniente de extratos de levedura seca de panificação, foi otimizada. A melhor preparação enzimática da GK foi obtida por rompimento celular com esferas de vidro, durante sete minutos, com lise de 54,2% das células. O extrato celular foi parcialmente purificado com 1% de sulfato de estreptomicina, antes da precipitação com igual volume de solução a 30% (m/v) de polietilenoglicol 3350, e posteriormente dialisado. A atividade máxima da GK foi obtida em pH 10,0, a 60ºC e 50mM de substrato, por metodologia clássica. A enzima apresentou alta estabilidade térmica ― a atividade foi completamente mantida até 50ºC, durante uma hora ― e em pH entre 6,0 e 8,0. Além disso, manteve-se estável, por quatro meses, a 4°C, na presença de azida de sódio 0,05% e cloreto de cobalto 10mM, e, por até oito meses, com o extrato liofilizado. Calculados pelos métodos de Lineweaver-Burk, Hanes-Woolf e Eadie-Hofstee, o valor da constante de Michaelis (Km) da enzima variou entre 1,99mM e 3,11mM, e a Vmax, entre 1,14U/mL e 1,19U/mL. Utilizou-se a metodologia de superfície de resposta (MSR) para melhor definição dos parâmetros da reação enzimática, observando-se valores ótimos de atividades a temperaturas entre 52ºC e 56ºC, pH entre 10,2 e 10,5 e concentração de substrato de 150mM a 170mM. A MSR mostrou-se adequada para modelar a reação e maximizar a atividade da glicerol quinase. Este método, de baixo custo, dosa a glicerol quinase em uma seqüência de reações, sendo de grande importância para diversas indústrias, como a de alimentos, açúcar e álcool. / Abstract: In the present study, the activity of the enzyme glycerol kinase (GK; EC 2.7.1.30; ATP: glycerol 3-phosphotransferase) from dry baker's yeast, was optimized. The best enzymatic preparation of GK was obtained by cell disruption with glass beads, for seven minutes, with 54.2% of lysed cells. Cell extract was partially purified with 1% of streptomycin sulphate, before the precipitation with equal volume of a 30% solution (m/v) of polyethylene glycol 3350, and then it was dialyzed. The maximum activity of GK was obtained with pH 10.0, at 60ºC and 50mM of substrate, by the classic methodology. The enzyme presented high thermal stability ― the activity was completely maintained up to 50ºC, during one hour ― and at pH between 6.0 and 8.0. Besides, it was stable, for four months, at 4°C, in the presence of sodium azide 0.05% and cobalt chloride 10mM, and, for up to eight months, with the lyophilized extract. The value of the Michaelis constant (Km) of the enzyme was calculated by the methods of Lineweaver-Burk, Hanes-Woolf and Eadie-Hofstee,and it varied between 1.99mM and 3.11mM, and Vmax, between 1.14U/mL and 1.19U/mL. Response surface methodology (RSM) was used for better definition of the parameters of the enzymatic reaction, being observed higher activity values at temperatures between 52ºC and 56ºC, pH between 10.2 and 10.5 and substrate concentration from 150mM to 170mM. RSM showed to be an adequate approach for modeling the reaction and maximizing the glycerol kinase activity. This low cost method doses glycerol kinase in a sequence of reactions, being of great importance for many industries, like food, sugar and alcohol. / Orientador: Maristela de Freitas Sanches Peres / Coorientador: Edwil Aparecida de Lucca Gattás / Banca: Luis Henrique Souza Guimarães / Banca: Rubens Monti / Mestre

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