Made available in DSpace on 2016-02-05T18:29:28Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-03-25. Added 1 bitstream(s) on 2016-02-05T18:33:11Z : No. of bitstreams: 1 000856523.pdf: 885289 bytes, checksum: 8ba3eecc7223dda20c63ac810083c4d7 (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / As amilases são enzimas pertencentes à classe das hidrolases, atuando na estrutura do amido com a hidrólise das ligações glicosídicas dos tipos α-1,4 e α-1,6, do interior das cadeias de amilose e amilopectina, respectivamente. Atualmente são responsáveis por cerca de 30% do mercado mundial de enzimas e apresentam uma vasta gama de aplicações industriais. Os fungos capazes de produzir enzimas amilolíticas podem ser cultivados mediante insumos de baixo custo empregados na fermentação em estado sólido (FES), o que possibilita a valorização dos subprodutos da agroindústria, bem como fornece suporte semelhante ao encontrado pelo micro-organismo no ambiente natural. O presente estudo visa produzir amilases por Rhizopus microsporus var. oligosporus em FES utilizando o farelo de trigo como substrato, purificar parcialmente o extrato bruto enzimático obtido, caracterizar bioquimicamente o extrato enzimático parcialmente purificado e posteriormente realizar a sacarificação pela hidrólise do amido presente na quirera de arroz e fermentação alcoólica por Saccharomyces cerevisiae para produção de etanol. A atividade enzimática do extrato bruto foi 39,8 U/mL o que equivale a 358 U/g de substrato. O índice de purificação, após as etapas de cromatografia foi parcial, mas suficiente para que a caracterização bioquímica do extrato produzido fosse realizada. Estes testes demonstraram faixa ótima no pH 4,0 e pH 5,5, indicando as condições ácidas como as melhores para este estudo. A estabilidade do pH foi ampla variando do pH 3,5 ao pH 8,5 com cerca de 40 a 60% de atividade relativa. A temperatura ótima de atividade enzimática determinada como ideal foi de 60 a 65 °C, porém a enzima mostrou-se termoestável até 60 °C. Os testes do efeito de íons na reação enzimática amilolítica demonstraram que os íons Cu+2, Zn+2, Al+2 e Na+2 comportaram-se como inibidores da atividade. O íon Mn+2 destacou-se por potencializar em... / Amylases are enzymes belonging to the class of hydrolases acting on starch structure with the hydrolysis of glycosidic bonds of α-1,4 and α-1,6 types, in the interior of the chains of amylose and amylopectin, respectively. Currently they are responsible for about 30% of the world market enzymes and show a wide range of industrial applications. Fungi capable of producing amylases can grow by low cost inputs in solid-state fermentation (SSF), which enables the recovery of the agricultural industry by-products and provides support similar to that found by the microrganism in the natural environment. This study aims to produce amylase by Rhizopus microsporus var. oligosporus in solid-state fermentation using wheat bran as substrate partially to purify the crude enzyme extract obtained biochemically characterize the partially purified enzyme extract and subsequently to carry out the hydrolysis saccharification of starch present in broken rice and fermentation of it by Saccharomyces cerevisiae for ethanol production. Enzymatic activity of the raw extract was 39.8 U/mL equivalent to 358 U/g substrate. The purification ratio after the chromatography step was partial, but sufficient for the biochemical characterization of the produced extract was taken. These tests showed optimal range of pH 4.0 to pH 5.5 indicating the acidic condition as the best for this study. The pH stability was wide range of pH 3.5 to pH 8.5 with 40 to 60% relative activity. The optimum temperature for enzyme activity determined as optimum was 60 to 65 °C, but the enzyme was thermostable up to 60 °C. Ion effect of the amylolytic enzyme tests showed that the reaction Cu+2, Zn+2, Al+2 and Na+2 ions behaved like activity inhibitors. The Mn+2 ions distinguished for enhancing at about 60% relative enzymatic activity to hydrolysis without addition of ions. The enzymatic hydrolysis of broken rice using as substrate allowed the complete conversion of starch to reducing sugars ...

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:24Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2012-04-18Bitstream added on 2014-06-13T20:35:53Z : No. of bitstreams: 1 freitas_ac_me_rcla.pdf: 1903514 bytes, checksum: b15d5cad8c8ce930f33f9a5187a1c952 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / As amilases são enzimas que catalisam a hidrólise do amido, dentre as quais se destaca a α-amilase, a β-amilase e a glicoamilase. Apresentam grande importância biotecnológica devido sua aplicação em vários processos industriais, principalmente alimentício. Podem ser obtidas de plantas, animais e microorganismos, no entanto, enzimas microbianas encontram maior demanda industrial. Além da importância econômica destas enzimas, novas metodologias têm sido desenvolvidas com resíduos como substrato para muitos processos industriais. A utilização de resíduos agro-industriais não só contribui para minimizar o impacto ambiental como atribui um valor econômico a esses substratos. Além disso, a imobilização de enzimas tem sido uma estratégia utilizada para a condução de bioprocessos, uma vez que os biocatalisadores imobilizados podem ser reutilizados em processos contínuos reduzindo custos de produção. Neste trabalho foi comparada a produção de amilases de dois fungos importantes para a indústria de alimentos, Rhizopus oryzae e Rhizopus microsporus var. oligosporus em fermentação submersa avaliando posteriormente os melhores métodos de imobilização da enzima, visando a produção de xarope de glicose. Os resultados mostraram que a farinha de trigo tipo II foi melhor ao farelo de mandioca e à farinha de mandioca como fonte de carbono na fermentação. As condições definidas para a fermentação foram: temperatura de 30°C e 96 h de tempo de fermentação para ambos os micro-organismos. O melhor pH para a atividade enzimática de Rhizopus oryzae foi 5,0, e de Rhizopus microsporus var. oligosporus foi 4,0 e 5,0. Ambas as enzimas apresentaram 100% de estabilidade em pH 4,0 a 7,0. A melhor temperatura para a atividade enzimática da amilase de R. oryzae foi 50°C e de R. oligosporus foram 60°C e 65°C. Ambas as... / Amylases are enzymes that catalyze starch hydrolysis, among which stands out α-amylase, β-amylase and glucoamylase. These enzymes have great importance due to its biotechnological application in various industrial processes, especially in food industry, among others. Also, they can be obtained from plants, animals and microorganisms, however microbial enzymes are the highest industrial demand. Besides economic importance, new methodologies has been developed with agricultural waste as substrate for many industrial processes. Bio-waste application in agro-industry not only minimizes environmental impacts as it increases economic value attached to these substrates. Immobilized enzymes is one strategy being used to conduct bio-processes, since immobilized biocatalysts can be reused in continuous processes and lowering production costs. In this paper two important fungi amylases from Rhizopus oryzae e Rhizopus microsporus var. oligosporus were characterized for enzyme production by optimal conditions and immobilization techniques, in order to produce glucose syrup. Results showed that type II wheat flour was better than cassava bagasse and cassava flour as fermentation’s carbon source. Fermentation conditions were: temperature 30°C during 96 hours for both microorganisms. Best enzymatic pH activity of Rhizopus oryzae was achieved at 5.0, and for Rhizopus microsporus var. oligosporus was 4.0 and 5.0. Both enzymes showed 100% stability from pH 4.0 to 7.0. The best temperature for amylase enzymatic activity of R. oryzae was 50°C and R. oligosporus were 60°C and 65°C. Both enzymes were 100% stable at temperature range of 20°C to 40°C, however the enzyme of R. oligosporus were more stable at temperatures above 50°C than R. oryzae. The products of starch enzymatic hydrolysis were analyzed by... (Complete abstract click electronic access below)

Orientador: Pedro de Oliva Neto / Banca: Maria das Graças de Almeida Felipe / Banca: Eutímio Gustavo Fernández Núñez / Resumo: As amilases são enzimas pertencentes à classe das hidrolases, atuando na estrutura do amido com a hidrólise das ligações glicosídicas dos tipos α-1,4 e α-1,6, do interior das cadeias de amilose e amilopectina, respectivamente. Atualmente são responsáveis por cerca de 30% do mercado mundial de enzimas e apresentam uma vasta gama de aplicações industriais. Os fungos capazes de produzir enzimas amilolíticas podem ser cultivados mediante insumos de baixo custo empregados na fermentação em estado sólido (FES), o que possibilita a valorização dos subprodutos da agroindústria, bem como fornece suporte semelhante ao encontrado pelo micro-organismo no ambiente natural. O presente estudo visa produzir amilases por Rhizopus microsporus var. oligosporus em FES utilizando o farelo de trigo como substrato, purificar parcialmente o extrato bruto enzimático obtido, caracterizar bioquimicamente o extrato enzimático parcialmente purificado e posteriormente realizar a sacarificação pela hidrólise do amido presente na quirera de arroz e fermentação alcoólica por Saccharomyces cerevisiae para produção de etanol. A atividade enzimática do extrato bruto foi 39,8 U/mL o que equivale a 358 U/g de substrato. O índice de purificação, após as etapas de cromatografia foi parcial, mas suficiente para que a caracterização bioquímica do extrato produzido fosse realizada. Estes testes demonstraram faixa ótima no pH 4,0 e pH 5,5, indicando as condições ácidas como as melhores para este estudo. A estabilidade do pH foi ampla variando do pH 3,5 ao pH 8,5 com cerca de 40 a 60% de atividade relativa. A temperatura ótima de atividade enzimática determinada como ideal foi de 60 a 65 °C, porém a enzima mostrou-se termoestável até 60 °C. Os testes do efeito de íons na reação enzimática amilolítica demonstraram que os íons Cu+2, Zn+2, Al+2 e Na+2 comportaram-se como inibidores da atividade. O íon Mn+2 destacou-se por potencializar em... / Abstract: Amylases are enzymes belonging to the class of hydrolases acting on starch structure with the hydrolysis of glycosidic bonds of α-1,4 and α-1,6 types, in the interior of the chains of amylose and amylopectin, respectively. Currently they are responsible for about 30% of the world market enzymes and show a wide range of industrial applications. Fungi capable of producing amylases can grow by low cost inputs in solid-state fermentation (SSF), which enables the recovery of the agricultural industry by-products and provides support similar to that found by the microrganism in the natural environment. This study aims to produce amylase by Rhizopus microsporus var. oligosporus in solid-state fermentation using wheat bran as substrate partially to purify the crude enzyme extract obtained biochemically characterize the partially purified enzyme extract and subsequently to carry out the hydrolysis saccharification of starch present in broken rice and fermentation of it by Saccharomyces cerevisiae for ethanol production. Enzymatic activity of the raw extract was 39.8 U/mL equivalent to 358 U/g substrate. The purification ratio after the chromatography step was partial, but sufficient for the biochemical characterization of the produced extract was taken. These tests showed optimal range of pH 4.0 to pH 5.5 indicating the acidic condition as the best for this study. The pH stability was wide range of pH 3.5 to pH 8.5 with 40 to 60% relative activity. The optimum temperature for enzyme activity determined as optimum was 60 to 65 °C, but the enzyme was thermostable up to 60 °C. Ion effect of the amylolytic enzyme tests showed that the reaction Cu+2, Zn+2, Al+2 and Na+2 ions behaved like activity inhibitors. The Mn+2 ions distinguished for enhancing at about 60% relative enzymatic activity to hydrolysis without addition of ions. The enzymatic hydrolysis of broken rice using as substrate allowed the complete conversion of starch to reducing sugars ... / Mestre

Orientador: Pedro de Oliva Neto / Banca: Valéria Mart Gomes de Lima / Banca: Rondinelli Donizetti Herculano / Resumo: As amilases são enzimas que catalisam a hidrólise do amido, dentre as quais se destaca a α-amilase, a β-amilase e a glicoamilase. Apresentam grande importância biotecnológica devido sua aplicação em vários processos industriais, principalmente alimentício. Podem ser obtidas de plantas, animais e microorganismos, no entanto, enzimas microbianas encontram maior demanda industrial. Além da importância econômica destas enzimas, novas metodologias têm sido desenvolvidas com resíduos como substrato para muitos processos industriais. A utilização de resíduos agro-industriais não só contribui para minimizar o impacto ambiental como atribui um valor econômico a esses substratos. Além disso, a imobilização de enzimas tem sido uma estratégia utilizada para a condução de bioprocessos, uma vez que os biocatalisadores imobilizados podem ser reutilizados em processos contínuos reduzindo custos de produção. Neste trabalho foi comparada a produção de amilases de dois fungos importantes para a indústria de alimentos, Rhizopus oryzae e Rhizopus microsporus var. oligosporus em fermentação submersa avaliando posteriormente os melhores métodos de imobilização da enzima, visando a produção de xarope de glicose. Os resultados mostraram que a farinha de trigo tipo II foi melhor ao farelo de mandioca e à farinha de mandioca como fonte de carbono na fermentação. As condições definidas para a fermentação foram: temperatura de 30°C e 96 h de tempo de fermentação para ambos os micro-organismos. O melhor pH para a atividade enzimática de Rhizopus oryzae foi 5,0, e de Rhizopus microsporus var. oligosporus foi 4,0 e 5,0. Ambas as enzimas apresentaram 100% de estabilidade em pH 4,0 a 7,0. A melhor temperatura para a atividade enzimática da amilase de R. oryzae foi 50°C e de R. oligosporus foram 60°C e 65°C. Ambas as... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Amylases are enzymes that catalyze starch hydrolysis, among which stands out α-amylase, β-amylase and glucoamylase. These enzymes have great importance due to its biotechnological application in various industrial processes, especially in food industry, among others. Also, they can be obtained from plants, animals and microorganisms, however microbial enzymes are the highest industrial demand. Besides economic importance, new methodologies has been developed with agricultural waste as substrate for many industrial processes. Bio-waste application in agro-industry not only minimizes environmental impacts as it increases economic value attached to these substrates. Immobilized enzymes is one strategy being used to conduct bio-processes, since immobilized biocatalysts can be reused in continuous processes and lowering production costs. In this paper two important fungi amylases from Rhizopus oryzae e Rhizopus microsporus var. oligosporus were characterized for enzyme production by optimal conditions and immobilization techniques, in order to produce glucose syrup. Results showed that type II wheat flour was better than cassava bagasse and cassava flour as fermentation's carbon source. Fermentation conditions were: temperature 30°C during 96 hours for both microorganisms. Best enzymatic pH activity of Rhizopus oryzae was achieved at 5.0, and for Rhizopus microsporus var. oligosporus was 4.0 and 5.0. Both enzymes showed 100% stability from pH 4.0 to 7.0. The best temperature for amylase enzymatic activity of R. oryzae was 50°C and R. oligosporus were 60°C and 65°C. Both enzymes were 100% stable at temperature range of 20°C to 40°C, however the enzyme of R. oligosporus were more stable at temperatures above 50°C than R. oryzae. The products of starch enzymatic hydrolysis were analyzed by... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Amilases microbianas têm aplicações biotecnológicas principalmente na conversão de amido para xaropes de maltose ou glicose. O objetivo deste trabalho foi estudar amilases produzidas pelo fungo Paecilomyces variotii, isolado de folhas de Psidium guajava. As melhores condições para produção enzimática foram padronizadas, usando o meio SR, pH 7,0, suplementado com farinha de aveia 1,5% como fonte de carbono, inoculado com 1,75x108 conídios/mL, a 30ºC, sem agitação, por 6 dias. O fungo desenvolveu-se em uma ampla faixa de pH (3-8), concentração osmótica (0?15% NaCl), e altas temperaturas (até 45ºC), o que o caracteriza como um microrganismo tolerante a ambientes extremos. As amilases foram purificadas por seqüencial eluição em cromatografias de DEAE-celulose e Sephadex G-100, sendo nesta última separada em duas formas amilolíticas (PI e PII). PI foi submetido em eletroeluição resultando em uma ?amilase com 16.1 vezes de purificação com 8,9% de recuperação. PII foi caracterizado como uma glucoamilase, com recuperação e fator de purificação de 6,2% e 47,9 vezes, respectivamente. Análises em PAGE confirmou o grau de homogeneidade e o caráter amilolítico (?-amilase e glucoamilase) após revelação dos géis com iodo ou glicoseoxidase. Esses resultados foram confirmados através de TLC, onde maltose e maltotriose foram os principais produtos de hidrólise do amido para PI e somente glicose para PII. ?-amilases e glucoamilase apresentaram massas moleculares (SDS-PAGE) de 75 kDa e 86,5 kDa, com pH e temperatura ótimos de 4,0 e 60ºC, e 5,0 e 55ºC, respectivamente. Em relação à estabilidade, ambas enzimas foram estáveis até 60ºC. Temperaturas superiores levaram a instabilidade e uma diminuição das atividades. As amilases foram estáveis em todos os pHs testados (2,5 ? 8,0), sendo maior em pH ácido para a glucoamilase e o contrário para a ?amilase. Amido favoreceu a estabilidade da glucoamilase, mas esta foi inibida por glicose, já para ?-amilase o amido atuou como protetor da enzima em períodos superiores a 40 minutos e esta não sofreu inibição pelo produto final. O ponto isoelétrico e o conteúdo de carboidratos foram de 3,5 e 27,5% para a glucoamilase e 4,5 e 23% para a ?-amilase, respectivamente. A glucoamilase e a ?-amilase de P. variotii hidrolisaram preferencialmente amido Reagen® e Sigma®. Constante de Michaelis e Vmáx foram determinados para vários substratos, podendo estimar uma eficiência catalítica favorável a amilopectina para a glucoamilase e amido Reagen® para a ?-amilase. A atividade glucoamilásica foi ensaiada com vários íons metálicos, mas somente Mn2+ 5mM aumentou a atividade em 80,7%. A ?-amilase foi ativada por 1mM de Ca2+ (65%) e Co2+ (60%). Análises de dicroísmo circular forneceram alguns dados sobre a estrutura dessas enzimas, sendo que, a glucoamilase mostrou-se rica em ?-hélices e a ?amilase uma mistura de ?-hélices e folhas ?. Através de análises em Western Blotting foi possível determinar pouca homologia entre as glucoamilases produzidas por Paecilomyces variotti e Scytalidium thermophilum, o que é condizente com os dados encontrados na literatura, uma vez que o gênero Paecilomyces encontra-se mais próximo, do ponto de vista evolucionário, de Talaromyces. Esses dados foram confirmados com a realização de espectrometria de massa para a glucoamilase de P. variotii, no qual um fragmento de aminoácidos da glucoamilase deste microrganismo apresentou homologia com a glucoamilase de T. emersonii. / Microbial amylases have biotechnological applications mainly for the conversion of starch to maltose or glucose syrup. The aim of this work was to study amylases produced by the fungus Paecilomyces variotii, isolated from Psidium guajava leaves. The best growth conditions for enzymatic production were standardized, using SR medium, pH 7.0, supplemented with 1.5% oat flour as carbon source, inoculated with 1.75x108 conidia/mL, at 30ºC, without agitation, for 6 days. The fungus developed in a wide range of pH (3-8), osmotic concentration (0-15% NaCl), and high temperatures (up to 45ºC), which characterized it as a tolerant microorganism at extreme environment. The amylases were purified by sequential elution in DEAE-cellulose and Sephadex G-100 chromatography, being in the last step resolved two amylolytic forms (PI and PII). PI was submitted to electroelution resulting in an ?-amylase purified 16.1-fold, with 8.9% recuperation. PII was characterized as a glucoamylase, with a recovery and purification factor of 6.2% and 47.9-fold, respectively. Analysis in PAGE showed that the enzyme was homogeneous and the amylolytic activities (?-amylase and glucoamylase) were confirmed after PAGE, revealing the gels for activity using both iodine and glucose-oxidase. Analysis by Thin Layer Chromatography confirmed the character of these enzymes, which released either maltose and maltotriose (PI), or only glucose (PII), as the main products of starch hydrolysis. ?-amylase and glucoamylase presented molecular masses in SDS-PAGE of 75 kDA and 86.5 kDa, respectively. Optimal pH and temperature were 4.0 and 60ºC for ?-amylase, and 5.0 and 55ºC for glucoamylase. Thermostability analysis showed that both enzymes were stable up to 60ºC. Higher temperatures decreased amylolytic activities. The amylases were stable in all pH tested (2.5-8.0), being higher in acid pH for glucoamylase, and the opposite for ?amylase. Addition of starch in the assay favored the stability of glucoamylase, but it was inhibited by addition of glucose (end product). In contrast, starch protected ?-amylase activity in periods higher 40 minutes and the enzyme was not inhibited by the end product. The isoelectric point and carbohydrate content were 3.5 and 27.5% for glucoamylase and 4.5 and 23% for ?-amylase, respectively. The glucoamylase and ?-amylase of P. variotii hydrolyzed preferentially starch Reagen® and Sigma®, respectively. Km and Vmax values were determined for several substrates, being estimated a catalytic efficiency favorable to amylopectin for glucoamylase and starch Reagen® for ?-amylase. The glucoamylase activity was tested with several metal ions, but only 5mM Mn2+ increased the activity in 80.7%. The ?-amylase was activated by 1mM Ca2+ (65%) and Co2+ (60%). Circular dichroism analysis supplied additional information about the glucoamylase structure, since the protein showed to be rich in ?-helix but ?-amylase showed to be a mixture of ?-helix and ?-sheet. By the analysis in Western Blotting was possible to determine some structural homology between the glucoamylases produced by Paecilomyces variotii and Scytalidium thermophilum, that is in agreement with published information, since the genera Paecilomyces is related, from the evolutionary viewpoint, with Talaromyces. This information were confirmed with the data from mass spectrometry for the glucoamylase of P. variotii, which a sequenced fragment of protein glucoamylase of this microorganism presented homology with the same enzyme produced by Talaromyces emersonii.

Amilases microbianas têm aplicações biotecnológicas principalmente na conversão de amido para xaropes de maltose ou glicose. O objetivo deste trabalho foi estudar amilases produzidas pelo fungo Paecilomyces variotii, isolado de folhas de Psidium guajava. As melhores condições para produção enzimática foram padronizadas, usando o meio SR, pH 7,0, suplementado com farinha de aveia 1,5% como fonte de carbono, inoculado com 1,75x108 conídios/mL, a 30ºC, sem agitação, por 6 dias. O fungo desenvolveu-se em uma ampla faixa de pH (3-8), concentração osmótica (0?15% NaCl), e altas temperaturas (até 45ºC), o que o caracteriza como um microrganismo tolerante a ambientes extremos. As amilases foram purificadas por seqüencial eluição em cromatografias de DEAE-celulose e Sephadex G-100, sendo nesta última separada em duas formas amilolíticas (PI e PII). PI foi submetido em eletroeluição resultando em uma ?amilase com 16.1 vezes de purificação com 8,9% de recuperação. PII foi caracterizado como uma glucoamilase, com recuperação e fator de purificação de 6,2% e 47,9 vezes, respectivamente. Análises em PAGE confirmou o grau de homogeneidade e o caráter amilolítico (?-amilase e glucoamilase) após revelação dos géis com iodo ou glicoseoxidase. Esses resultados foram confirmados através de TLC, onde maltose e maltotriose foram os principais produtos de hidrólise do amido para PI e somente glicose para PII. ?-amilases e glucoamilase apresentaram massas moleculares (SDS-PAGE) de 75 kDa e 86,5 kDa, com pH e temperatura ótimos de 4,0 e 60ºC, e 5,0 e 55ºC, respectivamente. Em relação à estabilidade, ambas enzimas foram estáveis até 60ºC. Temperaturas superiores levaram a instabilidade e uma diminuição das atividades. As amilases foram estáveis em todos os pHs testados (2,5 ? 8,0), sendo maior em pH ácido para a glucoamilase e o contrário para a ?amilase. Amido favoreceu a estabilidade da glucoamilase, mas esta foi inibida por glicose, já para ?-amilase o amido atuou como protetor da enzima em períodos superiores a 40 minutos e esta não sofreu inibição pelo produto final. O ponto isoelétrico e o conteúdo de carboidratos foram de 3,5 e 27,5% para a glucoamilase e 4,5 e 23% para a ?-amilase, respectivamente. A glucoamilase e a ?-amilase de P. variotii hidrolisaram preferencialmente amido Reagen® e Sigma®. Constante de Michaelis e Vmáx foram determinados para vários substratos, podendo estimar uma eficiência catalítica favorável a amilopectina para a glucoamilase e amido Reagen® para a ?-amilase. A atividade glucoamilásica foi ensaiada com vários íons metálicos, mas somente Mn2+ 5mM aumentou a atividade em 80,7%. A ?-amilase foi ativada por 1mM de Ca2+ (65%) e Co2+ (60%). Análises de dicroísmo circular forneceram alguns dados sobre a estrutura dessas enzimas, sendo que, a glucoamilase mostrou-se rica em ?-hélices e a ?amilase uma mistura de ?-hélices e folhas ?. Através de análises em Western Blotting foi possível determinar pouca homologia entre as glucoamilases produzidas por Paecilomyces variotti e Scytalidium thermophilum, o que é condizente com os dados encontrados na literatura, uma vez que o gênero Paecilomyces encontra-se mais próximo, do ponto de vista evolucionário, de Talaromyces. Esses dados foram confirmados com a realização de espectrometria de massa para a glucoamilase de P. variotii, no qual um fragmento de aminoácidos da glucoamilase deste microrganismo apresentou homologia com a glucoamilase de T. emersonii. / Microbial amylases have biotechnological applications mainly for the conversion of starch to maltose or glucose syrup. The aim of this work was to study amylases produced by the fungus Paecilomyces variotii, isolated from Psidium guajava leaves. The best growth conditions for enzymatic production were standardized, using SR medium, pH 7.0, supplemented with 1.5% oat flour as carbon source, inoculated with 1.75x108 conidia/mL, at 30ºC, without agitation, for 6 days. The fungus developed in a wide range of pH (3-8), osmotic concentration (0-15% NaCl), and high temperatures (up to 45ºC), which characterized it as a tolerant microorganism at extreme environment. The amylases were purified by sequential elution in DEAE-cellulose and Sephadex G-100 chromatography, being in the last step resolved two amylolytic forms (PI and PII). PI was submitted to electroelution resulting in an ?-amylase purified 16.1-fold, with 8.9% recuperation. PII was characterized as a glucoamylase, with a recovery and purification factor of 6.2% and 47.9-fold, respectively. Analysis in PAGE showed that the enzyme was homogeneous and the amylolytic activities (?-amylase and glucoamylase) were confirmed after PAGE, revealing the gels for activity using both iodine and glucose-oxidase. Analysis by Thin Layer Chromatography confirmed the character of these enzymes, which released either maltose and maltotriose (PI), or only glucose (PII), as the main products of starch hydrolysis. ?-amylase and glucoamylase presented molecular masses in SDS-PAGE of 75 kDA and 86.5 kDa, respectively. Optimal pH and temperature were 4.0 and 60ºC for ?-amylase, and 5.0 and 55ºC for glucoamylase. Thermostability analysis showed that both enzymes were stable up to 60ºC. Higher temperatures decreased amylolytic activities. The amylases were stable in all pH tested (2.5-8.0), being higher in acid pH for glucoamylase, and the opposite for ?amylase. Addition of starch in the assay favored the stability of glucoamylase, but it was inhibited by addition of glucose (end product). In contrast, starch protected ?-amylase activity in periods higher 40 minutes and the enzyme was not inhibited by the end product. The isoelectric point and carbohydrate content were 3.5 and 27.5% for glucoamylase and 4.5 and 23% for ?-amylase, respectively. The glucoamylase and ?-amylase of P. variotii hydrolyzed preferentially starch Reagen® and Sigma®, respectively. Km and Vmax values were determined for several substrates, being estimated a catalytic efficiency favorable to amylopectin for glucoamylase and starch Reagen® for ?-amylase. The glucoamylase activity was tested with several metal ions, but only 5mM Mn2+ increased the activity in 80.7%. The ?-amylase was activated by 1mM Ca2+ (65%) and Co2+ (60%). Circular dichroism analysis supplied additional information about the glucoamylase structure, since the protein showed to be rich in ?-helix but ?-amylase showed to be a mixture of ?-helix and ?-sheet. By the analysis in Western Blotting was possible to determine some structural homology between the glucoamylases produced by Paecilomyces variotii and Scytalidium thermophilum, that is in agreement with published information, since the genera Paecilomyces is related, from the evolutionary viewpoint, with Talaromyces. This information were confirmed with the data from mass spectrometry for the glucoamylase of P. variotii, which a sequenced fragment of protein glucoamylase of this microorganism presented homology with the same enzyme produced by Talaromyces emersonii.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:31:00Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2006-07-31Bitstream added on 2014-06-13T20:01:21Z : No. of bitstreams: 1 tavano_ol_dr_araiq.pdf: 761592 bytes, checksum: 1c98a6250ff1a76b1380af40256bd7b4 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Neste trabalho estudou-se a possibilidade de imobilização de uma amilase produzida por cepa de Neurospora crassa (mutante exo-1), e produção de derivados ativos e estabilizados. Foram testados diferentes suportes sólidos, incluindo-se diferentes suportes de agarose e suportes epóxidos preparados com Eupergit e Sepabeads. Além da agarose 10BCL foi utilizada a agarose 4BCL para que se verificasse possíveis dificuldades difusionais do substrato desta enzima, o amido. O acompanhamento das cinéticas de imobilização com a maltose como alternativa ao amido, também colaborou em evidenciar a dificuldade de difusão do amido através de ambos os suportes glioxil-agarose. O derivado obtido com agarose 10BCL, assim como aquele produzido com uso de suporte Eupergit foram os derivados mais estáveis, capazes de manter 100% de suas atividades após 12 horas de incubação à temperatura de 60°C, quando na forma solúvel a enzima conservou apenas 12% de sua atividade inicial. Quando incubados a 70°C destacou-se o derivado de glioxil-agarose (10BCL) como mais estável, mantendo cerca de 30% de sua atividade inicial após 4 horas de incubação. Quando testada a utilização de uma agarose comercial alternativa, sem percentual de crosslink conhecido, de menor custo, sua aplicação mostrou-se promissora e os derivados produzidos além de ativos se apresentam estáveis frente à temperatura. Em conjunto, as informações contidas no presente estudo indicam que a amilase de Neurospora crassa apresenta-se promissora em comparação às amilases de mercado aqui estudadas, tanto em sua utilização na forma solúvel quanto no que se relaciona a produção de derivados estáveis. / In this work were studied the immobilization of amylase from Neurospora crassa (Mutant Exo-1). This amylase showed easily production, purification and high capacity of immobilization on agarose and epoxy supports. It was used crosslinked agarose with two polymer concentration: 4 and 10%. The 4BCL agarose presents bigger porous diameter than 10 BCL agarose, so, in this case, possible diffusion problems of the starch across the supports could be reduced. Also, in this study, we have tested two epoxy supports for this amylase immobilization, using Eupergit and Sephabeads supports. The activies of the obtained derivatives were measured using two substrates - maltose and starch. Both glyoxyl agarose support prepared with 4BCl and 10BCL agarose present diffusion problems when the starch was used as substrate to measure the immobilization course. The 10BCL glyoxyl derivative presented the highest thermal stability when comparing the others derivatives. Among the epoxy derivatives the Eupergit one were better than the derivatives obtained using Sepabeads as support. In a confrontation between the two best derivatives, that is, the glyoxyl 10 BCL and Eupergit derivatives, both of them were stable at 60º incubation, maintaining 100% of activities for 12 hours, while the soluble amylase preserved about 12% of initial activity. These two amylase derivatives only showed differences at 70ºC incubation, when the glyoxyl 10BCL amylase derivative was more thermally stable, preserving about 30% of the initial activity after 4 hours.

Made available in DSpace on 2016-02-05T18:30:04Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-04-11. Added 1 bitstream(s) on 2016-02-05T18:34:10Z : No. of bitstreams: 1 000857393.pdf: 1233316 bytes, checksum: df86cf7d2b7b3a47fa18b9bd274e26e2 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / As amilases pertencem à classe das hidrolases e são enzimas de grande importância para aplicações industriais representando de 25 a 33% do mercado mundial de enzimas. Há uma gama extensiva de aplicações e um enorme interesse na descoberta de enzimas com melhores propriedades na degradação do amido. O presente trabalho visou otimizar a tecnologia de produção de amilases por Rhizopus microsporus var. oligosporus em fermentação em estado sólido com farelo de trigo. Em uma segunda etapa o extrato enzimático foi parcialmente caracterizado e utilizado para produção de xarope de glicose. Foi determinada a concentração ideal de sais para suplementação do meio de cultivo, a influência da umidade e inóculo na produção amilolítica utilizando-se um delineamento central composto rotacional (DCCR). Estabeleceu-se o protocolo para extração enzimática e verificou-se a produção ao longo do tempo em diferentes temperaturas de fermentação. A atividade enzimática foi determinada a partir da quantificação dos açúcares redutores liberados durante reação de hidrólise de amido. A menor concentração otimizada foi de 1,25% (m/m) de sulfato de amônio, 0,25% de fosfato de potássio e 1,25% de ureia. O melhor teor de umidade para a produção amilolítica foi de 50% e a extração mais eficiente ocorreu com 10 mL de água destilada por grama de substrato. A máxima produção enzimática ocorreu nos cultivos a 30 °C durante 120 h. A melhor temperatura para atividade amilolítica foi de 60 a 65 °C. A melhor estabilidade térmica (80%) foi obtida até 50 °C por 1 hora de incubação. A enzima produzida apresentou maior atividade em uma faixa de pH entre 4,0 e 5,0. A estabilidade foi superior a 80% após 1 hora de contato em pH de 3,0 a 7,0. O extrato enzimático bruto foi capaz de realizar a conversão total de amido em açúcar redutor após 6 horas de reação a 55 °C. Para a farinha de trigo tipo II foi obtido um rendimento... / The amylases belong to the class of the hydrolases and they are enzymes of great importance to industrial applications, representing from 25% to 33% of the worldwide enzymes business. There is a wide range of applications and a huge interest in the discovery of enzymes with better properties in the starch degradation. The present work aims to optimize the technology of production of amylases by Rhizopus microsporus var. oligosporus in solid state fermentation with wheat bran. In second stage the enzymatic extract was partially characterized and used in glucose syrup production. The ideal concentration of salts to supplement the culture medium was determined, as well as the influence of moisture and inoculum on amylase production using a central composite rotational design (DCCR). The best protocol for enzymatic extraction and profiles of amylase production at different temperatures of fermentation were determined. The enzymatic activity was measured by the quantification of reducing sugars released during hydrolysis reaction of starch. The lowest optimal concentration was 1.25% (w/w) ammonium sulfate, 0.25% potassium phosphate and 1.25% urea. The best moisture level for amylolytic production was 50%, and the most efficient extraction was with 10 ml of distilled water per gram of substrate. The maximum enzyme production in the cultures was at 30 °C for 120 h. The best temperature for amylolytic activity was 60 to 65 °C, and better stability (80%) was obtained up to 50 °C for 1 hour of incubation. The enzyme produced showed greater activity in a pH range 4.0-5.0, and more than 80% of stability after 1 hour of contact in a pH range 3.0-7.0. The crude enzymatic extract was able to perform the total conversion of starch to reducing sugar in 6 hours of reaction at 55 °C. For type II wheat flour was obtained a yield of 83% in 6.5 hours, and for wheat bran, 62% in 7 hours. The product of the catalytic reaction was concentrated to obtain 20% ...

Orientador: Pedro de Oliva Neto / Banca: Sandra Regina Ceccato Antonini / Banca: Eutimio Gustavo Fernandez Nuñez / Resumo: As amilases pertencem à classe das hidrolases e são enzimas de grande importância para aplicações industriais representando de 25 a 33% do mercado mundial de enzimas. Há uma gama extensiva de aplicações e um enorme interesse na descoberta de enzimas com melhores propriedades na degradação do amido. O presente trabalho visou otimizar a tecnologia de produção de amilases por Rhizopus microsporus var. oligosporus em fermentação em estado sólido com farelo de trigo. Em uma segunda etapa o extrato enzimático foi parcialmente caracterizado e utilizado para produção de xarope de glicose. Foi determinada a concentração ideal de sais para suplementação do meio de cultivo, a influência da umidade e inóculo na produção amilolítica utilizando-se um delineamento central composto rotacional (DCCR). Estabeleceu-se o protocolo para extração enzimática e verificou-se a produção ao longo do tempo em diferentes temperaturas de fermentação. A atividade enzimática foi determinada a partir da quantificação dos açúcares redutores liberados durante reação de hidrólise de amido. A menor concentração otimizada foi de 1,25% (m/m) de sulfato de amônio, 0,25% de fosfato de potássio e 1,25% de ureia. O melhor teor de umidade para a produção amilolítica foi de 50% e a extração mais eficiente ocorreu com 10 mL de água destilada por grama de substrato. A máxima produção enzimática ocorreu nos cultivos a 30 °C durante 120 h. A melhor temperatura para atividade amilolítica foi de 60 a 65 °C. A melhor estabilidade térmica (80%) foi obtida até 50 °C por 1 hora de incubação. A enzima produzida apresentou maior atividade em uma faixa de pH entre 4,0 e 5,0. A estabilidade foi superior a 80% após 1 hora de contato em pH de 3,0 a 7,0. O extrato enzimático bruto foi capaz de realizar a conversão total de amido em açúcar redutor após 6 horas de reação a 55 °C. Para a farinha de trigo tipo II foi obtido um rendimento... / Abstract: The amylases belong to the class of the hydrolases and they are enzymes of great importance to industrial applications, representing from 25% to 33% of the worldwide enzymes business. There is a wide range of applications and a huge interest in the discovery of enzymes with better properties in the starch degradation. The present work aims to optimize the technology of production of amylases by Rhizopus microsporus var. oligosporus in solid state fermentation with wheat bran. In second stage the enzymatic extract was partially characterized and used in glucose syrup production. The ideal concentration of salts to supplement the culture medium was determined, as well as the influence of moisture and inoculum on amylase production using a central composite rotational design (DCCR). The best protocol for enzymatic extraction and profiles of amylase production at different temperatures of fermentation were determined. The enzymatic activity was measured by the quantification of reducing sugars released during hydrolysis reaction of starch. The lowest optimal concentration was 1.25% (w/w) ammonium sulfate, 0.25% potassium phosphate and 1.25% urea. The best moisture level for amylolytic production was 50%, and the most efficient extraction was with 10 ml of distilled water per gram of substrate. The maximum enzyme production in the cultures was at 30 °C for 120 h. The best temperature for amylolytic activity was 60 to 65 °C, and better stability (80%) was obtained up to 50 °C for 1 hour of incubation. The enzyme produced showed greater activity in a pH range 4.0-5.0, and more than 80% of stability after 1 hour of contact in a pH range 3.0-7.0. The crude enzymatic extract was able to perform the total conversion of starch to reducing sugar in 6 hours of reaction at 55 °C. For type II wheat flour was obtained a yield of 83% in 6.5 hours, and for wheat bran, 62% in 7 hours. The product of the catalytic reaction was concentrated to obtain 20% ... / Mestre

Orientador: Ricardo Andrade Reis / Coorientador: Juliana Duarte Messana / Banca: Marcia Helena Machado da Rocha Fernandes / Banca: Giovani Fiorentini / Banca: Thiago Fernandes Bernardes / Banca: Odilon Gomes Pereira / Resumo: Objetivou-se neste trabalho avaliar os efeitos de dietas contendo silagem inoculada com Lactobacillus plantarum e Bacillus subtilis e suplementadas ou não com amilase sobre a digestibilidade aparente, fermentação ruminal e síntese de proteína microbiana em carneiros, assim como o desempenho e qualidade de carne de cordeiros. Para tanto, dois estudos foram conduzidos, no quais os animais receberam um dos quatro tratamentos (dietas): 1) silagem de milho não inoculada sem adição de amilase na mistura total da ração (MTR); 2) silagem de milho não inoculada e amilase adicionada na MRT; 3) silagem de milho inoculada com 1 × 105 UFC de L. plantarum e 1 × 105 UFC de B. subtilis, sem adição de amilase; 4) silagem de milho inoculada com 1 × 105 UFC de L. plantarum e 1 × 105 UFC de B. subtilis e amilase adicionada na MRT. A enzima utilizada foi a amilase numa taxa de aplicação de 2 g de produto / kg de matéria seca (MS) da dieta (602 unidade dextrinizante (UD) / kg de MS da dieta). A suplementação com amilase em dietas contendo silagem não inoculada aumentou (P=0,045) o consumo de matéria seca dos carneiros quando comparados com aqueles alimentados com silagem não inoculada sem suplementação com amilase (1,311 vs. 1,066 g/d), mas não diferiu dos outros tratamentos. A digestibilidade aparente da MS, MO, PB, FDN e EB aumentou (P<0,01) nos carneiros alimentos com silagem inoculada ou suplementados com amilase, sem interações entre os tratamentos. Os animais alimentados com dietas contendo ... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Objetivou-se neste trabalho avaliar os efeitos de dietas contendo silagem inoculada com Lactobacillus plantarum e Bacillus subtilis e suplementadas ou não com amilase sobre a digestibilidade aparente, fermentação ruminal e síntese de proteína microbiana em carneiros, assim como o desempenho e qualidade de carne de cordeiros. Para tanto, dois estudos foram conduzidos, no quais os animais receberam um dos quatro tratamentos (dietas): 1) silagem de milho não inoculada sem adição de amilase na mistura total da ração (MTR); 2) silagem de milho não inoculada e amilase adicionada na MRT; 3) silagem de milho inoculada com 1 × 105 UFC de L. plantarum e 1 × 105 UFC de B. subtilis, sem adição de amilase; 4) silagem de milho inoculada com 1 × 105 UFC de L. plantarum e 1 × 105 UFC de B. subtilis e amilase adicionada na MRT. A enzima utilizada foi a amilase numa taxa de aplicação de 2 g de produto / kg de matéria seca (MS) da dieta (602 unidade dextrinizante (UD) / kg de MS da dieta). A suplementação com amilase em dietas contendo silagem não inoculada aumentou (P=0,045) o consumo de matéria seca dos carneiros quando comparados com aqueles alimentados com silagem não inoculada sem suplementação com amilase (1,311 vs. 1,066 g/d), mas não diferiu dos outros tratamentos. A digestibilidade aparente da MS, MO, PB, FDN e EB aumentou (P<0,01) nos carneiros alimentos com silagem inoculada ou suplementados com amilase, sem interações entre os tratamentos. Os animais alimentados com dietas contendo silagem não inoculada e suplementados com amilase apresentaram alta proporção de ácido propiônico e baixa de ácido acético, e consequentemente baixa relação de aceitoc:propiônico. A síntese de proteína microbiana tendeu a ser maior (P=0,097) nos carneiros alimentados com silagem não inoculada e suplementados com a... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor