Amilases microbianas têm aplicações biotecnológicas principalmente na conversão de amido para xaropes de maltose ou glicose. O objetivo deste trabalho foi estudar amilases produzidas pelo fungo Paecilomyces variotii, isolado de folhas de Psidium guajava. As melhores condições para produção enzimática foram padronizadas, usando o meio SR, pH 7,0, suplementado com farinha de aveia 1,5% como fonte de carbono, inoculado com 1,75x108 conídios/mL, a 30ºC, sem agitação, por 6 dias. O fungo desenvolveu-se em uma ampla faixa de pH (3-8), concentração osmótica (0?15% NaCl), e altas temperaturas (até 45ºC), o que o caracteriza como um microrganismo tolerante a ambientes extremos. As amilases foram purificadas por seqüencial eluição em cromatografias de DEAE-celulose e Sephadex G-100, sendo nesta última separada em duas formas amilolíticas (PI e PII). PI foi submetido em eletroeluição resultando em uma ?amilase com 16.1 vezes de purificação com 8,9% de recuperação. PII foi caracterizado como uma glucoamilase, com recuperação e fator de purificação de 6,2% e 47,9 vezes, respectivamente. Análises em PAGE confirmou o grau de homogeneidade e o caráter amilolítico (?-amilase e glucoamilase) após revelação dos géis com iodo ou glicoseoxidase. Esses resultados foram confirmados através de TLC, onde maltose e maltotriose foram os principais produtos de hidrólise do amido para PI e somente glicose para PII. ?-amilases e glucoamilase apresentaram massas moleculares (SDS-PAGE) de 75 kDa e 86,5 kDa, com pH e temperatura ótimos de 4,0 e 60ºC, e 5,0 e 55ºC, respectivamente. Em relação à estabilidade, ambas enzimas foram estáveis até 60ºC. Temperaturas superiores levaram a instabilidade e uma diminuição das atividades. As amilases foram estáveis em todos os pHs testados (2,5 ? 8,0), sendo maior em pH ácido para a glucoamilase e o contrário para a ?amilase. Amido favoreceu a estabilidade da glucoamilase, mas esta foi inibida por glicose, já para ?-amilase o amido atuou como protetor da enzima em períodos superiores a 40 minutos e esta não sofreu inibição pelo produto final. O ponto isoelétrico e o conteúdo de carboidratos foram de 3,5 e 27,5% para a glucoamilase e 4,5 e 23% para a ?-amilase, respectivamente. A glucoamilase e a ?-amilase de P. variotii hidrolisaram preferencialmente amido Reagen® e Sigma®. Constante de Michaelis e Vmáx foram determinados para vários substratos, podendo estimar uma eficiência catalítica favorável a amilopectina para a glucoamilase e amido Reagen® para a ?-amilase. A atividade glucoamilásica foi ensaiada com vários íons metálicos, mas somente Mn2+ 5mM aumentou a atividade em 80,7%. A ?-amilase foi ativada por 1mM de Ca2+ (65%) e Co2+ (60%). Análises de dicroísmo circular forneceram alguns dados sobre a estrutura dessas enzimas, sendo que, a glucoamilase mostrou-se rica em ?-hélices e a ?amilase uma mistura de ?-hélices e folhas ?. Através de análises em Western Blotting foi possível determinar pouca homologia entre as glucoamilases produzidas por Paecilomyces variotti e Scytalidium thermophilum, o que é condizente com os dados encontrados na literatura, uma vez que o gênero Paecilomyces encontra-se mais próximo, do ponto de vista evolucionário, de Talaromyces. Esses dados foram confirmados com a realização de espectrometria de massa para a glucoamilase de P. variotii, no qual um fragmento de aminoácidos da glucoamilase deste microrganismo apresentou homologia com a glucoamilase de T. emersonii. / Microbial amylases have biotechnological applications mainly for the conversion of starch to maltose or glucose syrup. The aim of this work was to study amylases produced by the fungus Paecilomyces variotii, isolated from Psidium guajava leaves. The best growth conditions for enzymatic production were standardized, using SR medium, pH 7.0, supplemented with 1.5% oat flour as carbon source, inoculated with 1.75x108 conidia/mL, at 30ºC, without agitation, for 6 days. The fungus developed in a wide range of pH (3-8), osmotic concentration (0-15% NaCl), and high temperatures (up to 45ºC), which characterized it as a tolerant microorganism at extreme environment. The amylases were purified by sequential elution in DEAE-cellulose and Sephadex G-100 chromatography, being in the last step resolved two amylolytic forms (PI and PII). PI was submitted to electroelution resulting in an ?-amylase purified 16.1-fold, with 8.9% recuperation. PII was characterized as a glucoamylase, with a recovery and purification factor of 6.2% and 47.9-fold, respectively. Analysis in PAGE showed that the enzyme was homogeneous and the amylolytic activities (?-amylase and glucoamylase) were confirmed after PAGE, revealing the gels for activity using both iodine and glucose-oxidase. Analysis by Thin Layer Chromatography confirmed the character of these enzymes, which released either maltose and maltotriose (PI), or only glucose (PII), as the main products of starch hydrolysis. ?-amylase and glucoamylase presented molecular masses in SDS-PAGE of 75 kDA and 86.5 kDa, respectively. Optimal pH and temperature were 4.0 and 60ºC for ?-amylase, and 5.0 and 55ºC for glucoamylase. Thermostability analysis showed that both enzymes were stable up to 60ºC. Higher temperatures decreased amylolytic activities. The amylases were stable in all pH tested (2.5-8.0), being higher in acid pH for glucoamylase, and the opposite for ?amylase. Addition of starch in the assay favored the stability of glucoamylase, but it was inhibited by addition of glucose (end product). In contrast, starch protected ?-amylase activity in periods higher 40 minutes and the enzyme was not inhibited by the end product. The isoelectric point and carbohydrate content were 3.5 and 27.5% for glucoamylase and 4.5 and 23% for ?-amylase, respectively. The glucoamylase and ?-amylase of P. variotii hydrolyzed preferentially starch Reagen® and Sigma®, respectively. Km and Vmax values were determined for several substrates, being estimated a catalytic efficiency favorable to amylopectin for glucoamylase and starch Reagen® for ?-amylase. The glucoamylase activity was tested with several metal ions, but only 5mM Mn2+ increased the activity in 80.7%. The ?-amylase was activated by 1mM Ca2+ (65%) and Co2+ (60%). Circular dichroism analysis supplied additional information about the glucoamylase structure, since the protein showed to be rich in ?-helix but ?-amylase showed to be a mixture of ?-helix and ?-sheet. By the analysis in Western Blotting was possible to determine some structural homology between the glucoamylases produced by Paecilomyces variotii and Scytalidium thermophilum, that is in agreement with published information, since the genera Paecilomyces is related, from the evolutionary viewpoint, with Talaromyces. This information were confirmed with the data from mass spectrometry for the glucoamylase of P. variotii, which a sequenced fragment of protein glucoamylase of this microorganism presented homology with the same enzyme produced by Talaromyces emersonii.

Amilases microbianas têm aplicações biotecnológicas principalmente na conversão de amido para xaropes de maltose ou glicose. O objetivo deste trabalho foi estudar amilases produzidas pelo fungo Paecilomyces variotii, isolado de folhas de Psidium guajava. As melhores condições para produção enzimática foram padronizadas, usando o meio SR, pH 7,0, suplementado com farinha de aveia 1,5% como fonte de carbono, inoculado com 1,75x108 conídios/mL, a 30ºC, sem agitação, por 6 dias. O fungo desenvolveu-se em uma ampla faixa de pH (3-8), concentração osmótica (0?15% NaCl), e altas temperaturas (até 45ºC), o que o caracteriza como um microrganismo tolerante a ambientes extremos. As amilases foram purificadas por seqüencial eluição em cromatografias de DEAE-celulose e Sephadex G-100, sendo nesta última separada em duas formas amilolíticas (PI e PII). PI foi submetido em eletroeluição resultando em uma ?amilase com 16.1 vezes de purificação com 8,9% de recuperação. PII foi caracterizado como uma glucoamilase, com recuperação e fator de purificação de 6,2% e 47,9 vezes, respectivamente. Análises em PAGE confirmou o grau de homogeneidade e o caráter amilolítico (?-amilase e glucoamilase) após revelação dos géis com iodo ou glicoseoxidase. Esses resultados foram confirmados através de TLC, onde maltose e maltotriose foram os principais produtos de hidrólise do amido para PI e somente glicose para PII. ?-amilases e glucoamilase apresentaram massas moleculares (SDS-PAGE) de 75 kDa e 86,5 kDa, com pH e temperatura ótimos de 4,0 e 60ºC, e 5,0 e 55ºC, respectivamente. Em relação à estabilidade, ambas enzimas foram estáveis até 60ºC. Temperaturas superiores levaram a instabilidade e uma diminuição das atividades. As amilases foram estáveis em todos os pHs testados (2,5 ? 8,0), sendo maior em pH ácido para a glucoamilase e o contrário para a ?amilase. Amido favoreceu a estabilidade da glucoamilase, mas esta foi inibida por glicose, já para ?-amilase o amido atuou como protetor da enzima em períodos superiores a 40 minutos e esta não sofreu inibição pelo produto final. O ponto isoelétrico e o conteúdo de carboidratos foram de 3,5 e 27,5% para a glucoamilase e 4,5 e 23% para a ?-amilase, respectivamente. A glucoamilase e a ?-amilase de P. variotii hidrolisaram preferencialmente amido Reagen® e Sigma®. Constante de Michaelis e Vmáx foram determinados para vários substratos, podendo estimar uma eficiência catalítica favorável a amilopectina para a glucoamilase e amido Reagen® para a ?-amilase. A atividade glucoamilásica foi ensaiada com vários íons metálicos, mas somente Mn2+ 5mM aumentou a atividade em 80,7%. A ?-amilase foi ativada por 1mM de Ca2+ (65%) e Co2+ (60%). Análises de dicroísmo circular forneceram alguns dados sobre a estrutura dessas enzimas, sendo que, a glucoamilase mostrou-se rica em ?-hélices e a ?amilase uma mistura de ?-hélices e folhas ?. Através de análises em Western Blotting foi possível determinar pouca homologia entre as glucoamilases produzidas por Paecilomyces variotti e Scytalidium thermophilum, o que é condizente com os dados encontrados na literatura, uma vez que o gênero Paecilomyces encontra-se mais próximo, do ponto de vista evolucionário, de Talaromyces. Esses dados foram confirmados com a realização de espectrometria de massa para a glucoamilase de P. variotii, no qual um fragmento de aminoácidos da glucoamilase deste microrganismo apresentou homologia com a glucoamilase de T. emersonii. / Microbial amylases have biotechnological applications mainly for the conversion of starch to maltose or glucose syrup. The aim of this work was to study amylases produced by the fungus Paecilomyces variotii, isolated from Psidium guajava leaves. The best growth conditions for enzymatic production were standardized, using SR medium, pH 7.0, supplemented with 1.5% oat flour as carbon source, inoculated with 1.75x108 conidia/mL, at 30ºC, without agitation, for 6 days. The fungus developed in a wide range of pH (3-8), osmotic concentration (0-15% NaCl), and high temperatures (up to 45ºC), which characterized it as a tolerant microorganism at extreme environment. The amylases were purified by sequential elution in DEAE-cellulose and Sephadex G-100 chromatography, being in the last step resolved two amylolytic forms (PI and PII). PI was submitted to electroelution resulting in an ?-amylase purified 16.1-fold, with 8.9% recuperation. PII was characterized as a glucoamylase, with a recovery and purification factor of 6.2% and 47.9-fold, respectively. Analysis in PAGE showed that the enzyme was homogeneous and the amylolytic activities (?-amylase and glucoamylase) were confirmed after PAGE, revealing the gels for activity using both iodine and glucose-oxidase. Analysis by Thin Layer Chromatography confirmed the character of these enzymes, which released either maltose and maltotriose (PI), or only glucose (PII), as the main products of starch hydrolysis. ?-amylase and glucoamylase presented molecular masses in SDS-PAGE of 75 kDA and 86.5 kDa, respectively. Optimal pH and temperature were 4.0 and 60ºC for ?-amylase, and 5.0 and 55ºC for glucoamylase. Thermostability analysis showed that both enzymes were stable up to 60ºC. Higher temperatures decreased amylolytic activities. The amylases were stable in all pH tested (2.5-8.0), being higher in acid pH for glucoamylase, and the opposite for ?amylase. Addition of starch in the assay favored the stability of glucoamylase, but it was inhibited by addition of glucose (end product). In contrast, starch protected ?-amylase activity in periods higher 40 minutes and the enzyme was not inhibited by the end product. The isoelectric point and carbohydrate content were 3.5 and 27.5% for glucoamylase and 4.5 and 23% for ?-amylase, respectively. The glucoamylase and ?-amylase of P. variotii hydrolyzed preferentially starch Reagen® and Sigma®, respectively. Km and Vmax values were determined for several substrates, being estimated a catalytic efficiency favorable to amylopectin for glucoamylase and starch Reagen® for ?-amylase. The glucoamylase activity was tested with several metal ions, but only 5mM Mn2+ increased the activity in 80.7%. The ?-amylase was activated by 1mM Ca2+ (65%) and Co2+ (60%). Circular dichroism analysis supplied additional information about the glucoamylase structure, since the protein showed to be rich in ?-helix but ?-amylase showed to be a mixture of ?-helix and ?-sheet. By the analysis in Western Blotting was possible to determine some structural homology between the glucoamylases produced by Paecilomyces variotii and Scytalidium thermophilum, that is in agreement with published information, since the genera Paecilomyces is related, from the evolutionary viewpoint, with Talaromyces. This information were confirmed with the data from mass spectrometry for the glucoamylase of P. variotii, which a sequenced fragment of protein glucoamylase of this microorganism presented homology with the same enzyme produced by Talaromyces emersonii.

Orientador: Gabriela Alves Macedo / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-25T19:00:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 MadeiraJunior_JoseValdo_D.pdf: 997594 bytes, checksum: 9fe380b24aeba39fd18427a9159f14e1 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: A tanase, também conhecida como tanino acil hidrolase (EC 3.1.1.20), catalisa principalmente a hidrólise de ligações ésteres de taninos hidrolisáveis, liberando ácido gálico e glicose. Esta enzima tem grande potencial nas indústrias, química, farmacêutica e alimentícia. Para a produção da tanase, a fermentação em estado sólido apresenta vantagens sob a submersa, como maior produção enzimática de forma extracelular, maior produtividade, maior estabilidade de pH e temperatura, e menor custo do produto. Este menor custo se dá, entre outros motivos, pelo uso de resíduos agroindustriais e menor quantidade de água no meio. O grupo de pesquisa do laboratório de Bioquímica de Alimentos (DCA ¿ FEA ¿ UNICAMP) iniciou um estudou da produção da tanase em resíduo de Citrus. Os resultados obtidos mostraram grande potencial da produção enzimática, e simultâneo aumento do potencial antioxidante no resíduo fermentado, que por seguintes trabalhos foram constatados que este potencial se dava pelo aumento da concentração de compostos fenólicos bioativos. Os compostos fenólicos têm sido foco em pesquisas pela sua ação no metabolismo humano, agindo na prevenção de doenças crônicas, sendo portanto, importantes antioxidantes na indústria de alimentos. Com tudo, os processos de obtenção são por síntese química ou extração a partir de fontes vegetais, nos quais são usados ácidos, bases e solventes orgânicos. Estes processos geram grande quantidade de resíduos, degradam os compostos de interesse e diminuem o rendimento. Uma alternativa para minimizar estes problemas são os processos ambientalmente amigáveis, que podem ser por fermentação ou extração enzimática. Este projeto teve como principal objetivo a produção da tanase e compostos fenólicos pelo fungo Paecilomyces variotii, utilizando como substrato resíduo de frutas cítricas. Primeiramente foi realizada a produção da tanase em diferentes condições do processo de fermentação em estado sólido, como granulometria do substrato, hidratação do substrato, adição de indutores, fonte de nitrogênio, temperatura de incubação, entre outros. Em seguida, esta enzima foi semi-purificada e caracterizada bioquimicamente. Após esta etapa, foram realizados dois processos de obtenção de compostos fenólicos, via fermentativa e enzimática: para o primeiro processo foram avaliadas as condições da temperatura de incubação, hidratação do substrato e granulometria do resíduo; para o segundo, as condições testadas foram as atividades enzimáticas da pectinase, celulase e tanase (produzida neste trabalho). Após os processos de biotransformação, os extratos de compostos fenólicos bioativos obtidos foram avaliados quanto sua atividade antioxidante e anti-proliferação celular tumoral do tipo cólon-retal (células HT29) / Abstract: Tannase, also known as tannin acyl hydrolase (EC 3.1.1.20) catalyzes the hydrolysis of ester bonds of hydrolysable tannins, releasing gallic acid and glucose. This enzyme has great potential in chemical, pharmaceutical and food industries. For tannase production, the solid-state fermentation has advantages over submerged, such as great production in extracellular enzyme form, higher productivity, greater stability of pH and temperature, and lower product cost. This low cost occurs, among other reasons, by the use of agro-industrial residues and low water added in the medium. The research group of Laboratory of Food Biochemistry (DCA - FEA - UNICAMP) initiated a studied of tannase production in Citrus residues. The results showed great potential of enzyme production, and simultaneous increased the antioxidant potential in fermented Citrus residue, which others works published that potential was occurred by increasing the concentration of bioactive phenolic compounds. Phenolic compounds have been the focus in research for its action in human metabolism, acting in the prevention of chronic diseases, and therefore, important antioxidants in the food industry. However, the processes of obtaintion are by chemical synthesis or extraction from plant sources, which acids, bases and organic solvents are used. These processes generate large amounts of waste, degrade the compounds of interest and reduce the yield. An alternative to minimize these problems, environmentally friendly processes may be realized, such as by fermentation or enzymatic extraction. This project aimed to the production of tannase and phenolic compounds by the fungus Paecilomyces variotii, using as substrate Citrus residues. Firstly, the tannase production was carried out under different conditions of the solid-state fermentation process, such as particle substrate size, moisture of substrate, inductor compounds, nitrogen source, temperature of incubation, others. After that, the enzyme produced was semi-purified and biochemically characterized. The second part, two biotransformation processes for phenolic compounds obtainment were carried out, by fermentation and enzymatic reaction: for fermentation process, temperature of incubation, moisture of substrate and substrate particle size were evaluated; for enzymatic process, the conditions tested were the enzymatic activity of the pectinase, cellulase and tannase (produced in this work). After the biotransformation processes, the extracts of Citrus residues biotransformed were evaluated for antioxidant activity and tumor cell anti-proliferation type colorectal (HT29 cells) / Doutorado / Ciência de Alimentos / Doutor em Ciência de Alimentos

Orientador: Gabriela Alves Macedo / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-08T15:42:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Battestin_Vania_D.pdf: 4281162 bytes, checksum: b173ac91bb78b5cc016fe8016611c298 (MD5) Previous issue date: 2007 / Resumo: A tanino acil hidrolase conhecida como tanase (E.C: 3.1.1.20) é uma enzima produzida por fungos filamentosos, leveduras e bactérias. São caracterizadas por sua atividade em complexos polifenólicos, sendo capazes de hidrolisar ligações éster (entre o grupo anel aromático e o resíduo de glicose) e ligações depsídicas (ligação éster entre os anéis aromáticos) em substratos como ácido tânico, epicatequina galato, epigalocatequina galato entre outros. O objetivo deste trabalho foi selecionar linhagens de fungos produtores de tanase e estudar a produção, purificação, caracterização e aplicação desta enzima. A produção da tanase pelas linhagens de fungos selecionados foi testada em meios de cultura contendo resíduos agroindustriais de café e uva com 0,5% e 1,5% de ácido tânico. A linhagem LAB 153G, identificada como Paecilomyces variotii, se destacou produzindo 0,275 U/mL de tanase em meio contendo resíduo de café. No estudo de otimização da produção de tanase pela linhagem P. variotii utilizando metodologia de superfície de resposta, foi obtido um aumento de 9 vezes na produção da enzima, utilizando-se as seguintes condições: faixa de temperatura de 29-34ºC, meio de cultivo contendo resíduo de café.farelo de trigo, 50% : 50% (p/p), ácido tânico 8-14% e tempo de incubação de 5 dias. A preparação de tanase bruta apresentou atividade ótima em pH 6,5 e 70ºC e estabilidade na faixa de pH 4,0-7,5 após 24 h de incubação a 30ºC. A enzima bruta mostrou-se estável após 30 min de tratamento a 70ºC em pH 6,0. A tanase purificada mostrou atividade ótima em pH 5,5 e 50ºC; e estabilidade máxima na faixa de pH 4,5 ¿ 6,5 após 12 h de incubação a 30ºC. A enzima purificada mostrou-se estável após 30 min de tratamento a 50ºC. A tanase extracelular foi também purificada cerca de 19,3 vezes, utilizando precipitação com sulfato de amônio seguida de purificação com cromatografia de troca iônica (DEAE-Sepharose). A tanase de P. variotii apresentou valor de Km igual a 0,61 µM e Vmáx igual a 0,55 U/mL, para o substrato ácido tânico. No estudo de aplicação da tanase em substratos naturais como epigalocatequina galato extraído de chá verde, foi verificado que os produtos obtidos da hidrólise apresentaram maior atividade antioxidante quando comparado com epigalocatequina galato / Abstract: Tannin acyl hydrolases, commonly referred to as tannases (E.C. 3.1.1.20), are inducible enzymes produced by fungi, yeast and bacteria. Tannases have been mostly characterized by their activity on polyphenolic complexes, are able to hydrolyse the ¿ester¿ bond (galloyl ester of an alcohol moiety) and the ¿depside¿ bond (galloyl ester of gallic acid) in substrates such as tannic acid, epicatechin gallate, epigallocatechin gallate, chlorogenic acid. The objective of this work was to select tannase producing fungi and to study the production and characterization of this enzyme. These fungi lineages were tested in vegetable residues as coffee and grape, adding 0.5 and 1.5% of tannic acid in the fermentation media. The best result was obtained using LA153G and coffee residues with activity 0.275 U/mL; the best tannase producing fungus was identified as Paecilomyces variotii. This strain was used for the optimization of enzyme production by experimental design method. After the optimization process, the tannase activity increased by 9 times. According to the optimization process, the best conditions for tannase production by the lineage of P. variotii were: temperature 29 to 34 ºC; % residue, coffee husk:wheat bran - 50:50 (p/p), tannic acid 8 to15 % and 5 days of fermentation. The biochemical properties of tannase were determined. Temperature 70 ºC and pH values from 6.5 were optimum for crude tannase activity. Tannase showed stability at pH 4.0-7.5 after 24 h the incubation at 30ºC. The tannase was stable in a temperature 70 ºC after 30 min in pH 6.0. The purified tannase showed optima activity in pH 5.5 and 50ºC; stability at pH 4.5-6.5 after 12 h the incubation at 30ºC. The tannase was stable in a temperature 50ºC after 30 min. An extracellular tannase was partially purified using ammonium sulphate precipitation followed by DEAE-Sepharose ion exchange chromatography. DEAE-Sepharose column chromatography led to an overall purification of 19.3 fold. The tanase showed values for Km of 0.61 µM and Vmax of 0.55 U.mL-1. The activity of crude tannase on the epigallocatechin gallate extract of green tea was investigated. This work establish a relationship between the antioxidants effects of epigallocatechin gallate compared to the obtained enzymatic reaction products (epigalocatechin and gallic acid) / Doutorado / Doutor em Ciência de Alimentos

Orientador: Gabriela Alves Macedo / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-23T16:40:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Zanovello_Leonardo_M.pdf: 1456528 bytes, checksum: 96eb948fa9191bcc8eb18911f70d2482 (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: O Brasil é conhecido por ser um dos maiores produtores agroindustriais do mundo, o que reflete diretamente no crescimento econômico do país. Entretanto, toda essa produção tende a gerar alguns problemas de cunho ambiental como o acúmulo de resíduos e excedente de subprodutos. Uma solução para este problema, é a utilização deste material em processos biotecnológicos como a fermentação em estado sólido, que pode viabilizar a síntese microbiana de fitases, que são usualmente aplicadas como aditivos em ração animal. Neste cenário, este trabalho foi conduzido com o objetivo de utilizar o subproduto agroindustrial da extração de óleo dos frutos de tungue (torta de tungue) para produção da enzima fitase, bem como verificar a degradação dos compostos tóxicos presentes nesse resíduo pela manipulação do fungo filamentoso Paecilomyces variotii. Por meio da técnica de planejamento experimental foi obtido um aumento do rendimento na produção da enzima de aproximadamente 2,5 vezes, apresentando atividade específica de 9,56 U/mg de proteína. Foram ainda avaliadas as características bioquímicas do extrato bruto enzimático, que demonstrou pH e temperatura ótimos em 5,0 e 37°C respectivamente. A enzima apresentou estabilidade em pHs alcalinos e em temperaturas acima dos 60°C. Também foi estudada a influência de sais e inibidores na atividade, com destaque para os íons Fe+2,Fe+3, Zn+2, os quais afetaram negativamente a ação da fitase. Nos estudo da detoxificação dos ésteres de forbol, através das análises por cromatografia líquida de alta eficiência, em 48horas de fermentação não foi detectada quantidade significativa do composto tóxico. Assim como na análise citotóxica por MTT (teste da atividade da desidrogenase mitocondrial) foi constatado crescimento celular semelhante ao controle após a utilização de coproduto fermentado por 72 horas, comprovando que o processo de detoxificação foi eficiente / Abstract: Brazil is well known to have one of the biggest agro-industrial production in the world, which is direct reflected in the country's economic growth. However, the large yield of field usually come with some environmental issues like the accumulation of agro-industrial by-products. A promising solution for this problem is to reuse the residues in biotechnological processes as solid state fermentation (SSF), using microorganisms to synthesize phytases, that can be applied in animal feed. The aim of this work was to use the agro-industrial residue from tung's fruit oil extraction, known as tung meal, for phytase production, as well as the biochemistry characterization of crude enzymatic extract and detoxification of phorbol ester presents in Tung meal structure by the fungus Paecilomyces variotii. Statistical approach of experimental design showed a 2,5-fold increase in phytase production yield, being that the specific activity of the enzyme was 9,56 U/mg. The biochemistry characteristics of phytase crude extract were optimum pH of 5,0 and optimum temperature of 37°C, besides the enzyme showed stability in alkaline pH and worked in temperatures over than 60°C. The effects caused by salt and phytase activity inhibitors, showed that Fe+2, Fe+3, Zn+2 decreased drastically the action of enzyme. The detoxification tests were performed by HPLC analysis, running samples with 48, 72, 96, 120 hours of fermentation, without any kind of treatment and only heat treatment. After 48 hours fermentation was not detected significant amount of toxic compound, as well as analysis by MTT cytotoxicity test (mitochondrial dehydrogenase activity), was observed the same cell growth as the control samples following the use of processed waste for 72 hours, proving that the detoxification process was efficient / Mestrado / Ciência de Alimentos / Mestre em Ciência de Alimentos

A amplificação in vitro de DNA, utilizando reação em cadeia da polimerase (PCR), tem sido estudada como uma alternativa aos tradicionais métodos de detecção de micro-organismos contaminantes em tanques de armazenagem de biodiesel. Neste sentido, objetivou-se padronizar um método rápido e eficaz para detecção de Paecilomyces variotii utilizando-se a técnica de PCR e avaliar o desenvolvimento de P. variotii em amostras contendo diesel puro (B0), mistura diesel/biodiesel (B7) e biodiesel puro (B100). Em sistemas contendo meio mínimo mineral e misturas diesel/biodiesel, após 60 dias, verificou-se que o micro-organismo desenvolveu biomassa significativamente superior em B7 e B100 quando comparados a B0. A técnica de PCR foi capaz de detectar um mínimo de 103 esporos/mL de P. variotii em suspensão com água, correspondente a 0,0144 ng de DNA/μL, e demonstrou ausência de reações inespecíficas frente aos fungos Aspergillus fumigatus e Pseudallescheria boydii. Entretanto, o método mostrou-se ineficaz para detecção de P. variotii em amostras contendo diesel, biodiesel ou misturas de diesel/biodiesel. / The in vitro amplification of DNA using polymerase chain reaction (PCR), has been studied as an alternative to traditional methods for detecting microorganisms contaminating biodiesel storage tanks. In this sense, the aim of this study was to standardize a fast and effective method for detection of Paecilomyces variotii using the PCR technique and evaluate the development of P. variotii in samples containing pure diesel (B0), blend diesel/biodiesel (B7) and pure biodiesel (B100). In systems containing mineral minimal medium and diesel/biodiesel blends after 60 days, it was found that the microorganism biomass developed significantly higher in B7 and B100 when compared to B0. The PCR technique was able to detect a minimum of 103 spores/mL of P. variotii in suspension with water, corresponding to 0,0144 ng DNA/μL, and showed no nonspecific reactions against the fungi Aspergillus fumigatus and Pseudallescheria boydii. However, this method proved to be ineffective for the detection of P. variotii in samples containing diesel, biodiesel or diesel/biodiesel blends.

A amplificação in vitro de DNA, utilizando reação em cadeia da polimerase (PCR), tem sido estudada como uma alternativa aos tradicionais métodos de detecção de micro-organismos contaminantes em tanques de armazenagem de biodiesel. Neste sentido, objetivou-se padronizar um método rápido e eficaz para detecção de Paecilomyces variotii utilizando-se a técnica de PCR e avaliar o desenvolvimento de P. variotii em amostras contendo diesel puro (B0), mistura diesel/biodiesel (B7) e biodiesel puro (B100). Em sistemas contendo meio mínimo mineral e misturas diesel/biodiesel, após 60 dias, verificou-se que o micro-organismo desenvolveu biomassa significativamente superior em B7 e B100 quando comparados a B0. A técnica de PCR foi capaz de detectar um mínimo de 103 esporos/mL de P. variotii em suspensão com água, correspondente a 0,0144 ng de DNA/μL, e demonstrou ausência de reações inespecíficas frente aos fungos Aspergillus fumigatus e Pseudallescheria boydii. Entretanto, o método mostrou-se ineficaz para detecção de P. variotii em amostras contendo diesel, biodiesel ou misturas de diesel/biodiesel. / The in vitro amplification of DNA using polymerase chain reaction (PCR), has been studied as an alternative to traditional methods for detecting microorganisms contaminating biodiesel storage tanks. In this sense, the aim of this study was to standardize a fast and effective method for detection of Paecilomyces variotii using the PCR technique and evaluate the development of P. variotii in samples containing pure diesel (B0), blend diesel/biodiesel (B7) and pure biodiesel (B100). In systems containing mineral minimal medium and diesel/biodiesel blends after 60 days, it was found that the microorganism biomass developed significantly higher in B7 and B100 when compared to B0. The PCR technique was able to detect a minimum of 103 spores/mL of P. variotii in suspension with water, corresponding to 0,0144 ng DNA/μL, and showed no nonspecific reactions against the fungi Aspergillus fumigatus and Pseudallescheria boydii. However, this method proved to be ineffective for the detection of P. variotii in samples containing diesel, biodiesel or diesel/biodiesel blends.

A amplificação in vitro de DNA, utilizando reação em cadeia da polimerase (PCR), tem sido estudada como uma alternativa aos tradicionais métodos de detecção de micro-organismos contaminantes em tanques de armazenagem de biodiesel. Neste sentido, objetivou-se padronizar um método rápido e eficaz para detecção de Paecilomyces variotii utilizando-se a técnica de PCR e avaliar o desenvolvimento de P. variotii em amostras contendo diesel puro (B0), mistura diesel/biodiesel (B7) e biodiesel puro (B100). Em sistemas contendo meio mínimo mineral e misturas diesel/biodiesel, após 60 dias, verificou-se que o micro-organismo desenvolveu biomassa significativamente superior em B7 e B100 quando comparados a B0. A técnica de PCR foi capaz de detectar um mínimo de 103 esporos/mL de P. variotii em suspensão com água, correspondente a 0,0144 ng de DNA/μL, e demonstrou ausência de reações inespecíficas frente aos fungos Aspergillus fumigatus e Pseudallescheria boydii. Entretanto, o método mostrou-se ineficaz para detecção de P. variotii em amostras contendo diesel, biodiesel ou misturas de diesel/biodiesel. / The in vitro amplification of DNA using polymerase chain reaction (PCR), has been studied as an alternative to traditional methods for detecting microorganisms contaminating biodiesel storage tanks. In this sense, the aim of this study was to standardize a fast and effective method for detection of Paecilomyces variotii using the PCR technique and evaluate the development of P. variotii in samples containing pure diesel (B0), blend diesel/biodiesel (B7) and pure biodiesel (B100). In systems containing mineral minimal medium and diesel/biodiesel blends after 60 days, it was found that the microorganism biomass developed significantly higher in B7 and B100 when compared to B0. The PCR technique was able to detect a minimum of 103 spores/mL of P. variotii in suspension with water, corresponding to 0,0144 ng DNA/μL, and showed no nonspecific reactions against the fungi Aspergillus fumigatus and Pseudallescheria boydii. However, this method proved to be ineffective for the detection of P. variotii in samples containing diesel, biodiesel or diesel/biodiesel blends.

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Orientador: Gabriela Alves Macedo / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-16T16:18:09Z (GMT). No. of bitstreams: 1 MadeiraJunior_JoseValdo_M.pdf: 1179155 bytes, checksum: 65b86d843e7273040bbbed20eae90c33 (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: O objetivo deste trabalho foi avaliar a viabilidade de produzir simultaneamente fitase e tanase através da fermentação sólida, em bagaço de laranja e torta de mamona, empregando o fungo Paecilomyces variotii. A produção mundial de laranja tem aumentado significativamente desde a década de oitenta, especialmente no setor de processamento de suco. Para o ano de 2010 a produção mundial de laranja está estimada em 66,4 milhões de toneladas, sendo que 40% desta produção serão convertidas em subprodutos, principalmente a casca. Uma das alternativas para o uso deste resíduo tem sido na forma peletizada para alimentação animal. A mamona é uma oleaginosa muito estudada para a produção de biodiesel. A torta residual da extração do óleo é de grande utilidade para adubação e também rica em proteínas, abrindo possibilidade da sua utilização como ração animal. Esta segunda aplicação enfrenta o problema da presença da ricina, composto tóxico presente na torta, havendo a necessidade de detoxificá-la antes do destino como ração. O uso de enzimas na alimentação animal é conhecido e está sendo bem explorado. A maior dificuldade de expandir o uso de enzimas ainda é o custo de produção. Uma alternativa para isto seria a utilização destes resíduos como substrato da fermentação para produção de enzimas. Dessa forma, o uso dos resíduos para alimentação animal representa uma alternativa viável para este setor, assim como para a produção de biocatalizadores através da fermentação sólida. As características do bagaço de laranja e torta de mamona após a fermentação foram avaliadas a fim de estudar sua viabilidade como ingrediente para ração animal. No estudo de otimização da produção de tanase por Paecilomyces variotii utilizando metodologia de superfície de resposta, foram obtidas atividades de 4800 e 2400 U/g em bagaço de laranja e torta de mamona, respectivamente. Essa produção foi conduzida utilizando 3 e 4,6% de ácido tânico, 61 e 25% de solução salina, 96 e 48 horas de tempo de incubação para os resíduos de laranja e mamona, respectivamente. Para produção de fitase as atividades foram de 320 e 280 U/g em bagaço de laranja e torta de mamona, respectivamente. As condições de cultivo em bagaço de laranja foram 5,8% de ácido tânico, 66% de solução salina e 72 horas de incubação. O processo fermentativo com torta de mamona foi conduzido com as mesmas condições com exceção da porcentagem de solução salina, que foi de 25%, e a ausência de ácido tânico. Após o processo fermentativo, o bagaço de laranja apresentou maior capacidade antioxidante em relação ao meio não fermentado, representando um ingrediente interessante para uso em ração animal. A torta de mamona fermentada apresentou menor concentração de ricina no meio de cultivo, entretanto, ainda exibiu atividade tóxica em células Vero / Abstract: The aim of this study was to evaluate the feasibility of producing both phytase and tannase by solid fermentation on orange peel and castor bean cake, using the fungus Paecilomyces variotii. World production of oranges has increased significantly since the eighties, especially in the processing of juice. For the year 2010, the world production of oranges is estimated at 66.4 million tons, with 40% of this production will be converted into waste, mainly the peel. An alternative use of this waste has been as pellets for animal food. The castor bean is an oilseed much studied for the production of bio-diesel. The castor cake of the extraction of oil is very useful for fertilization and also rich in protein, opening the possibility of its use as animal food. This second application faces the problem of the presence of ricin, a toxic compound present in the castor cake. There is a need for a detoxification before using it as food. The use of enzymes in animal feed is well known and is being explored. The biggest difficulty to expand the use of enzymes is the production cost. An alternative to this would be the use of waste as fermentation substrate for enzyme production with higher added value. Therefore, the use of these residues for animal food represents a viable alternative to the sector as well as for the production of biocatalysts by solid fermentation. The characteristics of the orange peel and the castor cake after fermentation were evaluated in order to study its feasibility as an ingredient for animal food. In the study of optimization of the production of tannase by Paecilomyces variotii using response surface methodology, activities were obtained from 4,800 and 2,400 U/g in orange peel and castor cake, respectively. This production was conducted using 3 and 4.6% tannic acid, 61 and 25% salt solution, 96 and 48 hours of incubation time for the waste of orange and castor bean, respectively. For phytase production by Paecilomyces variotii, the activities were of 320 and 280 U/g using orange peel and castor cake, respectively. Growing conditions on orange peel were 5.8% tannic acid, 66% salt solution and 72 hours of incubation. The fermentation with castor cake was conducted with the same conditions except for the absence of tannic acid and the percentage of salt solution which was 25%. After fermentation, the orange peel had a higher antioxidant capacity compared to a non-fermented environment, an interesting ingredient in animal food. The fermented castor cake showed lower concentration of ricin in the culture medium. However, it still exhibited toxic activity in Vero cells / Mestrado / Mestre em Ciência de Alimentos